JP2007003474A - 試料液中粒子の位置制御方法および粒子測定装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 試料液中に含まれる粒子の位置を自動的に調整できるようにする。
【解決手段】 ラミナーシースフロー形成部１２は、フローセル１４とヘッド部１６とから構成してある。フローセル１４は、シース液２８に包まれた試料液２２が流れる試料流路５２を有する。ヘッド部１６には、試料液２２を供給する試料液供給ノズル６６と、試料液供給ノズル６６が供給した試料液２２の周囲にシース液２８を供給するシース液供給部５８とを備えている。ヘッド部１６の上方からは、レーザビームからなるトラップビーム４８が入射する。トラップビーム４８は、試料流路５２に入射し、励起レーザビーム３２の中心部を通る。試料液２２に含まれている粒子は、トラップビーム４８にトラップされて、励起レーザビーム３２の中心部を通過する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、流体中に含まれる粒子の位置を制御する方法に係り、特に細い流路に試料液を連続的に流し、側方からレーザビームを照射して試料液中に含まれる粒子を測定するフローサイトメトリーに好適な試料液中粒子の位置制御方法および粒子測定装置に関する。

近年、フローサイトメトリーと呼ばれる分析手法が医療分野や環境分野、工業分野などにおいて広く用いられている。フローサイトメトリーは、化学物質や、蛍光物質によって標識付けした細胞、タンパク質、細菌などの粒子を試料液に含ませてフローセルの試料流路に連続的に供給して流し、側方からレーザビームを照射してその散乱光や粒子から放射された蛍光を検出し、粒子の数や特性などを分析する手法である。

レーザビームは、周知のように強度がガウス分布をなしている。このため、粒子がレーザビームの中心部を通過した場合と周縁部を通過した場合とでは、検出した散乱光の強度や蛍光の強度が異なってくる。このため、測定の信頼性を高めるためには、試料液中に含まれている粒子をレーザビームの一定の位置、特にエネルギーが最も大きい中心部を通るように制御することが望ましい。そこで、レーザビームを２つのビームに分割し、これらを平行させてフローセルに入射し、各ビームに基づく検出信号から試料流のずれを検出し、ノズルホルダに設けた調整つまみによってサンプルノズルの位置を調整し、試料流がいずれか一方のビームの中心を通るようにする方法が提案されている（特許文献１）。
特開平７−３１８４７８号公報

特許文献１に記載の位置調整方法は、サンプルノズルを移動可能に形成するとともに、サンプルノズルに調整つまみを設ける必要がある。このため、測定装置が複雑高価となる。しかも、オペレータが手で調整つまみを回転させてサンプルノズルの位置を調整しなければならず、操作が面倒であるとともに調整に時間がかかる。また、試料液やシース液の供給側における圧力変動などによる一時的、突発的な位置ずれに対応することが困難である。

本発明は、前記従来技術の欠点を解消するためになされたもので、試料液中に含まれる粒子の位置を自動的に調整できるようにすることを目的としている。
また、本発明は、一時的、突発的な位置ずれにも容易に対応できるようにすることを目的としている。

上記の目的を達成するために、本発明に係る試料液中粒子の位置制御方法は、シース液に包まれてフローセル中を流れる試料液中の粒子の位置を制御する方法であって、前記フローセルの試料流路内に流路に沿ってレーザビームからなるトラップビームを入射し、前記フローセルに供給された前記粒子を前記トラップビームで捕捉して、前記試料流路の側方から照射した励起レーザビームの中心部に案内することを特徴としている。トラップビームは、赤色または赤外領域のレーザ光であることが望ましい。また、トラップビームの波長は、励起レーザビームの波長と異ならせるとよい。

そして、上記の位置制御方法を実施するための本発明に係る粒子測定装置は、シース液に包まれた試料液が流れる試料流路を設けたフローセルと、前記フローセルに前記試料液を供給する試料液供給部、および前記試料液供給部が供給した前記試料液の周囲に前記シース液を供給するシース液供給部を備え、前記フローセルに取り付けるヘッド部と、前記ヘッド部を介して前記試料流路内に流路に沿ってレーザビームからなるトラップビームを入射するトラップビーム光源と、を有することを特徴としている。

ヘッド部のトラップビームの入射する面は、トラップビームの光路に直交して形成した平面にするとよい。また、試料液供給部は、試料流路の軸線に対して傾斜して設け、先端を試料流路に入射するトラップビームに近接して配置する。そして、シース液供給部は、試料液供給部の周囲に設けた第１供給部と、試料流路に入射するトラップビームの試料液供給部と反対側に設けた第２供給部と殻構成するとよい。

レーザビームは、強度（エネルギー）がガウス分布をなす。したがって、上記のようになっている本発明は、粒子がトラップビームの中心から外れると、放射圧によって中心に引き戻される力を受ける。したがって、粒子はトラップビームの中心部にトラップ（捕捉）される。そこで、トラップビームの中心部を励起レーザビームの中心部を通るように試料流路に入射すれば、粒子を確実に励起レーザビームの中心部を通過させることができる。このため、粒子の測定のばらつきを小さくすることができ、測定精度が向上して信頼性を高めることができる。

トラップビームを赤色または赤外線領域のレーザ光により形成すると、粒子に吸収されるレーザ光のエネルギーが小さく、粒子に与えるダメージを小さくすることができる。また、トラップビームの波長を励起レーザビームの波長と異ならせると、粒子によって反射されたレーザ光、または粒子から放射された蛍光が励起レーザビームによるものか、トラップビームによるものかを容易に識別することができる。

トラップビームの入射する面を、トラップビームの光路に直交した平面とすることにより、トラップビームが屈折することがないので、トラップビームを容易、確実にフローセルの試料流路に入射させることができる。試料液供給部を試料流路の軸線に対して傾斜させて設けると、トラップビームが試料流路に入射する妨げとなるのを防ぐことができる。そして、試料液供給部の先端をトラップビームに近接配置すると、試料液中の粒子をトラップビーム内に容易、確実に吐出することができる。また、シース液供給部を、試料液供給部の周囲に設けた第１供給部と、試料流路に入射するトラップビームの試料液供給部と反対側に設けた第２供給部とから構成すると、シース液、試料液供給部から供給（吐出）された試料液が偏って流れるのを防止することができ、試料液中の粒子を確実にトラップビームにトラップさせることができる。

本発明に係る試料液中粒子の位置制御方法および粒子測定装置の好ましい実施の形態を、添付図面に従って詳細に説明する。
図２は、本発明の実施の形態に係る粒子測定装置の概略を示すブロック図である。図２において、粒子測定装置１０は、フローサイトメータを構成していて、シース液に包まれた試料液の流れを形成するラミナーシースフロー形成部１２を備えている。ラミナーシースフロー形成部１２は、実施形態の場合、フローセル１４と、フローセル１４の上に水密に接続したヘッド部１６とから構成してある。フローセル１４とヘッド部１６とは、例えば石英ガラスなどの透明体によって形成してある。

フローセル１４は、中心部の上下方向に微細な試料流路が設けてあって、この試料流路中をシース液に包まれた試料液（ラミナーシースフロー）が流れるようになっている。そして、ヘッド部１６は、詳細を後述するように、試料液供給部とシース液供給部とを有している。シース液供給部は、試料液供給部から供給された試料液の周囲にシース液を供給し、フローセル１４の試料流路に流入するラミナーシースフローを形成する。そして、ヘッド部１６の試料液供給部には、試料液供給管１８が接続され、試料液供給源２０から試料液２２が供給される。また、ヘッド部１６のシース液供給部には、シース液供給管２４の先端が接続され、シース液供給源２６からシース液２８が供給される。

試料液２２には、細胞やタンパク質、微生物などの粒子が含まれている。これらの粒子は、その性質や構造などに応じて適宜の蛍光物質によって標識付けがしてある。そして、粒子測定装置１０は、この蛍光物質を励起するための励起用レーザ光源３０を備えている。励起用レーザ光源３０が放射した励起レーザビーム３２は、反射鏡やレンズからなる光学系３４を介してフローセル１４に照射される。励起レーザビーム３２は、フローセル１４の試料流路の側方から試料流路に直交して入射するようになっており、ビームの中心が試料流路の断面中心部を通るようになっている。

また、フローセル１４の側方には、光学系３６を構成している集光レンズ３８が配置してある。集光レンズ３８は、光軸が励起レーザビーム３２の光路と直交しており、励起レーザビーム３２によって励起された粒子の蛍光物質から放射された蛍光４０を集光するようになっている。集光レンズ３８が集光した蛍光４０は、光学系３６によって光センサ４２に導かれる。光センサ４２は、入射した蛍光４０をその強度に応じた電気信号に返還し、演算装置４４に入力する。なお、図示していないが、フローセル１４の側方における適宜の位置には、粒子によって散乱された励起レーザビーム３２の散乱光を集光するレンズが配置してあり、レンズによって集光された散乱光の強度信号が演算装置４４に入力するようにしてある。

さらに、粒子測定装置１０は、トラップビーム光源４６を備えている。トラップビーム光源４６は、赤色または赤外線領域のレーザ光からなるトラップビーム４８を放射する。トラップビーム４８は、光学系５０を介してヘッド部１６の上方からラミナーシースフロー形成部１２に入射する。そして、トラップビーム４８は、フローセル１４の試料流路内を流路に沿って入射し、励起レーザビーム３２の中心部を通るようになっており、詳細を後述するように、試料液２２に含まれている粒子をトラップ（捕捉）して励起レーザビーム３２の中心部に案内する。

フローセル１４は、図１にラミナーシースフロー形成部１２の理想化した基本概念を示したように、上下方向に試料流路５２が直線状に設けてある。試料流路５２は、実施形態の場合、矩形状に形成してある。また、フローセル１４は、試料流路５２の上部に、試料流路５２に連通している試料液導入部５４が形成してある。試料液導入部５４は、上方に向けて漸次拡開している。そして、試料液導入部５４の上端には、ヘッド部１６に設けた合流部５６の下端が接続している。合流部５６は、上方に向けて拡開しており、上部がシース液供給部５８となっている。

シース液供給部５８は、大径の第１供給部６０と、第１供給部６０より小径の第２供給部６２とからなっている。これらの第１供給部６０、第２供給部６２は、傾斜流路とヘッド部１６の側面に直交した水平流路とからなっている。傾斜流路は、ヘッド部１６の中心側が低く、外方に向けて高くなるように形成してあって、外側端部が水平流路に連通している。また、ヘッド部１６は、第１供給部６０の水平流路の上部にノズル挿入孔６４が形成してある。ノズル挿入孔６４は、第１供給部６０に連通していて、軸線が第１供給部６０の傾斜流路の軸線と一致している。このノズル挿入孔６４には、試料液供給部となる試料液供給ノズル６６を挿入するようになっている。すなわち、試料液供給ノズル６６は、第１供給部６０の中心部に配置される。

試料液供給ノズル６６は、先端が試料流路５２に入射するトラップビーム４８に近接した位置となるように挿入される。そして、試料液供給ノズル６６の先端からヘッド部１６内に供給（吐出）された試料液２２に含まれている粒子は、トラップビーム４８内に吐出、または流入するようになっていて、トラップビーム４８に捕捉された状態でフローセル１４の試料流路５２内に流入する。また、試料液供給ノズル６６を所定位置に挿入すると、シース液供給部５８の第２供給部６２の軸心が試料液供給ノズル６６の先端とほぼ一致するようになっている。

なお、試料流路５２に入射したトラップビーム４８は、光路の中心が励起レーザビーム３２の中心を通るようになっている。また、試料流路５２の直上の、シース液供給部５８を構成している第１供給部６０と第２供給部６２との間には、ビーム入射部６８が形成してある。ビーム入射部６８は、トラップビーム４８の光路に直交した平面からなっていて、トラップビーム４８が屈折しないようにしてあり、トラップビーム４８を容易、確実に試料流路５２に入射できるようにしてある。

このようになっている実施形態の粒子測定装置１０は、測定対象となる細胞やタンパク質などの粒子を含んだ試料液２２が、試料液供給源２０から試料液供給管１８、試料液供給ノズル６６を介してラミナーシースフロー形成部１２のヘッド部１６内に供給される。また、シース液供給源２６からのシース液２８がシース液供給管２４、シース液供給部５８の第１供給部６０、第２供給部６２を介して、ヘッド部１６内の試料液供給ノズル６６から吐出された試料液２２の周囲に供給される。ヘッド部１６に供給されたシース液２８は、試料液２２を包み込んでラミナーシースフロートを形成し、合流部５６を介してフローセル１４の試料液導入部５４に流入し、さらに試料液流路５２を流下する。

試料液２２に含まれている測定対象の粒子は、試料液供給ノズル６６からトラップビーム４８内に吐出される。この粒子は、レーザビームからなるトラップビーム４８の放射圧（光圧）により、トラップビーム４８の中心部にトラップ（捕捉）された状態で試料流路５２に流入する。そして、粒子は、トラップビーム４８の中心が励起レーザビーム３２の中心を通るようになっているため、トラップビーム４８によって励起レーザビーム３２の中心を通るようにトラップされる。図３は、トラップビーム４８による粒子をトラップする原理を説明する図である。

レーザビームからなるトラップビーム４８は、図３の曲線７０に示したように、強度（エネルギー）がガウス分布をなしている。いま、トラップビーム４８が、ビーム中心ａに対して粒子中心Ｏのずれている粒子７２を透過したとする。このときの、トラップビーム４８の中心部の最もエネルギーの大きな光線４８ａと、周縁部のエネルギーの小さな光線４８ｂとが粒子７２を透過した場合を考える。

一般に粒子７２は、生理食塩水などからなる周囲媒質（試料液）より屈折率が大きい。このため、光線４８ａは、点Ａにおいて粒子７２に入射すると、粒子７２の法線に近づくように屈折する。また、光線４８ａは、点Ｂにおいて粒子７２から出ると、粒子７２の法線から遠ざかるように屈折する。同様に、光線４８ｂは、点Ｃにおいて粒子７２に入射すると、法線に近づく方向に屈折し、点Ｄから出ると法線から遠ざかる方向に屈折する。

光は、波長をλ、振動数をν、光の速度をｃ、プランク定数をｈとすると、

の運動量ｐを有しており、

のエネルギーＥを有する。

前記したように、光線４８ａは、点Ａから粒子７２に入射し、点Ｂから出て行くことにより、屈折して進行方向が変わり、運動量が変化する。これにより、粒子７２は、光線４８ａの運動量の変化に伴う放射圧Ｆ_ａＡ、Ｆ_ａｂを受ける。この放射圧Ｆ_ａＡ、Ｆ_ａＢは、粒子７２の点Ａ、点Ｂにおける法線方向の力である。これは、次の理由による。

図４に示したように、媒質１（屈折率ｎ_１）と媒質２（屈折率ｎ_２）とが平面Ｚで接していて、光８０が入射角θ_１で媒質１から媒質２に入射し、屈折角θ_２のように屈折したとする。光８０が媒質１から媒質２に入射する際に有する運動量（ベクトル）をｐ_１↑、屈折したのちの運動量をｐ_２↑とすると、光８０の屈折したことによる運動量の変化Δｐ↑は、

である。

光８０が媒質１を進む速度をｖ_１↑、媒質２を進む速度をｖ_１↑とすると、Δｐ↑は、数式１から、

となる。ただし、各ベクトルの向きは、図４に示した平面Ｚの法線８２を基準にして反時計方向に測った角度で示している。また、ｖ_１、ｖ_２は、対応する速度ベクトルの大きさを示し、ｅは自然対数の底、ｊは虚数単位である。そして、オイラーの公式により、

であるので、Δｐ↑を複素数形式で表現すると、

となる。

屈折率ｎは、媒質中の光の速さｖとすると、ｎ＝ｃ／ｖであるから、１／ｖ＝ｎ／ｃとなる。このため、Δｐ↑の平面Ｚに垂直な成分（実数部）Δｐ_Ｖ、平行な成分（虚数部）Δｐ_Ｐは、

となる。数式８のカッコ内は、スネルの法則によりｎ_１ｓｉｎθ_１＝ｎ_２ｓｉｎθ_２であるから、Δｐ_Ｐは０となる。すなわち、境界面と平行な方向の運動量は、常に保存される。したがって、境界面に働く運動量の変化分Δｐ↑による力は、平面Ｚに垂直な成分を有し、図４にＦとして示した力（放射圧）が境界面に作用する。

このような放射圧は、図３に示したトラップビーム（光線）４８のように、粒子７２を透過した場合、光線４８の粒子７２への入射側と、粒子７２からの出射側とに生ずる。したがって、粒子７２の中心Ｏには、光線４８ａによる放射圧Ｆ_ａＡ、Ｆ_ａＢの和の合成放射圧（力）Ｆ_ａと、光線４８ｂによる放射圧Ｆ_ｂＣ、Ｆ_ｂＤの和の合成放射圧Ｆ_ｂとが作用する。これらの放射圧は、個々の光子の運動量に基づくものであり、個々の光子による放射圧Ｆに光子の数を乗じたものである。そして、エネルギーの大きな光線４８ａは、エネルギーの小さな光線４８ｂよりも多くの光子が粒子７２に入射するため、光線４８ｂによる合成放射圧Ｆ_ｂより大きな合成放射圧Ｆ_ａを粒子７２に与える。このため、粒子７２は、粒子中心Ｏがトラップビーム４８の中心ａからずれると、トラップビーム４８のビーム中心ａの方向に移動する力を受ける。したがって、粒子７２は、トラップビーム４８の中心部に保持（トラップ）される。

そして、粒子７２は、トラップビーム４８の中心が励起レーザビーム３２の中心を通るようになっているため、トラップビーム４８に案内されて励起レーザビーム３２の中心部を確実に通過する。このため、粒子測定のばらつきを小さくすることができ、測定精度が向上して信頼性を高めることができる。しかも、実施形態においては、トラップビーム４８を赤色または赤外線領域のレーザビームによって形成しているため、粒子７２がタンパク質や細胞などであっても、粒子７２によるトラップビーム４８のエネルギーの吸収が小さく、トラップビーム４８によるダメージをほとんど受けることがない。

なお、トラップビーム４８の波長は、励起レーザビーム３２の波長と異ならせてある。これにより、検出側（受光側）においてフィルタを介在させると、粒子７２により散乱されたレーザ光、または粒子７２が放射した蛍光４０が励起レーザビーム３２によるものであるか否かを容易に識別することができる。また、実施形態においては、シース液供給部５８が試料液供給ノズル６６の周囲に設けた第１供給部６０と、試料流路５２に入射するトラップビーム４８の試料液供給ノズル６６と反対側に設けた第２供給部６２とからなっているため、シース液２８、試料液２２が偏って流れるのを防止することができ、試料液中の粒子７２を確実にトラップビーム４８にトラップさせることができる。

図５は、ラミナーシースフロー形成部１２の具体例を模式的に示したものであり、（１）は平面図、（２）は（１）のＡ−Ａ線に沿った断面図である。図５において、この実施形態に係るラミナーシースフロー形成部１２は、ヘッド部１６とフローセル１４とが、例えば平面視円形に形成してある。そして、ヘッド部１６の直径方向の周面には、シース液２２をヘッド部１６内に供給するシース液供給部５８を構成している第１供給部６０と第２供給部６２とが設けてある。これらの供給部６０、６２は、ヘッド部１６の周壁に形成した供給孔９０を有している。この供給孔９０のヘッド部外周側には、可撓なシース液供給管２４を保持させた管ホルダ９２を同心に螺着できるようになっている。

ヘッド部１６は、上面の一部に適宜に傾斜させた傾斜面９４が形成してある。この傾斜面９４には、第１供給部６０と第２供給部６２とを結ぶ軸線と対応した位置にノズルホルダ９６を螺着できるねじ部が設けてある。そして、ノズルホルダ９６をこのねじ部に螺着することにより、ノズルホルダ９６に保持させた試料液供給ノズル６６の先端を、ノズル挿入孔６４を介してヘッド部１６の中心部に挿入できるようになっている。

図６は、ラミナーシースフロー形成部１２の他の具体例を模式的に示したものである。図６（１）はラミナーシースフロー形成部１２の平面図であり、（２）は縦断面図であって、中心線の左側がＢ−Ｏ線、Ｃ−Ｏ線、Ｅ−Ｏ線に沿った断面図であり、中心線の右側がＤ−Ｏ線に沿った断面図である。

図６に示した具体例の図５に示した具体例との主なる相違点は、シース液の供給部が３つ設けてある点である。これらの供給部は、円形ヘッド部１６の中心に対して等角度間隔、すなわち中心Ｏに対して１２０°間隔で設けてある。そのうちのノズルホルダ９６の両側に位置する２つが第１供給部６０ａ、６０ｂを構成している。そして、ノズルホルダ９６は、これらの第１供給部６０ａ、６０ｂの中間に螺着するようになっている。したがって、第２供給部６２となる他の１つの供給部は、ノズルホルダ９６に対してヘッド部１６の直径方向に位置している。

このようになっている図６の例においては、シース液の供給部がヘッド部１６の中心に対して１２０°間隔に向けてあって、試料液供給ノズル６６から供給された試料液の周囲に等方的、均等にシース液を供給することができ、シース液による層流を確実に形成することができる。なお、第１供給部６０ａ、６０ｂ、第２供給部６２の配置間隔は、図６に示した例に限定されず、適宜に選択することができる。

実施の形態に係るラミナーシースフロー形成部の断面図である。 実施の形態に係る粒子測定装置の概略ブロック図である。 実施の形態に係るトラップビームによる粒子をトラップする原理を説明する図である。 光による放射圧の説明図である。 ラミナーシースフロー形成部の具体例を模式的に示した説明図である。 ラミナーシースフロー形成部の他の具体例を模式的に示した説明図である。

符号の説明

１０………粒子測定装置、１２………ラミナーシースフロー形成部、１４………フローセル、１６………ヘッド部、２２………試料液、２８………シース液、３２………励起レーザビーム、４８………トラップビーム、５２………試料流路、５８………シース液供給部、６０………第１供給部、６２………第２供給部、６６………試料液供給部（試料液供給ノズル）、７２………粒子。

Claims (7)

1. シース液に包まれてフローセル中を流れる試料液中の粒子の位置を制御する方法であって、
   前記フローセルの試料流路内に流路に沿ってレーザビームからなるトラップビームを入射し、前記フローセルに供給された前記粒子を前記トラップビームで捕捉して、前記試料流路の側方から照射した励起レーザビームの中心部に案内することを特徴とする試料液中粒子の位置制御方法。
2. 請求項１に記載の試料液中粒子の位置制御方法において、
   前記トラップビームは、赤色または赤外領域のレーザ光であることを特徴とする試料液中粒子の位置制御方法。
3. 請求項１または２に記載の試料液中粒子の位置制御方法において、
   前記トラップビームは、波長が前記励起レーザビームの波長と異なっていることを特徴とする試料液中粒子の位置制御方法。
4. シース液に包まれた試料液が流れる試料流路を設けたフローセルと、
   前記フローセルに前記試料液を供給する試料液供給部、および前記試料液供給部が供給した前記試料液の周囲に前記シース液を供給するシース液供給部を備え、前記フローセルに取り付けるヘッド部と、
   前記ヘッド部を介して前記試料流路内に流路に沿ってレーザビームからなるトラップビームを入射するトラップビーム光源と、
   を有することを特徴とする粒子測定装置。
5. 請求項４に記載の粒子測定装置において、
   前記ヘッド部の前記トラップビームの入射する面が、前記トラップビームの光路に直交して形成した平面であることを特徴とする粒子測定装置。
6. 請求項４または５に記載の粒子測定装置において、
   前記試料液供給部は、前記試料流路の軸線に対して傾斜して設けられ、先端が前記試料流路に入射する前記トラップビームに近接配置してあることを特徴とする粒子測定装置。
7. 請求項４ないし６のいずれかに記載の粒子測定装置において、
   前記シース液供給部は、前記試料液供給部の周囲に設けた第１供給部と、前記試料流路に入射する前記トラップビームの前記試料液供給部と反対側に設けた第２供給部とを有することを特徴とする粒子測定装置。

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