JP2007020527A - γ−アミノ酪酸豊富な食品の製造法及びγ−アミノ酪酸産生菌ラクトバシルス・カルバタスKM14株 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、グルタミン酸含有蛋白素材を水系下に加水分解したもの、及び/又はグルタミン酸含有アミノ酸混合物をγ−アミノ酪酸産生菌ラクトバシルス・カルバタスを用いて発酵することを特徴とするγ−アミノ酪酸豊富な食品の製造法である。また、本発明は、γ−アミノ酪酸産生菌ラクトバシルス・カルバタス KM14株である。
【選択図】なし
Description
そして一般に、グルタミン酸もしくはその塩をGABA生成菌や特許文献2に記載のような米糠の酵素や酵母の補酵素を使用し、GABAに変換される。
しかし上記の報告では精製グルタミン酸を原料としてGABAを生産しているに過ぎない。製造コストを考慮すると、精製グルタミン酸を使用しなくとも、高蛋白含有物を分解してGABAを生成させ、一貫して効率よくGABAの豊富な食品を製造する技術が望まれている。
また、特許文献8には、キムチから単離されたラクトバチルス・ヒルガルディー K-3株(寄託番号:FERM P-18422)およびそれを使用した食品の製造方法が開示されている。
これらのうちで、オカラを用いるものとしては、特許文献9に、オカラを酵素などで分解した可溶化液、構成アミノ酸としてグルタミン酸を含む蛋白質などからなる培地にGABA生産菌を培養し、GABAを生成させ、これを含む食品素材が開示されている。このGABA生産菌として乳酸菌、酵母、菌、枯草菌(納豆菌)、放射菌、糸状菌、担子菌、連鎖球菌、粘菌類、光合成菌、芽胞菌、藻類(クロレラ)などが列挙されているが、乳酸菌は具体的には実施例においてラクトバチルス・ブレビス IFO12005を開示しているだけである。
また、特許文献10に、オカラに糖類を加えて乳酸発酵して飲料を製造する方法を開示している。しかし、オカラを酵素分解するわけでもなく、乳酸菌もラクトバシルス・アシドフイルスなど公知の菌を用いており、GABAに関する記載も見られない。
次に、グルタミン酸を含む蛋白素材の一つとして、加熱したオカラに酵素や麹菌を添加して、分解した分解物に前記GABA生産乳酸菌を接種して発酵したところGABAを豊富に含む食品が得られることを見出した。
この際に、グルタミン酸あるいはグルタミン酸を含むペプチド等は添加しなくてもGABAを豊富に含む食品が得られる知見を得た。
そして、ラクトバシルス・カルバタス(Lactobacillus curvatus)のなかでも最もGABA生産能に優れたラクトバシルス・カルバタス(Lactobacillus curvatus)KM14株を見出したのである。
グルタミン酸含有蛋白素材としてオカラを利用することができる。
加水分解として、酸分解又は酵素分解を利用することができる。
ラクトバシルス・カルバタスとして、グルタミン酸を5重量%含む培地において30℃で2日間培養したとき、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率が50%以上、好ましくは60%以上となるものを利用することができる。
ラクトバシルス・カルバタスとして、グルタミン酸を5重量%含む培地において30℃で2日間培養したときの、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率が70%以上となるラクトバシルス・カルバタス KM14株(寄託番号:FERM P-20497)を利用することがより好ましい。
また、本発明は、グルタミン酸を5重量%含む培地において30℃で2日間培養したときの、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率が50%以上であるγ−アミノ酪酸産生菌ラクトバシルス・カルバタスである。
ラクトバシルス・カルバタスの菌株は、グルタミン酸を5重量%含む培地において30℃で2日間培養したときの、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率が70%以上であるγ−アミノ酪酸産生菌ラクトバシルス・カルバタス KM14株(寄託番号:FERM P-20497)が好ましい。
また、本発明により新規GABA乳酸菌ラクトバシルス・カルバタス KM14株が見出されたものである。
通常、グルタミン酸を含む食用の蛋白素材であれば特に限定されない。小麦、大豆、コーン、米などの植物蛋白、鳥獣魚介肉などの動物性蛋白も利用することができる。
この内、小麦由来の蛋白素材、例えば小麦グルテンなどはグルタミン酸が豊富で好ましい。この場合、加水分解をアルカリ域で行う必要がある。
また、大豆由来の蛋白素材もグルタミン酸が豊富であり好ましい。大豆由来の蛋白素材としては、大豆、大豆粉、脱脂大豆、豆乳や豆乳粉末、濃縮大豆蛋白、分離大豆蛋白などの他、大豆蛋白質が含まれているオカラなどを利用することができる。
オカラ中には蛋白質や糖質などが含まれており、蛋白質が20〜30重量%含まれる。オカラの蛋白質を構成するアミノ酸の内、グルタミン酸の構成比は20重量%を占めており、大豆蛋白素材の中でもオカラに含まれるグルタミン酸含量はより高い。
よって本発明においては、グルタミン酸含有蛋白素材としてオカラを使用することがより好ましい。
加熱を行う場合の温度は特に限定されないが、例えばオカラは通常100℃〜160℃で1分〜60分行われ、好ましくは100〜130℃で10〜60分が適当である。
オカラ中の蛋白質を熱変性させて酵素で加水分解されやすくするだけでなく、オカラ中のセルロース、ヘミセルロースなどを熱水分解して水溶性ヘミセルロースを生成したり、後述するセルラーゼなどのオカラ繊維の加水分解酵素を作用しやすくする効果がある。
加水分解に酵素を用いる場合、蛋白質分解酵素が好ましい。動物起源、植物起源、微生物起源などの起源は問わず、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼの何れでもよいが、アルカリプロテアーゼは小麦蛋白(グルテン)、米蛋白(プロラミン)、コーン蛋白(ゼイン)のようにアルカリ域で溶解する蛋白に有効なだけでなく大豆蛋白にも有効であり好ましい。
繊維質の分解を促進させるためには、各種エステラーゼ、キシラーゼなどを加えることがより有効である。その他の多糖類加水分解酵素を添加することもできる。
分解条件は使用する酵素によっても異なるため特に限定されないが、通常は20〜70℃で1〜24時間であり、より好ましくは40〜60℃で12時間〜24時間が適当である。また、pHは使用する酵素の作用pH範囲で行えばよい。
水100部に対して、10〜30部(w/w比)のオカラを分散、より好ましくは水100部に対して、10〜20部(w/w比)のオカラを分散させ、前述の酵素により加水分解することが適当である。
オカラの割合が多すぎるとオカラが膨潤して操作性が悪くなり、オカラの割合が少なすぎると、例えば約0.5〜1.0部のグルタミン酸しか溶出しないので効率が悪くなる。
本発明のGABA産生菌を用いて発酵することにより前記割合で生成されたグルタミン酸をより効率よくGABAに変換できるものである。
本発明に用いるGABA産生菌ラクトバシルス・カルバタスは、グルタミン酸をGABAへ変換する能力を有するものであれば用いることができる。
特にグルタミン酸を5重量%含む培地において30℃で2日間培養したときの、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率が50%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは70%以上のラクトバシルス・カルバタスが適当である。70%以上の変換率を有する乳酸菌としては、ラクトバシルス・カルバタス KM14株が好ましい。なお、変換率は培養前のグルタミン酸濃度に対する培養後のGABA濃度(%)を算出して求めることができる。
この分離菌を培養後、グルタミン酸−ブロモクレゾール グリーンを使用し、グルタミン酸のカルボキシル基がグルタミン酸カルボキシラーゼによって脱炭酸されるときのpHの変化を測定することによりグルタミン酸デカルボキシラーゼ活性を測定することができる(Rice, E.W., C.H. Johnson, M.E. Dunnigan, and D.J. Reasoner (1993) Applied and Environmental Microbiology 59 (12) 4347-4349)。
この数種の乳酸菌は、菌学的特性や遺伝学的相同性試験の結果、全てラクトバシルス・カルバタスであった。
さらにこの数種の菌を培地にグルタミン酸を加え、変換率を測定したところ、1タイプの菌株がほぼ全てのグルタミン酸をGABAに変換していることが明らかとなった。
そこで、この活性が特に高かった株をγ−アミノ酪酸産生菌「ラクトバシルス・カルバタス KM14株」として寄託した(寄託番号:FERM P-20497)。
グルタミン酸含有蛋白素材を水系下に加水分解したもの及び/又はグルタミン酸含有アミノ酸混合物は前述のようにグルタミン酸が豊富な素材である。
この素材中のグルタミン酸をラクトバシルス・カルバタスを用いて発酵することによりGABAを生成し、目的のGABAが豊富な食品を得ることができる。
また、発酵後の培養物を公知の方法でろ過、濃縮、活性炭処理などで清澄化することも可能である。この清澄化はろ紙、ろ布などを用いる濾過方法、あるいは遠心分離など公知の手段を利用することができる。
また、発酵後の培養物のpHを調整、あるいは無調整で濃縮することも可能である。濃縮手段は特に限定されず、例えば、エバポレーターなどで加熱温度70〜90℃、蒸発温度40〜60℃により行うことができる。
また、必要に応じて、濾過滅菌、加熱滅菌などによって滅菌することもできる。また炭酸を充填して炭酸飲料にすることもできる。
また、オカラを分解して発酵したものは旨味成分も多いので、味噌、醤油、塩、食酢、香辛料、砂糖などの甘味料を加え、調味料などの食品素材としても利用できる。
[実施例1]
(乳酸菌類の分離)
供試試料は市販の殺菌していない国内産漬物、キムチ、糠漬けなど5種類を用いた。また、炊いた米10gを50mlのイオン交換水に浸漬させ室温で2週間放置後、試料とした。
乳酸菌の分離は試料 1 gを生理食塩水で適宜希釈し、YPD白亜寒天培地(1重量%グルコース、0.5重量%ペプトン、1重量%酵母エキス、0.5重量%炭酸カルシウム、1.5重量%寒天)にて、30℃ または37℃ で平板培養し、生育したコロニーから行った。
E.W.Riceらの方法(Rice, E.W., C.H. Johnson, M.E. Dunnigan, and D.J. Reasoner (1993) Applied and Environmental Microbiology 59 (12) 4347-4349)に従って行った。
すなわち、分離された菌を液体培地(1重量%グルコース、0.5重量%ペプトン、1重量%酵母エキス)にて30℃、48時間培養した。この培養液から遠心分離によって菌体を回収した。さらに、この菌体を生理食塩水(NaCl 0.85% )で洗浄後、表1に示したGAD(Glutamate Decarboxylase)試薬を0.6 mlずつ分注し、攪拌後30℃、72 hr放置した。これを遠心分離で、菌体を除去後、上澄み液の660 nmにおける吸光度を測定した。
GABAは菌体の持っているGADによってグルタミン酸のカルボキシル基から脱炭酸して得られ、その際にカルボキシル基に作用するので、酸性から中性付近へとpHが変動する。
そこで、培養した菌体を糖を含まないグルタミン酸溶液にいれ、脱炭酸反応によるpH の変化をブロモクレゾールグリーン溶液で測定した。
このGAD測定は、菌体により生成されるGADによりグルタミン酸が脱炭酸されることで、pHが中性付近に移行し、黄色から青色に呈色する反応を利用する。分離の際に、コロニーのタイプや形状などをグループ別にし、その中で、無作為に釣菌した。その得られた15 タイプの株から 4 株に発色が認められ、GABA生産能が認められた。
────────────────────
L-グルタミン酸 1g
ブロモクレゾール グリーン 0.05g
塩化ナトリウム 90g
トリトン X-100(商品名) 3ml
蒸留水 1000ml
────────────────────
生理学的同定試験は「乳酸菌実験マニュアル」(内村泰ら:乳酸菌実験マニュアル〜分離から同定まで〜 (株)朝倉書店 (1992))に従った。
すなわち、グラム染色は菌体を火炎固定後、クリスタルバイオレット液で染色し、エタノール・アセトン(2:1)混合液で脱色し、乾燥後1,000倍の倍率で検鏡した。形態及び胞子形成観察はカバーグラスに菌体を風乾、火炎固定後メチレンブルー液で染色し、洗浄後、乾燥し、1,000倍の倍率で検鏡した。
胞子は、染色された細胞内に無色透明の光るものが観察されたとき、胞子ありとした。
カタラーゼ試験は培養した菌体を回収し、3% 過酸化水素水 1 mlを注ぎ2〜3分観察した。このとき発泡がないものはカタラーゼ陰性、発泡が認められたものはカタラーゼ陽性とした。
運動性試験は0.15%寒天培地を用いて、前培養した供試菌株を白金線に付け穿刺した。30℃ で3日間培養し、穿刺の広がりを肉眼観察した。ガス発生試験は液体培地ダーラム管を入れて、ガス発生の有無を肉眼観察した。生育温度試験は液体培地にて15℃、20℃、40℃、45℃ で3日間培養し、生育の有無を観察した。
───────────────
形態観察 短桿
胞子形成 なし
グラム染色 陽性
カタラーゼ なし
運動性 なし
ガス発生 なし
───────────────
次に、糖の資化性について、下記に示した18種類の糖を加えた培地(1重量%酵母エキス、0.5重量%ペプトン、1重量%各種糖)での生育を観察した。その結果、表3の通り、リボース、フラクトース、ラクトース、マンノースに発酵性が認められた。しかし、Xyloseに発酵性が認められなかったことよりカルバタスであることが明らかとなり、食品として十分に適する菌種であることがわかった。
────────────────────────────────
Arabinose − Ribose + Xylose − Galactose +
Fructose + Mannitol − Sorbitol − Cellobiose −
Maltose − Lactose + Melibiose − Saccharose −
Trehalose − Raffinose − Mannose + Rhamnose −
Sucrose − Starch −
────────────────────────────────
(+;資化性あり、−;資化性なし)
11SリボソームRNAは菌の属種固有の遺伝的配列である。この配列によって、菌種の属種が推定できる。菌体を培養後、定法に従い、DNAをフェノール−クロロフォルムで抽出後、11sリボソームRNAに存在する特定配列を鋳型としてPCRで増幅した。これをDNAシークエンサーで配列を読み込んだ。このデータをデータベースよりタイプストレインの配列と比較し、相同性を算出した。
11SリボソームRNAの結果より、98%の相同性があった。つまり、KM14株の遺伝配列はタイプストレインのそれと比べて98%同じであることが示された。
また、菌学的特性や遺伝学的相同性試験の結果、4種は同等で、ラクトバシルス・カルバタスであることが確認された。そこで、活性の高かった株をγ−アミノ酪酸産生菌ラクトバシルス・カルバタス KM14株として寄託した(寄託番号:FERM P-20497)。
(オカラからのGABA生産)
分離大豆蛋白製造工程で副製されるオカラ(不二製油株式会社製)10gに蒸留水100mlを加え、オートクレーブにて120℃で20分間の加熱を行った。
加熱したオカラ分散液に5ml滅菌水に溶解した蛋白質分解酵素、スミチームFP(商品名、新日本化学工業株式会社)、ウマミザイムG(商品名、天野エンザイム株式会社)を、それぞれ0.01g加え12〜24時間50℃で加水分解した後、遠心分離にて固液分離を行った。
また、加熱したオカラ分散液に別途塩酸で酸分解したオカラ分解物を調製した。
これらのオカラ分解物に前記の「ラクトバシルス・カルバタス KM14株」を接種し、30℃で48時間培養した。結果を表4に示した。
───────────────────────────────────
条件 固形分濃度(重量%) 培養前グルタミン酸 培養後GABA
───────────────────────────────────
酵素分解 4.9 1380 1195
酸分解 11.5 6770 4280
───────────────────────────────────
本発明において見出されたラクトバシルス・カルバタスKM14株のGABA生産能について他の乳酸菌との比較を行った。
(方法)
供試菌株として、ラクトバシルス・カルバタスKM14株、対照としてラクトバシルス・ブレビスNRIC 1032を用いた。
先ず、菌株のGAD(Glutamate decarboxylase)測定は、液体培地(1重量%グルコース、0.5重量%ペプトン、1重量%酵母エキス)にて30℃、48hr培養を行なった。この菌体を生理食塩水にて洗浄し、活性菌体とした。
これをグルタミン酸が1〜5%含む1重量%グルコース、1重量%酵母エキス溶液に接種し、一般的に漬物中でGABAを生産することが知られているラクトバシルス・ブレビスと同様に、30℃で、48時間培養した。その結果を表5に示した。
─────────────────────────────────────
菌株 培養前グルタミン酸 培養後グルタミン酸 培養後GABA 変換率
─────────────────────────────────────
KM14株 1 0.1 0.9 90%
2 0.1 1.5 75%
5 0.1 3.5 70%
─────────────────────────────────────
ブレビス株 1 0.1 0.6 60%
2 0.9 1.0 50%
5 3.2 1.8 36%
─────────────────────────────────────
また、オカラのように従来は副産物として有効利用が少なかった蛋白含有素材を予め酸分解や酵素分解し、GABA生産乳酸菌を接種して発酵するとGABAを豊富に含む食品が得られるものであり、オカラの有効利用が可能となった。
本発明は、オカラだけでなくグルタミン酸を含有する蛋白素材からGABA含有食品の生産が可能になったものであり産業の発達に大いに寄与するものである。
Claims (7)
- グルタミン酸含有蛋白素材を水系下に加水分解したもの、及び/又はグルタミン酸含有アミノ酸混合物を、γ−アミノ酪酸産生菌ラクトバシルス・カルバタス(Lactobacillus curvatus)を用いて発酵することを特徴とするγ−アミノ酪酸豊富な食品の製造法。
- グルタミン酸含有蛋白素材がオカラである請求項1の製造法。
- 加水分解が酸分解又は酵素分解である請求項1の製造法。
- ラクトバシルス・カルバタスが、グルタミン酸を5重量%含む培地において30℃で2日間培養したとき、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率が50%以上のγ−アミノ酪酸産生能を有するものである請求項1の製造法。
- ラクトバシルス・カルバタスが、グルタミン酸を5重量%含む培地において30℃で2日間培養したとき、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率が70%以上のγ−アミノ酪酸産生能を有するラクトバシルス・カルバタス KM14株(寄託番号:FERM P-20497)である請求項1の製造法。
- グルタミン酸を5重量%含む培地において30℃で2日間培養したときの、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率が50%以上であるγ−アミノ酪酸産生菌ラクトバシルス・カルバタス。
- グルタミン酸を5重量%含む培地において30℃で2日間培養したときの、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率が70%以上であるγ−アミノ酪酸産生菌ラクトバシルス・カルバタス KM14株(寄託番号:FERM P-20497)。
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