JP2007077048A - ペプチドホルモン封入ナノ粒子を含む医薬製剤及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 即効性と持続性とを兼備するとともに、剤形の小型化が可能なペプチドホルモン封入ナノ粒子を含む医薬製剤及びその製造方法を提供する。
【解決手段】 ペプチドホルモンが生体適合性ナノ粒子の内部に加えて外層にも封入されたペプチドホルモン封入ナノ粒子を用いることにより、ナノ粒子の外層に封入されたペプチドホルモンにより製剤の即効性を高め、ナノ粒子の内部に封入されたペプチドホルモンを徐放させることにより製剤の持続性を高めることができる。また、ナノ粒子の内部に加えて外層にもペプチドホルモンが封入されるため、製剤中のペプチドホルモン含量を高めることができ、剤形の小型化が可能な医薬製剤となる。
【選択図】 図１

Description

本発明は、ナノ粒子内にインスリン、カルシトニン等のペプチドホルモンを封入して成るペプチドホルモン封入ナノ粒子を含む医薬製剤及びその製造方法に関する。

近年、ライフスタイルの変化や人口増加に伴い糖尿病患者が増加している。糖尿病は、免疫異常やウィルス感染等により膵臓のランゲルハンス島β細胞が破壊され、インスリン分泌不全となって発症するインスリン依存性のＩ型と、遺伝的素質に加えてライフスタイ
ルが原因となり、インスリン作用の相対的不足によって発症するインスリン非依存性のII
型に大別される代謝性疾患である。

糖尿病の治療法は、患者の症状に応じて食事療法、運動療法、薬物療法など様々であるが、Ｉ型の糖尿病患者のほとんどはインスリンを体外から摂取することで血糖値を制御す
る必要がある。インスリンの生理活性作用には、摂食後の血糖値の上昇に応じた量のインスリンが分泌され、血糖値を正常値に維持する血糖値降下作用の他、アミノ酸の取り込みやタンパク質及びグリコーゲンの合成促進作用、分解抑制作用等、多くの作用があり、このうちの血糖値降下作用を利用したＩ型糖尿病の治療薬として広く使用されている。

このインスリンに代表されるペプチドホルモンは、消化管内で酵素分解を受けやすいため、利便性の高い経口投与製剤では生体内利用率が極めて低くなる。そのため、従来、皮下注射によるインスリン投与が行われている。しかし、インスリンを皮下注射により投与する場合、急激な血糖値の低下により人体に強い負荷を与えるおそれがある上、インスリンを酵素分解する肝臓を通過することにより生体内利用率が低下（肝初回通過効果）することが知られている。

そこで、例えば特許文献１及び２には、生体内分解性高分子の金属塩のマイクロカプセルにインスリンを封入し、投与後初期のインスリン過剰放出を抑制する徐放性製剤が開示されている。しかし、血液中のインスリンレベルを一定に維持して血糖値を常に正常値に維持するためには、患者自身の手で毎日頻回（１〜５回程度）の皮下注射を行う必要があり、注射時の苦痛及び利便性を改善し、患者のコンプライアンスを向上させる新たな投与方法の開発が望まれていた。

このような背景のもと、経口、注射以外のインスリン投与経路として、肺、鼻腔の経粘膜を利用する投与経路が盛んに研究されている。中でも肺胞を経由して送達する経肺ルートは、消化管に比べタンパク質分解酵素が少ないこと、肺胞の比表面積は約１００ｍ²と非常に広く、小腸粘膜の表面積（２００ｍ²）に匹敵すること、上皮細胞が薄く、血中への薬物移行性が良いこと、さらには肝初回通過効果を回避できること等、高い生体内利用率の獲得に有利な条件が揃っている。

経肺ルートで投与される経肺投与製剤としては、これまで噴霧乾燥技術でインスリンを複合粉末化した吸入製剤や、球形析晶法を用いてインスリンと高分子とをコンポジット化して形成された高分子ナノ粒子等の実用化が試みられている。しかし、水中エマルション溶媒拡散法に代表される従来の球形析晶法を用いて製造されたインスリン封入高分子ナノ粒子は嵩密度が低く、実用的な経肺投与量（１回当り吸入量１００ｍｇ以下）とするには製剤中のインスリン含量を高める必要があった。

そこで、例えば特許文献３には、インスリンにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合させることにより、高分子ナノ粒子内への封入率を高め、且つナノ粒子の破壊（バースト）を抑制するとともに、投与初期における血糖値の低下を抑制する方法が開示されている。しかし、特許文献３の方法では、予めインスリンへのＰＥＧ結合処理を行う必要があり、製造工程数が増加する。また、投与初期においてもある程度の血糖値低下作用を発現させる必要があるところ、ＰＥＧ結合処理されたインスリンを用いた場合は血糖値低下作用のコントロールが困難となる。

また、インスリンと同様にペプチドホルモンの一種であるカルシトニンは、甲状腺Ｃ細胞より体内に分泌され、副甲状腺ホルモンとともに血中カルシウム濃度を低下させ、破骨細胞に直接作用して骨の溶解を抑制する働きがあり、骨粗鬆症の予防及び治療薬として用いられているが、インスリンよりもさらに高分子ナノ粒子内への封入が困難であり、高濃度カルシトニン製剤の開発が望まれていた。

一方、薬物及び生体適合性高分子からなるナノ粒子と糖アルコールとを含む液体原料を流動ガス中に噴霧する噴霧乾燥式流動層造粒法により、いわゆるDrug Delivery System（以下、ＤＤＳという）に好適な取り扱い性に優れた薬物含有複合粒子の製造方法及び経肺投与薬剤への適用性が提案されている（特許文献４参照）。しかし、ペプチドホルモンをナノ粒子内に封入し、それを用いて実用的な経肺投与量を満足する経肺投与薬剤とするためには、複合粒子内のペプチドホルモン封入率をさらに高めるという改良の余地が残されていた。
特開２００１−２３３７８８号公報 特開２００２−１１４６６７号公報 特表２００４−５３４７２１号公報 特開２００４−２６２８１０号公報

本発明は、上記問題点に鑑み、ペプチドホルモンの薬効について即効性と持続性とを兼備するとともに、ペプチドホルモン含量を高めることにより剤形の小型化が可能なペプチドホルモン封入ナノ粒子を含む医薬製剤を提供することを目的とする。また、本発明の他の目的は、低コストで環境負荷も少ないペプチドホルモン封入ナノ粒子を含む医薬製剤の製造方法を提供することにある。

上記目的を達成するために本発明の第１の構成は、生体適合性ナノ粒子の内部及び該粒子の外層にペプチドホルモンを封入して成るペプチドホルモン封入ナノ粒子を含む医薬製剤である。

また本発明の第２の構成は、上記構成の医薬製剤において、前記ペプチドホルモンが、インスリンであることを特徴としている。

また本発明の第３の構成は、上記構成の医薬製剤において、前記ペプチドホルモンが、カルシトニンであることを特徴としている。

また本発明の第４の構成は、上記構成の医薬製剤において、前記生体適合性ナノ粒子を構成する生体適合性高分子が、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、若しくは乳酸・グリコール酸共重合体のいずれかであることを特徴としている。

また本発明の第５の構成は、上記構成の医薬製剤において、前記ペプチドホルモンを内部に封入した前記生体適合性ナノ粒子が結合剤によって複合化されるとともに、当該結合剤を外層としてペプチドホルモンを封入したことを特徴としている。

また本発明の第６の構成は、上記構成の医薬製剤において、前記結合剤が糖アルコールであることを特徴としている。

また本発明の第７の構成は、上記構成の医薬製剤が経肺投与用途に使用されることを特徴としている。

また本発明の第８の構成は、ポリビニルアルコール水溶液に、少なくともペプチドホルモンの溶液と生体適合性高分子を有機溶媒に溶解させた溶液との混合液を加えて、前記ペプチドホルモンが前記生体適合性高分子の内部に封入されたペプチドホルモン封入ナノ粒子の懸濁液を生成するナノ粒子形成工程と、前記ペプチドホルモン封入ナノ粒子の懸濁液から前記有機溶媒を留去する溶媒留去工程と、前記有機溶媒が留去された前記ペプチドホルモン含有ナノ粒子を前記ペプチドホルモンが含まれた結合剤によって複合化する複合化工程と、を有することを特徴とする医薬製剤の製造方法である。

また本発明の第９の構成は、上記構成の医薬製剤の製造方法において、前記複合化工程が凍結乾燥により行われることを特徴としている。

また本発明の第１０の構成は、上記構成の医薬製剤の製造方法において、前記複合化工程が噴霧乾燥式流動層造粒法により行われることを特徴としている。

また本発明の第１１の構成は、ポリビニルアルコールの水溶液に、少なくとも親水性のペプチドホルモンの溶液と親水性修飾処理された生体適合性高分子を有機溶媒に溶解させた溶液との混合液を加えて、前記親水性のペプチドホルモンが前記生体適合性高分子の内部及び外層のいずれにも封入されたペプチドホルモン含有ナノ粒子の懸濁液を生成するナノ粒子形成工程と、前記ペプチドホルモン含有ナノ粒子の懸濁液から前記有機溶媒を留去する溶媒留去工程と、を含むことを特徴とする医薬製剤の製造方法である。

また本発明の第１２の構成は、上記構成の医薬製剤の製造方法において、前記ポリビニルアルコール水溶液中のポリビニルアルコール濃度が０．５重量％未満であることを特徴としている。

また本発明の第１３の構成は、上記構成の医薬製剤の製造方法において、前記溶媒留去工程の後に、さらに前記ペプチドホルモン封入ナノ粒子の懸濁液からポリビニルアルコールを除去する除去工程を有することを特徴としている。

また本発明の第１４の構成は、上記構成の医薬製剤の製造方法において、前記ポリビニルアルコール水溶液中のポリビニルアルコール濃度が０．１重量％以上１０重量％以下であることを特徴としている。

また本発明の第１５の構成は、上記構成の医薬製剤の製造方法において、前記有機溶媒が少なくともアセトンを含むことを特徴としている。

本発明の第１の構成によれば、ナノ粒子の外層に封入されたペプチドホルモンにより製剤の即効性を高めることができ、ナノ粒子の内部に封入されたペプチドホルモンを徐々に放出させることにより製剤の持続性を高めることができる。また、ナノ粒子の内部に加えて外層にもペプチドホルモンが封入されるため、製剤中のペプチドホルモン含量を高めることができ、剤形の小型化が可能な医薬製剤が提供される。

また、本発明の第２の構成によれば、上記第１の構成の医薬製剤において、ペプチドホルモンとしてインスリンを用いることにより、ナノ粒子の外層に封入されたインスリンにより即効的な血糖値降下作用を高め、ナノ粒子の内部に封入されたインスリンにより持続的な血糖値降下作用を高めたインスリン製剤となる。また、製剤中のインスリン含量を高めることができ、剤形の小型化も実現可能となる。さらに、ナノ粒子内部及び外層のインスリンの封入割合を調整して血糖値降下作用について即効性と持続性のバランスをとることにより、食前、食後等の服用場面に応じた適切な作用を発現するインスリン製剤を提供することができる。

また、本発明の第３の構成によれば、上記第１の構成の医薬製剤において、ペプチドホルモンとしてカルシトニンを用いることにより、従来ナノ粒子内への封入が難しく、僅かしか封入できなかったカルシトニンを外層に封入して封入率を高めることができ、剤形の小型化が可能な高濃度カルシトニン製剤が提供される。また、ナノ粒子内部及び外層のカルシトニンの封入割合を調整することにより、血中カルシウム濃度低下作用について即効性と持続性を兼ね備えたカルシトニン製剤となる。

また、本発明の第４の構成によれば、上記第１乃至第３のいずれかの構成の医薬製剤において、生体適合性高分子としてポリ乳酸、ポリグリコール酸、若しくは乳酸・グリコール酸共重合体のいずれかを用いることにより、生体への刺激・毒性が低くペプチドホルモンを内包可能であり、且つペプチドホルモンの効力を保持したまま長期間保存できるとともに、生体適合性高分子の分解によりペプチドホルモンの徐放が可能となる。

また、本発明の第５の構成によれば、上記第１乃至第４のいずれかの構成の医薬製剤において、結合剤によってナノ粒子を複合化するとともに、結合剤から成る外層にペプチドホルモンを封入することにより、簡便な方法でナノ粒子の外層にペプチドホルモンを封入可能となる。さらに、容器への充填時に取り扱いが容易で使用時には再分散可能な凝集粒子となるため、ナノ粒子の取り扱い性も向上する。

また、本発明の第６の構成によれば、上記第５の構成の医薬製剤において、結合剤として糖アルコールを用いて複合化することにより、複合化されたナノ粒子の分散性、耐熱性が向上するとともに、一旦ナノ粒子内に封入されたペプチドホルモンの粒子表面への再漏出を防止できる。

また、本発明の第７の構成によれば、上記第１乃至第６のいずれかの構成の医薬製剤を経肺投与用途に使用することにより、製剤中のペプチドホルモン含量を高めて実用的な経肺投与量を実現することができる。特に、糖尿病の治療に用いられるインスリン製剤の場合、経口投与における生体内利用率の低下及び皮下注射における苦痛及び利便性を改善して患者のコンプライアンスを向上させることができる。

また、本発明の第８の構成によれば、ポリビニルアルコール水溶液に、少なくともペプチドホルモンの溶液と生体適合性高分子を有機溶媒に溶解させた溶液との混合液を加えて、ペプチドホルモンが前記生体適合性高分子中に封入されたペプチドホルモン封入ナノ粒子の懸濁液とし、該懸濁液から有機溶媒を留去した後、ペプチドホルモンが含まれた結合剤によって複合化して医薬製剤を製造することにより、製剤中のペプチドホルモン含量が高く、且つ容器への充填時に取り扱いが容易で、使用時には再分散可能な凝集粒子に複合化することができる医薬製剤を簡便且つ低コストで製造することができる。

また、本発明の第９の構成によれば、上記第８の構成の医薬製剤の製造方法において、複合化工程を凍結乾燥によって行うことにより、ナノ粒子の複合化を良好に且つ効率よく行うことができる。

また、本発明の第１０の構成によれば、上記第８の構成の医薬製剤の製造方法において、複合化工程を噴霧乾燥式流動層造粒法によって行うことにより、ナノ粒子が弱く一次凝集した複合粒子を容易に且つ短時間で製造することができる。

また、本発明の第１１の構成によれば、ポリビニルアルコールの水溶液に、少なくとも親水性のペプチドホルモンの溶液と親水性修飾処理された生体適合性高分子を有機溶媒に溶解させた溶液との混合液を加えて、親水性のペプチドホルモンが生体適合性高分子の内部及び外層のいずれにも封入されたペプチドホルモン含有ナノ粒子の懸濁液とし、該懸濁液から有機溶媒を留去して医薬製剤を製造することにより、親水性のペプチドホルモンの封入率を向上させたナノ粒子を、複合化工程を設けずに製造することができる。

また、本発明の第１２の構成によれば、上記第８乃至第１１のいずれかの構成の医薬製剤の製造方法において、ポリビニルアルコール水溶液中のポリビニルアルコール濃度を０．５重量％未満とすることにより、高濃度のポリビニルアルコール水溶液を用いた場合のように、ナノ粒子を遠心分離などで洗浄して余剰のポリビニルアルコールを除去する除去工程が不要となるため、製造時の工程と時間が削減できる。

また、本発明の第１３の構成によれば、上記第８乃至第１２のいずれかの構成の医薬製剤の製造方法において、溶媒留去工程の後に、さらにペプチドホルモン封入ナノ粒子の懸濁液からポリビニルアルコールを除去する除去工程を設けることにより、高濃度のポリビニルアルコール水溶液を用いてナノ粒子を形成した後、余剰のポリビニルアルコールを除去することができ、ナノ粒子中に封入されるペプチドホルモンの封入率を安定させることができる。

また、本発明の第１４の構成によれば、上記第１３の構成の医薬製剤の製造方法において、ポリビニルアルコール水溶液中のポリビニルアルコール濃度を０．１重量％以上１０重量％以下とすることにより、ポリビニルアルコール水溶液の濃度（粘度）を有機溶媒の拡散に対して適切な範囲に維持することができる。

また、本発明の第１５の構成によれば、上記第８乃至第１４のいずれかの構成の医薬製剤の製造方法において、有機溶媒としてアセトンを用いることにより、人体に対する悪影響のおそれの少ない医薬製剤を製造することができ、且つ環境への負荷も低減される。

本発明に用いられるペプチドホルモン封入ナノ粒子は、ペプチドホルモンを生体適合性高分子内に封入して、ナノ単位の大きさの粒子（ナノスフェア）としたものである。このナノ粒子又はナノ粒子から放出されたペプチドホルモン、及びその両方が粘膜を経て血中に到達することができるため、ＤＤＳ製剤の材料として好適に用いることができる。

本発明においては、ナノ粒子の内部のみでなく外層にもペプチドホルモンを封入したことを特徴とする。このような構成により、ナノ粒子内部から徐放的に放出されるペプチドホルモンとは別に、投与直後にナノ粒子の外層から溶け出すペプチドホルモンを作用させることで医薬製剤に即効性と持続性の両方を付与することができる。また、ナノ粒子内部への封入が困難なペプチドホルモンの場合、外層にも封入することでトータルの封入量が増加するため、封入率を高めることができる。

ナノ粒子の外層にペプチドホルモンを封入する方法としては、ナノ粒子を粉末化させる際に再分散可能な凝集粒子（ナノコンポジット）に複合化し、複合化に用いた結合剤を外層としてナノ粒子の表面にさらにペプチドホルモンを付着させる方法が挙げられる。ナノコンポジットの構造を図１に示す。ナノコンポジット１は、生体適合性ナノ粒子２を結合剤３により複合化して成り、ペプチドホルモン４は、ナノ粒子２の内部のみでなく、結合剤３で形成されたナノ粒子２の外層にも封入されている。

ナノ粒子の複合化方法としては、凍結乾燥法、流動層乾燥造粒法または乾式機械的粒子複合化法等が挙げられるが、凍結乾燥法が好適に用いられる。例えば、ペプチドホルモンが水溶性（親水性）の場合、一旦封入されたペプチドホルモンがナノ粒子表面へ漏出すると、周囲に存在する水に再溶解する。この水を系外に除去すると、その分だけペプチドホルモン成分が減少して封入率にばらつきが発生してしまう。そこで、有機または無機の結合剤を再分散可能に複合化させ、ペプチドホルモンの溶解した水を除去せずにそのままナノ粒子と共に凍結乾燥させることが好ましい。このとき、結合剤と共にペプチドホルモンをさらに追加することにより、結合剤で形成される外層中に所定量のペプチドホルモンを封入することができる。

結合剤は、複合化の際にナノ粒子の外層を形成するとともに、ペプチドホルモンの封入率のばらつきを効果的に防止し、且つナノ粒子の取り扱い性を高める作用も兼ね備えている。このような結合剤としては、例えばマンニトール、トレハロース、ソルビトール、エリスリトール、マルチトース、キシリトース等の糖アルコールやショ糖等が挙げられる。

また、流動層乾燥造粒法または乾式機械的粒子複合化法（例えば、メカノフュージョンシステムＡＭＳ（ホソカワミクロン（株）製）を使用して圧縮力および剪断力を加えること）により複合化しても良い。特に、流動層乾燥造粒法の中でも粒子化する材料を含む混合物を流動ガス中に噴霧する噴霧乾燥式流動層造粒法を用いた場合、時間と手間のかかる凍結乾燥工程を省略可能となり、複合粒子を容易に且つ短時間で製造できるため工業化にも有利となる。

噴霧乾燥式流動層造粒法では、具体的には、図２に示すような、噴霧乾燥式流動層造粒・コーティング型の粉体処理装置５を用いることで、複合粒子（ナノコンポジット）を得る。

上記粉体処理装置５は、大略的に、略円筒形状の空間である上方部位と、同じく略円筒形状の空間で上方部位よりも内径の小さい下方部位と、上方部位および下方部位をつなぎ、内径が連続的に変化し、かつ断面が略台形状の中部位との３つの空間が一体化してなる流動層空間６を内部に有するケーシング７、該ケーシング７の最下部に設けられ、上方の流動層空間６に対して液体原料を噴射可能とするスプレーノズル８、流動層空間６の上方部位において、下方側に突出する２つのバッグフィルタ９ａ・９ｂ、図示しない液体原料供給部、および、流動層空間６に乾燥・流動化用エアー（噴霧乾燥のための流動ガス）を供給する、同じく図示しないエアー供給部を備えている。

上記粉体処理装置５では、はじめ何もない流動層空間６内に、液体原料を噴霧することで、粒子の凝集造粒とレイヤーリング造粒との繰り返しにより、顆粒状の粉体を形成することができる。それゆえ、装置構成が簡単で製造プロセスを簡素化できる上に、良質の顆粒を製造できるという利点がある。

本発明では、上記凝集造粒およびレイヤーリング造粒を利用して、内部にペプチドホルモンを封入した生体適合性ナノ粒子およびペプチドホルモンを添加した結合剤としての糖アルコールを分散・懸濁させた液体原料（混合物）を流動層空間６内に噴射して、第１のコンポジット粒子（複合粒子）１０を生成粒子とする。

具体的には、まず、図２の左図に示すように、液体原料供給部から供給された上記液体原料（図中矢印Ｓ）を流動層空間６内に噴射する。噴霧供給された液体原料のスプレーミスト径は数μｍ〜数十μｍ程度と極めて微小な液滴であるため、液体原料は流動層空間６を上昇していく過程で瞬間的に固化されて、第１のコンポジット粒子１０となって、流動層空間６上方のバッグフィルタ９ａ・９ｂに捕集される。

上記バッグフィルタ９ａ・９ｂでは、パルスジェット逆洗方式により、間欠的に第１のコンポジット粒子１０をケーシング７の下方のスプレーゾーン８ａに払い落とす。このスプレーゾーン８ａは、スプレーノズル８から液体原料が噴射される領域であるため、ここで第１のコンポジット粒子１０の表面に液体原料が付着し、凝集しつつ成長して、より大きな第２のコンポジット粒子（複合粒子）１１になる。この過程が凝集造粒である。

また、上記凝集造粒と同時に、より大きく成長した第２のコンポジット粒子１１に対しては、液体原料がその第２のコンポジット粒子１１の表面へ直接付着し、さらに乾燥され固化される。これによって、第２のコンポジット粒子１１はさらに成長する。この過程がレイヤーリング造粒である。このような凝集造粒とレイヤーリング造粒とが継続することで、図２の中図に示すように、第２のコンポジット粒子１１の流動層（図中矢印Ｆ）が流動層空間６内に形成される。

これ以降に供給された液体原料は、ほぼ全てが第２のコンポジット粒子１１の表面に付着して展延し、さらに析出して乾燥される。すなわち、流動層が形成された後はレイヤーリング造粒が進展する。そのため、このレイヤーリング造粒の期間を調節することで、第２のコンポジット粒子１１の球形化と重量の増加とを制御することが可能となり、図２の右図に示すように、最終的に、適度な平均粒径を有する第２のコンポジット粒子１１となる。また、条件によって多孔質の粒子など粒子物性を制御することもできる。また、この部分でパルス的にジェットエアを当てることで、コンポジット粒子群の凝集塊を解砕して粒径コントロールができる。

なお、噴霧乾燥式流動層造粒法においては、結合剤として結晶性の弱い糖アルコールを用いると、複合化の際にアモルファス化してしまい良好に粒子化できなくなる。そのため、結晶性の強いマンニトールを用いることが好ましい。

以上のようにして得られた複合粒子は、使用前まではナノ粒子が集まった取り扱いやすい凝集粒子となっており、使用時に水分に触れることで糖アルコールが溶解し、糖アルコールに保持されていたペプチドホルモンと、ペプチドホルモンを内包したナノ粒子とに復元できる複合粒子となる。

本発明に用いられる生体適合性高分子は、生体への刺激・毒性が低く、生体適合性で、投与後分解して代謝される生体内分解性のものが望ましい。また、内包するペプチドホルモンを持続して徐々に放出する粒子であることが好ましい。このような素材としては、特にポリ乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を好適に用いることができる。ＰＬＧＡは薬物を内包可能であり、当該薬物の効力を保持したまま長期間保存できることが知られている。さらに、生体内の酵素によるＰＬＧＡの分解により、数時間から数十時間単位の徐放ができると考えられる。

ＰＬＧＡの分子量は、５，０００〜２００，０００の範囲内であることが好ましく、１５，０００〜２５，０００の範囲内であることがより好ましい。乳酸とグリコール酸との組成比は１：９９〜９９：１であればよいが、乳酸１に対しグリコール酸０．３３３であることが好ましい。また、乳酸およびグリコール酸の含有量が２５重量％〜６５重量％の範囲内であるＰＬＧＡは、非晶質であり、かつアセトン等の有機溶媒に可溶であるから、好適に使用される。

生体適合性高分子としては、ほかに、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリアスパラギン酸等が挙げられる。また、これらのコポリマーであるアスパラギン酸・乳酸共重合体（ＰＡＬ）やアスパラギン酸・乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＡＬＧ）を用いても良く、アミノ酸のような荷電基あるいは官能基化し得る基を有していてもよい。

上記以外の生体適合性高分子としては、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレンのようなポリアルキレン、ポリプロピレン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテルおよびポリビニルエステルのようなポリビニル化合物、アクリル酸とメタクリル酸とのポリマー、セルロースおよび他の多糖類、ならびにペプチドまたはタンパク質、あるいはそれらのコポリマーまたは混合物が挙げられる。また、ナノ粒子の表面に粘膜付着性を高めるキトサンを複合化したり、リン脂質（レシチン／フォスファチジルコリン）を複合化させてもよい。

また、ＰＬＧＡの表面をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾しておくと、特に親水性のペプチドホルモンとＰＬＧＡとの親和性が向上し、封入が容易になるため好ましい。特に、生体適合性高分子として疎水性ポリマーブロックと親水性ポリマーブロックが結合したブロック共重合体を用いて、親水性ポリマーブロックが粒子表面の外殻部（シェル部）に、疎水性ポリマーブロックが粒子内部（コア部）に位置するコアシェル構造の生体適合性ナノ粒子を形成し、当該シェル部を外層としてペプチドホルモンを封入する方法を用いることもできる。このようなナノ粒子の構造を図３に示す。

生体適合性ナノ粒子２は、疎水性ポリマーブロック１２と、親水性ポリマーブロック１３が結合したブロック共重合体１４が多数凝集して形成されたものであり、貧溶媒として水相を用いた水中エマルジョン法で調製すると、図３に示すように、親水性ポリマーブロック１３が粒子表面に張り出して外殻部（シェル部）１５を形成し、疎水性ポリマーブロック１２は粒子内部（コア部）１６に位置するコアシェル構造を形成する。

親水性ポリマーブロック１３は、水分子を引き付けて保持する能力が高いため、親水性ポリマーブロック１３が張り出したシェル部１５は、貧溶媒中の水分子を引き付けて水和相を形成する。親水性のペプチドホルモン４は、ナノ粒子晶析時に有機溶媒（良溶媒）の拡散に伴い貧溶媒中へと拡散するが、親水性ポリマーブロック１３と相互作用することにより、貧溶媒中への漏出が抑制され、主としてナノ粒子２のシェル部１５での封入が可能になると考えられる。

なお、ペプチドホルモン４の親水性が弱くなると、親水性ポリマーブロック１３との相互作用も弱くなってシェル部１５への封入率が低下するが、反対に疎水性ポリマーブロック１２との相互作用によりコア部１６への封入率が向上するため、ペプチドホルモン４が両親媒性であってもナノ粒子全体として高い封入率が確保される。

従って、従来の球形晶析法では製造が困難であった、親水性のペプチドホルモンの封入率を高めたナノ粒子を簡便且つ低コストで製造することができる。また、ナノ粒子を複合化することなくナノ粒子の外層にペプチドホルモンを封入可能となるため、製造工程も簡素化される。さらに、コアシェル構造を有する図３のナノ粒子を前述した方法で複合化することにより、シェル部１５のさらに外側に形成される結合剤層３（図１参照）にもペプチドホルモン４が封入されるため、ペプチドホルモン４の封入率を一層高めることができる。

なお、貧溶媒として油相を用いた油中エマルジョン法でナノ粒子を調製しても良い。その場合、疎水性ポリマーブロック１２が粒子表面に張り出してシェル部１５を形成し、親水性ポリマーブロック１３はコア部１６に位置する。即ち、図３の構成とは逆のコアシェル構造を有するため、親水性のペプチドホルモン４は主にコア部１６に封入されることとなる。この場合、即効性を高めるためにはナノ粒子２を複合化し、結合剤層３（図１参照）にもペプチドホルモン４を封入しておくことが望ましい。

生体適合性のブロック共重合体１４としては、生体への刺激・毒性が低く、生体適合性で、投与後分解して代謝される生体内分解性のものが望ましい。また、内包するペプチドホルモンを持続して徐々に放出する粒子であることが好ましい。このような素材としては、特に疎水性ポリマーブロック１２がポリ乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）で構成され、親水性ポリマーブロック１３がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で構成されたＰＥＧ−ＰＬＧＡ共重合体を好適に用いることができる。

ナノ粒子に内包されるペプチドホルモンとしては、インスリン、カルシトニン、ガストリン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、オキシトシン、ヴァソプレッシン（抗利尿性ホルモン）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）、成長ホルモン、ソマトスタチン（成長ホルモン分泌抑制ホルモン）、インターフェロン等が挙げられる。

上記ペプチドホルモンの中でも、特に、糖尿病の治療に用いられるインスリンは、後述するように製剤に即効性、持続性を兼備させることで効果が向上することから、ナノ粒子に封入するペプチドホルモンとして好適である。また、骨粗鬆症の予防及び治療薬に用いられるカルシトニンは、従来、ナノ粒子内部への封入が極めて困難であったが、上記方法によってナノ粒子の外層へ封入することにより、高濃度カルシトニン製剤の材料として好適に用いられる。因みに、インスリンは非親水性であり、カルシトニンは親水性が強い。

これらのペプチドホルモンのナノ粒子内部及び外層への封入率が高いほど、製剤中のペプチドホルモンの含有量も高くなるため好ましい。但し、ナノ粒子外層への封入率の増加は、製剤としては即効性の強いものとなり、ナノ粒子内部への封入率の増加は持続性に優れたものとなることから、この即効性と持続性の両者を製剤の剤形や服用場面等に応じてバランス良く備えるようにすべきである。そのため、ナノ粒子内部へのペプチドホルモンの封入率は、生体適合性高分子に対し０．０１重量％以上２０重量％以下が好ましく、０．１重量％以上１０重量％以下が特に好ましい。

また、上記ペプチドホルモンのうち何れか１種のみを封入しても良いが、特に効能や作用機序の異なるペプチドホルモンを複数種封入しておけば、各成分の相乗効果が期待できる。さらに、ペプチドホルモンと共に、例えばビタミン誘導体等の、ペプチドホルモン以外の成分を封入することもできる。

また、ナノ粒子内部及び外層へのペプチドホルモンの封入割合は、ナノ粒子を用いて製造される医薬製剤の作用機序や、要求される即効性、持続性の程度等により適宜設定することができる。即ち、薬剤投与後から血中等の目標部位到達までに時間を要する製剤や、投与後長期間に亘る効果の持続性が要求される製剤の場合は、ナノ粒子内部への封入割合を高くすれば良い。一方、短時間で血中等の目標部位に到達する製剤や、投与直後より効果の発現が要求される製剤の場合は、ナノ粒子の外層への封入割合を高くすれば良い。

ペプチドホルモンの封入割合は、ナノ粒子の複合化に用いられる結合剤を外層として封入する場合は、ナノ粒子形成時に添加するペプチドホルモン量と、結合剤と共に複合化するペプチドホルモン量の調整、或いはナノ粒子を形成する生体適合性高分子の種類により変更可能である。一方、コアシェル構造を有するナノ粒子のシェル部を外層として封入する場合は、シェル部の大きさはブロック共重合体を構成する親水性ポリマーブロックの分子量に依存するため、親水性ポリマーブロックと疎水性ポリマーブロックの分子量をペプチドホルモンの封入割合に応じて選択すれば良い。

本発明に用いられるペプチドホルモン封入ナノ粒子は、１，０００ｎｍ未満の平均粒子径を有するものであれば特に制限はないが、目標部位への到達効率を高めるためには平均粒子径を３００ｎｍ以下とすることが好ましい。一方、前述したようにナノ粒子の粒子径が小さくなるほど封入率も低くなるため、平均粒子径は３０ｎｍ以上とすることが好ましい。

本発明に用いられるペプチドホルモン封入ナノ粒子の製造方法としては、目的の物質を１，０００ｎｍ未満の粒子径を有する粒子に加工することができる方法であれば特に限定されるものではないが、球形晶析法を用いることが非常に好ましい。球形晶析法は、化合物合成の最終プロセスにおける結晶の生成・成長プロセスを制御することで、球状の結晶粒子を設計し、その物性を直接制御して加工することができる方法である。球形晶析法の一つに、エマルジョン溶媒拡散法（ＥＳＤ法）がある。

ＥＳＤ法は、次に示すような原理によって、ナノスフェアを製造する技術である。本法には、薬物を封入する基剤ポリマーとなるＰＬＧＡ等を溶解できる良溶媒と、これとは逆にＰＬＧＡを溶解しない貧溶媒の二種類の溶媒が用いられる。この良溶媒には、ＰＬＧＡ等を溶解し、且つ貧溶媒へ混和するアセトン等を用いる。そして、貧溶媒には、通常、ポリビニルアルコール水溶液等を用いる。

操作手順としては、まず、良溶媒中にＰＬＧＡを溶解後、このＰＬＧＡが析出しないように、薬物溶解液を良溶媒中へ添加混合する。次に、このＰＬＧＡと薬物の混合液を、貧溶媒中に攪拌下、滴下すると、混合液中の良溶媒（アセトン）が貧溶媒中へ急速に拡散移行する。その結果、貧溶媒中で良溶媒の自己乳化が起き、サブミクロンサイズの良溶媒のエマルジョン滴が形成される。さらに、良溶媒と貧溶媒の相互拡散により、エマルジョン内から良溶媒であるアセトンが貧溶媒へと継続的に拡散していくので、エマルジョン滴内のＰＬＧＡ並びに薬物の溶解度が低下し、最終的に、薬物を包含した球形結晶粒子のＰＬＧＡナノスフェアが生成する。

上記球形晶析法では、物理化学的な手法でナノ粒子を形成でき、しかも得られるナノ粒子が略球形であるため、均質なナノ粒子を、触媒や原料化合物の残留といった問題を考慮する必要がなく、容易に形成することができる。その後、良溶媒である有機溶媒を減圧留去し（溶媒留去工程）、ペプチドホルモン封入ナノ粒子粉末を得る。そして、得られた粉末をそのまま、或いは必要に応じて凍結乾燥等により複合化し（複合化工程）、複合粒子とした後、容器内に充填してペプチドホルモン封入ナノ粒子を含む医薬製剤とする。

このようにして製造された医薬製剤は、経肺投与用、皮下及び静脈注射用、或いは経皮、経口投与用等の種々の用途に使用することができる。特に、経肺投与用途に使用した場合、高濃度のペプチドホルモンを含有するため剤形の小型化が可能となり、実用的な経肺投与量を満足できる製剤となる。また、経口投与用途に用いる場合は、外層に封入されたペプチドホルモンが消化酵素による分解を受けにくくなるように、キトサン等の賦形剤を用いて錠剤化するか、カプセル内に充填してカプセル剤とすることが好ましい。

上記球形晶析法で用いられる良溶媒および貧溶媒の種類、並びに液体架橋剤の種類は、目的となる薬物の種類等に応じて決定されるものであり特に限定されるものではないが、ペプチドホルモン封入ナノ粒子は、人体へ直接投与する医薬製剤の原料として用いられるため、人体に対して安全性が高く、且つ環境負荷の少ないものを用いる必要がある。このような貧溶媒としては、例えばポリビニルアルコール水溶液が好適に用いられ、良溶媒としては、例えばアセトンのみ、若しくはアセトンとエタノールの混合液が好適に用いられる。なお、余剰のポリビニルアルコールが残存している場合は、溶媒留去工程の後に、遠心分離等によりポリビニルアルコールを除去する工程（除去工程）が設けられる。

ポリビニルアルコール水溶液の濃度、或いはアセトンとエタノールの混合比や、結晶析出時の条件や機械的剪断力の加え方も特に限定されるものではなく、目的となる薬物の種類や、球形造粒結晶の粒径（本発明の場合ナノオーダー）等に応じて適宜決定すればよいが、ポリビニルアルコール水溶液の濃度が高いほどナノ粒子表面へのポリビニルアルコールの付着が良好となり、乾燥後の水への再分散性が向上する反面、ポリビニルアルコール水溶液の濃度が所定以上になると、貧溶媒の粘度が上昇して良溶媒の拡散性に悪影響を与える。そのため、ポリビニルアルコールの重合度やけん化度によっても異なるが、ナノ粒子形成工程後に除去工程を設ける場合は０．１重量％以上１０重量％以下が好ましく、２％程度がより好ましい。なお、除去工程を設けない場合は０．５重量％以下とすることが好ましい。

なお、本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。以下、本発明のペプチドホルモン封入ナノ粒子を含む医薬製剤の製造方法及び作用効果について、インスリン製剤及びカルシトニン製剤を例に挙げて具体的に説明する。

［インスリン封入ＰＬＧＡナノスフェアの調製法］
インスリン（ウシ由来、ＳＩＧＭＡ製、２８．０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）１００ｍｇを０．０１ｍｏｌ／Ｌの塩酸１８ｍＬに溶解させた。生体適合性高分子である乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ：分子量２０，０００、乳酸／グリコール酸＝７５／２５、Ｔｇ＝４５℃、和光純薬製ＰＬＧＡ７５２０）２ｇをその良溶媒であるアセトン１００ｍＬに溶解してポリマー溶液とした後、前記インスリン−塩酸溶液を添加して混合液とする。次にこの混合液を、貧溶媒として調製した２重量％のポリビニルアルコール（ＰＶＡ：ポバール４０３、クラレ社製）水溶液２５０ｍＬ中に４０℃、４００ｒｐｍで攪拌下、一定速度（４ｍＬ／分）で滴下し、良溶媒の貧溶媒中への拡散によってインスリン封入ＰＬＧＡナノスフェアの懸濁液を得た。

続いて、減圧下アセトンを留去した後、遠心分離操作（遠心加速度４１，０００Ｇ）によりインスリン封入ＰＬＧＡナノスフェアの沈殿を回収し、沈殿を精製水に再懸濁して再度遠心分離操作を行い、過剰のポリビニルアルコールを除去した。上澄みを除去後、−４５℃で凍結乾燥し粉末化して、水への再分散性の良好なインスリン封入ＰＬＧＡナノスフェア粉末を得た。

［インスリン封入ＰＬＧＡナノコンポジット製剤の調製法］
精製水（ｐＨ＝６．８、以下同じ）にトレハロース（林原製）７００ｍｇを溶解させ、さらにインスリン（ウシ由来、ＳＩＧＭＡ製）１２．４ｍｇを懸濁させ５０ｍＬにメスアップした。このインスリン懸濁液を、実施例１で得られたナノスフェア粉末３５０ｍｇを精製水１００ｍＬに再懸濁させた懸濁液中に添加し、均一に混合した後、−４５℃で凍結乾燥して、ナノ粒子の内部及び外層にインスリンが封入された本発明のＰＬＧＡナノコンポジット製剤を得た。

比較例１

実施例２のインスリン懸濁液に代えて、精製水にトレハロース（林原製）７００ｍｇを溶解し５０ｍＬとしたトレハロース水溶液を用い、実施例２と同様の方法によりナノ粒子の内部にのみインスリンが封入されたＰＬＧＡナノコンポジット製剤を得た。

比較例２

実施例１で得られたナノスフェア粉末に代えて、インスリンを封入していないＰＬＧＡナノスフェアを用い、比較例１と同様の方法によりナノ粒子の内部及び外層にインスリンが封入されていないＰＬＧＡナノコンポジット製剤を得た。

［インスリン封入ＰＬＧＡナノコンポジット製剤中のインスリン含有率の評価］
実施例２及び比較例１、２で得られた各ＰＬＧＡナノコンポジット製剤中の組成重量割合を測定した。実施例２及び比較例１、２のナノコンポジット製剤を３０ｍｇずつ秤量し、それぞれ精製水１０．０ｍＬでメスアップしてトレハロースを溶解させた。このとき析出するＰＬＧＡナノスフェア及び外層中のインスリンを遠心分離操作（遠心加速度４１，０００Ｇ、−２０℃、２０分）により固形分として単離した。

次に、実施例２及び比較例１の製剤から単離された固形分にアセトニトリル３．０ｍＬを加えてＰＬＧＡを溶解し、ナノスフェア内のインスリンを漏出させた。漏出したインスリンを０．０１Ｎの塩酸で溶解させつつ１０ｍＬにメスアップし、再析出したＰＬＧＡを遠心分離操作により除去した後、上清２０μＬを高速液体クラマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量して粒子内部及び外層に封入されたインスリン量を測定した。

ここで、比較例１のＨＰＬＣ実測値はＰＬＧＡナノスフェア内部のインスリン含有量と見なすことができ、この値は同一バッチで晶析作製したナノスフェアからなる実施例２のナノスフェア内部のインスリン含有量にも適用できる。従って、実施例２のＨＰＬＣ実測値（内部及び外層のトータル値）と比較例１のＨＰＬＣ実測値（内部値）とを用いて、実施例２のナノコンポジット製剤におけるナノ粒子内部と外層（トータル値−内部値）のインスリン量がそれぞれ算定された。

ＨＰＬＣの操作条件としては、移動相（アセトニトリル／１．２体積％過塩素酸水溶液＝３５／６５）を、４０℃に設定したカラム（日本分光製、Ｆｉｎｅｐａｋ ＳＩＬ３００Ｃ１８Ｔ−５）内を流速１．５ｍＬ／分で流し、検出器（島津製作所製、ＳＰＤ−６ＡＶ）を用いて検出波長２１４ｎｍでインスリンのピークを検出した。結果を表１に示す。

表１から明らかなように、トレハロース水溶液にインスリンを懸濁させた液を用いて複合化した実施例２の製剤では、外層のトレハロースにもインスリンが封入されていた。一方、トレハロース水溶液を用いて複合化した比較例１の製剤では、ＰＬＧＡナノスフェア内部にのみインスリンが封入されていた。なお、実施例２においてはナノスフェアの内部と外層に１：１の割合でインスリンが封入されるようにインスリンの仕込み量を設定したが、晶析及び凍結乾燥プロセスでの各成分のロス等により、内部及び外層へのインスリンの封入割合は約６：４となっていた。

また、いずれのナノコンポジット製剤においてもＰＬＧＡナノスフェアとトレハロースの重量比はほぼ１：２となっていた。こうして調製された略同一剤形サイズの実施例２及び比較例１のナノコンポジット製剤におけるインスリン濃度は、各々０．４１及び０．２５（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）であった。従って、同一ユニットを投与する条件下では、外層にもインスリンを封入した実施例２の製剤は、比較例１に比べて剤形の小型化が可能であることが確認された。

［インスリン封入ＰＬＧＡナノコンポジット製剤の再分散時における粒度分布］
比較例１で得られたＰＬＧＡナノコンポジット製剤を水中へ再分散させた際のＰＬＧＡナノスフェア粒子の粒度分布を動的光散乱法により測定した。結果を図４に示す。図４から明らかなように、再分散したＰＬＧＡナノスフェア粒子の粒子径は１００ｎｍ〜６００ｎｍの範囲に分布しており、平均粒子径は２１５ｎｍであった。なお、同様の方法により実施例２及び比較例２のナノコンポジット製剤を再分散させた際の平均粒子径を測定したところ、それぞれ２１７ｎｍ及び２１０ｎｍであり、粒子径分布についても各製剤で大きな差は認められなかった。

実施例２及び比較例１、２で作製されたＰＬＧＡナノコンポジット製剤を、ヒトと体内動態の類似するビーグル犬に経肺投与し、所定時間毎に血中グルコース濃度の変化を測定した。

なお、ビーグル犬の個体当たりの吸気量が少ないことや、呼吸タイミングの制御ができないことから、製剤粉末の経肺投与は困難であると判断し、ナノコンポジット製剤を少量の生理食塩水に分散させ、超音波ネブライザーによりミスト化したものを気管挿入カテーテルを介してビーグル犬の自発呼吸により肺内へ送達する方法を用いた。ナノコンポジット製剤がドライパウダーとして経肺投与されると、肺内の微量水分を吸収してナノスフェアに再分散されるものと考えられるが、上記の送達方法によれば、予めナノスフェアに再分散させたことになるので、実際に近い評価結果が得られるものと判断した。

また、インスリンは分散溶媒のｐＨにより溶解性や重合度が変化し、投与後の吸収性にも影響を及ぼすと考えられるため、それらの変動を最小限に抑制する目的からｐＨ＝６．０の生理食塩水に各製剤を用時に分散させたところ、ｐＨの変動はほとんど見られないことを確認した。そして、インスリン濃度が一定（０．０５４ｍｇ／ｍＬ）になるように、実施例２及び比較例１の製剤濃度を夫々１．８３ｍｇ／ｍＬ、３．０１ｍｇ／ｍＬにした。

［ナノコンポジット製剤の投与法］
吸入システムの概略図を図５に示す。各製剤の分散液を超音波ネブライザー２０（ＮＥ−Ｕ１７、オムロンヘルスケア製）に仕込み、１．０ｍＬ／分の一定流量でミストを発生させた。このミストを、排気ポンプ２１により１２．０Ｌ／分の気流を流通させたメイン配管２２（帯電防止処理した内径１５ｍｍのテフロン（商標）製ホース）内へ混合させた。メイン配管２２中のミストの一部はビーグル犬の自発呼吸によりバイパス配管２３（帯電防止処理した内径１９ｍｍのポリエチレン製ホース）内へ流れ込み、さらにビーグル犬の気管支に挿入したカテーテル２４（内径８ｍｍの塩化ビニール製低圧カフ付気管内チューブ）を介して肺内まで送達された。

また、ビーグル犬の自発呼吸により圧力変動の少ない安定した吸入を遂行するために、分岐後のメイン配管２２に逆止弁２５を設け、補助エアーを取り込ませて吸入システムの排気量を一定に維持した。一方、ビーグル犬により吸入されなかった余剰ミストは、メイン配管２２に設置した回収トラップ２６及び回収フィルター２７（ガラス繊維フィルターＧＢ−１００Ｒ、アドバンテック東洋製）で捕集した。

インスリンの投与量は、ヒトの臨床治験データ（０．１５ｕｎｉｔｓ／ｋｇ）に基づき、ビーグル犬の平均体重を１０ｋｇとして１．５ｕｎｉｔｓに設定した。上記吸入システムを用いた投与では調剤量の２０％がビーグル犬の肺内に送達されると推定して、実施例２の製剤１８．３ｍｇ、比較例１の製剤３０．１ｍｇに生理食塩水を加えて全量を１０ｍＬとしたものを分散液とした。なお、比較例２については比較例１と同様に、３０．１ｍｇの製剤に生理食塩水を加えて全量を１０ｍＬとした。

また、投与経路による差を評価するための比較対照例として、インスリン５．４ｍｇに生理食塩水を加えて全量を１００ｍＬとしたインスリン懸濁液（ｐＨ＝６．０、インスリン濃度０．０５４ｍｇ／ｍＬ）を皮下注射製剤としてビーグル犬の背部皮下に１ｍＬ（インスリン投与量として０．０５４ｍｇ＝１．５ｕｎｉｔｓ）注射した。ビーグル犬は３匹（雌、１２〜１６ヶ月齢、体重７．２５ｋｇ、１１．１０ｋｇ、１０．１０ｋｇ）使用し、インスリン皮下注射、比較例２、比較例１、実施例２の順に薬剤投与した。なお、各製剤の投与終了後、２週間の休薬期間を設けた。

［血中グルコースレベルの測定］
インスリン製剤の投与及び採血パターンを図６に示す。インスリン製剤の投与２５分前にビーグル犬の橈側皮静脈から１．０ｍＬ採血し、測定された血中グルコース濃度を標準血中グルコース濃度（＝１００）とした。その後、ペントバルビタールナトリウム（ネンブタール、大日本製薬製）を静脈から投与して麻酔し、ビーグル犬（投与前１６〜１８時間から投与後２４時間絶食）を側臥してカテーテルを気管内に挿管して吸入システムと接続した。１０分間ミストを吸入させた後、一定時間毎（投与終了後０．１７、０．５、２、４、８、１２、２４時間）に採血し、遠心分離して得た血清を自動血液分析装置（ＴＢＡ−２００ＦＲ、東芝製）により、酵素法（ＨＫ−Ｇ６ＰＤＨ法）を用いて標準血中グルコース濃度に対する血中グルコース濃度の割合（血中グルコースレベル）を測定した。また、皮下投与についても吸入投与と同条件にて採血し、血中グルコースレベルを測定した。測定結果を図７に示す。

図７から明らかなように、インスリン皮下注射による投与では、インスリンが皮下から速やかに吸収されるため、投与後１０分から血中グルコースレベルの低下が認められ、投与後４時間で初期値の７５％まで低下して作用のピークを迎え、その後投与から８時間経過した時点で作用が消失した。

一方、比較例１及び実施例２のインスリン製剤の吸入による投与では、皮下注射と同様に投与後１０分から血中グルコースレベルが低下した。比較例１の製剤では、投与直後の血中グルコースレベルの低下が皮下注射よりも速く、実施例２の製剤では、即効性は皮下注射とほぼ同等であり、共に皮下注射と同等以上の即効性が認められた。さらに、比較例１及び実施例２のインスリン製剤は１２時間に亘って効果が持続し、共に皮下注射に比べて顕著な持続性が認められた。

特に、投与後３０分から１０時間までの血中グルコースレベルは、皮下注射に比べて変動が少なく安定に推移している。この結果より、インスリンをＰＬＧＡナノスフェア内に封入することにより、肺胞部でのインスリンの徐放化が可能となり、製剤処方の最適化を進めていくことでインスリンの徐放性や基礎インスリンレベルの確立に貢献しうることが示唆された。なお、インスリンを含まない比較例２の製剤の吸入による投与では、血中グルコースレベルの経時的変化はほとんど認められなかった。このことから、ＰＬＧＡナノコンポジット粒子自体の吸入行為、並びに基剤としてのＰＬＧＡナノスフェアが血中グルコース濃度の変動に影響を及ぼさないことが確認された。

［ナノコンポジット製剤のミスト径分布測定］
ビーグル犬が吸入しているミスト径を評価するため、ビーグル犬の吸入試験と同条件下で、吸入システム（図５参照）のカテーテル２４の先端にカスケードインパクター（ＩＴＰ０２−１０５、Ｉｎ Ｔｏｘ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ製）を接続して、上述した各製剤の分散液のミストを発生させ、７段階に分級捕集（吸入流量５００ｍＬ／分、捕集時間５分）した。ミストの捕集にはガラス繊維フィルター（ＧＢ−１００Ｒ、アドバンテック東洋製）を用い、捕集前後の乾燥させたフィルターの重量差から各段階の製剤捕集重量を求め、空気力学的径を評価した。測定結果を表２及び図８に示す。

表２及び図８から明らかなように、気管支に相当する第２ステージ（空気力学的径で４．０μｍ）以降に回収された各製剤のミスト頻度は７４．７〜８７．６％と高い値を示した。また、各製剤の空気力学的平均径は１．５０〜２．５１μｍと微小であり、気管支への送達率については各製剤間で大差はなかった。一方、肺胞に対応する第５ステージ（空気力学的径で１．０５μｍ）以降への到達率は２１．８〜４６．３％であり、肺胞への送達率は比較例１及び２の製剤でほぼ同等であり、実施例２の製剤はそれらの約半分程度の値であった。

この原因としては、実施例２のナノコンポジット製剤においては分散液中の設定製剤濃度が１．８３ｍｇ／ｍＬであるのに対し、比較例１及び比較例２のナノコンポジット製剤においては３．０１ｍｇ／ｍＬであり、設定製剤濃度が１．６４倍高くなっているため、その分だけ分散液中のＰＬＧＡナノスフェアの含有量が多くなり、気液界面の張力を低下させていると推定され、これが気液界面でのより微細なミストの生成に寄与し、肺胞への到達率を高めているものと考えられる。

また、上記の結果を踏まえて実施例５における血中グルコースレベルの低下作用を考察すると、比較例１のナノコンポジット製剤は、血中へインスリンが移行し易い肺胞部へより多く送達されており、そこでＰＬＧＡナノスフェア内部の比較的表面付近に封入されていたインスリンが即効的に溶出し、血中へ速やかに吸収されたものと推定された。他方、実施例２のナノコンポジット製剤は、肺胞以降へ送達されるミストの割合は比較例１に比べ半数程度であるものの、ＰＬＧＡナノスフェアの外層に含浸されていたインスリンがＰＬＧＡナノスフェア表面に吸着され、この吸着インスリンがナノスフェアに同伴されて肺胞部に送達されて即効性に寄与しているものと推定された。

なお、インスリンのＰＬＧＡナノスフェア表面への吸着は、インスリン未封入のＰＬＧＡナノスフェアの生理食塩水懸濁液にインスリンを添加して分散させ、超音波処理した後、遠心分離によりＰＬＧＡナノスフェアを単離し、これを生理食塩水で再分散後、凍結乾燥して得られたナノスフェア粉末を実施例３と同様の方法で処理し、ＨＰＬＣで分析したところ、インスリンが検出されたことから確認された。

［ビーグル犬によるナノコンポジット製剤の吸入量の測定］
ビーグル犬のナノコンポジット製剤の吸入量を評価するため、吸入システム（図５参照）のカテーテル２４に実験動物用人工呼吸器（ＳＮ−４８０−３、シナノ製作所製）をガラス繊維フィルター（ＧＢ−１００Ｒ、アドバンテック東洋製）を介して接続し、吸入システムをビーグル犬の吸入試験と同条件下で運転した。人工呼吸器の運転条件をビーグル犬の麻酔下呼吸回数（１２回／分）及び呼吸量（２０８ｍＬ／回）に設定し、ミストを発生させた。１０分間の模擬吸入運転を実施し、ガラス繊維フィルターによる製剤捕集重量からビーグル犬の推定吸入量を算出したところ、実施例２及び比較例１のナノコンポジット製剤の吸入量は、それぞれ０．０６４ｍｇ／分及び０．１１６ｍｇ／分であった。

［インスリン封入ＰＬＧＡナノコンポジット製剤の薬理効果］
血中グルコース濃度低下作用を示す総面積ＡＡＣ（時間濃度曲線下面積；ここでは図７の折れ線グラフよりも上側で且つ血中グルコースレベル１００より下側部分の面積）を算出し、これをビーグル犬が摂取したインスリン量で除した値（％×時間／ｕｎｉｔｓ）を指標として、実施例２、比較例１のインスリン製剤の吸入投与、及び比較対照例である皮下投与における薬理効果を評価した。なお、各製剤の相対的薬理効果を評価するため、インスリンの皮下投与値を基準（＝１００）として比較した。結果を表３に示す。

実施例７の結果より、実施例２及び比較例１のインスリン製剤の吸入速度は各々０．０６４ｍｇ／分及び０．１１６ｍｇ／分であるため、ビーグル犬が１０分間の吸入試験で摂取した有効インスリン量は、それぞれ０．２６ｕｎｉｔｓ及び０．２９ｕｎｉｔｓであった。図７から求めたＡＡＣ値をこれらのユニット値で除し、さらにインスリン皮下注射の結果を１００として示した相対的薬理効果は、実施例２で３４７、比較例１で３８３となり、いずれも皮下注射の結果を大きく上回った。この原因としては、前述したようにＰＬＧＡナノスフェアが肺胞まで送達され、その滞留時間が延長されることにより、皮下投与法に比べて薬物の徐放効果や酵素分解の抑制効果が顕著に現れるためと考えられる。

また、実施例２のインスリン製剤は、比較例１に比べてＰＬＧＡナノスフェア含有量が少ないにも係わらず比較例１とほぼ同等の薬理効果を示した。これは、実施例６のミスト径分布の評価結果から、実施例２のインスリン製剤では比較例１に比べてＰＬＧＡナノスフェア粒子が肺胞に到達する頻度は小さいものの、気管支に相当する第２ステージ以降の到達頻度は同等であるため、ＰＬＧＡナノスフェアの外層中に含浸されたインスリンが分散液中でやや大きなミストとなって飛翔し、気管支や細気管支に沈着するものと考えられる。

これらの部位は、肺胞に比べて吸収速度は遅いと考えられるが、インスリンの到達作用部位が比較例１に比べて拡大されるため、広範囲の組織部位から血中に移行することにより薬理効果が向上したものと推定される。さらに、実施例２のインスリン製剤ではＰＬＧＡナノスフェアの外層中にインスリンを高い含量で配合できるので、高い薬理効果を備えるとともに比較例１に比べ剤形の小型化が可能となり、臨床試験への応用において実用的な経肺投与量を実現する有用な粒子設計法となる。

［カルシトニン封入ＰＬＧＡナノスフェアの調製法］
カルシトニン（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）２５０ｍｇをメタノール５０ｍＬに溶解させた。生体適合性高分子である乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ：和光純薬製ＰＬＧＡ７５２０）５ｇをアセトン１００ｍＬに溶解した後、前記カルシトニンのメタノール溶液を添加、混合した。この混合液を、貧溶媒として調製した２重量％のポリビニルアルコール（ＰＶＡ：クラレ社製）水溶液５００ｍＬ中に４０℃、４００ｒｐｍで攪拌下、一定速度（４ｍＬ／分）で滴下し、良溶媒の貧溶媒中への拡散によってカルシトニン封入ＰＬＧＡナノスフェアの懸濁液を得た。

続いて、減圧下４０℃、１００ｒｐｍで攪拌を続け、２時間有機溶媒を留去した後、遠心分離操作（２０，０００ｒｐｍ、−２０℃、２０分）によりカルシトニン封入ＰＬＧＡナノスフェア表面の余剰ＰＶＡを除去し、上澄みを除去後、沈殿を回収した。沈殿を精製水に再懸濁して再度遠心分離操作を行い過剰のポリビニルアルコールを除去した。上澄みを除去し、得られた沈殿を精製水１５０ｍＬに再懸濁した後、−４５℃で一日間凍結乾燥し粉末化して、水への再分散性の良好なカルシトニン封入ＰＬＧＡナノスフェア粉末を得た。

［カルシトニン封入ＰＬＧＡナノコンポジット製剤の調製法］
精製水１５０ｍＬにトレハロース（林原製）１．４ｇを溶解させ、さらにカルシトニン（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）１．４ｍｇを溶解させた。このカルシトニン溶解液を、実施例９で得られたナノスフェア粉末７００ｍｇを精製水１００ｍＬに再懸濁させた懸濁液中に添加し、均一に混合した後、−４５℃で一晩凍結乾燥して、ナノ粒子の内部及び外層にカルシトニンが封入された本発明のＰＬＧＡナノコンポジット製剤を得た。

精製水１５０ｍＬにトレハロース（林原製）１．４ｇを溶解させ、さらにカルシトニン（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）２．８ｍｇを溶解させたカルシトニン溶解液を用い、実施例１０と同様の方法によりナノ粒子の内部及び外層にカルシトニンが封入された本発明のＰＬＧＡナノコンポジット製剤を得た。

精製水１５０ｍＬにトレハロース（林原製）１．４ｇを溶解させ、さらにカルシトニン（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）４．２ｍｇを溶解させたカルシトニン溶解液を用い、実施例１０と同様の方法によりナノ粒子の内部及び外層にカルシトニンが封入された本発明のＰＬＧＡナノコンポジット製剤を得た。

比較例３

実施例１０のカルシトニン溶解液に代えて、精製水１５０ｍＬにトレハロース（林原製）１．４ｇを溶解したトレハロース水溶液を用い、実施例１０と同様の方法によりナノ粒子の内部にのみカルシトニンが封入されたＰＬＧＡナノコンポジット製剤を得た。

［カルシトニン封入ＰＬＧＡナノコンポジット製剤の再分散時における粒度分布及びカルシトニン含有率の評価］
実施例１０〜１２、及び比較例３で得られたナノコンポジット製剤を水中に再分散し、実施例４と同様に動的光散乱法により平均粒子径を測定したところ、いずれの製剤も２１５ｎｍ〜２３０ｎｍの範囲であり、粒子径分布についても各製剤で大きな差は認められなかった。また、ＨＰＬＣを用いて実施例３と同様の手順で各製剤のカルシトニン含有率を定量した。各製剤におけるＰＬＧＡナノスフェア、外層（トレハロース）及び内部及び外層に含有されるカルシトニンの重量割合、並びに各製剤中のカルシトニン量（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）を表４に示す。

表４から明らかなように、各製剤におけるカルトニンの重量割合は、実施例１０〜１２及び比較例３の順に、各々０．２０重量％、０．２６重量％、０．３３重量％、０．１３重量％であった。トレハロース水溶液にカルシトニンを溶解させた液を用いて複合化した実施例１０〜１２の製剤では、外層のトレハロースにもカルシトニンが封入されていた。一方、トレハロース水溶液を用いて複合化した比較例３の製剤では、ＰＬＧＡナノスフェア内部にのみカルシトニンが封入されていた。なお、実施例１０〜１２においてはナノスフェアの内部と外層に２：１、１：１、及び２：３の割合でカルシトニンが封入されるようにカルシトニンの仕込み量を設定しており、実際の封入割合もほぼ理論値と一致していた。

また、いずれのナノコンポジット製剤においてもＰＬＧＡナノスフェアとトレハロースの重量比はほぼ１：２となっていた。こうして調製された実施例１０〜１２及び比較例３のナノコンポジット製剤におけるカルシトニン濃度は、各々１４．０、１８．６２、２３．２６、及び９．３２（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）であった。従って、同一ユニットのカルシトニンを投与する条件下では、外層にもカルシトニンを封入した実施例１０〜１２の製剤は、比較例３に比べて実施例１０〜１２の順に剤形が小型化できることになる。

［カルシトニン封入ＰＬＧＡナノコンポジット製剤の薬理効果］
実施例１０〜１２及び比較例３で調製したカルシトニン封入ＰＬＧＡナノコンポジット製剤の薬理効果をラットにより評価した。評価手順を以下に示す。
１）投与３時間前にラットの気管および頸静脈を露出させた。
２）投与０．５時間前に採血し、この血中カルシウム濃度を基準（＝１００）とした。
３）気管支に７号カニューレを挿入し、その先に、実施例１０〜１２及び比較例３で調製したナノコンポジット製剤を、カルシトニンの投与量がラットの体重（ｋｇ）あたり１００ｕｎｉｔｓになるように充填したチューブを取り付けた。このチューブに三方活栓を取り付け、さらにシリンジを取り付けた。シリンジ内に空気を入れ、これを圧縮した後、三方活栓を解放することによって、ナノコンポジット粒子をラットの肺内に投与した。
４）投与後、０．５、１、２、４、８、１２、２４時間ごとに採血した。各血液は遠心分離し、得られた血清中のカルシウム濃度を、自動血液分析装置を用いて測定した。標準血中カルシウム濃度に対する各時間の血中カルシウム濃度の割合（血中カルシウムレベル）を算出した。
結果を図９に示す。

外層にカルシトニンを含有しない比較例３の製剤を投与した場合、血中カルシウムレベルは投与後４時間まで徐々に低下したのに対し、外層にカルシトニンを含浸させた実施例１０〜１２の製剤は、投与後０．５〜２時間のうちに即効的な作用が認められた。これは外層のカルシトニンが吸収効率の高い肺胞からより即効的に吸収されたためであると考察した。

また、持続性については、比較例３の製剤では投与後１２時間に亘って血中カルシウムレベル低下作用が観察され、実施例１０〜１１の製剤も比較例３と同程度の持続性が確認されたのに対し、実施例１２の製剤では投与後８時間で投与前と同程度の血中カルシウム濃度に戻った。これは、カルシトニンを内包したナノスフェア量が多いほど、カルシトニンが酵素分解を受けにくく、かつ吸収部位に十分長く留まったＰＬＧＡナノスフェアが加水分解により内包するカルシトニンを長時間に亘って徐々に放出し、血中に吸収されたためであると考察した。また、比較例３の製剤の薬理効果（ＡＡＣ；時間濃度曲線下面積）を１００としたとき、各製剤の相対的な薬理効果は、実施例１０〜１２の順に各々８５、７０、４５となった。

以上の結果から、ナノスフェアに内包したカルシトニンと外層のカルシトニンの配合割合を１：０．５乃至１：１に粒子設計した実施例１０及び１１の製剤は、外層にカルシトニンを含浸していない比較例３の製剤と比較して、同程度の即効性と持続性を兼ね備えることが実証されたことより、剤形の小型化にも有利な粒子設計であることが示唆された。

ペプチドホルモン封入ナノ粒子を含む本発明の医薬製剤は、ナノ粒子の外層に封入されたペプチドホルモンにより即効性を高め、且つナノ粒子の内部に封入されたペプチドホルモンにより持続性を高めることができるため、即効性と持続性のバランスのとれた医薬製剤を提供できる。また、ナノ粒子の内部に加えて外層にもペプチドホルモンが封入されるため、製剤中のペプチドホルモン含量を高めて剤形の小型化が可能となる。特に、ペプチドホルモンとして、糖尿病の治療薬であるインスリンや、骨粗鬆症の治療薬であるカルシトニンを用いた経肺投与製剤に好適である。

また、ナノ粒子を形成する材料として、生体への刺激・毒性が低く、投与後分解して代謝される生体適合性高分子を用いるので、人体への安全性を確保するとともに、ペプチドホルモンの効力を保持したまま長期間保存でき、さらに生体適合性高分子の分解によりペプチドホルモンの徐放が可能となる。特に、生体適合性高分子としてＰＧＡ、ＰＬＡ、若しくはＰＬＧＡを用いた場合に好適である。

また、結合剤を用いてペプチドホルモン含有ナノ粒子を複合化しておけば、簡便な方法でナノ粒子の外層にペプチドホルモンを封入可能となる。さらに、容器への充填時に取り扱いが容易で使用時には再分散可能な凝集粒子となる。特に、結合剤として糖アルコールを用いた場合、複合化されたナノ粒子の分散性、耐熱性が向上するとともに、一旦ナノ粒子内に封入されたペプチドホルモンの粒子表面への再漏出を防止できる。

また、球形晶析法を用いてナノ粒子を形成する本発明の医薬製剤の製造方法は、ペプチドホルモンの溶液と生体適合性高分子の有機溶媒溶液の混合液を加えるポリビニルアルコール水溶液の濃度を０．５重量％以下とすることで、高濃度のポリビニルアルコール水溶液を用いた場合のように、ナノ粒子を遠心分離などでの洗浄が不要となるため手間と時間が削減でき、製造面で有利となる。

一方、高濃度のポリビニルアルコール水溶液を用いてナノ粒子を形成した後、ナノ粒子を遠心分離などで洗浄して余剰のポリビニルアルコールを除去する工程を設けた場合、ナノ粒子中に封入されるペプチドホルモンの封入率を安定化することができる。このとき、ポリビニルアルコール水溶液の濃度を０．１重量％以上１０重量％以下とすることで、貧溶媒の粘度を良溶媒の拡散に影響を与えない程度に抑えることができる。

また、人体や環境への影響の少ないアセトン、エタノールなどを良溶媒として用いたので、人体へ直接投与する医薬製剤の原料として安全性の高いものとなる。また、複合化工程を凍結乾燥或いは噴霧乾燥式流動層造粒法により行うこととすれば、ナノ粒子の複合化を良好に且つ効率よく行うことができる。

は、本発明の医薬製剤に用いられるペプチドホルモン含有ナノコンポジットの構造を示す模式図である。 は、噴霧乾燥式流動層造粒法によるナノ粒子の複合化工程の一例を示す模式図である。 は、コアシェル構造を有するペプチドホルモン含有ナノ粒子の構造を示す模式図である。 は、実施例４において、ＰＬＧＡナノコンポジット製剤を水中へ再分散させた際のＰＬＧＡナノスフェア粒子の粒度分布を動的光散乱法により測定した結果を示すグラフである。 は、ナノコンポジット製剤の分散液をミスト化したものをビーグル犬の自発呼吸により肺内へ送達する吸入システムの概略図である。 は、実施例５におけるインスリン製剤の投与及び採血パターンを示す図である。 は、実施例５における血中グルコースレベルの測定結果を示すグラフである。 は、実施例６において、ビーグル犬の吸入するミストの空気力学的径を測定した結果を示すグラフである。 は、実施例１４における血中カルシウムレベルの測定結果を示すグラフである。

符号の説明

１ ナノコンポジット
２ 生体適合性ナノ粒子（ナノスフェア）
３ 結合剤（外層）
４ ペプチドホルモン
５ 粉体処理装置
６ 流動層空間
８ スプレーノズル
８ａ スプレーゾーン
９ａ バッグフィルタ
９ｂ バックフィルタ
１０ コンポジット粒子
１１ コンポジット粒子
１２ 疎水性ポリマーブロック
１３ 親水性ポリマーブロック
１４ ブロック共重合体
１５ シェル部
１６ コア部
２０ 超音波ネブライザー
２１ 排気ポンプ
２２ メイン配管
２３ バイパス配管
２４ カテーテル
２５ 逆止弁
２６ 回収トラップ
２７ 回収フィルター

Claims (15)

1. 生体適合性ナノ粒子の内部及び該粒子の外層にペプチドホルモンを封入して成るペプチドホルモン封入ナノ粒子を含む医薬製剤。
2. 前記ペプチドホルモンが、インスリンであることを特徴とする請求項１に記載の医薬製剤。
3. 前記ペプチドホルモンが、カルシトニンであることを特徴とする請求項１に記載の医薬製剤。
4. 前記生体適合性ナノ粒子を構成する生体適合性高分子が、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、若しくは乳酸・グリコール酸共重合体のいずれかであることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の医薬製剤。
5. 前記ペプチドホルモンを内部に封入した前記生体適合性ナノ粒子が結合剤によって複合化されるとともに、当該結合剤を外層としてペプチドホルモンを封入したことを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の医薬製剤。
6. 前記結合剤が糖アルコールであることを特徴とする請求項５に記載のインスリン製剤。
7. 経肺投与用途に使用されることを特徴とする請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の医薬製剤。
8. ポリビニルアルコール水溶液に、少なくともペプチドホルモンの溶液と生体適合性高分子を有機溶媒に溶解させた溶液との混合液を加えて、前記ペプチドホルモンが前記生体適合性高分子の内部に封入されたペプチドホルモン封入ナノ粒子の懸濁液を生成するナノ粒子形成工程と、
   前記ペプチドホルモン封入ナノ粒子の懸濁液から前記有機溶媒を留去する溶媒留去工程と、
   前記有機溶媒が留去された前記ペプチドホルモン含有ナノ粒子を前記ペプチドホルモンが含まれた結合剤によって複合化する複合化工程と、
   を有することを特徴とする医薬製剤の製造方法。
9. 前記複合化工程が凍結乾燥により行われることを特徴とする請求項８に記載の医薬製剤の製造方法。
10. 前記複合化工程が噴霧乾燥式流動層造粒法により行われることを特徴とする請求項８に記載の医薬製剤の製造方法。
11. ポリビニルアルコールの水溶液に、少なくとも親水性のペプチドホルモンの溶液と親水性修飾処理された生体適合性高分子を有機溶媒に溶解させた溶液との混合液を加えて、前記親水性のペプチドホルモンが前記生体適合性高分子の内部及び外層のいずれにも封入されたペプチドホルモン含有ナノ粒子の懸濁液を生成するナノ粒子形成工程と、
    前記ペプチドホルモン含有ナノ粒子の懸濁液から前記有機溶媒を留去する溶媒留去工程と、
    を含むことを特徴とする医薬製剤の製造方法。
12. 前記ポリビニルアルコール水溶液中のポリビニルアルコール濃度が０．５重量％未満であることを特徴とする請求項８乃至請求項１１のいずれか１項に記載の医薬製剤の製造方法。
13. 前記溶媒留去工程の後に、さらに前記ペプチドホルモン封入ナノ粒子の懸濁液からポリビニルアルコールを除去する除去工程を有することを特徴とする請求項８乃至請求項１２のいずれか１項に記載の医薬製剤の製造方法。
14. 前記ポリビニルアルコール水溶液中のポリビニルアルコール濃度が０．１重量％以上１０重量％以下であることを特徴とする請求項１３に記載の医薬製剤の製造方法。
15. 前記有機溶媒が少なくともアセトンを含むことを特徴とする請求項８乃至請求項１４のいずれか１項に記載の医薬製剤の製造方法。

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