JP2007049997A - 増殖因子に対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明には、セレックス法により同定される、TGFβ1とPDGFに対する特異的RNAおよびssDNAリガンドが含まれる。本発明にはまた、セレックス法により同定される、hKGFに対する特異的RNAリガンドが含まれる。さらに本発明には、TGFβ1とhKGFのその受容体との相互作用を阻害するRNAリガンド、およびPDGFとその受容体との相互作用を阻害するDNAリガンドが含まれる。
【選択図】なし
Description
トランスフォーミング増殖因子−β(TGFβ)ポリペプチドは、多くの細胞型において増殖、分化、および遺伝子発現に影響を及ぼす。性状解析されたこのファミリーの第1のポリペプチドであるTGFβ1は、共有結合している2つの同一の112アミノ酸サブユニットを有する。TGFβ1は、非常に保存されたタンパク質であり、ヒト型をマウス型から区別しているのはわずか1個のアミノ酸である。TGFβ遺伝子ファミリーには哺乳動物において発現される2つの他のメンバーがある。TGFβ2はTGFβ1と71%相同である(デ・マーティン(de Martin)ら,(1987)EMBO J.6:3673−3677)が、一方TGFβ3はTGFβ1と80%相同である(デリンク(Derynck)ら,(1988)EMBO J.7:3737−3743)。核磁気共鳴により測定されるTGFβ1の構造的特徴(アーチャー(Archer)ら,(1933)Biochemistry32:1164−1171)は、TGFβ2の結晶構造に一致している(ダオピン(Daopin)ら,(1992)Science 257:369−374;シュラネッガーとグルッター(Schlunegger and Grutter),(1992)Nature 358:430−434)。
血小板由来増殖因子(PDGF)は、もともと血小板溶解物から単離され、血清には存在するが血漿には存在しない主要な増殖促進活性として同定された。2つの相同的なPDGFアイソホームのPDGF AおよびBが同定されたが、これらは、別の遺伝子(染色体7および22上)によりコードされている。血小板からの最も豊富な分子種は、ABヘテロダイマーであるが、3つ全ての可能なダイマー(AA、ABおよびBB)が天然に存在する。翻訳後、PDGFダイマーはプロセシングを受けて約30kDaの分泌タンパク質になる。高親和性でPDGFに結合する2つの細胞表面タンパク質、aおよびβが同定された(ヘルディン(Heldin)ら,Proc.Natl.Acad.Sci.78:3664(1981);ウィリアムズ(Williams)ら,Proc.Natl.Acad.Sci.79:5867(1981))。両方の種とも、5つの免疫グロブリン様の細胞外ドメイン、単一の膜通過ドメインおよびキナーゼ挿入ドメインにより分離された細胞内チロシンキナーゼドメインを含有する。機能性の高親和性受容体はダイマーであり、PDGFによる受容体の細胞外ドメインの連動によりいくつかのチロシン残基の交差リン酸化(1つの受容体のチロシンキナーゼがダイマー中のもう一方をリン酸化する)が起こる。受容体リン酸化により、核への細胞分裂促進性または走化性のシグナルの変換に至るカスケード現象が起こる。例えば、PDGFβ受容体の細胞内ドメインにおいて、リン酸化されると、ホスホリパーゼC−g、ホスファチジルイノシトール3’−キナーゼ、GTPase−活性化タンパク質、およびShc、Grb2およびNckのようないくつかのアダプター分子を含む、異なるsrc−相同性2(SH2)ドメイン含有タンパク質と相互作用する9つのチロシン残基が同定されている(ヘルディン(Heldin),Cell,80:213(1995))。最近数年間に、3つの受容体ダイマー(aa、aβ、およびββ)に対する3つのPDGFアイソホームの特異性が解明されている。a−受容体ホモダイマーは、3つ全てのPDGFアイソホームに高親和性で結合し、β−受容体ホモダイマーは、PDGF BBのみに高親和性で結合してPDGF ABには約10倍低い親和性で結合し、そしてaβ−受容体ヘテロダイマーは、PDGF BBおよびPDGF ABに高親和性で結合する(ウェスターマークとヘルディン(Westermark and Heldin),Acta Oncologica,32:101(1993))。これらの特異性のパターンは、A−鎖がa−受容体のみに、そしてB−鎖がaおよびβ−受容体サブユニットの両方に高親和性で結合する能力から生じる。
a)hKGFの生化学的性質
ヒトケラチン細胞増殖因子(hKGF)は、小さな(26−28KD)塩基性のヘパリン結合増殖因子であり、FGFファミリーの一員である。hKGFは、比較的新規に同定された分子であり、これはFGF−7としても知られている(フィンチ(Finch)ら,(1989)Science 244:752−755)。これは、上皮細胞に特異的な増殖因子であり(ルービン(Rubin)ら,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:802−806)、その主な機能は、発生/形態形成(ワーナー(Werner)ら,(1994)Science 266:819−822)および創傷治癒(ワーナー(Werner)ら,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6896−6900)におけるものである。インビボのhKGFの主要な供給源は、間質繊維芽細胞である(フィンチ(Finch)ら,(1989)Science 244:752−755)。微小血管(microvascular)内皮細胞(スモラ(Smola)ら,(1993)J.Cell Biol.122:417−429)、およびごく最近になって、活性化上皮内gdT細胞(ボイスメニュ(Boismenu)ら,(1994)Science 266:1253−1255)もhKGFを合成することが証明された。hKGF発現は、創傷内で促進されている(ワーナー(Werner)ら,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6896−6900)。いくつかのサイトカインが、hKGF誘導物質であること(ブラウクル(Brauchle)ら,(1994)Oncogene 9:3199−3204)、そしてIL−1が最も強力であること(ブラウクル(Brauchle)ら,(1994)Oncogene 9:3199−3204;チェディッド(Chedid)ら,(1994)J.Biol.Chem.269:10753−10757)が証明された。bFGFとは異なり、hKGFは、シグナルペプチドを持っており、このため、産生細胞から分泌される(フィンチ(Finch)ら,(1989)Science 244:752−755)。hKGFは大腸菌(E.coli)内で過剰発現させることができ、組換えタンパク質(〜19−21KD)は生物学的に活性である(ロン(Ron)ら,(1993)J.Biol.Chem.268:2984−2988)。大腸菌由来の組換えタンパク質は、天然のタンパク質よりも10倍細胞分裂促進性である(ロン(Ron)ら,(1993)J.Biol.Chem.268:2984−2988)。この差は、グリコシル化のためでろう。天然タンパク質は、強力なAsnグリコシル化部位を有する(ロン(Ron)ら,(1993)J.Biol.Chem.268:2984−2988)。
組換えhKGF分子は、1993年から利用可能になったばかりである。したがって、ヒト疾患におけるhKGFの役割に関する情報は限られている。しかし発表された文献は、少なくとも2つのヒトの疾患、すなわち、乾癬と癌におけるhKGFの役割を強く示唆する証拠を含んでいる。hKGFは、炎症性腸疾患にも関与している(ピー・フィンチ(P.Finch)、私信)。
乾癬は、皮膚炎症と共に、表皮の過増殖とケラチン細胞の不完全分化を特徴とする(エイベル(Abel)ら,(1994)Scientific American Medicine III−1〜III−18;グリーブス(Greaves)ら,(1995)N Eng J Medicine332:581−588)、衰弱性の皮膚障害である(グリーブス(Greaves)ら,(1995)N Eng J Medicine 332:581−588)。未だ乾癬に対する有効な治療法はない(匿名,(1993)Drug & Market Development 4:89−101;エイベル(Abel)ら,(1994)Scientific American MedicineIII−1〜III−18;グリーブス(Greaves)ら,(1995)N Eng J Medicine 332:581−588)。乾癬は、スカンジナビアにおいて最も発病率が高く人口の0.5〜2.8パーセントに起こる。1992年に米国では、乾癬に罹患した4〜8百万人が、そのどれもが非常に有効というものはない種々の薬剤および関連治療のために約6百万ドルを費やしたと推定された。この支出の大部分は、1年の治療に1,000〜1,500ドルを費やす重症乾癬の患者約400,000名により行われた。毎年約200,000の新規症例がある。
増殖因子および増殖因子のhKGFおよび/またはその受容体の発現の制御解除が、いくつかのヒト癌におけるトランスフォーメーション事象であると予測されることは、文献上十分に確立されている。hKGF系のトランスフォーミング能力は、インビトロで証明されている(ミキ(Miki)ら,(1991)Science 251:72−75)。別の研究において、癌細胞株は、hKGF受容体を発現し、かつaFGFではなくhKGFに応答し、一方肉腫細胞株は、hKGF受容体を発現せず、hKGFではなくaFGFに応答することが見い出された(イシイ(Ishii)ら,(1994)Cancer Res 54:518−522)。
いくつかの分化不全の胃癌は、K−samと呼ばれる増幅遺伝子を有するが、これはhKGF−受容体のアイソホームである(カトー(Katoh)ら,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2960−2964)。hKGFをラットにインビボで投与すると、膵管上皮細胞(イー(Yi)ら,(1994)Am J Pathol 145:80−85)、肝細胞、および消化管全体の上皮細胞の増殖が引き起こされる(ホウスリー(Housley)ら,(1994)J Clin Invest94:1764−1777)。
hKGFをラットに投与すると、肺癌の気管支肺胞細胞の一種に類似したII型肺細胞(pneumocyte)過形成が起こる(ウーリッチ(Ulich)ら,(1994)J Clin Invest 93:1298−1306)。
インビボで、hKGFは、乳管拡張および暴発性上皮過形成を引き起こし、これらは両方とも乳癌の共通の特徴である(ウーリッチ(Ulich)ら,(1994)Am J Pathol 144:862−868;イー(Yi)ら,(1994)Am J Pathol 145:1015−1022)。しかし、授乳ラットの乳管上皮は、hKGFの増殖促進作用に抵抗性であり、このことは、妊娠中の女性は乳癌に対する罹病性が低下し、乳牛はほとんど乳癌ができないという疫学的観察に関して重要である(クズマ(Kuzma),1977,乳房の病気(Breast in Pathology),モスビー社(Mosby Co.))。乳癌へのhKGFの関与を支持する別の証拠がある。hKGF mRNAは、健常なヒト乳房組織および試験した乳癌試料15個中12個において近年検出されている(クーズ(Koos)ら,(1993)J Steroid Biochem Molec Biol 45:217−225)。乳癌におけるhKGF mRNAの存在を、hKGFが、非腫瘍性乳腺に存在するという観察、およびhKGFが、乳房上皮の暴発性増殖を引き起こすという観察と関連させて考えると、これは、hKGFが、健常および腫瘍性の乳房上皮の増殖の制御において重要なオートクリンまたはパラクリン増殖因子であることを示唆している(ウーリッチ(Ulich)ら,(1994)Am J Pathol 144:862−868)。浸潤性導管腺癌は、癌への防御的宿主応答を表すと言われている繊維形成性間質により特徴的に囲まれている(ウーリッチ(Ulich)ら,(1994)Am J Pathol 144:862−868)。hKGFは、間質由来であるため、繊維形成性間質は腫瘍の増殖を阻害するよりもこれに寄与する可能性が高い。
前立腺腫瘍に及ぼすアンドロゲンの増殖促進作用は、アンドロゲンが前立腺間質細胞におけるhKGFの発現を誘導するため、hKGFにより媒介されると考えられる(ヤン(Yan)ら,(1992)Mol Endo 6:2123−2128)。インビボでアンドロゲン依存性である前立腺腫瘍は、インビトロではアンドロゲン非依存性であるが、hKGF依存性である(ヤン(Yan)ら,(1992)Mol Endo 6:2123−2128)。アンドロゲンにより支配されるプロセスである、hKGFが、精嚢発生中の上皮誘導において機能するという観察は、アンドロメジン(andromedin)としてのhKGFの役割に一致している(アラリド(Alarid)ら,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:1074−1078)。さらには、hKGFは、アンドロゲン受容体の異常な活性化を引き起こし、このため恐らく前立腺癌におけるアンドロゲン除去療法の失敗に寄与している(クリグ(Culig)ら,(1994)Cancer Res.54:5474−5478)。この情報に基づき、遺伝子改変により、hKGFをアンドロゲン制御から解放し、こうしてアンドロゲン依存性腫瘍をアンドロゲン非依存性の非常に悪性の腫瘍に変換させることが可能である。このような腫瘍はなお、hKGFがアンドロゲン受容体の異常な活性化も引き起こすため、アンドロゲンに制御されるマーカーのPSAを発現することが可能であろう。また、hKGFは、老人男性の一般的な健康問題である良性前立腺肥大(BPH)の原因である可能性が高い。
現在までに、モノクローナル抗体および短鎖hKGF−受容体由来ペプチド(25量体)がhKGF競合物質として報告されている(ボッタロ(Bottaro)ら,(1993)J.Biol.Chem.268:9180−9183)。1G4と呼ばれるモノクローナル抗体は、hKGFに対して200pMのKdを有する。この短鎖ペプチドは、ヒト受容体を発現するNIH/3T3細胞の細胞表面へのhKGF結合を約1〜5μMのKiで阻害する。ボッタロ(Bottaro)ら(WO94/25057)は、hKGFとその受容体との間の結合を阻害するhKGF−受容体ペプチドを提供している。また、hKGF受容体が介在する細胞増殖を阻害する能力について試験化合物を評価する方法も提供している。
アンタゴニストを使用する、増殖因子およびリンホカインのこれらの細胞表面受容体との相互作用の阻止は、疾患治療の1つのアプローチである。このようなアンタゴニストの発見には、受容体−増殖因子またはリンホカイン相互作用の生化学的測定法が利用可能であることが必要である。古典的な測定法は、放射標識した増殖因子またはリンホカイン(トレーサー)のその細胞表面受容体への競合阻害である。これらの型の測定法は、表面に関連する受容体を発現する細胞株を利用して、種々の濃度のアンタゴニスト候補の存在下で細胞結合トレーサーの量を測定する。さらに、他の測定法は、関連する受容体を発現する細胞株からの膜抽出物を利用して、トレーサー結合に続いてフィルター結合を行う(ネンクエスト薬剤発見システム(Nenquest Drug Discovery System):ヒト腫瘍壊死因子−アルファ、エヌイーエヌリサーチプロダクツ(NEN Research Products)、イーアイデュポンデニモアーズ社(E.I.DePont de Nemours & Co.(Inc.))、ボストン、マサチューセッツ州を参照のこと)か、または膜抽出物を固相支持体上に固定化する(アーダル(Urdal)ら,(1988)J.Biol.Chem.263:2870−2877;スミス(Smith)ら,(1991)Bioch Bioph Res Comm 176:335−342)。受容体が誘導したトレーサーの電気泳動移動度シフトを適用して、受容体をトレーサーに架橋して、次に変性ゲル上で解析することにより、細胞表面受容体の存在およびサイズを同定した(例えば、クル(Kull)ら,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5756−5760;ホーマン(Hohmann)ら,(1989)J.Biol.Chem.264:14927−14934;スタウバー(Stauber)ら,(1989)L.Biol.Chem.264:3573−3576を参照のこと)。未変性ゲルおよび非架橋複合体の使用は増殖因子またはリンホカインおよびこれらの受容体について記載されていないが、核酸タンパク質相互作用の検討に広く適用されている(サムブルーク(Sambrook)ら,(1989)分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),コールドスプリングハーバーラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory),コールドスプリングハーバー,ニューヨーク州)。
標的分子に対して高特異性結合を有する核酸分子のインビトロでの進化方法が開発されている。この指数的濃縮によるリガンドの系統的進化(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)(セレックス(SELEX)と呼ばれる)方法は、現在は放棄されている米国特許出願第07/536、428号(標題「指数的濃縮によるリガンドの系統的進化」)、1991年6月10日出願の米国特許出願第07/714,131号(標題「核酸リガンド」)、1992年8月17日出願の米国特許出願第07/931,473号(標題「核酸リガンド」(現在、米国特許第5,270,163号、PCT/US91/04078号も参照)に記載されており、この各々は本明細書に具体的に引用される。これらの各出願は本明細書においてまとめてセレックス(SELEX)特許出願と呼び、任意の所望の標的分子に対して核酸リガンドを作成するための基本的に新規な方法を記載している。
本例は、例2〜4で使用され導入される一般的方法を提供する。
このセレックス法で使用されるヒト組換えTGFβ1は、ジェネンテク(Genentech)から得た。ヒト組換えTGFβ1はまた、アールアンドディーシステムズ(R & D Systems)(ミネアポリス、ミネソタ州、米国)から購入した。
TGFβ1に結合するセレックスリガンドは、基本的に米国特許第5,270,163号(ツエルクとゴールド(Tuerk and Gold)(1990)Science 249:505−510)に記載の方法により得た。PCR鋳型の出発プールを作成するために、それぞれ16.1pmolの精製していない単一の標準的DNA(少なくとも全部で2×1012〜2×1013の異なる分子)を含有する20の別個のPCR反応物を、最初の転写の前にプールした。PCR条件は、シリコーン化マイクロ遠心管中、50mM KCl、10mMトリス−塩酸(pH9)、0.1%トリトンX−100、1.5mM MgCl2、0.2mMずつのdATP、dCTP、dGTP、およびdTTP、2μMずつのプライマー、および100μlの0.075U/mlのTaqDNAポリメラーゼであった。すべてのPCRサイクルは、アンプリワックス(Ampliwax)(パークアンドエルマー(Perk and Elmer)、ノーウォーク(Norwalk)、コネチカット州、米国)を用いる、ホットスタートを利用した。最初のPCRは10サイクル持続した:PCRサイクルは、94℃−1分、52℃−1分、72℃−2分であった。最初の変性は、94℃で4分であり、最後の伸長は72℃で5分であった。PCR反応物を合わせ、フェノール/クロロホルムで抽出し、イソプロパノールで沈殿(2.0M酢酸アンモニウム、50%イソプロパノール)させて、プライマーを除去した。
2.5pmolのビオチン化TGFβ1を、200μlのKRHT中の30μl SAアガロースビーズ(ピアス(Pierce))に結合させた。混合物を37℃で15〜30分インキュベートした。ベクターに、遠心分離と200μlの冷KRHTへの再懸濁を3回行って、非結合TGFβ1を除去し、最終容量500μlのKRHTに再懸濁した。2’−NH2ピリミジンを含有するRNAを70℃で3分間加熱し(2’−OHまたは2’−Fピリミジンを含有するRNAは95℃で加熱した)、SAビーズに結合したTGFβ1を含有するKRHT中に希釈した。RNAの最終濃度は1μMであり、TGFβ1は5nMであった。37℃で30分間回転させて結合を起こす。ビーズを200μlの結合緩衝液で3回遠心分離と再懸濁を行って、非結合RNAを除去する。前述のようにビーズからRNAを溶出した。
TGFβ1に対するリガンドについての2つの測定法は、いつも同等の結果を与えた。SAビーズ測定法では、ビオチン化TGFβ1をポリエチレン試験管(リンブロ(Linbro)、アイシーエヌ(ICN)、アービン(Irvine)、カリホルニア州、米国)中でKRHTで連続希釈し、前述のようにビーズに結合させた。非結合TGFβ1を洗い流した後、各試験管に微量の32P標識RNA(<0.1nM)を加え、ボルテックス混合した。37℃で30分間静止インキュベート後、非結合RNAを200μlのKRHTで3回洗浄して除去した。
セレックス実験は、表2に記載する。セレックス実験1と2からのプライマーは、制限エンドヌクレアーゼSacI(5’プライマーT7SacBam;配列番号7)とXbaI(3’プライマー3XH;配列番号9)の認識部位を含有する。セレックス実験1と2からのPCR産物は、SacI/XbaI消化したpGem9zf(プロメガ(Promega))中に方向をそろえてクローン化した。5’プライマーT7SB2N(配列番号8)と3’プライマー3XH(配列番号9)は、セレックス実験3〜9に使用した。セレックス実験3〜9からのPCR産物は、修飾したpGem9zf:BamHIクローニングベクターのBamHI/XbaI部位に方向をそろえてクローン化した。BamHI部位を、以下のようにしてpGem9zf中に作成した。TGFβ1(配列は示していない)に結合しなかったライブラリー2(lib2−6−2)から単離したクローンを、BamHIとXbaIで消化した。修飾pGem9zfベクターのクローニング部位に隣接する配列を、表1に示す(配列番号10〜11)。
TGFβ1へのRNAリガンドの高親和性結合に必要な最小配列を決定するために、トランケーション(truncation)実験を行った。3’境界の決定のために、T4ポリヌクレオチドキナーゼを使用して5’末端をγ−32P−ATPで標識した。5’境界は、α−32P−pCpとT4 RNAリガーゼを用いて、3’末端標識リガンドで確立した。部分的アルカリ加水分解後、放射能標識RNAリガンドを、1nM〜50nM濃度のTGFβ1とインキュベートし、タンパク質結合RNAをニトロセルロース分離法により分離した。RNAトランケートを、高分解能変性ポリアクリルアミドゲルで解析した。G−残基で終止する放射能標識リガンドのラダーを、部分的RNaseT1消化で作成し、マーカーとして使用した。
TGFβ1シグナル導入は、細胞表面受容体への結合で始まり、種々の遺伝子の転写が導入される。これらの遺伝子の1つが、Pai1である。TGFβ1測定法は、Pai1プロモーターに融合したルシフェラーゼレポーター遺伝子を有するミンク肺上皮細胞(MLEC)を利用する。MLECはその細胞表面にTGFβ1を有する。すなわち、一定の誘導時間後ルシフェラーゼ酵素活性を測定することにより、TGFβ1に対する細胞の応答および培地中のTGFβ1の有効濃度を測定できる。
(A.セレックス実験)
TGFβ1に対するRNAリガンドを作成するために、例1に記載の方法を使用して、9つのセレックス実験(表2に要約)を行った。表1に示すように、RNAプールは、分子の中心部分に存在するランダム塩基の数が異なる:40N6(配列番号2)セレックス中の40ヌクレオチド、および64N6とlib2−6−1RN6(配列番号1,3)セレックス実験中の64ヌクレオチド。目標はTGFβ1に結合するだけでなく受容体結合を阻止するRNAリガンドを選択することであったため、大きなランダム領域(64N)を選択した。2つの実験で、短いランダム領域(40N)も含めた。TGFβ1に対するリガンドは40Nではまれであり、定性的には選択した64N6リガンドと同じであった。
セレックスライブラリー中の多くのクローンは、配列が同じかまたは似ている。ライブラリーをGトラックによりスクリーニングし、各Gトラック型の代表的のもののみを結合測定法で試験した。結合測定法は5点(16.5nM、5.5nM、1.8nM、0.6nM、および0.2nM)であり、Kdが10nMより小さいセレックスクローンのみが検出できた。結合測定法で良好に(Kd<10nM)結合したRNAリガンドのみを配列決定した。配列は肉眼で検査し、核酸配列を整列させて折り畳んで2次構造の領域を予測させるコンピュータープログラムを使用して解析した。配列相同性によりリガンドを5群(A,B、C、D、およびオーファン)に分類した。各群は特徴的な可能な2’置換を有した。
A群リガンドについて表4に記載のKdとBmaxは、特に明記しない場合はリガンドの2’−NH2置換したものについてのものである。A群リガンドのBmaxは0.38±0.12(n=14)であり、これはニトロセルロースフィルター上の測定されたTGFβ1の保持に一致する。A群ライブラリーのKdはすべて似ており、2.2±1.1nM(n=14)であった。測定した場合、ニトロセルロースとSAアガロースビーズ結合測定法は同等の結果を与えた。
結合に必要なヌクレオチドを決定するために、多くのTGFβ1リガンドについてトランケーション実験を行った。A群リガンドのlib3−13(配列番号12)とlib8−9(配列番号16)の端を切り取り、一貫した結果を得た。断片lib3−13−79はTGFβ1に結合し、従ってlib3−13中のヌクレオチド3’〜ヌクレオチド79までのいずれも結合には必須ではない。同様にヌクレオチド5’〜38のすべてが欠失されても、残りの断片lib3−13−(38−123)はまだTGFβ1に結合することができる。5’境界は配列lib6−23(配列番号21)に一致し、これはlib3−13(配列番号25)のヌクレオチド19〜36に対応する欠失を有するが、TGFβ1に結合する。A群クローンのすべての高親和性結合決定基は、ランダム領域内にあり、42ヌクレオチド断片lib3−13−(38−79)に対応するかも知れない。A群の多くのリガンドは、lib3−13−(72−81)に対応する領域中の予測された必須の結合ドメイン内の欠失または置換を有する。lib4−32中の欠失と置換は、lib3−13のヌクレオチド80に対応する3’境界には影響を及ぼさない。すなわち、3’境界はおそらく正しく、ヌクレオチド配列72〜81の変化は、結合に必要な核酸構造を大きく変化させることはないものである。しかし、この領域の突然変異(顕著にはヌクレオチド72)は、前述のようにTGFβ1受容体結合を阻止するリガンドの能力を変化させるかも知れない。
好適な実施態様において、40個のランダム位置(40N)を有する縮重ライブラリーから、TGFβ1に対する特異的高親和性を有するRNAおよびDNAリガンドを探すため、第2のセットのセレックス実験を行った。本例は、例6で使用し導入した一般的方法を示す。
M−MLVスーパースクリプト逆転写酵素は、ギブコビーアールエル(GibcoBRL)(ゲーサーズバーグ(Gaithersburg)、メリーランド州)から購入した。T7 RNAポリメラーゼは、ネクスター・ファーマシューチカルズ社(NeXsdar Pharmaceutical,Inc.)(ボールダー(Boulder)、コロラド州、米国)の標準的方法に従って精製した。TaqDNAポリメラーゼ(アンプリタク(Amplitaq))は、パーキンエルマー/シータス(Perkin Elmer/Cetus)、リッチモンド、カリホルニア州)から得た。T4ポリヌクレオチドキナーゼ、DNAポリメラーゼ(クレノウ断片)、およびアルカリ性ホスファターゼは、ニューイングランドバイオラボズ社(New England Biolabs,Inc.)(ビバリー(Bevery)、マサチューセッツ州)から購入した。2’−アミノ置換ヌクレオチド三リン酸であるアミノ−UTPおよびアミノ−CTPは、ネクスター・ファーマシューチカルズ社(NeXsdar Pharmaceutical,Inc.)(ボールダー(Boulder)、コロラド州)の標準的方法に従って合成した。この実験で使用した他の試薬は、入手できる最も高品質のものである。
RNAは、2本鎖DNAオリゴヌクレオチドおよびT7 RNAポリメラーゼを使用して、インビトロ転写により合成した。DNAオリゴヌクレオチド(表5)は、オペロン社(Operon INc.)、アラメダ(Alameda)、カリホルニア州)から購入し、6%分取用ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。PCR増幅は、50mM KCl、10mMトリス−塩酸(pH8.6)、2.5mM MgCl2、170mg/ml BSA、およびdNTP(各1mM)中で行った。TaqDNAポリメラーゼは、0.1ml反応物当たり100単位で使用し、5’プライマーおよび3’プライマーは、1mMで存在した。転写は、40mM NaCl、10mMジチオスレイトール、50mMトリス−酢酸(pH8.0)、8mM酢酸マグネシウム、2mMスペルミジン、および2mM NTP中で行った。T7 RNAポリメラーゼは1U/mlで存在した。反応物は28℃で16時間インキュベートし、次に20単位のDNAseIで37℃で10分間処理した。反応物は半分量の添加緩衝液(93%ホルムアミド、10mM EDTA、pH8.0)を加えて停止させ、95℃で3分間加熱した後、6%ポリアクリルアミド/8M尿素変性ゲルで電気泳動した。RNA転写体をUVシャドーイングで可視化し、ゲルから切り出し、TE緩衝液(10mMトリス−酢酸(pH8.0)、2mM EDTA)に溶出した。RNA転写体をエタノール沈殿させ、真空下で乾燥し、蒸留水に再溶解した。RNAの濃度ならびに1本鎖DNAの濃度は、A260を測定し、1A260単位は、それぞれ40mg/mlと33mg/mlと仮定して定量した。
TGFβ1に結合するセレックスリガンドは、基本的に米国特許第5,270,163号(ツエルクとゴールド(Tuerk and Gold)(1990)Science 249:505−510も参照)に記載の方法により、表5に記載のオリゴヌクレオチド(配列番号43〜54)を使用して得た。DNA鋳型は、混合ヌクレオチドDNA合成により作成した40ヌクレオチド(40N)可変配列、ならびに鋳型の増幅に必要な5’および3’固定配列を含有した。オリゴヌクレオチド40N7(配列番号43)と40N8(配列番号49)の5’固定配列はまた、T7 RNAポリメラーゼプロモーターを含有した。最初のラウンドのRNAセレックスのためのRNAは、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片を用いて1本鎖DNA鋳型40N7と40N8上でプライマー伸長して作成した2本鎖DNA鋳型から転写した。RNAセレックスは、15ラウンドまでのRNA合成、標的への結合、結合と非結合RNAのニトロセルロース濾過による分離、cDNA合成、および2本鎖DNA鋳型を再生するためのPCR増幅から構成された。RNAプールによる標的への結合は、結合緩衝液A(120mM NaCl、2.5mM KCl、0.12mM MgSO4、40mMヘペス、20mM NaH2PO4/Na2HPO4、pH7.4、0.01%HSA)中で37℃で少なくとも10分間行った後濾過した。これに対して、1本鎖DNAセレックスの最初のラウンドは、合成法で合成したオリゴヌクレオチド40D7と40D8を直接用いて行った。セレックスは、25ラウンドの標的への結合、結合と非結合1本鎖DNAのニトロセルロース濾過による分離、2本鎖DNA集団を再生するためのPCR増幅、および次のラウンドのセレックスのための1本鎖DNAを精製するための分取用ポリアクリルアミドゲル電気泳動から構成された。1本鎖DNAプールへの標的の結合は、結合緩衝液B(150mM NaCl、10mMトリス−酢酸(pH7.5)、0.001%BSA)中で37℃で少なくとも15分間行った後濾過した。RNAおよびDNAレパートリーの放射能標識は、10mlの容量中の5ピコモルの核酸、2単位のT4 ポリヌクレオチドキナーゼ、および6mlの[γ32P]ATP(800Ci/mmol)を37℃で30分間インキュベートして行った。各ラウンドのセレックス実験の核酸の濃度は、1500nMと1nMの間で変動し、標的TGF−β1の濃度は150nMと0.03nMの間で変動した。
核酸レパートリーのクローニングは、PCR増幅によりRNAレパートリーから作成した2本鎖DNAを用いて、ツエルクとゴールド(Tuerk and Gold)(1990)Science 249:505−510の方法により行った。PCR増幅したDNAを、制限酵素SphIとHindIIIで消化し、pGEM内の適合する部に結合させた。結合プラスミドを大腸菌(E.coli)内に形質転換し、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルβ−D−ガラクトシド、イソプロピルチオガラクトシドと100mg/mlアンピシリンを含有するLB寒天上に蒔いた。β−ガラクトシダーゼを発現しないコロニーを解析した。DNAの配列決定は、サンガー(Sanger)ら(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463−5467のジデオキシヌクレオチド法を使用して、ツエルクとゴールド(Tuerk and Gold)(1990)が記載したように行った。プラスミドは、アルカリ分解ミニプレップ法(マニアティス(Maniatis)ら(1982)モレキュラークローニング、実験室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)、ニューヨーク州)により、大腸菌(E.coli)から単離した。DNAを、50mMトリス−塩酸(pH8.3)、60mM NaCl、6mM 酢酸マグネシウム、および1mM DTT中で0.4mM dNTPと0.2mMのジデオキシ−NTPと、48℃で20分間インキュベートした。DNAポリメラーゼは、反応物中4単位で存在した。添加緩衝液10mlを加えて95℃に3分間加熱して反応を停止し、次に6%ポリアクリルアミド/8M尿素変性ゲルでゲル電気泳動を行った。Gトラック配列決定は既に記載したように行い、これは異なる配列のリガンドのクローン化ライブラリーを迅速にスクリーニングするための便利な方法である。簡単に説明すると、Gトラックスクリーニング反応物は、50mMトリス−塩酸(pH8.3)、60mM NaCl、6mM酢酸マグネシウム、および1mM DTTを、0.4mM dNTP、0.2mMのジデオキシ−NTP、および4単位のDNAポリメラーゼとともに含有した。反応を48℃で20分間行い、10μlの添加緩衝液を加えて95℃に3分間加熱して反応を停止し、次に6%ポリアクリルアミド/8M尿素変性ゲルでゲル電気泳動を行った。
TGFーB1の40D7 DNAライブラリーの結合解析は、図1に示す。ラウンド19(三角)とラウンド0(丸)から得た結合データを示す。実験は、核酸(1nM未満)と結合緩衝液(150mM NaCl、10mMトリス−酢酸(pH8.2)、0.001%BSA)中で記載した濃度のTGFーb1を、0.1ml容量中で37℃で15分間インキュベートして行った。試料をニトロセルロースで濾過し、直ちに3mlのTE緩衝液(10mMトリス−酢酸(pH8.0)、0.1mM EDTA)を加えた。ニトロセルロースフィルターに保持された放射能標識物と結合反応に加えた総放射能標識物の量から、結合した放射能標識のパーセントを計算した。結果は、40D7ライブラリーの見かけのKdは1nMであり、出発プールの見かけのKdは30nMであることを示す。すなわち、40D7ライブラリーは、約3倍の結合の上昇を示す。
本例は、PDGFに対する核酸リガンドの進化のために例8〜15で使用し導入した一般的方法を示す。
組換えヒトPDGF−AA(分子量=29,000)、PDGF−AB(分子量=27,000)およびPDGF−BB(分子量=25,000)は、アールアンドディーシステムズ(R & D Systems)(ミネアポリス、ミネソタ州、米国)から、凍結乾燥型で担体タンパク質のない形で購入した。すべての3つのアイソフォームは、成熟ヒトPDGF A−鎖の長い型(ベトショルツ(Betsholtz 9ら,(1986)Nature 320:695−699)およびヒトPDGF B−鎖の天然に存在する成熟型(ジョンソン(Johnsson)ら,(1984)EMBO J.3:921−928)の配列に基づく合成遺伝子から、大腸菌(E.coli)中で産生した。ランダム化されたDNAライブラリー、PCRプライマー、およびDNAリガンドと5’−ヨード−2’−デオキシウリジン置換DNAリガンドは、ネクスター・ファーマシューチカルズ社(NeXsdar Pharmaceutical,Inc.)(ボールダー(Boulder)、コロラド州)またはオペロン・テクノロジーズ(Operon Technologies)(アラメダ(Alameda)、カリホルニア州)により、標準的固相ホスホラミダイト(phosphoramidites)法(シンハ(Sinha)ら,(1984)Nucleic Acids Res.12:4539−4557)を使用して合成した。
セレックス法の基本的な特徴は、セレックス特許出願に(またツエルクとゴールド(Tuerk and Gold)(1990)Science 249:505;ジェリネック(Jellinek)ら,Biochemistry,33;10450(1994);ジェリネック(Jellinek)ら,Proc.Natl.Acad.Sci.,90:11227(1993))に詳細に記載されており、これらは参考のため本明細書に引用される。不変配列のプライマーアニーリング領域(表7;配列番号90)が隣接する、連続的なランダム化された40ヌクレオチド濃縮領域を含有する初期のssDNAライブラリーは、4つのホスホラミダイト等モル混合物を使用する固相ホスホラミダイト法によりランダム化された位置を作成して合成した。ssDNAライブラリーを、8%ポリアクリルアミド/7M尿素ゲルで電気泳動して精製した。全長DNAに対応するバンドをUV光で可視化し、ゲルから切り出し、粉砕および浸漬方法で溶出し、エタノール沈殿させ、遠心分離してペレットにした。ペレットを真空下で乾燥し、1mM MgCl2を補足したリン酸緩衝化生理食塩水(PBSM=10.1mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4、137mM NaClおよび2.7mM KCl、1mM MgCl2、pH7.4)緩衝液に再懸濁した。タンパク質とインキュベートする前に、ssDNAをPBSM中で90℃で2分間加熱し、氷上で冷却した。約500pmol(3×1014分子)の5’32P末端標識ランダムssDNAをPDGF−ABと結合緩衝液(0.01%ヒト血清アルブミン(HSA)を含有するPBSM)中でインキュベートして、最初の選択を開始した。混合物を4℃で一晩インキュベートし、次に37℃で短時間(15分間)インキュベートした。8%ポリアクリルアミドゲル(1:30ビスアクリルアミド:アクリルアミド)で4℃で5V/cmで、2mM EDTAを含有する89mMトリス−ホウ酸(pH8.3)を泳動緩衝液として使用して電気泳動して、PDGF−ABに結合したDNAを、非結合DNAから分離した。遊離ssDNAの電気泳動度の約半分で泳動するPDGF−ssDNA複合体に対応するバンドを、オートラジオグラフィーで可視化し、ゲルから切り出し、粉砕および浸漬方法で溶出した。次の親和性選択で、ssDNAをPDGF−ABと37℃で15分間結合緩衝液中でインキュベートし、PDGF結合ssDNAを、既に記載されているように(グリーン(Green)ら,(1995)Chemistry and Biology 2,683−695)ニトロセルロース濾過により、非結合DNAから分離した。すべての親和性選択したssDNAプールをPCRで増幅し、ここでDNAは、50mM KCl、7.5mM MgCl2、0.05mg/mlウシ血清アルブミン、1mMデオキシヌクレオチド三リン酸、5μMプライマー(表7)および0.1単位/μl Taqポリメラーゼを含有する10mMトリス−塩酸(pH8.4)中で、12〜20回の熱サイクリング(93℃で30秒、52℃で10秒、72℃で60秒)を行った。5’PCRプライマーをポリヌクレオチドキナーゼと[γ−32P]ATPで5’末端標識し、3’プライマーは、ビオチンホスホラミダイト(グレンリサーチ(Glen Research)、スターリング(Sterling),バージニア州)を使用してビオチン化した。PCR増幅後、ビオチン化プライマーに対して10倍モル過剰で、精製されていないPCR反応混合物にストレプトアビジン(ピアス(Pierce)、ロックフォード(Rockford),イリノイ州)を加えて、室温で15分間インキュベートした。等量の停止溶液(90%ホルムアミド、1%ドデシル硫酸ナトリウム、0.025%ブロモフェノールブルー、およびキシレンシアノール)を加え、室温で20分間インキュベートしてdsDNAを変性させた。放射能標識した鎖を、12%ポリアクリルアミド/7M尿素ゲルで電気泳動して、放射能標識した鎖をストレプトアビジン結合ビオチン化鎖から分離した。速く泳動する放射能標識(非ビオチン化)ssDNA鎖をゲルから切り出し、前述のように回収した。ssDNAの量は、33μg/ml/吸収単位の吸光係数を用いて260nmでの吸収から推定した(サムブルーク(Sambrook)ら(1989)モレキュラークローニング、実験室マニュアル、第2版、第3巻、コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor))。
セレックスラウンド12からの増幅された親和性濃縮したプールを、12%ポリアクリルアミドゲルで精製し、大腸菌(E.coli)のJM109株中のHindIIIとPstI部位の間にクローン化した(サムブルーク(Sambrook)ら(1989)モレキュラークローニング、実験室マニュアル、第2版、第3巻、コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor))。各クローンを、アルカリ溶解法によりプラスミドを調製するのに使用した。前進配列決定プライマーとシーケナーゼ2.0(アマシャム(Amersham)、アーリントンハイツ(Arlington Heights)、イリノイ州)を使用して製造業者のプロトコールに従って、プラスミドを挿入領域で配列決定した。
種々の濃度のPDGFへの低濃度のssDNAリガンドの結合は、既に記載されているニトロセルロースフィルター結合法により測定した(グリーン(Green)ら,(1995)Chemistry and Biology 2,683−695)。PDGFストック溶液の濃度(PBS中)は、280nmでの吸光度から、アミノ酸配列から計算したe280値(エス・シー・ギルとピー・エィチ・フォン・ヒペル(Gill,S.C.,and von Hippel,P.H.)(1989)Anal.Biochem. 182:319−326):PDGF−AAは19,500M−1cm−1、PDGF−ABは15,700M−1cm−1、PDGF−BBは11,800M−1cm−1)に従って求めた。すべての結合実験のssDNAは、8%(>80ヌクレオチド)または12%(<40ヌクレオチド)ポリアクリルアミド/7M尿素ゲルで電気泳動して精製した。すべてのssDNAリガンドを90℃で結合緩衝液中で高希釈(約1nM)で2分間加熱し、氷で冷却して、タンパク質溶液にさらに希釈した。結合混合物は典型的には37℃で15分間インキュベートしてから、ニトロセルロースフィルターで分離した。
3’末端から連続的に端を切り取った5’末端標識DNAリガンド集団を作成するために、DNAリガンド鋳型(端を切り取ったプライマー5N2、表7;配列番号92)の3’不変配列領域に相補的なプライマーを、[γ−32P]−ATPとT4 ポリヌクレオチドキナーゼを用いて5’末端で標識し、鋳型にアニーリングし、そしてシーケナーゼ(アマシャム(Amersham)、アーリントンハイツ(Arlington Heights)、イリノイ州)と4つのdNTPとddNTPの混合物で伸長した。結合緩衝液中で37℃で15分間インキュベート後、PDGF−ABに対する高親和性を保持するこの集団の断片を、ニトロセルロースフィルター分離により、弱い親和性を有するものから分離した。親和性選択の前後の、8%ポリアクリルアミド/7M尿素ゲルによる断片の電気泳動分離は、3’境界の決定を可能にする。5’末端から連続的に端を切り取った3’末端標識DNAリガンド集団を作成するために、DNAリガンドを、[γ−32P]−コルディセピン−5’−三リン酸(ニューイングランドヌクレア(New England Nuclear)、ボストン、マサチューセッツ州)とT4 RNAリガーゼ(プロメガ(Promega)、マジソン、ウィスコンシン州)3’末端で標識し、ATPとT4 ポリヌクレオチドキナーゼを用いて5’末端でリン酸化し、そしてラムダエキソヌクレアーゼ(ギブコビーアールエル(GibcoBRL)(ゲーサーズバーグ(Gaithersburg)、メリーランド州)で部分的に消化した。7mMグリシン−KOH(pH9.4)、2.5mM MgCl2、1μg/ml BSA、15μg tRNA、および4単位のラムダエキソヌクレアーゼを有する100μl容量中で、37℃で15分間10ピコモルの3’標識リガンドの部分的消化を行った。5’境界を、3’境界に記載の方法と類似の方法で決定した。
最小DNAリガンドの融解プロフィールは、ケリー(Cary)モデル1E分光光度計で得た。オリゴヌクレオチド(320〜400nM)をPBS、PBSM、または1mM EDTAを含有するPBS中で95℃で加熱し、室温に冷却してから融解プロフィール測定を行う。試料を1℃/分の速度で15から95℃に加熱し、0.1℃毎に吸光度を測定して融解プロフィールを作成した。プロッティングプログラムであるカレイダグラフ(Kaleidagraph)(シネジ・ソフトウェア(Synergy Software)、リーディング(Reading)、ペンシルバニア州)を用いて、データ点の一次導関数を計算した。一次導関数値は、各側の27個のデータ点で各点を平均する55点平滑化関数を用いて、平滑化した。平滑化一次導関数曲線のピークを用いて、Tm値を推定した。
チミジンの5’−ヨード−2’−デオキシウリジンによる単一のまたは複数の置換を有するDNAリガンドを、固相ホスホラミダイト法を使用して合成した。架橋する能力について試験するために、微量の5’32P末端標識リガンドを、結合緩衝液中でPDGF−AB(100nM)と37℃で15分間インキュベートした後照射した。結合混合物を、サーモスタットで37℃に温度を維持した1cm長のキュベットに移し、XeCl荷電ルモニクス(Lumonics)モデルEX748エキシマレーザーを使用して、20Hzで308nmで25〜400秒照射した。焦点のエネルギーは175ミリジュール/パルスで、キュベットを収束レンズの焦点の24cm上に置いた。照射後、アリコートを、0.1%SDSを含有する等量のホルムアミド添加緩衝液と混合し、95℃で5分間インキュベート後、8%ポリアクリルアミド/7M尿素ゲルで遊離リガンドから架橋PDGF/リガンド複合体を分離した。
PDGF α−またはβ−受容体でトランスフェクションしたブタ大動脈内皮(PAE)細胞への125I−PDGF−AAおよび125I−PDGF−BBの結合を、前記したように行った(ヘルディン(Heldin)ら,(1988)EMBO J.7,1387−1394)。異なる濃度のDNAリガンドを、1mg/ml のウシ血清アルブミンを補足した0.2mlのリン酸緩衝化生理食塩水中で125I−PDGF−AA(2ng、100,000cpm)または125I−PDGF−BB(2ng、100,000cpm)とともに、細胞培養物(1.5cm3)に加えた。4℃で90分インキュベート後、細胞培養物を洗浄し、細胞に結合した放射能をガンマカウンターで測定した(ヘルディン(Heldin)ら,(1988)EMBO J.7,1387−1394)。
20ng/mlのPDGF−BBまたは10%胎児牛血清に応答してかつ消化ベクター濃度のDNAリガンドの存在下で、PDGFβ−受容体を発現するPAE細胞への[3H]チミジン取り込みを、既に記載されているように行った(モリ(Mori)ら,(1991)J.Biol.Chem.266,21158−21164)。37℃で24時間インキュベート後、DNAに取り込まれた3H−放射能をβカウンターを使用して測定した。
40個の連続的な位置でランダム化された1本鎖DNA(表7;配列番号90)の約3×1014分子(500pmol)のライブラリーから、セレックス法によりPDGF−ABに対する高親和性DNAリガンドを同定した。最初のラウンドでポリアクリルアミドゲル電気泳動により、そして以後のラウンドでニトロセルロースフィルター結合により、PDGF結合DNAを非結合DNAから分離した。12ラウンドのセレックス後、親和性が濃縮されたプールは見かけの解離定数(Kd)約50pMでPDGF−ABに結合した(データは示していない)。これは、初期のランダム化されたDNAライブラリーに比較して約700倍の親和性の改善である。この親和性の濃縮されたプールを使用してクローニングライブラリーを作成し、ここでから39個の単離体を配列決定した。これらのリガンドの32はユニークな配列を有した(表8;配列番号93〜124)。最小配列決定を行ったリガンドには、クローン番号の隣に星印(*)を付けた。最小リガンドとして高親和性結合を保持することがわかったクローン番号は、斜体で書いてある。表8に示すすべてのリガンドは、ニトロセルロースフィルター結合法を用いて、PDGF ABに結合する能力について試験した。この群から最適のリガンドを同定するために、PDGF−ABに結合した5’32P末端標識リガンドの割合を、タンパク質濃度の範囲にわたって測定することにより、PDGF−ABへの相対的親和性を測定した。高親和性でPDGF−ABに結合するリガンドについては、PDGF−BBとPDGF−AAについての親和性も調べた。すべての場合で、PDGF−ABとPDGF−BBに対するリガンドの親和性は同等であり、PDGF−AAはかなり低かった(データは示していない)。
PDGF−ABに対する6つの最適のリガンドについて、高親和性結合に必要な最小の配列を決定した。一般的に3’および5’最小配列境界の情報は、核酸リガンドを部分的に断片化し、次に標的に対する高親和性を保持する断片を選択することにより得られる。RNAリガンドでは、断片は穏やかなアルカリ加水分解により作成される(ツエルク(Tuerk)ら,J.Mol.Biol.213:749−761;ジェリネック(Jellinek)ら,Biochemistry,33;10450(1994);ジェリネック(Jellinek)ら,(1995)Biochemistry,34:11363−11372;グリーン(Green)ら,(1995)J.Mol.Biol.247:60−68)。DNAは塩基に対してより耐性であり、DNAについて断片を作成するための別の方法が必要である。3’境界を決定するために、ジデオキシ配列決定法を使用してDNAリガンドの3’不変配列にアニーリングした5’末端標識プライマーを伸長して、3’末端で連続的に端を切り取ったリガンド断片の集団を作成した。この集団をニトロセルロースフィルターにより親和性選択し、PDGF−ABへの高親和性結合を保持している最も短い断片(3’末端から端を切り取った)をポリアクリルアミドゲル電気泳動により同定した。5’境界も同様に決定したが、5’末端で連続的に端を切り取った3’末端標識リガンド断片の集団は、ラムダエキソヌクレアーゼで限定消化して作成した。次に最小リガンドは、2つの境界の間の配列として規定した。これらの実験から得られる情報は有用であるが、境界は1回に1つの末端が調べられるため、示唆された境界は絶対的なものではないことに注意すべきである。端を切り取っていない(放射能標識)末端は、結合を増強するか、低下させるか、または影響を及ぼさない(ジェリネック(Jellinek)ら,(1994)Biochemistry,34:10450−10456)。
PDGF−AB/DNA複合体の動力学的安定性を調べるために、最小のリガンド20t、36t、および41t(配列番号172〜174)のPDGF−ABとの複合体の解離速度を、PDGF−AB(1nM)に結合した放射能標識リガンド(0.17nM)の量を、過剰の非標識リガンドの添加後の時間の関数として測定して、求めた(図6)。これらのタンパク質およびDNAリガンドの濃度で、DNAリガンドの高親和性画分のみがPDGF−ABに結合する。解離速度定数の以下の値は、図6のデータ点を一次速度式に適合させて得られた:リガンド20tは4.5±0.2×10−3s−1(t1/2=2.6分)、リガンド36tは3.0±0.2×10−3s−1(t1/2=3.8分)、リガンド41tは1.7±0.1×10−3s−1(t1/2=6.7分)。解離定数と解離速度定数について計算された会合速度(kon=koff/Kd)は、20tは3.1×107M−1s−1、36tは3.1×107M−1s−1、そして41tは1.2×107M−1s−1である。
最小のリガンド20t、36t、および41tが折り畳み構造を取る能力を試験するために、PBSMまたはPBSE緩衝液中のUB吸光度対温度プロフィールからその溶融温度(Tm)を決定した。これらの実験で使用したオリゴヌクレオチド濃度(320〜440nM)では、非変性ポリアクリルアミドゲル上の単一のバンドとしてモノマー種が観察された(データは示していない)。リガンド20tと41tは、PBSM緩衝液中のTmがそれぞれ43.8±0.4℃および49.2±0.5℃である直線的な傾きのベースライン(ピーターシェイムとターナー(Petersheim and Truener)、(1983)Biochem.22:256−263)を有する2状態(折り畳みおよび非折り畳み)モデルによりよく説明される温度溶融性を示した。PBSE緩衝液では同様のTm値が得られた:リガンド20tでは44.8±0.5℃、そしてリガンド41tでは48.0±0.5℃。リガンド36tは、より複雑な溶融プロフィールを示し、2つの明確な遷移が観察された。この場合、データは、充分に折り畳まれた状態と広がった状態が、部分的に広がった中間的結果により連結されている、3状態モデルによりよく説明された。このモデルを用いて、リガンド36tのTm値が得られた:PBSM緩衝液中で47.0±0.9℃および67.1±3.8℃、そしてPBSE緩衝液中で44.2±1.7℃および64.3±4.1℃。
密接に接触しているDNAリガンドとPDGF上の部位を決定するために、5’−ヨード−2’−デオキシウリジン(IdU)−置換DNAリガンド20t、36t、および41t(配列番号172〜174)を用いて一連の光架橋実験を行った。308nmで単色光励起により、5−ヨード−および5−ブロモ−置換ピリミジンヌクレオチドは、最初のnからπ*遷移システム間横断により、反応性トリプレット状態を占める。励起されたトリプレット状態は次に、近接している電子の豊富なアミノ酸残基(例えば、Trp、TyrおよびHis)と反応して共有架橋を与える。この方法は、光傷害を最小にする>300nmの光での照射を可能にするため、核酸−タンパク質相互作用の研究に広く使用されている(ウィリス(Willis)ら,(1994)Nucleic Acids Res. 22:4947−4952;ダブリュー・ティー・スタンプとケー・ビー・ホール(Stump,W.T.,and Hall,K.B.)(1995)RNA 1:55−63;ウィリス(Willis)ら,(1993)Science 262:1255−1257;ジェンセン(Jensen)ら,(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:12220−12224)。リガンド20t、36t、および41tの類似体は、固相ホスホラミダイト法を使用してIdU残基ですべてのチミジン残基を置換して、合成した。PDGF−ABへのこれらのIdU置換リガンドの親和性は、非置換リガンドに比較してやや増強されており、8%ポリアクリルアミド/7M尿素ゲル上の遅い電気泳動度を有するバンドの出現に基づき、すべての3つの5’末端標識IdU置換リガンドは、308nmの照射でPDGF−ABに架橋した(データは示していない)。最も高い架橋効率は、IdU置換リガンド20tで観察された。観察された架橋の原因である特異的IdU位を同定するために、20tの7つの単一のまたは複数のIdU置換類似体を、PDGF−ABに光架橋する能力について試験した:リガンド20t−I1〜20t−I7(5’−TGGGAGGGCGCGT1T1CT1T1CGT2GGT3T4ACT5T6T6T6AGT7CCCG−3’(配列番号178〜184)、ここで番号は、7つのリガンドについて記載したチミジンヌクレオチドでのIdU置換を示す)。これらの7つのリガンドのうち、PDGF−ABの効率的な架橋は、リガンド20t−14でのみ観察された。光活性IdU位置は、らせんジャンクションのループ中の3’近接チミジンに対応する(図4)。
PDGFに対するDNAリガンドが、培養細胞に及ぼすPDGFアイソフォームの作用を阻害することができるかどうかを調べるために、トランスフェクションによりブタ大動脈内皮(PAE)細胞中で安定に発現されるPDGFα−およびβ−受容体への125I標識PDGFアイソフォームの結合に及ぼす影響を調べた。リガンド20t、36t、および41t(配列番号172〜174)はすべて、PDGFα−受容体(図7)またはPDGFβ−受容体(データは示していない)への125I−PDGF−BBの結合を効率的に阻害し、最大効果の半分は約1nM DNAリガンドであった。トロンビンを標的とし対照として含めたDNAリガンドT39は、作用はなかった。いずれのリガンドもPDGFα−受容体(図7)への125I−PDGF−AAの結合を阻害することができず、PDGF−BBおよびPDGF−ABに対するリガンド20t、36t、および41tの観察された特異性に一致していた。
ヌクレアーゼに対する核酸の安定性は、核酸ベースの治療薬を開発するのに重要な考慮点である。実験では、セレックス誘導リガンド中の多くの(ある場合はほとんどの)ヌクレオチドは、ヌクレアーゼ消化に耐性の修飾ヌクレオチドと置換しても、高親和性結合を犠牲にしないことを証明した(グリーン(Green)ら,(1995)Chemistry and Biology 2,683−695;グリーン(Green)ら,J.Mol.Biol.247,60−68)。ここで報告したDNAリガンドを用いるこの種の実験は、多くの位置で修飾ヌクレオチドによる置換が可能であることを示唆する(図9;配列番号175〜176)。具体的には、我々は、一カ所がまたは複数の箇所が置換されたリガンド36tのPDGF−AB結合性を調べるために、リガンド36t中の2’−デオキシリボヌクレオチドを2’−O−メチル−2’−デオキシ−および2’−フルオロ−2’−デオキシリボヌクレオチドで置換した。図9に示す置換パターンは、PDGF−ABへの高親和性結合に一致する。さらにこのリガンドは、らせんIIとIIIの末端のトリヌクレオチドループのペンタエチレングリコールスペーサー(グレン・リサーチ(Glin Research)、スターリング、バージニア州)の代用を許容する。従って、これらのDNAリガンドは、PDGF−ABおよびPDGF−BBの新規なクラスの特異的アンタゴニストの主要な化合物である。
(A.2’−フルオロ−2’−デオキシピリミジンRNAセレックス)
表12に示すようにプライマー鋳型(配列番号125〜127)を使用して、PDGF−ABを標的とする2’−フルオロ−2’−デオキシピリミジンを用いるセレックスを、前記したように行った(前記参照、およびジェリネック(Jellinek)ら,(1993,1994)前述)。簡単に説明すると、親和性選択ための2’−フルオロ−2’−デオキシピリミジンRNAを、T7 RNAポリメラーゼを使用して合成DNA鋳型からインビトロ転写により調製した(ミリガン(Milligan)ら,Nucleic Acids Res.,15:8783(1987))。すでに詳細に記載されているインビトロ転写の条件(ジェリネック(Jellinek)ら,(1994)前述)を使用したが、ATPおよびGTP(1mM)に対してより高濃度(3mM)の2’−フルオロ−2’−デオキシピリミジンヌクレオシド三リン酸(2’−F UTPと2’−F CTP)を使用した。0.01%ヒト血清アルブミンを含有するPBS中でPDGF−ABを2’−フルオロ−2’−デオキシピリミジンRNAと37℃で少なくとも15分間インキュベートして、親和性選択を行った。タンパク質結合RNAからの遊離RNAの分離は、既に記載されているように(ジェリネック(Jellinek)ら,(1993,1994)前述)、ニトロセルロースフィルターにより行った。親和性選択RNAの逆転写とPCRによる増幅は、既に記載されているように(ジェリネック(Jellinek)ら,(1994)前述)行った。19ラウンドのセレックスを行い、典型的には投入RNAの1〜12%を選択した。選択の最初の8ラウンドで、スラミン(suramin)(3〜15μM)を、選択緩衝液に加えて選択圧力を増加させた。親和性濃縮したプール(ラウンド19)をクローン化し、既に記載されているように(シュナイダー(Schneider)ら,(1992)前述)配列決定した。46のユニーク配列を同定し、配列を表13に示す(配列番号128〜170)。ユニーク配列リガンドを、高親和性でPDGF−ABに結合する能力についてスクリーニングした。ランダム2’−フルオロピリミジンRNA(表12)は解離定数(Kd)35±7nMでPDGFに結合したが、多くの親和性選択リガンドは、約100倍高い親和性でPDGF−ABに結合した。ユニークリガンドのうち、クローン9(Kd=91±16pM)、11(Kd=120±21pM)、16(Kd=116±34pM)、23(Kd=173±38pM)、25(Kd=80±22pM)、37(Kd=97±29pM)、38(Kd=74±39pM)、および40(Kd=91±32pM)は、PDGF−ABに対して最も高い親和性を示した(PDGF−ABへのこれらのリガンドの結合は2相性であり、高親和性結合成分のKdが与えられる)。
本例は、例17〜19で使用し導入した、hKGFに対する核酸リガンドの進化ための一般的方法を提供する。
組換えヒトケラチン細胞増殖因子(hKGF)とヒト上皮増殖因子(hEGF)は、アップステートバイオテクノロジー社(Upstate Biotechnology Inc.)(レークプラシッド(Lake Placid)、ニューヨーク州)から購入し、haFGF、hbFGF、PDGF−AB、TGFβ1、および抗KGF中和モノクローナル抗体は、アールアンドディーシステムズ(R & D Systems)(ミネアポリス、ミネソタ州)から購入した。組換えラットKGFは、キューイーディーアドバンストリサーチテクノロジーズ(QED Advanced Research Technologies)(サンジエゴ、カリホルニア州)から購入した。ヒトトロンビンはエンザイムリサーチラボラトリーズ(Enzyme Research Laboratories)(サウスベント(South Bend)、インディアナ州)から購入した。T4 DNAリガーゼ、HpaIIメチラーゼ、および制限酵素は、ニューイングランドバイオラボズ(New England Biolabs)(ビバリー(Beverly)、マサチューセッツ州)から購入した。pCR−ScriptAmpSK(+)クローニングキットは、ストラタジーン(Stratagene)(ラホイヤ、カリホルニア州)から購入した。AMV逆転写酵素は、ライフサイエンシーズ(Life Sciences)(セントピーターズバーグ(St.Petersburg)、フロリダ州)から購入した。TaqDNAポリメラーゼは、パーキンエルマー(Perkin Elmer)(フォスターシティ(Foster City)、カリホルニア州)から購入した。高純度ヌクレオチド三リン酸は、ファルマシア(Pharmacia)(ピスカタウェイ(Piscataway),ニュージャージー州)から購入した。α−32p−ATP、γ−32p−ATP、および5’32p−シチジン3’,5’−ビス(ホスフェート)(5’32p−pCp)は、デュポンNENリサーチプロダクツ(Dupont NEN Research Products)(ボストン、マサチューセッツ州)から得た。125I標識KGFは、既に記載されているように(ボッタロ(Bottaro)ら,(1990)J.Biol.Chem.265:12767−12770)調製した。PC−3前立腺ガン細胞は、ATCC(カタログ番号CRL1435)から得た。Balb/MK細胞と、ヒトKGF受容体でトランスフェクションしたNIH3T3(NIH3T3/KGFR)は、エス・アーロンソン(S.Aaronson)(マウントサイナイメディカルセンター(Mt.Sinai Medical CEnter),ニューヨーク州)からの供与であり、別のところ(ミキ(Miki)ら,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:246−250;ミキ(Miki)ら,(1991)Science 251:72−75;ワイスマン(Weissman)ら,(1983)Cell 32:599−606)に記載されている。T7 RNAポリメラーゼ、2’−NH2−および2’−F−修飾CTPおよびUTPは、ネクスター・ファーマシューチカルズ社(NeXsdar Pharmaceutical,Inc.)(ボールダー(Boulder)、コロラド州)から得た。DNAオリゴヌクレオチドは、オペロン・テクノロジーズ(Operon Technologies)(アラメダ(Alameda)、カリホルニア州)から得た。ニトロセルロース/酢酸セルロース混合マトリックス(0.45μm)HAフィルターは、ミリポア(Millipore)(ベッドフォード(Bedford),マサチューセッツ州)から得た。カルシウムおよびマグネシウム含有ダルベッコーリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS)は、ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、ゲーサーズバーグ(Gaithersburg)、メリーランド州)から購入した。化学物質は、少なくとも試薬等級であり、市販品を購入した。
セレックス法は、米国特許第5,270,163号などに詳細に記載されている(ツエルクとゴールド(Tuerk and Gold)(1990)Science 249:505−510も参照)。転写により最初のランダム配列RNAプールを作成するための2本鎖(dsDNA)鋳型を作成するために1本鎖DNA(ssDNA)プールを使用した。DNA鋳型は、PCRとcDNA合成のためのプライマーアニーリング部位のための、5’および3’固定領域が隣接する40ランダムヌクレオチドを含有した(表14;配列番号186〜188)。5’プライマーは、インビトロ転写のためのT7プロモーター配列を含有する。鋳型は、50mM KCl、10mM トリス−塩酸(pH9.0)、0.1%トリトンX−100、3mM MgCl2、0.5mMずつのdATP、dCTP、dGTP、およびdTTP、0.1U/mlのTaqDNAポリメラーゼ、および2.5nMずつの3G7と5G7プライマー(表14;配列番号187〜188)中で、93℃で3.5分の最初の変性、次に15サイクルの、93℃で30秒の変性、60℃で1分のアニーリング、および72℃で1分の伸長により、PCR増幅した。hKGFのセレックス実験は、RNAのランダム配列プール(ここで、すべてのピリミジンは2’−NH2修飾、または2’−F修飾されている)で開始した。転写反応は、約5μM DNA鋳型、5U/μlのT7 RNAポリメラーゼ、40mM トリス−塩酸(pH8)、12mM MgCl、5mM DTT、1mM スペルミジン、0.002%トリトンX−100、4%PEG8000、2〜4mMずつの2’−OHATP、2’−OH GTP、2’−NH2または2’−F CTP、2’−NH2または2’−F UTP、および0.25μM α32P 2’−OH ATP(800Ci/mmol)で行った。全長転写体は、使用前にゲル精製した。結合反応物を調製するために、RNA分子を、0.01%ヒト血清アルブミンを含有するカルシウムおよびマグネシウム含有ダルベッコーリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS)(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、ゲーサーズバーグ(Gaithersburg)、メリーランド州、カタログ番号21300−025)中で組換えhKGFとインキュベートした。室温でインキュベート(10分間〜10時間)後、タンパク質−RNA複合体を、ニトロセルロースで濾過して非結合RNAから分離した。ニトロセルロースフィルター結合RNAを、フェノール/尿素抽出により回収した。分離したRNAは、50mMトリス−塩酸(pH8.3)、60mM NaCl、6mM 酢酸マグネシウム、10mM DTT、50pmol DNA 3’プライマー(表14)、0.4mMずつのdATP、dCTP、dGTP、およびdTTP、1U/μlのAMV RT中で48℃で60分、AMV逆転写酵素によりcDNAに逆転写した。cDNAをPCR増幅し、次のセレックスサイクルの開始に使用した。
タンパク質−RNA複合体を分離するために、結合反応物を、ニトロセルロース/酢酸セルロース混合マトリックス(0.45μm孔径)(ミリポア(Millipore)(ベッドフォード(Bedford),マサチューセッツ州))で濾過した。濾過のために、フィルターを真空マニホールドにのせ、DPBS 5mlを吸引して湿潤させた。結合反応物をフィルターから吸引し、5mlで洗浄後、フィルターをシンチレーションカウンター(ベックマン(Beckman))で計測した。表15に示すように、選択の厳密性を増加させる手段として、DPBSまたは0.5M尿素を含有するより多量の洗浄量を使用した。ゲル精製し、内部にα−32p−ATP標識転写体を、DPBS中の種々の濃度のhKGFと37℃で10分間インキュベートした。オリゴヌクレオチド−タンパク質混合物を、あらかじめ湿潤させた孔径0.45μmのHAフィルターで濾過し、次にDPBS 5mlで洗浄した。フィルターに保持された放射能を計測し、タンパク質の非存在下でバックグランド結合について補正した。ソフトウェアパッケージであるカレイダグラフ(Kaleidagraph)(シネジ・ソフトウェア(Synergy Software)、リーディング(Reading)、ペンシルバニア州)を用いて、非線形最少自乗法により、データを1相性または2相性結合曲線に適合させ、平衡解離定数Kdを得た(ジェリネック(Jellinek)ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:11227−11231)。2相性結合は、平衡状態にない2つの親和性分子種の結合であるとして説明される。
ラウンド8フィルターから回収されたRNAを逆転写し、PCR増幅した。QIAクイックスピンカラム(キアゲン社(Quiagen Inc.)、チャッツワース(Chattsworth)、カリホルニア州)でカラムを精製後、エタノール沈殿し、増幅したDNAをHpaIIメチラーゼでメチル化した(ニューイングランドバイオラボズ(New England Biolabs)、ビバリー(Beverly)、マサチューセッツ州)。メチル化したDNAを、pCR−Script AmpSK(+)クローニングキット(ストラタジーンクローニングシステムズ(Stratagene Cloning Systems)、ラホイヤ、カリホルニア州)を使用して、pCR−Script Direct SK(+)プラスミドのSrfI制限部位にクローン化した。シーケナーゼ配列決定キット(ユナイテッドステーツバイオケミカル社(United States Biochemical Corporation)、クリーブランド、オハイオ州)を使用して、約80クローンを配列決定した。配列解析と2次構造予測は、既に記載されているようにコンピューターソフトウェアを使用して行った(フェングとドリトル(Feng and Doolittle)(1987)J.Mol.Evol.25:351−360;イエーガー(Jaeger)ら,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:7706−7710;イエーガー(Jaeger)ら,(1990)Methods Enzymol.183:281−306;ツッカー(Zucker)(1989)Sceince 244:48−52)。
T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてγ−32p−ATPで5’末端を標識したか、または5’−32P−pCpとT4 RNAリガーゼで3’末端で標識したオリゴヌクレオチドリガンドを用いて、それぞれ3’境界と5’境界を確立した(フィッツウォーター(Fitzwater)ら,(1996)Methods Enzymol.267:275−301)。部分的アルカリ加水分解後、放射能標識オリゴヌクレオチドを、0.1、0.6、および3.0nM hKGFとインキュベートし、オリゴヌクレオチドに結合したタンパク質をニトロセルロース濾過により単離した。ニトロセルロースに保持されたオリゴヌクレオチドトランケートを、高分解変性ポリアクリルアミドゲルで解析した。部分的RNaseAT1消化により作成されるアルカリ加水分解ラダーとG残基で停止する放射能標識リガンドのラダーを使用して、3’境界および5’境界をマッピングした。
オリゴヌクレオチドの融解プロフィールは、ケリー(Cary)モデル1E分光光度計を使用して得た。オリゴヌクレオチドをPBS(サムブルーク(Sambrook)ら,(1989)分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第2版,コールドスプリングハーバー(Cold Spring Harbor),ニューヨーク州)、または10mMリン酸緩衝液中で95℃で加熱し、室温に冷却してから融解プロフィール測定を行った。作成された溶融プロフィールは、温度の関数としての260nmの吸光度の変化を示す。記録の間、試料を1℃/分の速度で20〜95℃まで1℃/分の速度で加熱した。
(A.セレックス)
hKGFのRNAリガンドを作成するために、2つの平衡セレックス実験を開始した(1つは40個の連続的位置でランダム化された2’−NH2、および他の1つは2’−Fピリミジン修飾RNA分子)。各ラウンドのセレックス条件と結果は、表15に示す。出発プールは、それぞれ5×1014(500ピコモル)と2.5×1014(250ピコモル)の2’−NH2および2’−Fピリミジン修飾RNA分子を含有し、KDが約30nMでhKGFに結合した。8ラウンドのセレックス後、進化したプールは、KDが0.6nMで結合した。以後の2つのラウンドでKDのさらなる改善が観察された。前記したように、第8ラウンドのRNAプールを逆転写し、PCR増幅し、クローン化した。
2’−NH2セレックスで、31クローンのうち29は、ユニークであった。配列決定したセレックスのすべての43クローンは、ユニークであった。ユニークな配列とは、他のすべてのものから3つまたはそれ以上のヌクレオチドが異なるものであると定義される。表16は、配列決定したすべてのクローンの配列(配列番号189〜262)を、1文字コードで示す(コーニッシュ−ボウデン(Cornish−Bowden),1985 Nucleic Acids Res.13:3021−3030)。コンピューターによる全体的および局所的整列は、クローンの間で広範な相同性は示さず、明らかなファミリーはなかった。2’−NH2クローンは一般的にプリンが豊富であり、2’−Fクローンはピリミジンが豊富であった。整列パラメータを緩めると、フェング/ドリトル(Feng/Doolittle)アルゴリズムにより2’−NH2クローンが1つのファミリーに分類され、2’−Fクローンが別の群に分類された。配列を肉眼で観察すると、2’−NH2と2’−Fリガンドについてそれぞれ2つおよび3つの可能なファミリーが示唆された。保存された予測2次構造を使用して、38の2’−Fリガンドが2つのクラスに割り当てられた(図12Aと12B)。同様に、15の2’−NH2リガンドが2つのクラスに割り当てられた(図12Cと12D)。2’−Fリガンドの2つの提唱されるクラスは、シュードナット構造に折り畳まれる(ワイアット(Wyatt)ら,(1993)The RNA World 465−496;イー・テン・ダム(ten Dam,E.)(1992)Biochemistry 31:1665−1676)。これらの構造は非常に関連があり、実際これらは共通の構造の環状置換である。クラス1シュードナットのループ3(L3)は、保存配列5’RRYuyを示し、クラス2リガンドのループ1(L1)は配列5’AsYYを示す。これらの配列の両方とも、コンセンサス5’RRYYを含有する。2’−Fリガンドのあるものは、RRYY配列の2〜3コピーを含有する(図12Aと12B)。これらの構造の別の特徴は、ステム1(S1)中のプリンとピリミジンの均等でない分布である。このステムの1つの鎖は、ほとんどプリンを含有し、他の鎖はピリミジンを含有する。
hKGFリガンドの解離定数は、表17に記載のニトロセルロースフィルター結合により決定した。41個の2’−F リガンドのうち8個は2相性に結合した。残りの2’−Fおよび2’−NH2リガンドは1相性に結合した。タンパク質過剰では、2相性結合は、リガンドは平衡状態にない2つの親和性分子種(おそらくイソコンフォーマー)として存在することを示唆する。2’−F修飾リガンドであるK14Fは、それぞれ0.3〜3pMと2〜10nMの高親和性および低親和性解離定数で2相性に結合する。種々のクローンとランダムRNAについてKD測定で変動がいくつか観察されている。KD測定の実験的変動にもかかわらず、K14Fの高親和性分子種は、ランダムRNAより1,000〜5,000倍親和性が高い。1相性2’−F修飾リガンドのうち、K38Fは0.3nMの最もよいKDを有した。最良の2’−NH2修飾リガンドは、KDが0.4nMで結合し、これはランダムRNAに対して75倍の改善である。
結合に必要な最小配列を測定するために、さらに2つの2’−F リガンド(6Fと14F)(配列番号223と231)を試験した。3’末端と5’末端で標識したアルカリ加水分解ラダーをhKGFに結合させて、配列境界を決定した。部分的断片をニトロセルロース濾過により親和性精製し、高分解変性ゲルで解析した。両方のリガンドについて、境界は3’末端でのみ観察され(図13)、図12Aに示すクラス1の提唱された折り畳みに一致する。次に端を切り取った鋳型を使用して境界を確認した(図13)。7つの連続的ピリミジンでは境界の正確なマッピングができなかったため、3つのトランケートを6Fについて試験した。これらの3つのトランケートから、1つは図13に示すようにKGF結合活性を阻止した。単一の14Fトランケート(14F3’Tと命名)を試験した。提唱されたシュードナット構造のステム2(S2)を伸長するために、このトランケートは観察された境界より2塩基長かった。14F3’Tの端を切り取ったリガンドは、全長リガンドに類似の親和性で結合活性を保持した。全長リガンドのように、14F3’TはKGFに2相性に結合し、高親和性分子種は分子の約20%であり、Kd値約0.3〜3pMであった。これらの高親和性分子種は、KGFへの親和性の差に基づき低親和性分子種から部分的に分離した時、中点が0.3〜3pMにあり最大のプラトーが約70%である結合曲線を示した(データは示していない)。図13は、それぞれ53および49塩基の長さの6Fと14Fの最も短い活性トランケートの予測された折り畳みを示す。いずれの提唱されたシュードナット構造も、相対的に長いステムを含有する。6Fの2つの提唱されるステムは、非H型シュードナットを形成する単一の塩基により分離される。提唱される6F構造は、MMTV RNA中に存在するフレームシフト成分からの類似のシュードナットモチーフの溶解構造に似ている(シェン(Shen)ら,(1995)J.Mol.Biol.247:963−978)。14Fの2つのステム(S1とS2)は、全長が16塩基対の同軸で重なったらせんとして描くことができるであろう(H型シュードナット)。同様のシュードナット構造が、NMRデータに基づき提唱されている(ヅ(Du)ら,(1996)Biochemistry 35:4187−4198)。L1は短いため、リガンド14Fは非H型シュードナット(ここで、S1の最後のGU塩基対は形成されず、より柔軟性のあるらせん領域とより長いL1を可能にする)を形成することができる。14Fと14F3’Tの温度融解曲線は、このリガンドの顕著な熱安定性を示唆する(データは示していない)。これらの融解曲線は、150mMの塩中で濃度依存性で2相性のようである。2相性融解曲線は、すでにtRNAでも観察されており(ヒルアース(Hilbers)ら,(1976)Biochemistry 15:1874−1882)、RNA分子の三次折り畳みが原因であるとされている。RNAシュードナットについて多相温度遷移が提唱されている(ヅ(Du)ら,(1996)Biochemistry 35:4187−4198)。観察される2相性曲線は、約55℃の低Tmと85〜90℃以上の高Tmを含む。10mMの塩では、14Fの低Tmは観察されず、高Tmは75〜78℃まで移動してくる。14Fの融解プロフィールは、Tmは同じでも14F3’Tより平らなようである。このデータは、観察された熱安定性は最小の49量体が原因であることを示唆する。
K14Fリガンドの特異性を、ラットhKGF、およびヘパリン結合ヒト増殖因子、aFGF、bFGF、およびPDGFに対してKDを測定して試験した(表18)。結果は、hKGFを除いて、K14FはランダムRNAのようにすべての試験した標的に結合すること、そしてファクター400〜40,000でhKGFと他の類似のタンパク質を区別することができることを示唆する。
(A.受容体結合測定法)
その細胞表面受容体へのhKGFの結合を競合的に阻害するhKGFリガンドの能力を試験するために、2つの細胞株を使用した。最初の細胞株(PC−3)は、グレードIVの前立腺腫からの単離物である(ATCC CRL 1435)。第2の細胞株は、NIH3T3/FGFR−2と呼び、約0.5×106の高親和性KGF結合部位/細胞で、ヒトhKGF受容体を有する組換えNIH/3T3細胞株である(ミキ(Miki)ら,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:246−250)。
KGFの生物学的作用の1つは、上皮細胞の増殖の刺激である(ルビン(Rubin)ら,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:802−806)。KGFのこの増殖作用は、KGFへの暴露後の応答細胞の[3H]チミジン取り込みの刺激により測定できる。これらのこのような細胞株はすでに記載されている(ルビン(Rubin)ら,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:802−806)。種々のリガンドの抗分裂促進活性を試験するために、2つの細胞株を使用した。1つは、サルの上皮の継代数の小さい細胞株である4MBr−5(ATCC#CCL208)(カプト(Caputo)ら,(1979)In Vitro 15:222−223)であり、他の1つは、形質転換されたラットケラチン細胞株であるBalb/MKである(ワイスマンとアアロンソン(Weissman and Aaronson)(1983)Cell 32:599−606)。30ng/ml、EGF、および10%FCSを含有するF12K中で増殖させた4MBr−5細胞をトリプシン処理し、10mMヘペス(pH7.4)、および10%FCSを含有するM199に1.4×105細胞/mlで再懸濁した。96マイクロタイタープレートに100μlの細胞懸濁液を接種し、10ng/ml(0.5nM)のKGFを加え、種々の濃度(0〜1000nMの範囲)のK14Fを加えた。各インキュベート反応物を少なくとも三重測定でセットした。37℃で24時間インキュベート後、1μCi/ウェルの[3H]チミジンを10nMの非標識チミジンとともに加えた。細胞をさらに24時間インキュベートし、上清を吸引し、残存する細胞を、20μlの0.2N NaOHで溶解して採取した。[3H]チミジン取り込みの程度を、TCA沈殿とGFCフィルターディスク(ワットマン(Whattman),ヒルスボロ(Hillsboro),オレゴン州)を用いる濾過により測定した。
塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)に結合する核酸リガンドが、すでに米国特許第5,459,015号(米国特許第5,270,163号およびツエルクとゴールド(Tuerk and Gold)(1990)Science 249:505−510も参照)に記載のようにセレックス法で得られている。配列5’−GGGAGACAAGAAUAACGCUCAAGUAGACUAAUGUGUGGAAGACAGCGGGUGGUUCGACAGGAGGCUCACAACAGGC(配列番号265)を有する21Aと呼ぶ2’−NH2修飾核酸リガンドを、欠失解析により、bFGFへの高親和性結合に必要な最小配列情報について調べた。この解析により、端を切り取ったリガンド21A−t(GGUGUGUGGAAGACAGCGGGUGGuuc(配列番号266)、ここで下線を引いたGは、転写効率を改善するために加えたグアニンであり、小文字は定常領域からのものである)が得られた。
ヌクレアーゼによる分解に対するリガンド21A−tの安定性を上昇させるために、短いホスホラミダイトキャップを5’末端と3’末端に付加した。さらに、グリーン(Green)ら,(1995)Chem.Biol.2:683−695に記載の方法を使用して、bFGFに対する結合親和性を失うことなく2’−デオキシ−2’−O−メチルプリンで置換できる9つのリボプリン位置を同定し、NX−286(5’−TsTsTsTs mGmGaU rGaUrG aUrGrG mArArG mAaCrA rGaCmG mGmGaU mGmGaU aUaC TsTsTsTsT−3’(配列番号267)、ここで、sはホスホロチオエートヌクレオシド間結合、aUとaCはそれぞれ2’−デオキシ−2’−O−アミノシチジンと2’−デオキシ−2’−O−アミノシチジンであり、mAとmGはそれぞれ2’−デオキシ−2’−O−メチルアデノシンとグアノシン残基であり、rAとrGはアデノシンとグアノシン残基であり、Tは2’−デオキシチミジンである)と呼ぶリガンドが得られた。この修飾核酸リガンドは、電気泳動度シフト測定法により、Kd 0.4nMを有していた。
(1)一般情報:
(i)出願人: ラリー・ゴールド(LARRY GOLD);ネボジャ・ジャンジック
(NEBOJSA JANJIC);スティーブン・リングキスト(STEVEN RINGQUIST);ニコス・パグラティス(NIKOS PAGRATIS);ペネロピ・ジェイ・トゥースマン(PENELOPE J.TOOTHMAN)
(ii)発明の名称:トランスフォーミング増殖因子β(TGFβ)、血小板由来増殖因子(PDGF)およびヒトケラチン細胞増殖因子(hKGF)に対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド
(iii)配列の数:304
(iv)連絡住所:
(A)宛名:スワンソンおよびブラットシュン、エルエルシー(Swanson & Bratschun,L.L.C.)
(B)通り:8400東、プレンティス・アベニュー、スイート200(8400 E.Prentice Avenue,Suite 200)
(C)市:イングルウッド(Englewood)
(D)州:コロラド
(E)国:米国
(F)郵便番号:80111
(v)コンピューターで読める形式:
(A)媒体の型:ディスケット、3.5インチ、容量1.44Mb
(B)コンピューター:IBMコンパチブル
(C)オペレーティング・システム:MS−DOS
(D)ソフトウェア:ワードパーフェクト6.1(WordPerfect 6.1)
(vi)現行出願のデータ:
(A)出願番号:US96/
(B)出願日:
(C)分類:
(vii)先行出願のデータ
(A)出願番号:08/458,423
(B)出願日:1995年6月2日
(vii)先行出願のデータ
(A)出願番号:08/458,424
(B)出願日:1995年6月2日
(vii)先行出願のデータ
(A)出願番号:08/465,594
(B)出願日:1995年6月5日
(vii)先行出願のデータ
(A)出願番号:08/465,591
(B)出願日:1995年6月5日
(vii)先行出願のデータ
(A)出願番号:08/479,725
(B)出願日:1995年6月7日
(vii)先行出願のデータ
(A)出願番号:08/479,783
(B)出願日:1995年6月7日
(vii)先行出願のデータ
(A)出願番号:08/618,693
(B)出願日:1995年3月20日
(viii)弁理士/代理人情報:
(A)氏名:バリー・ジェイ・スワンソン(Barry J.Swanson)
(B)登録番号:33,215
(C)参照/整理番号:
(ix)電話連絡先情報:
(A)電話:(303)793−3333
(B)ファックス:(303)793−3433
(2)配列番号:1の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:117塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(xi)配列:配列番号:1:
(2)配列番号:2の情報:
(i)配列の特色:
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(ii)分子の型:RNA
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(2)配列番号:3の情報:
(i)配列の特色:
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(ii)分子の型:RNA
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(2)配列番号:4の情報:
(i)配列の特色:
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(ii)分子の型:DNA
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(i)配列の特色:
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(ii)分子の型:DNA
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(2)配列番号:6の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:95塩基対
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(ii)分子の型:DNA
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(ii)分子の型:DNA
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(2)配列番号:8の情報:
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(i)配列の特色:
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(i)配列の特色:
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(D)他の情報:全てのピリミジンは2’フルオロ(2’−F)修飾されている
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(2)配列番号:21の情報:
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(2)配列番号:23の情報:
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(2)配列番号:27の情報:
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(xi)配列:配列番号:28:
(2)配列番号:29の情報:
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(ii)分子の型:RNA
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(D)他の情報:全てのピリミジンは2’フルオロ(2’−F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:30:
(2)配列番号:31の情報:
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(ii)分子の型:RNA
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(i)配列の特色:
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(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’フルオロ(2’−F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:32:
(2)配列番号:33の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:83塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’フルオロ(2’−F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:33:
(2)配列番号:34の情報:
(i)配列の特色:
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(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’フルオロ(2’−F)修飾されている
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(2)配列番号:35の情報:
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(2)配列番号:36の情報:
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(D)他の情報:全てのCは2’−Fウラシルである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのUは2’NH2シトシンである
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(2)配列番号:37の情報:
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(ii)分子の型:RNA
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(D)他の情報:全てのCは2’−Fウラシルである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのUは2’NH2シトシンである
(xi)配列:配列番号:37:
(2)配列番号:38の情報:
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(A)長さ:115塩基対
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(ii)分子の型:RNA
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(D)他の情報:全てのCは2’−Fウラシルである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのUは2’NH2シトシンである
(xi)配列:配列番号:38:
(2)配列番号:39の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:92塩基対
(B)型:核酸
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(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’フルオロ(2’−F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:39:
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(A)長さ:111塩基対
(B)型:核酸
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(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’フルオロ(2’−F)修飾されている
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(2)配列番号:41の情報:
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(A)長さ:117塩基対
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(ii)分子の型:RNA
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(2)配列番号:42の情報:
(i)配列の特色:
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(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(xi)配列:配列番号:42:
(2)配列番号:43の情報:
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(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:43:
(2)配列番号:44の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:32塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:44:
(2)配列番号:45の情報:
(i)配列の特色:
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(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:45:
(2)配列番号:46の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:46:
(2)配列番号:47の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:15塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:47:
(2)配列番号:48の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:19塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:1−3位のNはビオチンである
(xi)配列:配列番号:48:
(2)配列番号:49の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:87塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:49:
(2)配列番号:50の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:40塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:50:
(2)配列番号:51の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:24塩基対
(B)型:核酸
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(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:51:
(2)配列番号:52の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:87塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:52:
(2)配列番号:53の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:23塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:53:
(2)配列番号:54の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:27塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:1−3位のNはビオチンである
(xi)配列:配列番号:54:
(2)配列番号:55の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:55:
(2)配列番号:56の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:56:
(2)配列番号:57の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:57:
(2)配列番号:58の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:70塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:58:
(2)配列番号:59の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:59:
(2)配列番号:60の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:60:
(2)配列番号:61の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:61:
(2)配列番号:62の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:62:
(2)配列番号:63の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:73塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:63:
(2)配列番号:64の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:72塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:64:
(2)配列番号:65の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:65:
(2)配列番号:66の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:66:
(2)配列番号:67の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:67:
(2)配列番号:68の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:72塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:68:
(2)配列番号:69の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:69:
(2)配列番号:70の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:70:
(2)配列番号:71の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:71:
(2)配列番号:72の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:72:
(2)配列番号:73の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:72塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
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(2)配列番号:74の情報:
(i)配列の特色:
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(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:75:
(2)配列番号:76の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:76:
(2)配列番号:77の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:72塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:77:
(2)配列番号:78の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:78:
(2)配列番号:79の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:72塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:79:
(2)配列番号:80の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:72塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:80:
(2)配列番号:81の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:81:
(2)配列番号:82の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:82:
(2)配列番号:83の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:67塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:83:
(2)配列番号:84の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:70塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:84:
(2)配列番号:85の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:85:
(2)配列番号:86の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:72塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:86:
(2)配列番号:87の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:87:
(2)配列番号:88の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:70塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:88:
(2)配列番号:89の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:89:
(2)配列番号:90の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:90:
(2)配列番号:91の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:28塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:1−3位のNはビオチンである
(xi)配列:配列番号:91:
(2)配列番号:92の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:49塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:92:
(2)配列番号:93の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:84塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:93:
(2)配列番号:94の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:85塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:94:
(2)配列番号:95の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:95:
(2)配列番号:96の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:85塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:96:
(2)配列番号:97の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:83塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:97:
(2)配列番号:98の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:98:
(2)配列番号:99の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:99:
(2)配列番号:100の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:85塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:100:
(2)配列番号:101の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:101:
(2)配列番号:102の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:102:
(2)配列番号:103の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:103:
(2)配列番号:104の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:104:
(2)配列番号:105の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:87塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:105:
(2)配列番号:106の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:84塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:106:
(2)配列番号:107の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:84塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:107:
(2)配列番号:108の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:108:
(2)配列番号:109の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:109:
(2)配列番号:110の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:110:
(2)配列番号:111の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:111:
(2)配列番号:112の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:112:
(2)配列番号:113の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:113:
(2)配列番号:114の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:114:
(2)配列番号:115の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:85塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:115:
(2)配列番号:116の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:116:
(2)配列番号:117の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:117:
(2)配列番号:118の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:83塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:118:
(2)配列番号:119の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:85塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:119:
(2)配列番号:120の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:120:
(2)配列番号:121の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:85塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:121:
(2)配列番号:122の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:122:
(2)配列番号:123の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:123:
(2)配列番号:124の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:86塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(xi)配列:配列番号:124:
(2)配列番号:125の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(xi)配列:配列番号:125:
(2)配列番号:126の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:39塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(xi)配列:配列番号:126:
(2)配列番号:127の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:24塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(xi)配列:配列番号:127:
(2)配列番号:128の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:93塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:128:
(2)配列番号:129の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:91塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:129:
(2)配列番号:130の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:95塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:130:
(2)配列番号:131の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:92塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:131:
(2)配列番号:132の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:95塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:132:
(2)配列番号:133の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:133:
(2)配列番号:134の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:134:
(2)配列番号:135の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:94塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:135:
(2)配列番号:136の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:93塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:136:
(2)配列番号:137の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:95塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:137:
(2)配列番号:138の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:138:
(2)配列番号:139の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:94塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:139:
(2)配列番号:140の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:94塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:140:
(2)配列番号:141の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:95塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:141:
(2)配列番号:142の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:94塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:142:
(2)配列番号:143の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:95塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:143:
(2)配列番号:144の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:144:
(2)配列番号:145の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:94塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:145:
(2)配列番号:146の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:146:
(2)配列番号:147の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:147:
(2)配列番号:148の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:94塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:148:
(2)配列番号:149の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:94塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:149:
(2)配列番号:150の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:150:
(2)配列番号:151の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:94塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:151:
(2)配列番号:152の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:94塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:152:
(2)配列番号:153の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:153:
(2)配列番号:154の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:98塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:154:
(2)配列番号:155の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:94塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:155:
(2)配列番号:156の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:156:
(2)配列番号:157の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:94塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:157:
(2)配列番号:158の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:97塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:158:
(2)配列番号:159の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:93塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:159:
(2)配列番号:160の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:93塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:160:
(2)配列番号:161の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:95塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:161:
(2)配列番号:162の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:162:
(2)配列番号:163の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:93塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:163:
(2)配列番号:164の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:95塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:164:
(2)配列番号:165の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:97塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:165:
(2)配列番号:166の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:94塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:166:
(2)配列番号:167の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:167:
(2)配列番号:168の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:93塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:168:
(2)配列番号:169の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:169:
(2)配列番号:170の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:96塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−F修飾されている
(xi)配列:配列番号:170:
(2)配列番号:171の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:23塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:1位および23位のNは相互に塩基対を形成し、1−4塩基対の長さであってよい
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:5位および10位のNは任意の塩基対である
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:6位および9位のNは任意の塩基対である
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:7位および8位のNは任意の塩基対である
(xi)配列:配列番号:171:
(2)配列番号:172の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:38塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:ヌクレオチド38は逆向きT(3’−3’結合)である
(xi)配列:配列番号:172:
(2)配列番号:173の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:40塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:ヌクレオチド40は逆向きT(3’−3’結合)である
(xi)配列:配列番号:173:
(2)配列番号:174の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:45塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:ヌクレオチド45は逆向きT(3’−3’結合)である
(xi)配列:配列番号:174:
(2)配列番号:175の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:36塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:8、11、25および26位のCは2’−O−メチル−2’−デオキシシチジンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:9、10、17、19および35位のGは2’−O−メチル−2’−デオキシグアノシンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:12、24および27位のAは2’−O−メチル−2’−デオキシアデノシンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:34位のUは2’−O−メチル−2’−デオキシウリジンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:6位および22位のUは2’−フルオロ−2’−デオキシウリジンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:23、32および33位のCは2’−フルオロ−2’−デオキシシチジンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:ヌクレオチド36は逆向きT(3’−3’結合)である
(xi)配列:配列番号:175:
(2)配列番号:176の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:32塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:8位のCは2’−O−メチル−2’−デオキシシチジンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:9、17、および31位のGは2’−O−メチル−2’−デオキシグアノシンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:22位のAは2’−O−メチル−2’−デオキシアデニンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:30位のUは2’−O−メチル−2’−デオキシウリジンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:6位および20位のUは2’−フルオロ−2’−デオキシウリジンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:21、28および29位のCは2’−フルオロ−2’−デオキシシチジンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:10位および23位のNはペンタエチレングリコールホスホルアミダイトスペーサーである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:ヌクレオチド32は逆向きT(3’−3’結合)である
(xi)配列:配列番号:176:
(2)配列番号:177の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:39塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:ヌクレオチド39は逆向きT(3’−3’結合)である
(xi)配列:配列番号:177:
(2)配列番号:178の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:13、14、16および17位のTはIdUで置換されている
(xi)配列:配列番号:178:
(2)配列番号:179の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:20位のTはIdUで置換されている
(xi)配列:配列番号:179:
(2)配列番号:180の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:23位のTはIdUで置換されている
(xi)配列:配列番号:180:
(2)配列番号:181の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:24位のTはIdUで置換されている
(xi)配列:配列番号:181:
(2)配列番号:182の情報:
(i) 配列の特色:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:27位のTはIdUで置換されている
(xi)配列:配列番号:182:
(2)配列番号:183の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:28−30位のTはIdUで置換されている
(xi)配列:配列番号:183:
(2)配列番号:184の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:33位のTはIdUで置換されている
(xi)配列:配列番号:184:
(2)配列番号:185の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:7アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:ペプチド
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:5位のXaaは同定できなかった修飾アミノ酸である
(xi)配列:配列番号:185:
(2)配列番号:186の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(xi)配列:配列番号:186:
(2)配列番号:187の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:32塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(xi)配列:配列番号:187:
(2)配列番号:188の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:16塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(xi)配列:配列番号:188:
(2)配列番号:189の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:189:
(2)配列番号:190の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:190:
(2)配列番号:191の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:70塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:191:
(2)配列番号:192の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:192:
(2)配列番号:193の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:193:
(2)配列番号:194の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:74塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:194:
(2)配列番号:195の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:195:
(2)配列番号:196の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:70塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:196:
(2)配列番号:197の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:44塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:197:
(2)配列番号:198の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:198:
(2)配列番号:199の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:70塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:199:
(2)配列番号:200の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:44塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:200:
(2)配列番号:201の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:201:
(2)配列番号:202の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:202:
(2)配列番号:203の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:203:
(2)配列番号:204の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:57塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:204:
(2)配列番号:205の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:205:
(2)配列番号:206の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:44塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:206:
(2)配列番号:207の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:207:
(2)配列番号:208の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:69塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:208:
(2)配列番号:209の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:209:
(2)配列番号:210の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:70塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:210:
(2)配列番号:211の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:70塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:211:
(2)配列番号:212の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:70塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:212:
(2)配列番号:213の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:82塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:213:
(2)配列番号:214の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:214:
(2)配列番号:215の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:53塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:215:
(2)配列番号:216の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:74塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:216:
(2)配列番号:217の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
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(xi)配列:配列番号:217:
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(i)配列の特色:
(A)長さ:73塩基対
(B)型:核酸
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(ii)分子の型:RNA
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(xi)配列:配列番号:218:
(2)配列番号:219の情報:
(i)配列の特色:
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(xi)配列:配列番号:219:
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(i)配列の特色:
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(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
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(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
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(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
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(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
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(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
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(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
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(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
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(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
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(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
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(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:235:
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(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:236:
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(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:237:
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(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:238:
(2)配列番号:239の情報:
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(ii)分子の型:RNA
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(xi)配列:配列番号:239:
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(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:240:
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(A)長さ:72塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:241:
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(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
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(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:242:
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(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:243:
(2)配列番号:244の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:74塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:244:
(2)配列番号:245の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:70塩基対
(B)型:核酸
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(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:245:
(2)配列番号:246の情報:
(i)配列の特色:
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(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:246:
(2)配列番号:247の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:247:
(2)配列番号:248の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:248:
(2)配列番号:249の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:249:
(2)配列番号:250の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:250:
(2)配列番号:251の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:251:
(2)配列番号:252の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
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(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:252:
(2)配列番号:253の情報:
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(A)長さ:71塩基対
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(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:253:
(2)配列番号:254の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:69塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:254:
(2)配列番号:255の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:255:
(2)配列番号:256の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:256:
(2)配列番号:257の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:74塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:257:
(2)配列番号:258の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:70塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:258:
(2)配列番号:259の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:73塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:259:
(2)配列番号:260の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:260:
(2)配列番号:261の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:71塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:261:
(2)配列番号:262の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:73塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:262:
(2)配列番号:263の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:13塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:263:
(2)配列番号:264の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:9塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:264:
(2)配列番号:265の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:76塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのCは2’−NH2 2 シトシンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのUは2’NH2 2 ウラシルである
(xi)配列:配列番号:265:
(2)配列番号:266の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:26塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのCは2’−NH2 2 シトシンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのUは2’NH2 2 ウラシルである
(xi)配列:配列番号:266:
(2)配列番号:267の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:35塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのUおよびCは2’−デオキシ−2’−アミノウリジンおよび2’−デオキシ−アミノシチジン残基である
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:14位および17位のAは2’−デオキシ−2’−O−メチルアデノシンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:5、6、22、23、24、26および27位のGは2’−デオキシ−2’−O−メチルグアノシンである
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:1−4位および31−35位のTは2’−デオキシチミジンである
(xi)配列:配列番号:267:
(2)配列番号:268の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:27塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:268:
(2)配列番号:269の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:26塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:269:
(2)配列番号:270の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:21塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:270:
(2)配列番号:271の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:11塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−NH2修飾されている
(xi)配列:配列番号:271:
(2)配列番号:272の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:49塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:272:
(2)配列番号:273の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:47塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:273:
(2)配列番号:274の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:45塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:274:
(2)配列番号:275の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:45塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:275:
(2)配列番号:276の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:45塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:276:
(2)配列番号:277の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:45塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:277:
(2)配列番号:278の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:42塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:278:
(2)配列番号:279の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:47塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:279:
(2)配列番号:280の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:42塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:280:
(2)配列番号:281の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:41塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:281:
(2)配列番号:282の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:44塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:282:
(2)配列番号:283の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:43塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:283:
(2)配列番号:284の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:43塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:284:
(2)配列番号:285の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:41塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:285:
(2)配列番号:286の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:44塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:286:
(2)配列番号:287の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:44塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:287:
(2)配列番号:288の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:43塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:288:
(2)配列番号:289の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:42塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:289:
(2)配列番号:290の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:44塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:290:
(2)配列番号:291の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:43塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:291:
(2)配列番号:292の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:41塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:292:
(2)配列番号:293の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:39塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:293:
(2)配列番号:294の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:294:
(2)配列番号:295の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:38塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:295:
(2)配列番号:296の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:34塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:296:
(2)配列番号:297の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:297:
(2)配列番号:298の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:32塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:298:
(2)配列番号:299の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:12塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:299:
(2)配列番号:300の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:42塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:300:
(2)配列番号:301の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:41塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:301:
(2)配列番号:302の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:41塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:302:
(2)配列番号:303の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:39塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:303:
(2)配列番号:304の情報:
(i)配列の特色:
(A)長さ:43塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:RNA
(ix)配列の特徴:
(D)他の情報:全てのピリミジンは2’−フルオロ(2’F)修飾されている
(xi)配列:配列番号:304:
Claims (80)
- TGFβに対する核酸リガンドの同定方法であって、
a) 核酸の候補混合物をTGFβに接触させ、ここで候補混合物よりTGFβへの親和性が上昇している核酸を、残りの候補混合物から分離する工程、
b) 残りの候補混合物から親和性が上昇した核酸を分離する工程、および
c) 親和性が上昇した核酸を増幅して、TGFβへの結合について比較的高い親和性と特異性を有する核酸配列が濃縮された核酸の混合物を得て、こうしてTGFβの核酸リガンドを同定する工程、
からなる上記方法。 - d)工程a)、b)およびc)を繰り返す工程を、さらに含む請求の範囲第1項に記載の方法。
- 核酸の候補混合物は1本鎖核酸からなる、請求の範囲第1項に記載の方法。
- 1本鎖核酸はリボ核酸である、請求の範囲第3項に記載の方法。
- 核酸は修飾核酸からなる、請求の範囲第4項に記載の方法。
- 核酸は、2’−アミノ(2’−NH2)修飾リボ核酸である、請求の範囲第5項に記載の方法。
- 核酸は2’−F修飾リボ核酸である、請求の範囲第5項に記載の方法。
- 核酸は2’−NH2−UTP、2’−F−CTP修飾リボ核酸である、請求の範囲第5項に記載の方法。
- 核酸は2’−F−UTP、2’−NH2−CTP修飾リボ核酸である、請求の範囲第5項に記載の方法。
- 1本鎖核酸はデオキシリボ核酸である、請求の範囲第3項に記載の方法。
- 哺乳動物およびヒトにおけるTGFβ媒介の病的状態の治療のための医薬組成物の製造のためのTGFβ核酸リガンドの使用。
- TGFβ核酸リガンドは、請求の範囲第1項に記載の方法により同定される、請求の範囲第11項に記載の使用。
- 哺乳動物およびヒトにおけるTGFβ1媒介の病的状態の治療のための医薬組成物の製造のためのTGFβ1核酸リガンドの使用。
- TGFβ1核酸リガンドは、請求の範囲第1項に記載の方法により同定される、請求の範囲第13項に記載の使用。
- リガンドは表3と6に記載のリガンド(配列番号12〜42;55〜89)から選択される、請求の範囲第14項に記載の使用。
- 精製され単離された、天然に存在しない、TGFβに対する核酸リガンド。
- 精製され単離された、天然に存在しない、TGFβ1に対する核酸リガンド。
- 核酸リガンドは1本鎖である、請求の範囲第17項に記載の、精製され単離された、天然に存在しない核酸リガンド。
- 核酸リガンドはリボ核酸である、請求の範囲第18項に記載の、精製され単離された、天然に存在しない核酸リガンド。
- 核酸リガンドはデオキシリボ核酸である、請求の範囲第18項に記載の、精製され単離された、天然に存在しない核酸リガンド。
- a)核酸の候補混合物をTGFβに接触させ、ここで候補混合物よりTGFβへの親和性が上昇している核酸を、残りの候補混合物から分離する工程、
b) 残りの候補混合物から親和性が上昇した核酸を分離する工程、および
c) 親和性が上昇した核酸を増幅して、TGFβへの結合について比較的高い親和性と特異性を有する核酸配列が濃縮された核酸の混合物を得て、こうしてTGFβの核酸リガンドを同定する工程、
からなる方法により同定されるTGFβに対する核酸リガンド。 - a)核酸の候補混合物をTGFβ1に接触させ、ここで候補混合物よりTGFβ1への親和性が上昇している核酸を、残りの候補混合物から分離する工程、
b) 残りの候補混合物から親和性が上昇した核酸を分離する工程、および
c) 親和性が上昇した核酸を増幅して、TGFβ1への結合について比較的高い親和性と特異性を有する核酸配列が濃縮された核酸の混合物を得て、こうしてTGFβ1の核酸リガンドを同定する工程、
からなる方法により同定されるTGFβ1に対する核酸リガンド。 - リガンドは、表3に記載の配列(配列番号12〜42)よりなる群から選択される、請求の範囲第19項に記載の、精製され単離された、天然に存在しない、TGFβ1に対するリボ核酸リガンド。
- リガンドは、表3に記載の配列(配列番号12〜42)よりなる群から選択されるリガンドと、実質的に相同的であり、TGFβ1に結合する実質的に同じ能力を有する、請求の範囲第19項に記載の、精製され単離された、天然に存在しない、TGFβ1に対するリボ核酸リガンド。
- リガンドは、表3に記載の配列(配列番号12〜42)よりなる群から選択されるリガンドと、実質的に同じ構造を有し、TGFβ1に結合する実質的に同じ能力を有する、請求の範囲第19項に記載の、精製され単離された、天然に存在しない、TGFβ1に対するリボ核酸リガンド。
- リガンドは、表6に記載の配列(配列番号55〜89)よりなる群から選択される、請求の範囲第20項に記載の、精製され単離された、天然に存在しない、TGFβ1に対するデオキシリボ核酸リガンド。
- リガンドは、表6に記載の配列(配列番号55〜89)よりなる群から選択されるリガンドと、実質的に相同的であり、TGFβ1に結合する実質的に同じ能力を有する、請求の範囲第20項に記載の、精製され単離された、天然に存在しない、TGFβ1に対するデオキシリボ核酸リガンド。
- リガンドは、表6に記載の配列(配列番号55〜89)よりなる群から選択されるリガンドと、実質的に同じ構造を有し、TGFβ1に結合する実質的に同じ能力を有する、請求の範囲第20項に記載の、精製され単離された、天然に存在しない、TGFβ1に対するデオキシリボ核酸リガンド。
- PDGFに対する核酸リガンドの同定方法であって、
a) 核酸の候補混合物をPDGFに接触させ、ここで候補混合物よりPDGFへの親和性が上昇している核酸を、残りの候補混合物から分離する工程、
b) 残りの候補混合物から親和性が上昇した核酸を分離する工程、および
c) 親和性が上昇した核酸を増幅して、PDGFへの結合について比較的高い親和性と特異性を有する核酸配列が濃縮された核酸の混合物を得て、こうしてPDGFの核酸リガンドを同定する工程、
からなる上記方法。 - d)工程a)、b)およびc)を繰り返す工程を、さらに含む請求の範囲第29項に記載の方法。
- 核酸の候補混合物は1本鎖核酸からなる、請求の範囲第29項に記載の方法。
- 1本鎖核酸はリボ核酸である、請求の範囲第31項に記載の方法。
- 1本鎖核酸はデオキシリボ核酸である、請求の範囲第31項に記載の方法。
- 核酸は修飾核酸からなる、請求の範囲第32項に記載の方法。
- 核酸は、2’−アミノ(2’−NH2)修飾リボ核酸である、請求の範囲第34項に記載の方法。
- 核酸は2’−フルオロ(2’−F)修飾リボ核酸である、請求の範囲第34項に記載の方法。
- PDGF媒介疾患の治療のための医薬組成物の製造のためのPDGFの核酸リガンドの使用。
- 核酸リガンドは、請求の範囲第29項に記載の方法により同定される、請求の範囲第37項に記載の使用。
- 核酸リガンドは、表8と13、および図3、4、と10に記載のリガンド(配列番号93〜124;128〜176)の1つから選択される、請求の範囲第38項に記載の使用。
- 精製され単離された、天然に存在しない、PDGFに対する核酸リガンド。
- 核酸リガンドは1本鎖である、請求の範囲第40項に記載の、精製され単離された、天然に存在しない核酸リガンド。
- 核酸リガンドはリボ核酸である、請求の範囲第41項に記載の、精製され単離された、天然に存在しない核酸リガンド。
- 核酸リガンドはデオキシリボ核酸である、請求の範囲第41項に記載の、精製され単離された、天然に存在しない核酸リガンド。
- a)核酸の候補混合物をPDGFに接触させ、ここで候補混合物よりPDGFへの親和性が上昇している核酸を、残りの候補混合物から分離する工程、
b) 残りの候補混合物から親和性が上昇した核酸を分離する工程、および
c) 親和性が上昇した核酸を増幅して、PDGFへの結合について比較的高い親和性と特異性を有する核酸配列が濃縮された核酸の混合物を得て、こうしてPDGFの核酸リガンドを同定する工程、
からなる方法により同定されるPDGFに対する核酸リガンド。 - リガンドは、表13に記載の配列(配列番号128〜170)よりなる群から選択される、請求の範囲第42項に記載の、精製され単離された、天然に存在しない、PDGFに対するリボ核酸リガンド。
- リガンドは、表13に記載の配列(配列番号128〜170)よりなる群から選択されるリガンドと、実質的に相同的であり、PDGFに結合する実質的に同じ能力を有する、請求の範囲第42項に記載の、精製され単離された、天然に存在しない、PDGFに対するリボ核酸リガンド。
- リガンドは、表13に記載の配列(配列番号128〜170)よりなる群から選択されるリガンドと、実質的に同じ構造を有し、PDGFに結合する実質的に同じ能力を有する、請求の範囲第42項に記載の、精製され単離された、天然に存在しない、PDGFに対するリボ核酸リガンド。
- リガンドは、表8と9、および図3、4、と10に記載の配列(配列番号93〜124、171〜176)よりなる群から選択される、請求の範囲第43項に記載の、精製され単離された、天然に存在しない、PDGFに対するデオキシリボ核酸リガンド。
- リガンドは、表8と9、および図3、4、と10に記載の配列(配列番号93〜124、171〜176)よりなる群から選択されるリガンドと、実質的に相同的であり、PDGFに結合する実質的に同じ能力を有する、請求の範囲第43項に記載の、精製され単離された、天然に存在しない、PDGFに対するデオキシリボ核酸リガンド。
- リガンドは、表8と9、および図3、4、と10に記載の配列(配列番号93〜124、171〜176)よりなる群から選択されるリガンドと、実質的に同じ構造を有し、PDGFに結合する実質的に同じ能力を有する、請求の範囲第43項に記載の、精製され単離された、天然に存在しない、PDGFに対するデオキシリボ核酸リガンド。
- 図3(配列番号171)に記載の保存構造からなる、請求の範囲第40項に記載の、精製され単離された、天然に存在しない、PDGFに対する核酸リガンド。
- hKGFに対する核酸リガンドの同定方法であって、
a) 核酸の候補混合物をhKGFに接触させ、ここで候補混合物よりhKGFへの親和性が上昇している核酸を、残りの候補混合物から分離する工程、
b) 残りの候補混合物から親和性が上昇した核酸を分離する工程、および
c) 親和性が上昇した核酸を増幅して、hKGFへの結合について比較的高い親和性と特異性を有する核酸配列が濃縮された核酸の混合物を得て、こうしてhKGFの核酸リガンドを同定する工程、
からなる上記方法。 - d)工程a)、b)およびc)を繰り返す工程を、さらに含む請求の範囲第52項に記載の方法。
- 核酸の候補混合物は1本鎖核酸からなる、請求の範囲第52項に記載の方法。
- 1本鎖核酸はリボ核酸である、請求の範囲第54項に記載の方法。
- 核酸は修飾核酸からなる、請求の範囲第55項に記載の方法。
- 核酸は、2’−アミノ(2’−NH2)修飾リボ核酸である、請求の範囲第56項に記載の方法。
- 核酸は2’−F修飾リボ核酸である、請求の範囲第56項に記載の方法。
- 哺乳動物およびヒトにおけるhKGF媒介の病的状態の治療のための医薬組成物の製造のためのhKGF核酸リガンドの使用。
- 核酸リガンドは、請求の範囲第52項に記載の方法により同定される、請求の範囲第59項に記載の使用。
- 核酸リガンドは、表16と23に記載のリガンド(配列番号189〜262、272〜304)の1つから選択される、請求の範囲第60項に記載の使用。
- hKGF受容体媒介細胞増殖を阻害する能力について試験化合物を測定する方法であって、
a)試験化合物をhKGF核酸リガンドおよびケラチン細胞増殖因子と接触させる工程;および
b)hKGF核酸リガンドとケラチン細胞増殖因子の間の結合を阻害する試験化合物の能力を検出する工程、
からなる上記方法。 - 増殖因子とその原形質膜結合受容体との相互作用を阻害する能力について試験化合物を測定する方法であって、
a) 原形質膜結合受容体を含有する細胞を可溶化する工程;
b) 細胞の原形質膜結合抽出物を作成する工程;
c) 抽出物を、標識された増殖因子のみおよび試験化合物の存在下で反応させて、複合体を形成させる工程;
d) 複合体を電気泳動により未変性の条件下で解析する工程;
e) イメージングにより複合体を可視化する工程;および
e) 抽出物と標識した増殖因子とのイメージを、試験化合物の存在下での抽出物のイメージと比較して、試験化合物が増殖因子と原形質膜結合受容体との間の相互作用を阻害したか否かを測定する工程、
からなる、上記方法。 - 増殖因子はhKGFである、請求の範囲第63項に記載の方法。
- 細胞はPC−3細胞である、請求の範囲第63項に記載の方法。
- 試験化合物は小分子、ペプチド、および抗体よりなる群から選択される、請求の範囲第63項に記載の方法。
- イメージングは、オートラジオグラフィーおよびホスホルイメージングよりなる群から選択される、請求の範囲第63項に記載の方法。
- 細胞が増殖因子原形質膜結合受容体を発現するかどうかを調べるために細胞を測定する方法であって、
a) 細胞を可溶化する工程;
b) 細胞の原形質膜抽出物を作成する工程;
c) 原形質膜抽出物を標識した増殖因子と反応させる工程;
d) 原形質膜抽出物と標識した増殖因子との間の反応を、未変性条件下の電気泳動で解析する工程;
e) 工程d)の電気泳動を標識した増殖因子の電気泳動と比較する工程;および
f) 標識した増殖因子単独の移動度に比較して、変化した移動度を有する複合体が形成されたかどうかを調べるために、電気泳動の結果を可視化する工程、からなる上記方法。 - 精製され単離された、天然に存在しない、hKGFに対する核酸リガンド。
- 核酸リガンドは1本鎖である、請求の範囲第69項に記載の、精製され単離された、天然に存在しない核酸リガンド。
- 核酸リガンドはリボ核酸である、請求の範囲第70項に記載の、精製され単離された、天然に存在しない核酸リガンド。
- a)核酸の候補混合物をhKGFに接触させ、ここで候補混合物よりhKGFへの親和性が上昇している核酸を、残りの候補混合物から分離する工程、
b) 残りの候補混合物から親和性が上昇した核酸を分離する工程、および
c) 親和性が上昇した核酸を増幅して、hKGFへの結合について比較的高い親和性と特異性を有する核酸配列が濃縮された核酸の混合物を得て、こうしてhKGFの核酸リガンドを同定する工程、
からなる方法により同定されるhKGFに対する核酸リガンド。 - リガンドは、表16と23に記載の配列(配列番号189〜262、272〜304)よりなる群から選択される、請求の範囲第71項に記載の、精製され単離された、天然に存在しない、hKGFに対するリボ核酸リガンド。
- リガンドは、表16と23に記載の配列(配列番号189〜262、272〜304)よりなる群から選択されるリガンドと、実質的に相同的であり、hKGFに結合する実質的に同じ能力を有する、請求の範囲第71項に記載の、精製され単離された、天然に存在しない、hKGFに対するリボ核酸リガンド。
- リガンドは、表16と23に記載の配列(配列番号189〜262、272〜304)よりなる群から選択されるリガンドと、実質的に同じ構造を有し、hKGFに結合する実質的に同じ能力を有する、請求の範囲第71項に記載の、精製され単離された、天然に存在しない、hKGFに対するリボ核酸リガンド。
- リガンドは、配列番号267に示す配列を有する、精製され単離された、天然に存在しない、hKGFに対するリボ核酸リガンド。
- 薬剤として有効な量のTGFβ核酸リガンドを活性成分として含む、TGFβ媒介の病的状態を治療するための医薬組成物。
- 薬剤として有効な量のTGFβ1核酸リガンドを活性成分として含む、TGFβ1媒介の病的状態を治療するための医薬組成物。
- 薬剤として有効な量のPDGF核酸リガンドを活性成分として含む、PDGF媒介の病的状態を治療するための医薬組成物。
- 薬剤として有効な量のhKGF核酸リガンドを活性成分として含む、hKGF媒介の病的状態を治療するための医薬組成物。
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