JP2006527245A - 磁性ナノ粒子 - Google Patents

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Abstract

複数の配位子を固定するための基板として使用できる例えば金属原子のクラスタのような小さな磁性粒子の材料及びこれを作製する方法を開示する。これらの磁性ナノ粒子を治療用又は診断用試薬としての使用、及び、配位子媒介相互作用の研究における使用も開示する。

Description

本発明は磁性ナノ粒子に関し、特に、固定化配位子を有する磁性ナノ粒子及びこれらの粒子と他の種との相互作用の研究におけるそれらの使用に関するものである。本発明はまた、例えば、スクリーニング、診断及び治療へのナノ粒子の応用に関するものである。
生体（バイオ）応答性粒子を有するナノ粒子を製造する方法の開発は、分子診断、治療及びバイオテクノロジーに役立つツールを製造するための道を開いてきた［１］。金属、半導体及び磁気コロイド状ナノ粒子は現在、応用可能性についての精力的な研究中である［２］。
外部の磁場の下で非常に強い磁気的性質を示す酸化鉄のような常磁性材料を含むナノ粒子を作製してきた。これらの磁性ナノ粒子は、細胞分離、インビボでの細胞及び組織ラベリング、磁気共鳴イメージングにおけるコントラストの強調、腫瘍ターゲッティング、温熱療法、及び、ドラッグ・デリバリーを含む多くの生物医学的用途で用いることができる。
このような用途で、ナノ粒子は好適には、免疫反応が誘発されるのを回避し、必要なら細胞に取りこまれるのに十分小さいのが好ましい。同じ磁気的特性を示すべく粒子がほぼ同じサイズであるように粒子サイズがコントロールできるならば、それも有効である。粒子は体内で壊れないように化学的に安定であるのが好ましい。
また、生物医学的用途用の磁性ナノ粒子は、それらが効果的に格納され、管理されるように、特に水中で安定であるのが好ましい。このような粒子は、使用前に格納されるとき、又は、体内において、溶液中で安定であり、凝集しないのが理想的である。磁性ナノ粒子は、互いに当たり合うので溶液中で凝集しやすい。これが体内で起こると、これが血流を妨げ、危険となり得；コロイド溶液においてはコロイドの使用を困難にしている。
これまで、市販されている鉄酸化物粒子を細胞選別及び分離で使用されてきた［３］。Ｆｅ／Ｐｔ［４］、Ｃｏ及びＣｏ／Ｆｅ［５］、Ｆｅ［６］、及び鉄酸化物［７］の単分散磁性ナノ粒子が最近、材料用途のために溶液化学によって合成されている［８］。凝集を防止するために架橋デキストランで被覆された鉄酸化物磁性ナノ粒子についてに記載されている。例えば、国際公開第０３／００５０２９号パンフレットを参照されたい。
理想的には、磁性ナノ粒子は金属酸化物ではない元素金属からなり、元素金属は磁気イメージングの良好な強調材である。しかしながら、このようなナノ粒子は金属が化学的に安定でないこともよくある。磁性ナノ粒子の化学的安定性を向上させる可能性の一つは、磁性金属を安定化するために不動態化金属を用いて磁気金属からそれらを合成することである。
米国特許出願公開第２００２／００６８１８７号明細書には、逆ミセルを用いて合成した表面活性剤（サーファクタント）で保護された金−鉄コアシェルナノ粒子が開示されている。しかしながら、この方法は複雑であり、３つの合成段階を要する。また、できた粒子の多層の組成は、非常に小さい粒子を要するならば、不都合となり得る粒子についてのサイズの小ささの限界を増大する。
米国特許第６，２５４，６６２号明細書は、超高密度記録媒体を作製するのに用いる、、固体表面上にナノ結晶薄膜を形成するためのＦｅＰｔ及びＣｏＰｔ合金ナノ粒子の使用について開示している。磁性バイアス膜及び磁力顕微鏡用磁気探針としての使用を含むこの膜の他の使用についても記載されているが、生物医学的用途については想定されていない。このような
上述の用途の多くは、細胞内若しくは細胞外分子に結合する配位子のような生物活性（アクティブ）のある分子にナノ粒子を連鎖することを要する。このような配位子は例えば、糖質（炭水化物）、核酸、又はタンパク質である。
米国特許第６，５１４，４８１号明細書は、スペーサーを介してペプチドのようなターゲット分子にリンクされたシリカシェルで被覆された鉄酸化物磁性ナノ粒子を開示している。国際公開第０２／０９８３６４号パンフレット及び国際公開第０１／１９４０５号パンフレットは、デキストランで被覆され、ペプチド及びオリゴヌクレオチドで機能化された磁性金属酸化物ナノ粒子を開示する。同様な戦略は、細胞内ラベリング用ナノ粒子［９］及びナノセンサとしてのナノ粒子［１０］を準備するのに用いられてきた。これらの方法はすべて、ナノ粒子をデキストラン若しくはシリカで被覆し、被覆されたナノ粒子は配位子に結合するように機能化され、最終的に配位子がナノ粒子に結合されることを要する時間のかかる多段階法である。
国際公開第０３／０７３４４４号パンフレットは、少なくとも３：７の比のＡｕ及びＦｅ金属原子からなるコアを有する超常磁性ナノ粒子を開示している。この文献では、配位子が硫化物群を介してコアにリンクでき、ナノ粒子はナノ電子デバイスを作製するのに用いられることが述べてられている。ナノ粒子のコアは５ｎｍ〜５０ｎｍの範囲の直径を有する。
国際公開第０３／０７３４４４号パンフレットは、一又は二以上のセグメントと該セグメントの少なくとも一つで結合された官能基若しくは配位子とを備えた磁性ナノワイヤを開示している。ナノワイヤは約１０〜３００ｎｍの範囲の直径と、１０ｎｍ〜数１０ミクロンの範囲の長さを有する。ナノワイヤのセグメントは、金、銀、白金、銅、鉄及びコバルトが単体若しくは合金でなる材料から成ってもよく、官能基はさらに、配位子をワイヤに付けるため若しくはターゲット分子と結合させるために配位子と反応するというような化学的反応が可能である原子若しくは原子群であってもよい。配位子とナノ粒子を結合する可能な方法の範囲を提案するが、例はカルボン酸基を含む配位子とナノワイヤとの間のイオン反応に基づく。
米国特許第６，５３１，３０４号明細書は、反応され、かつ、多糖若しくは糖の“変性体（モディファイヤ）”に共有でなく結合する金属合金から形成されたナノスケールコロイドを開示している。
国際公開第０２／３２４０４号パンフレットは、糖質媒介反応を研究する［１１］［１２］ための水溶性ナノツールを開示している。これらのツールは、金グリコ（糖）ナノ粒子と、糖質抗原を組み込んだカドミウム硫化物グリコナノドットである。これらの水溶性金及び半導体ナノドットは 生理溶液内で数ヶ月安定であり、極めて小さなコアサイズを提供する。これらは、グリコシダーゼに対して耐性があり、細胞毒性を示さない。これらはまた、糖質相互作用の基礎研究用の有用なプラットホームであり［１３］、バイオテクノロジー用途及び生物医学的用途用のツールである。しかしながら、これらのナノ粒子は磁性はない。
従って、生物医学的用途について安定化するために配位子に結合され、所望のサイズに合成され得、簡単で信頼性の高い合成法によって生成され得る、安定な磁性ナノ粒子について依然としてニーズがある。
広く言えば、本発明は、生物医学的用途に使用するのに特に適した磁性ナノ粒子を製造する材料及びその方法を提供する。特に、本発明は複数の配位子を固定するための基板として使用される磁性ナノ粒子であって、配位子がナノ粒子のコアに共有結合（連鎖）されたものを提供する。配位子は、糖質群、ペプチド、タンパク質ドメイン、核酸セグメント又は蛍光性群を備えてもよい。従って、これらのナノ粒子は、例えば、他の糖質、タンパク質又は核酸との配位子媒介の相互作用を研究するために使用され、治療薬及び診断薬として使用され得る。実施形態によっては、粒子はさらに、例えば水及び有機溶媒において溶解性であり、種々の同種の用途において使用できるという利点がある。
本発明は、安定なコロイド水溶液（強磁性流体）を形成するナノスケールサイズの磁性ナノ粒子を提供するものである。ここに記載の方法は、球状でかつ高多価糖質表面を有する安定で水溶性の磁性グリコナノ粒子を製造する方法として、重要な糖質のネオ複合糖質が金／鉄クラスターに共有結合する簡単で可変性の方法を構成する。この方法は、多くの他の分子をナノクラスターに直接付けることもできる。
従って、第１の態様では、本発明は、複数の配位子に結合（連鎖）された金属コアのような磁性コアを備える粒子を提供する。配位子は、糖質、ペプチド、タンパク質ドメイン、核酸セグメント又は他の生物マクロ分子を備えてもよい。配位子はさらに、又は、代替として蛍光性群を備えてもよい。
ここで、磁性コアが不動態化金属原子及び磁性金属原子を備え、コアにおいて磁性金属原子に対する不動態化金属原子の比は約５：０．１から約２：５の間であるのが好ましい。その比が約５：０．１から約５：１の間であるのがさらに好ましい。
ここに使用されているように、用語“不動態化金属”は、磁性を示さず、酸化に対して化学的に安定である金属を意味する。
本発明の不動態化金属は反磁性体であってもよい。“反磁性体”は、一原子あたり、ネットで永久磁気モーメントを有さない全てが対の電子を有する材料を意味する。“磁性”材料は対でない電子も有し、外部の磁場に対して正の感受性をを有する−すなわち、外部磁場が、電子の磁気モーメントを並ばせるように、印加した場に対して電子を整列するようにする。
磁性材料は、常磁性、超常磁性、又は強磁性であってもよい。常磁性材料は外部磁場に対して感受性は高くなく、外部磁場が動いたら、それらの磁性は保持されていない。強磁性材料は外部磁場に対して感受性が非常に高く、電子スピンが平行になるように隣接原子が協同するので、外部磁場が存在しないときでさえ、磁気ドメインを含んでいる。外部磁場は隣接ドメインの磁気モーメントを揃え、磁気的影響を拡大する。協同効果が３００ｎｍ以下の粒子では起こらず、これによって材料が永久磁力を有しないので、通常強磁性を有する材料の非常に小さい粒子は強磁性ではない。しかしながら、粒子がまた外部磁場に対して非常に感受性が高く、強い常磁性を有し、超常磁性として知られている。本発明のナノ粒子は超常磁性であることが好ましい。
一実施形態では、ナノ粒子は不動態化金属原子と磁性金属原子とを備えたコアからなるものであって、コアが複数の配位子に共有結合されているものである。コアにおいて磁性金属原子に対する不動態化金属原子の比は約５：０．１から約２：５の間であるのが好ましい。その比が約５：０．１から約５：１の間であるのがさらに好ましい。
他の態様では、本発明は、一又は二以上の数の上述の粒子を備えた組成物を提供する。実施形態によっては、ナノ粒子の数はコアに結合された異なる密度の同じか又は異なる配位子を有してもよい。
他の態様では、本発明は医学的な取り扱い法における使用のために上述で定義した粒子を提供する。
さらに他の態様では、本発明は、配位子の管理による回復された状態の取り扱いのための薬剤の作製用の上述で定義した粒子の使用を提供する。例として、これは、配位子が病状につながる傾向がある糖質の媒介した相互作用をブロックするように起こってもよい。
本実施形態では、本発明は、糖質媒介相互作用を含む状態を取り扱うための従来のアプローチに対する利点を有する。上述のように、相互作用は典型的には多価であり、相互作用を扱うのに用いられる薬剤はこれらの相互作用の一つ又はいくつかを調整することができるだけのことが多い。このため、所望の治療効果のための相互作用を信頼性高く調整できる相互作用のサイトに薬剤をデリバリーすることが困難となっている。この問題に比して、本発明は、糖質媒介相互作用を調整し、多価相互作用の調整の困難さを克服するための複数の配位子を有する薬剤を提供する。
好適な実施形態では、コア好適には金属コアの平均直径は０．５〜１００ｎｍ、好適には１〜５０ｎｍであり、さらに好適には１〜２０ｎｍである。さらには、コアの平均直径は５ｎｍ以下であり、さらに好適には２．５ｎｍ以下であり、もっと好適には２ｎｍ以下である。平均直径は透過電子顕微鏡ような重体技術を用いて測定することができる。
コア材料は金属（例えば、金若しくは他の不動態化金属原子）からなり得るし、又、２種類以上の原子から成ってもよい。コア材料はコンポジット又は不動態化金属原子と磁性金属との合金であるのが好ましい。好適な不動態化金属は、Ａｕ，Ａｇ，Ｐｔ，又はＣｕであり、好適な磁性金属はＦｅ及びＣｏであり、最も好適なコンポジットはＡｕ／Ｆｅである。他のコンポジット若しくは合金を用いてもよい。ナノ粒子コアは、Ａｕ／Ｆｅ，Ａｕ／Ｃｕ，Ａｕ／Ｇｄ，Ａｕ／Ｚｎ，Ａｕ／Ｆｅ／Ｃｕ，Ａｕ／Ｆｅ／Ｇｄ，Ａｕ／Ｆｅ／Ｃｕ／Ｇｄを含む合金からなってもよく、本発明で用いてもよい。好適なコア材料はＡｕとＦｅであり、最も好適な材料はＡｕである。ナノ粒子のコアはナノメートルの範囲のコア径を有するように、１００個から５００個（例えば、金原子）であるのが好ましく、約２０個から５００個であるのがさらに好ましく、５０個から５００個であるのがもっと好ましい。本発明のナノ粒子のさらに好適な例はＡｕ原子及びＧｄ原子例えばＧｄ ＩＩＩから成るコアであって、例えば１０ｎｍ以下の平均直径、好適には５ｎｍ以下の平均直径、さらに好適には２．５ｎｍの平均直径を有する。この種の好適な粒子は、ナノ粒子のコアに存在する金属原子の比で、約１−２０％のＧｄ原子と約９９−８０％のＡｕ原子、好適には約１−１０％のＧｄ原子と約９９−９０％のＡｕ原子を備える。
用途によっては、コア材料にＮＭＲ活性な一又は二以上の原子をドープし又はラベリングし、ナノ粒子をインビトロ又はインビボのいずれでもＮＭＲを用いて検出可能とする。ＮＭＲ活性な原子の例には、Ｍｎ＋２、Ｇｄ＋３、Ｅｕ＋２、Ｖ＋２、Ｃｏ＋２、Ｎｉ＋２、Ｆｅ＋２、Ｆｅ＋３及びランタニド＋３、又は、本願に記載した量子ドットを含む。
ナノメートルスケールの半導体結晶は量子ドットとして作用できるので、半導体原子を備えたナノ粒子のコアを検出することができる。すなわち、これらは光を吸収できるので、これによって材料内の電子をより高いエネルギー準位に励起して、続いて材料に特徴的な周波数でフォトンを放出できる。半導体コア材料の例にはセレン化カドミウム、硫化カドミウム、テルル化カドミウムがある。また、硫化亜鉛のような亜鉛化合物も含まれる。
実施形態によっては、本願発明のナノ粒子又は配位子は検出可能なラベルを含んでもよい。ラベルはナノ粒子又は配位子のコアの元素であってもよい。ラベルは、ナノ粒子の元素の固有の特性のため、又は、検出可能な他の部分（moiety）と結合（リンク）し、共役し又は連結することによって、検出可能であってもよい。ラベルの好適な例には、蛍光性基、放射性核種、磁気ラベル又はダイであるラベルを含む。蛍光性基いは、フルオレセイン、ローダミン若しくはテトラメチルローダミン、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５、等を含み、蛍光ラベルの励起及びラマン散乱スペクトロスコピーを用いて放出された光の検出によって検出してもよい（Y.C.Cao、R.Jin、C.A.Mirkin、Science、2002、297：1536-1539）。
実施形態によっては、ナノ粒子は、例えばＰＥＴ若しくはＳＰＥＣＴを用いることによって放射性核種から放出された放射線を用いてナノ粒子を検出するのに使用するために、、又は、治療のためすなわちターゲット細胞を殺すために、放射性核種を備えてもよい。本発明で使用するのに適した従来通常用いれている放射性核種の例には、ＴｃＯ４−が最も安定だが種々の酸化状態で存在する９９ｍＴｃ；３２Ｐ又は３３Ｐ；５７Ｃｏ；５９Ｆｅ；Ｃｕ２＋塩として使用されることが多い６７Ｃｕ；Ｇａ３＋塩例えばクエン酸ガリウムとして通常使用される６７Ｇａ；６８Ｇｅ；８２Ｓｒ；９９Ｍｏ；１０３Ｐｄ；Ｉｎ３＋塩として一般に使用される１１１Ｉｎ；ヨウ化ナトリウムとして一般に使用される１２５Ｉｎ又は１３１Ｉｎ；１３７Ｃｓ；１５３Ｇｄ；１５３Ｓｍ；１５８Ａｕ；１８６Ｒｅ；塩化タリウムのようなＴｌ＋として一般に使用される２０１Ｔｌ；３９Ｙ３＋；７１Ｌｕ３＋；及び２４Ｃｒ２＋；が含まれる。ラベル又はトレーサーとしての放射性核種の一般的な使用は従来周知であり、本願発明の態様での使用は当業者には容易に適用できる。放射性核種は、ナノ粒子のコアをドープすることによって、又は、それらをナノ粒子上に固定された配位子の一部として存在するラベルとして含むことによって、非常に容易に使用されてもよい。
前述の生物学的用途の磁性ナノ粒子は大抵は磁気金属酸化物、通常は鉄酸化物（マグネタイト）からなる。Ｆｅ及びＡｕを備えたナノ粒子は上述のように作製されるが、生物学的用途で用いたり、生物活性分子に結合されたりしない。これらのナノ粒子は、酸化を防止するために金で被覆された鉄の殻で囲繞された金コアを備えた“ナノ・オニオン”として合成される。金原子及び鉄原子のいずれをも備えたヘテロコアを有するここに記載のナノ粒子は上述の粒子を改良したものである。というのは、これらは、異なる殻のナノ・オニオンを作製するのに多段階の合成段階を必要とせず、簡単な一段階で合成できるからである。
ナノ粒子及びこれらの相互作用の結果は、従来周知の多くの技術を用いて検出できる。これらは、例えば簡単な外観検査によって又は光散乱（ナノ粒子を含む溶液の透過率）を用いることによってナノ粒子が他の種と結合するときに生ずる凝集を検出することから、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）又は原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）のような洗練された手法を用いてナノ粒子を視覚化することまで含むことができる。金属粒子を検出する他の手法はプラズモン共鳴すなわち、通常光放射によって生ずる金属の表面での電子の励起を用いることである。金属（例えば、銀若しくは金）と空気若しくは水のような誘電体材料との間の界面に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の現象が存在する。被分析物がナノ粒子の表面上に固定した配位子に結合して界面の屈折率が変化すると、ＳＰＲの変化が生ずる。ＳＰＲの他の利点は、リアルタイムの相互作用をモニターするのに利用できることである。上述のように、ナノ粒子がＮＭＲ活性の原子を含み若しくはドープされると、この手法は従来周知の方法を用いて、インビトロ又はインビボのいずれの場合でも、ナノ粒子を検出することができる。銀（I）のナノ粒子促進の還元を用い、さらに、リーダーとして平床スキャナーを用いて、量的な信号増幅に基づくシステムを用いて、ナノ粒子は文献［１８］に記載しているように検出できる。ナノ粒子が糖質基と蛍光プローブとを組み合わせた配位子を含むならば、蛍光スペクトロスコピーを用いることができる。また、糖質の同位元素ラベリングを用いてこれらの検出を容易にすることができる。
コアに結合した配位子は、一又は二以上の糖質（糖類）基、例えば、多糖類、オリゴ糖、又は単糖類の基を備えてもよい。配位子は糖脂質又は糖タンパク質のようなグリカノコンジュゲートであってもよい。糖質基に加えて、配位子はさらに、一又は二以上のペプチド基、タンパク質ドメイン、核酸分子（例えば、ＤＮＡセグメント、一重若しくは二重核酸分子、一重若しくは二重ＲＮＡ分子、１７個から３０個のリボヌクレオチドを有するＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡ配位子）、及び／又は、蛍光プローブを備えてもよい。
他の実施形態では、配位子はペプチド若しくはタンパク質であってもよい。これらは、細胞上のレセプターに結合するペプチドであってもよいし、抗体若しくは治療用タンパク質であってもよい。
他の実施形態では、配位子は核酸分子であってもよい。核酸は細胞内のシーケンスに結合するオリゴヌクレオチドであってもよい。代替として、核酸は細胞にデリバリするためにエンコーティング遺伝子シーケンスを備えてもよい。
粒子はこれに固定した一種類以上の配位子、例えば２，３，４，５，１０，２０又は１００個の異なる配位子を有してもよい。代替として若しくは加えて、複数の異なる種類の粒子を一緒に用いることができる。多数の付着サイトを有する配位子が複数のナノ粒子コア例えば、２，３若しくは４個の粒子に結合してもよい。この例としては、ポリペプチド若しくは核酸分子の端部に結合したナノ粒子コアがある。
好適な実施形態では、粒子の個々の金属コアに結合した平均数の配位子は少なくとも２０個の配位子であり、好適には少なくとも５０個の配位子であり、さらに好適には少なくとも６０個の配位子である。
配位子が粒子のコアに共有結合しているのが好ましい。これを実施するプロトコルは従来公知であるが、ここに記載に仕事は粒子のコアに供給結合した配位子に使用される反応の最初の報告である。
これは、還元条件のもとで金及び鉄を用いて還元端部を有する配位子を還元することによって実施してもよい。粒子を作製する好適な方法は、配位子を粒子に結合するのにチオール変性（誘導）された糖質部分を用いる。一態様では、本発明は、例えば金、又は、金及び鉄を備えたコアであって複数の配位子に共有結合したコアを有する、上述で規定した粒子を準備する方法を提供する。この方法は：
（ａ）配位子の硫化物誘導体を合成する段階と；
（ｂ）粒子を製造するための還元剤の存在下で、硫化物誘導体配位子を、ＨＡｕＣｌ４（テトラクロロ金酸）及び任意でコア内に鉄原子が存在する第二鉄塩と反応する段階と ；を備える。好適な鉄塩はＦｅＣｌ３である。
実施形態によっては、配位子はリンカーによって誘導体にされる。リンカーはジスルフィドリンカーであり、例えば、混合ジスルフィドリンカーである。リンカーはさらに、鎖エチレン基、ペプチド若しくはアミノ酸基、ポリヌクレオチド若しくはヌクレオチド基でなってもよい。
リンカー基の例としては、一般式ＨＯ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｍ−ＯＨ（ここで、ｎ及びｍはそれぞれ独立に１から５の間の整数）が代表的である。配位子は適切な基を介してスペーサーに好都合に結合でき、好適な混合ジスルフィドリンカーの場合はリンカーターミナルヒドロキシル基の一つを介して結合される。ナノ粒子が合成されるときは、リンカーのーＳ−Ｓ−が分離して、−Ｓ−を介してそれぞれナノ粒子のコアに共有結合できる２つのチオリンカーを形成する。好適な実施形態では、配位子は保護されたジスルフィドとして誘導体化される。好都合にも、メタノール若しくは水中においてジスルフィド保護された配位子は、テトラクロロ金酸の水溶液に加えることができる。好適な還元剤は水素化ホウ素ナトリウムである。本願方法の他の好適な特徴を以下に例で示す。
本発明は、従来技術で提案された他のアレイ型のものより利点を配位子の球型アレイを提供する。特に、ナノ粒子はほとんどの有機溶媒及び特に水の中で可溶性である。これはこれらの精製において使用でき、重要なことにはこれらが粒子の表面上に固定された配位子を用意するために溶液中で使用できることを意味する。ナノ粒子が可溶性であるという事実は、自然のコンフォメーションの配位子を用意する利点を有する。治療用途では、ナノ粒子は生理学的条件において無毒性、可溶性、及び安定である。
溶液中のナノ粒子は強磁性流体として知られる磁気コロイドを形成する。強磁性流体は流体の流体特性と固体の磁気特性を有する。これらは以下に記載するように広範囲の用途を有する。従来公知の強磁性流体が直面する主要な問題は安定性の欠如である：これは、磁気粒子が互いに引き合うからであり、これらは一定時間後に凝集する。凝集を防止するためにこれまで使用された方法は、粒子をサーファクタントで被覆すること、ポリマー若しくは多糖類を架橋することが含まれる。ナノ粒子を配位子若しくはターゲット分子に結合すれば、他の合成段階も必要となる。
本発明の粒子は水中で高い可溶性を有し、このため、強磁性流体を製造するのに理想的である。さらに、できる強磁性流体は極めて安定であり、凝集することなく何ヶ月にもわたって維持できる。本発明の強磁性流体は凝集の兆候なしで一年間維持した。本発明の方法は、粒子が予め被覆され、配位子に結合されることを必要とせず、安定で機能性配位子にすでに結合された磁性ナノ粒子が単一の反応で合成されるのを可能とするものである。
安定性は目で評価してもよく−コロイド溶液は凝集がない状態では透明のままであるが、一旦凝集が始まると不透明になる。代替として、凝結の存在を、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって、又は、重水中の粒子のプロトンＮＭＲスペクトルと新しく準備（製造）されたナノ粒子のそれとを比較することによって、決定してもよい。磁気粒子は準備後、少なくとも１年は凝集の兆候は示さないのが好ましい。
ここに記載の方法では、コアの形成と配位子の共有結合は同時の工程であり、このため、ネオ複合糖質の存在がナノクラスターの形状及びサイズをコントロールする。この方法で製造した糖質（グリコ）ナノ粒子は、従来公知の磁性ナノ粒子よりも小さく２ｎｍ以下のコアを有する。超常磁性挙動を全温度で示し、超伝導量子干渉素子（ＳＱＵＩＤ）計は、室温での強磁性成分の存在も示す。この異常磁気特性はイメージング及び細胞分離には重要である。
磁性ナノ粒子及び強磁性流体の応用についての以下の例は、ここに記載の技術の広範な応用性をサポートするために、例として挙げたのであって、限定的なものではない。
本発明の一の態様では、本発明のナノ粒子の磁気特性は、カラム若しくは遠心分離の必要性を排除する細胞分離技術において利用される。これによって、非常に純粋な細胞群が迅速にかつ容易に得ることができる。一実施形態では、ナノ粒子は、対象の細胞上のレセプターに特定的に結合する配位子に結合してもよい。次いでナノ粒子を、細胞懸濁液及び磁場の印加によって懸濁液の残りから分離された粒子に結合した細胞に加えてもよい。
これは、例えば腫瘍細胞の存在のために体液を検査することによって腫瘍の診断において、多くの用途で使用できる非常に感度が良くかつ効率的な方法である。この手法の感度はこの点で大きな利点である。
他の態様では、本発明は配位子との相互作用が生ずるか否かを決定する方法を提供し、この方法は、一又は二以上の配位子に結合したナノ粒子をパートナーと結合する候補に接触させる段階と、結合が生ずるか否かを決定する段階とを備える。
さらに他の態様では、本発明は配位子に結合できる物質をスクリーニングする方法を提供し、この方法は：
不動態化金属、又は、不動態化金属及び磁気金属を備えたコアであって、複数の配位子に共有結合されたコアを有するここに規定したナノ粒子を、一又は二以上の候補化合物に接触させる段階と；
候補化合物が配位子に結合するか否かを検出する段階と；を備える。
コアにおける磁気金属原子に対する不動態化金属原子の比は約５：０．１〜約２：５であるのが好ましい。比が約５：０．１〜約５：１であるばさらに好ましい。
他の態様では、本発明は、配位子に結合できる物質の試料において存在を決定する方法を提供するものであり、この方法は、試料を配位子に結合したナノ粒子に接触される段階と、結合が生ずるか否かを決定する段階とを備える。この方法は、例えば被分析物の存在に関連した病気状態の診断を助けるのに用いるために、試料内に一又は二以上の被分析物の存在若しくは量を決定するのに用いてもよい。被分析物の存在は被分析物とナノ粒子との凝集の形成によって信号化されてもよく、この存在は試料中に流体の緩和特性を測定することによって検出し得るものである。緩和特性の変化は凝集の存在、従ってターゲット分子の存在を示すものである。
配位子が糖質である場合、異なる糖質が介在する相互作用の範囲は従来公知であり、ここに開示したナノ粒子を用いて研究若しくは変調され得る。これらには、白血球−内皮細胞付着、糖質−抗体相互作用、糖質−タンパク質バクテリア及びウィルス相互作用、腫瘍細胞の免疫学的認識、腫瘍細胞−内皮細胞（例えば、転移研究のために）、及び、異組織と細胞との認識が含まれる。
他の態様では、本発明の磁性ナノ粒子及び強磁性流体を癌の治療に用いることができる。磁性ナノ粒子は腫瘍の温熱治療に用いてもよく、この場合、磁性ナノ粒子を腫瘍に注入し、高周波ＡＣ又はＤＣ磁場にさらす。代替として、近赤外光を用いてもよい。磁気材料の緩和磁気エネルギーによって生ずる熱が粒子の周りの腫瘍組織を殺す。本発明の一実施形態では、腫瘍細胞は腫瘍特定抗原をナノ粒子に組み込むことによって特定的にターゲットとしてもよい。これによって、注射によって容易には到達しない腫瘍を治療粒子によって標的にすることを可能とし、通常の健康な細胞が殺されるのを回避する。
所定の励起周波数について、最大特定吸収率（ＳＡＲ）、さらに最大効率加熱を得る最適ナノ粒子サイズが存在する。この技術は、治療の効率を最大にし、管理される強磁性流体の量を最小にするために、狭いコアサイズ分散を有する磁性ナノ粒子を必要とする。本発明の磁性ナノ粒子は、合成法がナノ粒子の厳密な制御を可能にするので、特にこの用途に適している。
他の実施形態において、ナノ粒子は抗体又は殺腫瘍ドラッグのような治療活性物質に結合していてもよい。ナノ粒子の磁気特性は、ナノ粒子を腫瘍細胞にガイドする磁場を用いることによって腫瘍を標的にするのにも用いることができる。しかしながら、腫瘍細胞にナノ粒子を向けるために磁場を用いるだけでは必ずしも実現可能若しくは正確ではなく、そのため、本発明はナノ粒子を腫瘍特定配位子を介して腫瘍細胞に特定して方向付けることができるという利点を提供する。これによって、使用するドラッグの量を減少することができ、副作用の可能性を低減する。というのも、ドラッグが必要とされる細胞にだけ向き、健康な細胞には向かわないからである。
他の態様では、本発明の磁性ナノ粒子を磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）の質を改善するのに用いられる。ＭＲＩは、腫瘍のような構造を効率的に見ることができるのに十分なコントラストを必ずしも提供しないが、得られたイメージをコントラスト媒体のような磁性ナノ粒子を用いることによってエンハンスすることができる。得られたエンハンス感度によって腫瘍を検出することができるが、まだ非常に小さく、治療が成功するチャンスが高いときに非常に早い段階で腫瘍の検出が可能となる。
このように腫瘍細胞の検出を温熱治療とくみあわせることもできる：腫瘍細胞が一旦同定されると、レーザー若しくは近赤外光を腫瘍サイトに向けて細胞を殺す。
さらに、現在、肺はＭＲＩイメージングによってイメージすることができない。ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）は肺をイメージすることができるが、放射線の繰り返し照射の危険のために、喘息及び肺気腫患者のような規則的な走査を要する患者については使用することができない。最近の研究では、過分極化気体ＭＲＩが喘息のような病気に適用できることを示している。これは、これらの気体の磁化が数秒で得られる肺全体のイメージ用に十分だからであり、患者に息を吸い込ませ、息を保持し、息を吐き出させる。患者が息を吸い、吐きときにイメージをとる能力は、ＭＲＩを用いて患者が息を吸い、吐くときに動的なイメージを精製することもできる。磁化された糖質ナノ粒子、及び、特にガドリニウムを含むこれらの粒子はせいぜい０．８ｎｍで製造できる。この小さな粒子は“磁化された気体”として有効に考えることができるので、従って、過分極化気体の使用よりはるかに便利なセッティングにおいて肺イメージング用に使用できる。
本発明の配位子結合粒子は腫瘍細胞に特定してデリバリーされ得て、そのため、もともとの腫瘍サイトから離れた腫瘍細胞さえ治療のために標的化される。
磁性元素金属を含むコアを有する本発明の実施形態は、元素金属は金属酸化物をイメージングする効率的なエンハンサーなので、特にイメージング用途によく適している。コア内の不動態化金属の存在は、これが磁性金属の酸化を防止するので有利である。不動態化金属はナノ粒子の生体適合性も増大し、コアを配位子に結合することを許容し、生物学的使用に加えて、酸化から磁性金属を保護し、凝集の可能性を低減する。
本発明のナノ粒子の他の利点は、標的分子又は治療分子に結合されるときにさえ、細胞に捕獲されるのに適した極端に小さいサイズであることである。
他の点では、本発明の磁性ナノ粒子はドラッグデリバリー用のトレーサーとして使用される放射性材料の代わりに用いてもよい。放射性材料の代わりに磁気粒子を使用することによって、ドラッグデリバリーが磁気変動を測定することが可能となり、これによって放射線からの潜在的な害を排除する。
一般的に、糖質のタンパク質のような他の種類又は他の糖質への結合が非常に弱く、多価の傾向があるので、糖質が媒介した相互作用を検出又は変調するのに従来困難な問題がある。従って、検出のために結合は弱く、また、相互作用を変調するために、一価の薬剤は多価の糖質をベースにした相互作用を破壊するのに限定的にしかうまくいかない。
糖質−糖質相互作用に関連した本発明の実施形態では、２種類の相互作用を同定することができる。同種親和性相互作用では、同一の糖質同士が互いに相互作用し、凝集が起こるまで表面に固定した単一種の配位子を有する粒子の濃度の安定的な増大によって検出され得る。これは、光散乱又は電子的効果によって検出される。
異好性相互作用は２又は３以上の異なるナノ粒子を混合し、粒子の凝集状態を決定することによって検出できる。
本発明は、糖質を媒介した相互作用を研究し、変形するための多目的なプラットフォームを提供する。例えば、粒子は抗糖質抗体を検出するのに用いられ、粒子の凝集を検出するために光散乱を介して抗体の粒子上の配位子への結合を検出し、又は、粒子クラスター内の金属原子が一緒になるときに変わる表面プラズモン共鳴のような磁場効果を介してその配位子への結合を検出する。
本発明は、糖質を媒介する相互作用が生ずるかどうかを決定する方法を提供するものであり、方法は、糖質を媒介した相互作用を介して本発明のナノ粒子と相互作用させるために、疑わしい一又は二以上の種を接触させる段階と、ナノ粒子が糖質媒介相互作用を変化させるかどうかを決定する段階と、を備える。
本発明は、糖質と結合するパートナーとの間の相互作用を壊す方法を提供し、この方法は、糖質及び結合パートナーを本発明のナノ粒子と接触させる段階を備え、ナノ粒子は糖質と結合パートナーとの相互作用を壊すことができる糖質基を備える。
他の態様では、配位子が抗原であるナノ粒子は例えば、表皮の外側層を介して経皮的通過を促進するためにデリバリーガンを用いることによって、ワクチンとして管理することができる。ナノ粒子は、例えばリンパ系を拡散しながら成熟する樹枝状細胞を細くすることができ、免疫応答の変形及び抗原に対するワクチン接種につながる。
配位子が抗原をエンコーディングする核酸であるナノ粒子はワクチンとしても管理してもよい。ナノ粒子は特にこのような用途によく合っている。というのは、粒子が十分に小さくて使用される細胞のダメージなしで細胞膜を貫通するように、核酸ワクチンは有効である個々の細胞に入らなければならないからである。
従来公知のワクチンデリバリーガンは、圧縮された空気又は気体通常はヘリウムガスの使用によってデリバリーを動かす。これは痛みを伴い、皮膚上にみみず腫れを生じ得る。本発明の磁性ナノ粒子は代替のデリバリーシステムで使用され、ここで、粒子をデリバリーする駆動力は磁場の印加によって供給する。磁場の反転によって、外側表皮層を介してナノ粒子を進ませるのに十分な急速な加速を生ずる。これによって、痛みを軽減し、圧縮ガスの使用によって生ずるみみず腫れの形成が低減される。
他の用途では、細胞表面糖質はウィルス若しくはバクテリアレセプター用の配位子（いわゆる付着因子）として作用すること、及び、糖質のレセプターへの結合が感染中に要する事象であることが公知である。これらの相互作用を変調できる合成糖質例えば、複合糖質は本発明のナノ粒子内に固定することができ、これらの相互作用を研究するための試薬として、また、ウィルス又はワクチン感染を防止するための治療のために、使用することができる。
他の用途では、本発明は免疫反応の変調（モジュレーション）例えば、以下の移植可能性で有効である。組織の免疫学的認識が移植された組織上に存在する表面糖質と抗体のようなホストの免疫システムのコンポーネントとの間の糖質が媒介する相互作用によって始まる。これによって、これは、この相互作用を起因とする免疫反応を改善するためにターゲットとなり得る。例えば、糖質Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｎＡｃ（“αＧａｌ”エピトープ（抗原決定基））が、移植された組織の拒絶に含まれる重要な抗原エピトープとして関係している。こうして、αＧａｌエピトープと免疫系との相互作用の変調はここに記載したナノ粒子用の治療ターゲットでありえる。
代替アプローチは、多くの腫瘍関連抗原若しくは腫瘍自己分泌因子が糖質ベースなので、癌の治療に有効である。この事象においては、ナノ粒子はワクチンとして備えられ、免疫系を準備して、糖質を表す腫瘍細胞が抗体上を攻撃することができるところの抗体を生成する。この点では、多くの細胞が、通常の健康な細胞とは対照的に、ナノ粒子によって刺激された免疫応答を腫瘍細胞に特定して向けることができる異常なグリコシル化（糖化）パターンを保有することは公知である。ナノ粒子は、例えば、内皮細胞を介した腫瘍細胞のマイグレーションを通して、癌の転移を阻止するのに使用することもできる。
前立腺癌におけるリンパ節転移の非侵襲的検出はすでに、ＭＲＩと組み合わせてリンパ向性超常磁性ナノ粒子を用いることによって立証されている。転移用の親和性若しくは特異性を増大した糖（グリコ）ナノ粒子の例のリストを以下に示す。
Ｌｅｘ−ＧＮＰ Ｌｅｙ−ＧＮＰ ＳＴｎ−ＧＮＰ
Ｇｌｏｇｏ−Ｈ−ＧＮＰ Ｇｇ３−ＧＮＰ Ｇｌｕｃｏ−ＧＮＰ
Ｍａｌｔｏ−ＧＮＰ Ｌａｃｔｏ−ＧＮＰ Ｍａｎ−ＧＮＰ
糖ナノ粒子のような存在する他の配位子に加えて、エストロゲン、ＤＨＥＡのようなホルモンをナノ粒子に付けて、可溶性にし得る。これらは乳癌のような癌の検出における使用を有してもよい。ペプチドは細胞表面腫瘍遺伝子コード化レセプターのような特定のレセプターに局在化したナノ粒子に付けることもできる。脂質、特にトールレセプターに結合するものを付けることもできる。メチレンブルーのような化学的配位子が、メラノーマ転移の検出に使用され得る糖ナノ粒子に付くことができる。最後に、ｓｉＲＮＡナノ粒子は、細胞内へ取りこんだ後に、腫瘍遺伝子若しくはウィルス特定ｍＲＮＡの発現をイメージし得る。
他の態様において、ナノ粒子は配位子に特定的に結合し得る抗体を増加させるキャリアとして使用できる。これは配位子が糖質である場合に特に好都合である。というのは、抗体は小さいことが多く、強い免疫応答を生じないので、これは糖質含有部分に対する抗体を増大することが従来のチャレンジングな問題であり得るためである。
他の態様では、糖質は、ナノ粒子によって必要となる細胞構成にガイドされ得る量子ドットを提供するために、セレン化カドミウムのナノ結晶に付けることができる。セレン化物に加えて硫化物のような他のアニオンを使用してもよい。量子ドットは生物学的イメージングにおける使用の可能性、電子デバイス及び光デバイスのいずれにおいても、量子コンピュータ及び候補ドラッグのスクリーニングにおける使用の可能性を有する。
他の態様では、本発明は、心筋救済の査定例えば、心臓麻痺後に生存している心臓の組織の量のために、本願で定義するナノ粒子の使用を含む。現在、これは、テクネチウムのような放射性核種と組み合わせて、細胞によって捕獲（取り込み）され得るセスタミビ（sestamibi）やテトロフォスミン（tetrofosmin）のような化合物を用いて−シンチグラフ技術（例えば、ＳＰＥＣＴ）によって大部分はモニターされる。放射性トレーサーの取り込みは局在的な血流に比例し、心筋救済の程度の示唆を与えることになる−取り込みが大きいほど、心筋救済も大きくなる。
セスタミビやテトロフォスミンのような化合物は、これらが細胞膜を介して受動的に拡散する脂溶性陽イオン複合体なので作用する。このような複合体の機能化された配位子は、磁化したナノ粒子のセルフアセンブル中の表面配位子として容易に組み込まれ得る。他の広範囲の新規な化学的配位子がナノ粒子に付いて、それらを自由に拡散可能にし得る。
本願に記載するナノ粒子は、拡散が細胞へ拡散し得るセスタミビ、テトロフォスミン等の他の化合物の誘導体の存在の下でセルフアセンブルしてもよい。その結果のナノ粒子を用いて、心筋救済を、放射能の必要なしで、磁気イメージングによってモニターし得る。磁気共鳴イメージングをナノ粒子の検出のために用いてもよい；放射性トレーサーについて、ナノ粒子の取り込み量は局部的な血流に比例する。現在通常用いられているシンチグラフィートレーサーは９９ｍＴｃ−セスタミビ、及び、９９ｍ−テトロフォスミンである（Recent Advances in 99Tc Radiopharmaceutiocals - Annals of Nuclear Medicine 16:79-93(2003）；Contributions of Nuclear Cardiology to Diagnosis and Prognosis of Patients with Coronary Artery Disease - Circulation 2000: 100: 1465-1478）。好適な態様では、本発明のナノ粒子はセスタミビに共役され、磁気イメージング用に用いられる。このように、ナノ粒子は心筋救済をモニターするために、９９ｍＴｃの代用をするのに用いてもよい。
他の用途では、ここに開示されている磁性ナノ粒子は磁気記録メディアの製造の際に用いてもよい。
本発明の実施形態を例として、添付図面を参照して非限定的に説明する。
本願に記載したナノ粒子又はこれの誘導体は、薬剤組成で配合（定式化）でき、種々の形で患者に投与できる。従って、ナノ粒子は、インビボ細胞及び組織ラベリングについて、腫瘍ターゲッティング及び温熱治療用の薬品として、又は、磁気共鳴イメージングにおいてコントラスト強調媒体（メディア）として使用してもよい。
経口投与用の薬剤組成物はタブレット、カプセル、粉末又は液体であってもよい。タブレットは、ゼラチン、補助薬又は不活性希釈剤のような固形キャリアを含んでもよい。液体薬剤組成物は一般に、水、石油、動物性若しくは植物性油、鉱油若しくは合成油のような液体キャリアを含んでもよい。生理食塩水、又は、エチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールのようなグリコールを含んでもよい。このような組成物及び調合液は一般に合成物の少なくとも0.1重量％を含む。
非経口投与は以下のルートによる投与を含む：静脈、皮膚若しくは皮下、鼻、筋肉内、眼球、経上皮、腹腔、及び、局所的（皮膚、眼、直腸、鼻、吸入、噴霧器）、及び、直腸系のルート。静脈、皮膚若しくは皮下の注射又は痛みサイトの注射については、有効成分は、発熱物質フリーでかつ適当なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に受け入れられる水溶液の形である。当業者は例えば化合物若しくはその誘導体の溶液を用いる適当な溶液を、例えば、生理食塩水で、グリセロール、液体ポリエチレングリコール若しくはオイルを用いて準備した分散液で準備することができる。
任意で他の活性材料と組み合わせた一又は二以上の化合物に加えて、組成物は調合可能な賦形剤、キャリア、バッファ、安定剤、等浸透圧剤、防腐剤若しくは抗酸化剤若しくは当業者に周知の他の材料の一又は二以上を含むことができる。このような材料は非毒性であり、活性材料の有効性と干渉すべきではない。キャリア若しくは他の材料の精確な性質は投与ルート例えば、経口又は非経口に依存してもよい。
液体薬剤組成物は典型的には、約３．０から９．０の間、より好適には約４．５から８．５の間、さらに好適には約５．０から８．０の間のｐＨを有するように配合される。組成物のｐＨは、典型的には約１ｍＭから５０ｍＭの範囲で使用される、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、トリス又はヒスチジンのようなバッファーの使用によって維持できる。さもなければ、組成物のｐＨは生理学的に受け入れられる酸若しくは塩基を用いて調整できる。
防腐剤は一般に薬剤組成物に含まれて細菌の繁殖を抑制し、組成物の保存期間を延ばし、多様な使用パッキングを可能とする。防腐剤の例には、フェノール、メタクレゾール、ベンジルアルコール、パラヒドロキシ安息香酸及びそのエステル、メチルパラベン、塩化ベンザルコニウム、及び、塩化ベンゼトニウムを含む。防腐剤は典型的には約０．１から１．０％の範囲で使用される。
薬剤組成物は、“予防的な有効量”又は“治療的な有効量”（この場合、病気予防は治療と考えてもよい）で個人に与えられ、これは個々に対する効果を示すのに十分である。典型的には、これは、個々に効果を出す治療的に有効な作用を引き起こす。投与される組成物の実際の量、及び投与の頻度は処置される状態の性質や深刻さに依存する。処置の処方箋、例えば、投与量の決定等は一般的な処置者や他の医師の責任の範囲内であり、典型的には処置される疾患、個々の患者の状態、デリバリーの場所、投与の方法及び処置者が知っている他の要素が考慮される。上述の手法及びプロトコルの例は、レミントン（Remington）のPhamaceutical Sciences（Mack Publishing 社, イーストン、ペンシルバニア州、第19版、1995年）、Handbook of Phamaceutical Additives（第2版、アッシュ（M.Ash）及びアッシュ（I.Ash）編著、2001年（Synapse Information Resources社、エディコット、ニューヨーク州、米国）、Handbook of Phamaceutical Excipents（第2版、1994年）。例えば、、組成物は体重の単位ｋｇあたり約０．０１から１００ｍｇの活性組成物のドーズ量を患者に投与するのが好ましく、体重の単位ｋｇあたり約０．５から１０ｍｇであればもっと好ましい。
抗体
ナノ粒子はコア粒子に結合した配位子に対して抗体応答を生ずるキャリアとして使用してもよい。これらの抗体は従来標準の技術を用いて変成できる。ここにはじめて例示するものと類似の抗体も公知の方法に関連してここに教示したものを用いて生成できる。これらの抗体を製造する方法は、ナノ粒子を用いてほ乳類（例えば、マウス、ラット、うさぎ、馬、やぎ、羊、又は猿）に免疫性を与える（免疫化する）ことを含む。抗体は従来公知の種々の技術のいずれを用いて、好ましくは抗体の対象の抗原への結合を用いることによってスクリーニングして免疫性が与えられた動物から得られてもよい。動物から、抗体及び／又は細胞生成抗体を分離することは、動物の犠牲の段階を伴ってもよい。
ほ乳類をナノ粒子を用いて免疫性を与えることと代替で若しくはこれに補助して、配位子及び／又はナノ粒子に対して特定的な抗体が、発現免疫グロブリン可変ドメインの組み込み技術によって生成されたライブラリから、例えば、それらの表面上に機能的な免疫グロブリン結合ドメインを表示するラムダバクテリオファージ又は繊維状バクテリオファージを用いて、得られてもよい；例えば、国際公開９２／０１０４７号パンフレットを参照されたい。ライブラリは素朴なものであってもよい。すなわち、ナノ粒子のいずれを用いても免疫性を与えられていない有機体（生命体）から得られたシーケンスから構築してもよいし、対象の抗原に曝された有機体から得られたシーケンスを用いて構築されてもよい。
“単クローン性抗体”という語は、抗体の実質的に均一な個体群から得られた抗体例えば、個体群を構成する個々の抗体は、少量存在する突然変異体に自然に生ずる可能性があるものとは異なり、同一であることを意味する。単クローン性抗体は、コーラ（Kohler）及びミルスタイン（Milstein）（Nature, 256:495, 1975年）に最初に記載された方法によって生産でき、又は、組み換え方法（カビリー（Cabilly））らによる米国特許第4,816,567号明細書、又は、単クローン性抗体生産技術及び応用（Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、79-97、Marcel Dekker社、ニューヨーク州、1987年）においてマージ（Mage）及びラモイ（Lamoyi）を参照されたい）。
ハイブリドーマ法ににおいて、マウス若しくは他の適当なホスト動物を、免疫化（免疫処置）に使用するナノ粒子に特定して結合する抗体を生産する若しくは生産し得るリンパ球を誘発する（発現する、引き出す）ために皮下、腹腔内、又は筋肉内のルートによって抗体を用いて免疫化する。代替として、リンパ球をインビトロで免疫化してもよい。次いで、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を使用して骨髄腫細胞を用いて融合し、ハイブリドーマ細胞を生成する（ゴーディング（Goding）によるMonoclonal Antibodies:Principles and Practice, 59-103 (Academic Press, 1996）を参照されたい）。
こうして準備したハイブリドーマ細胞を、融合されていない親ハイブリドーマ細胞の成長若しくは生存を防止する一又は二以上の物質を好適に含む適当な培地（培養液）に種がまかれ、成長し得る。例えば、親ハイブリドーマ細胞が酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠くならば、ハイブリドーマ用の培地は典型的には、ＨＧＰＲＴ不足細胞の成長を防止するヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン（ＨＡＴ媒体）を含む。
好適な骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞によって抗体の安定的な高レベルの発現を維持し、ＨＡＴ媒体のような媒体に敏感な細胞である。
ハイブリドーマ細胞が成長する培地は、ナノ粒子／配位子に対して向かう単クローン抗体の生成のために検査（評価、分析）される。好適には、結合特異性（選択性）は、酵素結合免疫吸着体検査によって決定される。本発明の単クローン抗体はナノ粒子／配位子に特定的に結合する抗体である。
本発明の好適な実施形態では、例えば、スキャチャード分析（ムンセン（Munson）及びポラード（Pollard）のAnal. Biochem., 107:220, 1980年参照）単クローン抗体はマイクロモル又はそれ以上の親和性（例えば、１０−６mol以上の親和性）を有する。
所望の特異性及び親和性の抗体を中和（中性）抗体を生成するハイブリドーマ細胞を生成し、クローンを希釈手順を制限することによってサブクローンして、標準法によって成長させ得る。この目的のための適当な培地には、 ダルベッコ変性イーグル培地若しくはＰＲＭＩ−１６４０培地が含まれる。また、ハイブリドーマ細胞は、動物中の腹水腫瘍としてインビボで成長してもよい。
サブクローンによって分泌された単クローン抗体は、例えばタンパク質Ａ−セファロース、水酸燐灰石クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、又は親和性クロマトグラフィのような従来の免疫グロブリン精製手法によって、培地、腹水流体若しくは血清から適当に分離される。
本発明の単クローン抗体をエンコーディングする核酸は、例えば、ネズミの抗体の重鎖及び軽鎖をエンコーディングする遺伝子に特定的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって、従来周知の手法を用いて容易に分離（単離）され、配列が決定される。本発明のハイブリドーマ細胞は抗体若しくはそのフラグメントをエンコーディングする核酸の好適な源である。一旦分離されると、核酸は発現ベクター若しくはクローニング・ベクターに縛られ、次いで、ホスト細胞に転写され、単クローン抗体を組み換えホスト細胞培地で生成されるように培養され得る。
所望の結合特性で抗体を生成できるハイブリドーマは本発明の範囲内であり、抗体（抗体フラグメントを含む）をエンコーディングする核酸を含むホスト細胞であり、それを発現し得る。本発明はまた、抗体が生成され、好適には分泌されている状態で抗体を生成できる細胞を成長させることを含む抗体の製法も提供する。
本発明による抗体は多くの方法で変性してもよい。実際、“抗体”との語は必要な特異性を有する結合ドメインを有するいかなる結合物質をもカバーするように解釈されたい。本発明は、合成分子や、抗原若しくはエピトープ、ここに記載したような糖質配位子に結合し得る抗体を形状が類似する分子を含む、抗体フラグメント、誘導体、抗体の機能同等物及び同族体をカバーする。
抗原若しくは他の結合パートナーを結合し得る抗体フラグメントの例には、ＶＬ、ＶＨ、Ｃｌ、及びＣＨｌドメインからなるＦａｂフラグメント；ＶＨ及びＣＨｌドメインからなるＦＶフラグメント；抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント；分離されたＣＤＲ領域及びＦ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィドブリッジによって結合された２個のＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントを含む。単一鎖Ｆｖフラグメントも含まれる。
本発明による単クローン抗体を生成するハイブリドーマは遺伝突然変異若しくは他の変異を受けてもよい。単クローン抗体に組み換えＤＮＡ技術の手法を用いて他の抗体、ヒト化抗体、又はオリジナル抗体の特異性を維持するキメラ分子を生成することができることは当業者は理解する。このような手法には、免疫グロブリン可変領域、又は、異なる免疫グロブリンの、抗体を一定（コンスタント）領域若しくは一定領域及びフレームワーク領域の相補決定領域（ＣＤＲ：complementarity determining region）をエンコーディングするＤＮＡを導入することを含む。例えば、欧州特許出願公開第０，１８４，１８７号明細書、英国特許出願公開第２，１８８，６３８号明細書、又は欧州特許出願公開第０，２３９，４００号明細書を参照されたい。キメラ抗体のクローニング及び発現は欧州特許出願公開第０，１２０，６９４号明細書及び欧州特許出願公開第０，１２５，０２３号明細書に記載されている。
実験セクション
例１−Ａｕ−Ｆｅナノ粒子
配位子に共有結合した磁気糖ナノ粒子を合成する方法を見出した。例として、２つの重要なオリゴ糖のチオール誘導ネオ複合糖質１及び２、非抗原性二糖マルトース（Ｇｌｃα（１→４）Ｇｌｃβ１−ＯＲ）、及び、抗原性ラクトース（Ｇａｌβ（１→４）Ｇａｌβ１−ＯＲ）を、インサーチュー磁性ナノ粒子を機能化するように準備した（図３，スキーム１）。ジスルフィド１及び２の合成は、都合よく保護されたマルトース及びラクトース誘導体を、11-アセチルチオ-アンデカノール（11-acetylthio-undecanol）、11-アセチルチオ-3,6,9-トリオキサ-アンデカノール（11-acetylthio-3,6,9-trioxa-undecanol）のそれぞを用いてグリコシド化することによって実施した［１２］。いずれのリンカーも、材料全体の特性における疎水性若しくは親水性の影響をテストするために用いられてきた。化合物１及び２はジスルフィドの形で分離し、金−鉄保護糖ナノ粒子の準備のためにこの形で用いた。水溶性糖ナノ粒子１−ＡｕＦｅ（マルト（malto）−ＡｕＦｅ）及び２−ＡｕＦｅ（ラクト−ＡｕＦｅ）はワンポット合成を用いてメタノール／水混合物において得た。１：４の比のＦｅＣｌ３及びＨＡｕＣｌ４をジスルフィド１又は２の存在下でＮａＢＨ４を用いて還元した。金属コアをネオ複合糖質単層で保護することにより、高安定性でバイオ機能化ナノクラスターとなる。これらは遠心濾過によって精製され、１Ｈ−ＮＭＲ、ＵＶ−ｖｉｓ、ＩＣＰ、ＴＥＭ、ＥＤＸ及びＳＱＵＩＤによってキャラクタライズされてきた。
誘導的にカップリングされたプラズマ−原子エミッションスペクトロスコピー（ＩＣＰ）によって実施された粒子の鉄分析は、１−ＡｕＦｅ及び２−ＡｕＦｅについてそれぞれ、０．２７％、２．８１％の鉄含有量を示した。これらのデータはそれぞれ５：０．１、５：１の平均Ａｕ：Ｆｅ比に対応する。図１は、５００Ｏｅの磁場で５ｋから３００ｋの範囲で超伝導量子干渉素子（ＳＱＵＩＤ）によって、ラクト（lacto）−ＡｕＦｅ（Ａ）及びマルト−ＡｕＦｅ（Ｂ）のナノ粒子についてゼロ磁場冷却及び磁場冷却磁化曲線を示す。磁気測定から、５ｋから３００ｋの範囲で超常磁性及び強磁性挙動の両方が存在していることが推察される。ＳＱＵＩＤ測定で、２ｎｍ直径の磁性ナノ粒子について予測される、５ｋ以下のブロッキング温度（ＴＢ）を有する糖ナノ粒子の超常磁性を確認している。超常磁性成分は、ａ）磁化の実験的な熱依存性をキュリー−ワイス則に部分的にフィッティングしたもの；ｂ）ヒステリシスループの印加磁場と温度との比（Ｈ／Ｔ）に対する部分的依存性；ｃ）ＺＦＣ曲線とＦＣ曲線との間の差；から明確に観察される。
図２は、ラクト−ＡｕＦｅ（Ａ）及びマルト−ＡｕＦｅ（Ｂ）のナノ粒子について透過電子顕微鏡写真（左）及びコアサイズ分布ヒストグラム（右）を示している。各黒点は単一の粒子に対応する。ドットは、コアに付いた配位子（ネオ複合糖質）によって規則的に分離されており、これらは秩序化した単層を形成している。ＴＥＭはフィリップス社のＣＭ２００マイクロスコープで２００ｋＶ電子ビームエネルギーで記録された。
２−ＡｕＦｅ試料（ラクト−ＡｕＦｅ）の場合では、糖ナノ粒子は分散され、球形で均一である。金／鉄クラスターの平均直径は２ｎｍと評価された。約１０ｎｍのサイズの数個の分離された粒子はグリッドのいくつかの領域で発見されたが、これらの粒子は、対応するヒストグラムで示したように、二峰性粒子サイズ分布を示す（図２Ｂ）。平均直径約２．５ｎｍ及び１．５ｎｍ以下の金／鉄クラスターを有する粒子が見つけられた。グリッドの拡張領域における一列に並んだ鎖の自発的な形成であって付加的な静磁力を示すものに留意する価値がある（図２Ｂ）。この挙動はナノ粒子間の双極子−双極子磁力又は量子トンネルに起因し得る。並んだ配置は２−ＡｕＦｅナノドットについて得られた顕微鏡写真に観察されなかったが、高秩序の単層が観察された。
準備
マルトＣｕ１１ＳａｕＦｅ：水（０．５ｍＬ）にＦｅＣｌ３（２ｍｇ；０．０１３ｍｍｏｌ；０．２５当量）が溶解した溶液を、ＭｅＯＨ（１１．５ｍＬ）にジスフフィド１（８０ｍｇ；０．０７５ｍｏｌ；３当量）を溶解した溶液に入れ、次いで、水（２ｍＬ）にＨａｕＣｌ４（１７ｍｇ；０．０５ｍｍｏｌ；１当量）が溶解した溶液を入れた。次いで、ＮａＢＨ４１Ｍ（５２ｍｇ；１．３８ｍｍｏｌ；２７．５当量）を高速撹拌しながら少量加えた。生成した黒い懸濁液をさらに２時間撹拌し、真空中で溶媒を除去した。糖ナノ粒子はＭｅＯＨで不溶性であるが、水には可溶である。
ラクトＥＧ４ＳａｕＦｅ：水（０．２５ｍＬ）にＦｅＣｌ３（１ｍｇ；０．００６５ｍｍｏｌ；０．２５当量）が溶解した溶液を、ＭｅＯＨ（１２ｍＬ）にジスフフィド２（７０ｍｇ；０．０７ｍｏｌ；５．５当量）を溶解した溶液に入れ、次いで、水（１ｍＬ）にＨＡｕＣｌ４（８ｍｇ；０．２５ｍｍｏｌ；１当量）が溶解した溶液を入れた。次いで、ＮａＢＨ４１Ｍ（２６ｍｇ；０．６９ｍｍｏｌ；２７．５当量）を高速撹拌しながら少量加えた。生成した黒い懸濁液をさらに２時間撹拌し、真空中で溶媒を除去した。糖ナノ粒子はＭｅＯＨで不溶性であるが、水には可溶である。
精製
精製を遠心濾過によって実施した。粗生成物を水（〜１５ｍＬ）ＮＡＮＯｐｕｒｅで溶解し、溶液を遠心濾過器（ＣＥＮＴＲＩＰＬＵＳ ＹＭ３０，ＭＩＣＲＯＣＯＮ，ＭＷＣＯ＝３００００）内にロードし、遠心力（３０００×ｇ，４０分）を印加した。黒っぽい糖ナノ粒子残留物をＭｅＯＨ及び水で洗い、開始材料がもはや薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）で検出できなくなるまで複数回繰り返した。残留物を水に溶解し、複数回遠心力をかけて、不溶性材料を除去した。透明な溶液を凍結乾燥し、得られた生成物は塩及び開始材料がなかった（１Ｈ及び２３ＮａＮＭＲスペクトロスコピ−においてジスルフィド及びＮａ＋からの信号がなかった）。
キャラクタリゼーション
サンプルのＴＥＭ検査を２００ｋＶ（フィリップス社のＣＭ２００マイクロスコープ）で実施した。Ａｕ／Ｆｅ糖ナノ粒子の水溶液の一滴（２０μＬ）をカーボン膜で被覆された銅グリッド上に置いた。グリッドは室温で数時間空気中で乾燥した。Ａｕ／Ｆｅクラスターの粒子サイズ分布を、自動イメージアナライザーを用いて複数の顕微鏡写真から評価した。ＥＤＸ分析は顕微鏡に取り付けたフィリップス社のＤＸ４装置で実施した。ＩＣＰ分析はＰＥＣ−００９プロトコルに従ってアグルクエムＳ．Ｌ．によって実施した。ＵＶスペクトルをＵＶ／ｖｉｓパーキンエルマーラムダ１２分光光度計によって得た。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルはブルーカーＤＲＸ−５００スペクトロメータによって得た。化学シフトをＤ２Ｏに対してｐｐｍ（δ）で与えられている。
１−ＡｕＦｅ：ＴＥＭ：金属コアの平均直径、１．５ｎｍと２．５ｎｍ
ＩＣＰ：０．２７％Ｆｅ
ＵＶ（Ｈ２Ｏ）：λ＝５００ｎｍ、表面プラズモン共鳴１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δ：５．３２（ｂｒｄ、１Ｈ、Ｈ−１’）、４．３７（ｂｒｄ、１Ｈ、Ｈ−１）、４．００−３．３０（ｍ、１３Ｈ）、２．７０（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２Ｓ）、１．８５−１．２０（ｍ、１７Ｈ）
２−ＡｕＦｅ：ＴＥＭ：金属コアの平均直径、２ｎｍ
ＩＣＰ：２．８１％Ｆｅ
ＵＶ（Ｈ２Ｏ）：λ＝５００ｎｍ、表面プラズモン共鳴１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δ：４．４９（ｂｒｄ、１Ｈ、Ｈ−１’）、４．４０（ｂｒｄ、１Ｈ、Ｈ−１）、４．１０−３．３０（ｍ、２３Ｈ）、２．９２（ｍ、０．５Ｈ）
例２−磁性Ａｕナノ粒子
異なる糖質分子の自己組織化単層（ＳＡＭ）で安定化された水溶性金糖ナノ粒子（ＧＮＰ）は、過剰なチオール誘導ネオ複合糖質の存在下で、水溶液中に金属塩前駆体の化学的還元によって準備した。サンプル準備手順では、出発として、金属クラスタが同時に保護されかつ有機分子で機能化された金ＧＮＰを生成するペナデらによるもの［１１］、［１９］を用いた。Ａｕ−Ｓ共有結合の形成は、その成長を妨害する金属クラスター（コア直径〜２ｎｍ）を分離し、溶液中においてナノクラスター上で大きな安定性を付与する。
この例では、我々は平均１．４ｎｍから１．５ｎｍの平均直径を有する金糖ナノ粒子において室温まで磁気ヒステリシスを実験的に観察したことを報告する。ペナデ法においてチオール：金の比を増大することによって、１．５ｎｍ以下の直径を有するＧＮＰサンプルを得ることができる。これは、チオールリンカー種としてマルトースネオ複合糖質１を用いて得られたＡｕ−ＧＮＰの準備及び磁気特性によって図解している（図４）。
金糖ナノ粒子の準備 マルト−Ａｕ：
四塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４、０．０１８ｍｍｏｌ）及び過剰なジスルフィドネオ複合糖質（０．２ｍｍｏｌ）の水溶液を質問で水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４，２２当量）で還元した。茶色の懸濁液が直ちに形成した。懸濁液を約２時間振り、次いで、溶媒を除去し、糖ナノ粒子（ＧＮＰ）を水で洗いかつ遠心濾過（ＣＥＮＴＲＩＰＬＵＳ、Ｍｒ３００００、１時間、３０００ｘｇ）することによって精製した。フィルタにおける残留物は水に溶解し、凍結乾燥した。ＧＮＰは透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、１ＨＮＭＲ、ＵＶ−可視スペクトロスコピー、導結合高周波プラズマ（ＩＣＰ）、及び元素分析によってキャラクタライズした。ＴＥＭ：平均直径；Ａｕ原子数、それぞれ１．５ｎｍ、７９個。ＵＶ−ＶＩＳ（Ｈ２Ｏ）：λ＝５２０ｎｍ。ＩＣＰ：２８％Ａｕ。（Ｃ２３Ｈ４３Ｏ１１Ｓ）ｎＡｕｎ（ｎ＝７９）について計算した元素分析：Ｃ ３８．１８；Ｈ ５．９８；Ｓ ４．４０；Ａｕ ２７．１８。見つかった：Ｃ ３９．５；Ｈ ６．０７；Ａｕ ２８．０。
図４は、ａ）において、マルトＡｕＧＮＰ、マルトＡｕＧＮＰについてのＴＥＭ顕微鏡写真、サンプルについての対応する粒子サイズ分布ヒストグラムについての合成スキームを；ｂ）において、Ｄ２Ｏ及びＤＭＳＯ−ｄ６についてのスペクトルを示している。マルトＡｕＧＮＰは、いずれの場合も、平均１．５ｎｍ以下の狭い粒子サイズ分布を示す。チオール保護されたマルトＡｕＧＮＰのｆｃｃ構造を示す高解像度電子顕微鏡（ＨＲＴＥＭ）写真を図５に示す。
超伝導量子干渉装置（ＳＱＵＩＤ）磁気計は室温まで強磁性挙動を示した。５Ｋで測定したヒステリシスループは１２０Ｏｅの保磁力を示している。保磁力の熱依存性から得られたブロッキング温度は、白金（III）表面上の単一のＣｏ原子において観察されるものと類似の有効異方的定数１０ｍｅＶ／原子に対応する３９５Ｋであることがわかった［１２］。磁化はキュリ−ワイス則に沿わなかず、かなりゆっくりしたＴ依存性を示した。Ａｕ原子当たり０．００３μＢの原子磁気モーメントを低Ｔ磁気測定から導出した。
図６は、金チオールでキャップされたマルトＡｕＧＮＰについて５Ｋで測定したヒステリシスループを示す。図５から、チオールで保護された糖ナノ粒子の磁化工程は、室温でさえヒステリシスループを示す典型的な強磁性材料と同様な挙動を示す。加えて、サンプルはいかなる温度でも飽和しなかったことが観察された。１Ｔでの磁化の半値程度の残留磁化が測定され、これは、ＧＮＰと共に原子が永久磁気モーメントを保持し、金ＧＮＰ系がランダムに方向を向いた磁気モーメントのアセンブリからなることを示している。
観察された挙動が強磁性不純物の存在に起因するか否かを議論できる。誘導結合高周波プラズマ（ＩＣＰ）分析は、マルト−ＡｕにおけるＦｅ不純物の量（０．００７重量％）が得られる磁化を説明するのには非常に低いことを示していた。この分析にもかかわらず、０．２重量％の鉄を含むマルト−ＡｕＦｅＧＮＰのサンプルは、磁気的挙動におけるＦｅの影響をキャラクタライズするのに準備した。図６は、ＧＮＰの両セットについての５Ｋで測定されたヒステリシスループを示している。マルト−ＡｕＦｅナノ粒子における鉄（強磁性不純物）の増大した量の存在がこの温度での強磁性挙動を低減し、他方、マルト−Ａｕサンプルにはヒステリシスループが残留している。ＧＮＰが分散されるので、粒子間相互作用は静磁気性となり得る。金コア間の平均距離はマルトースネオ複合糖質１の連続する分子の長さ（６ｎｍ）によって決定される。各粒子の永久磁気モーメントは非常に低いので、単一の隣接ＧＮＰによってＧＮＰに作用する磁場は１０Ｏｅより低い。従って、漂遊磁界の影響は無視できる。
バルクＡｕは反磁性なので、強磁性挙動はサイズと結合効果との組み合わせに起因してもよい［２１］。離散的な電子エネルギー構造［２２］、スタッキングフォルトの存在［２３］、Ｓに共有結合した表面原子の極端に高い割合（≧８０％）［２４］は強磁性の開始に起因し得てもよい。
結論として、非常に小さなチオールで保護された金（ゴールド）糖ナノ粒子は、他の非チオール保護金ナノ粒子若しくは金バルクの金属反磁性特性に比して、局所的な永久磁性を示すことを示している（図６）。この観察は、チオール−金の結合が、金結合近傍に局在した余分のｄホールと関連すると考えれる金糖ナノ粒子永久磁気モーメントを誘起することを示唆している。これは、磁気記録についての本発明のナノ粒子の技術的用途を示唆する。さらに、これらのＧＮＰの水溶性及び生物的ラベルは生物分野においてそれらの用途を大きく増幅する。
例３−Ａｕ−Ｇｄ（III）ナノ粒子
金糖ナノ粒子（ＧＮＰ）はＧｄ（III）及び他のランタノイドに複合されて新しいコントラスト剤を提供する。ＧＮＰに存在するネオ複合糖質配位子（６０から１００分子）はキレート部分である。
ラクトＥＧ４−Ａｕ（Ｇｄ）糖ナノ粒子の準備：水（１ｍＬ）に対応する金糖ナノ粒子を溶解した溶液に、ＧｄＣｌ３（０．５Ｍ、１．０８ｍＬ）を加えた。混合物を２０時間光のないところで撹拌した。溶液は遠心濾過した（ＭＩＣＲＯＣＯＮ ＹＭ３０、１３０００ｒｐｍ、８分）。残留物を洗浄した（８×０．５ｍＬ、メタノール／水、１／３）。ナノ粒子を水に溶解し、凍結乾燥すると、１７．５ｍｇの暗紫色ナノ粒子ができる。ＴＥＭ：平均直径２．５ｎｍ、ＥＤＸ：Ｇｄ６．８％；Ａｕ３３．２原子％。
緩和能の決定：水溶液中における水プロトンの１Ｈ ＮＭＲ緩和時間Ｔ１及びＴ２（３７℃、ｐＨ７．２）はブルッカー・ミニスペックＮＭＲスペクトロメータにおいて１．５テスラで測定した。Ｔ１値は反転回復法によって決定し、Ｔ２値はカール−パーセル−マイブーム−ギルシーケンスによって決定されした。５つの異なる濃度（０．０１，０．１，１，１０，１００μｇ／ｍＬ）でラクト−Ａｕ（Ｇｄ）ナノ粒子の溶液を、１５０ｍＭのＮａＣｌを用いてヘペスバッファに準備した。緩和能は、糖ナノ粒子の存否における水プロトンの縦緩和時間及び横緩和時間の差、及び、ｍＭで表したＧｄ（III）の濃度の差から計算した。図７及び図８は結果を示している。
結論として、ここに示した例では、本発明は、抗原性オリゴ糖に共有結合した水溶性超常磁性ナノ粒子を形成するための簡単な方法を提供する。この方法は糖質及び他の分子を組み込んだハイブリッドナノ粒子の形成に拡張できる。糖質−レセプター相互作用は磁性糖ナノ粒子をターゲット細胞及び組織にそれらの選択的ラベリングを許容しながら、向けることができる。これは、この種の多価磁性糖ナノ粒子がほとんど利用できなかった生物活性磁性ナノ粒子を補完することを立証する［９］、［１０］、［１１］。従って、本発明のナノ粒子の生理学的状態における安定性及び溶解性、簡単な作成及び精製は、診断用の潜在的候補、腫瘍ターゲッティング［１５］、温熱治療［１６］、及び磁気共鳴イメージング［１７］への応用においてこれらのツールを変えるものである。
参考文献
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乳（ラクト）−ＡｕＦｅ糖ナノ粒子（ａ）及びマルト−ＡｕＦｅ糖ナノ粒子（ｂ）についてのゼロ磁場冷却（ＺＦＣ、黒）及び磁場冷却（ＦＣ、白抜き）の曲線を示すものである。 ラクト−ＡｕＦｅ糖ナノ粒子（Ａ）の透過型電子顕微鏡（左）及びコアサイズ分布ヒストグラム（右）を示す。 マルト−ＡｕＦｅ糖ナノ粒子（Ｂ）の透過型電子顕微鏡（左）及びコアサイズ分布ヒストグラム（右）を示す。 磁性糖ナノ粒子の合成を模式的に示す。 マルト−ＡｕＦｅ糖ナノ粒子の作製に用いるネオ複合糖質１及びこれのＴＥＭ写真及びヒストグラムを示す。 マルト−Ａｕナノ粒子のＤ２Ｏ及びＤＭＳＯ−ｄ６の１Ｈ−ＮＭＲを示す。 ｆｃｃ構造を示すマルト−Ａｕナノ粒子のＨＲＴＥＭ写真をを示すものである。 ５Ｋでの１．５ｎｍ金−チオール保護糖ナノ粒子についてのヒステリシスループを示す。磁化は金の単位グラムあたりのｅｍｕで与えれている。すなわち、配位子に起因する磁化の寄与は仮定されていない。 Ｇｄ（III）濃度の増大に対するマルト−Ａｕナノ粒子のＴ１の値の変化を示す。 Ｇｄ（III）濃度の増大に対するマルト−Ａｕナノ粒子のＴ２の値の変化を示す。 Ｇｄ（III）濃度の増大に対するマルト−Ａｕナノ粒子のｒ１の値の変化を示す。 Ｇｄ（III）濃度の増大に対するマルト−Ａｕナノ粒子のｒ２の値の変化を示す。

Claims (65)

  1. 金属原子のコアを有する磁性ナノ粒子であって、前記コアが複数の配位子に共有結合し、２．５ｎｍ以下の直径を有する磁性ナノ粒子。
  2. 前記コアが不動態化金属原子及び磁性金属原子を含む請求項１に記載の磁性ナノ粒子。
  3. 前記コアが不動態化金属原子を含む請求項１に記載の磁性ナノ粒子。
  4. 前記不動態化金属が金、白金、銀又は銅であり、任意の磁性金属が鉄、コバルト又はガドリニウムである請求項２又は３のいずれかに記載の磁性ナノ粒子。
  5. 前記コアが、Ａｕ，Ａｕ／Ｆｅ，Ａｕ／Ｃｕ，Ａｕ／Ｇｄ，Ａｕ／Ｆｅ／Ｃｕ，Ａｕ／Ｆｅ／Ｇｄ，又は、Ａｕ／Ｆｅ／Ｃｕ／Ｇｄの原子からなる請求項１から４のいずれか一項に記載の磁性ナノ粒子。
  6. 前記磁性金属原子に対する不動態化金属原子の比が約５：０から約２：５である請求項２から５のいずれか一項に記載の磁性ナノ粒子。
  7. 前記磁性金属原子に対する不動態化金属原子の比が約５：０．１から約５：１である請求項２，４又は５のいずれか一項に記載の磁性ナノ粒子。
  8. 前記不動態化金属が金であり、磁性金属が鉄である請求項２，４，５又は７のいずれかに記載の磁性ナノ粒子。
  9. 鉄原子に対する金原子の比は約５：０．１である請求項８に記載の磁性ナノ粒子。
  10. 鉄原子に対する金原子の比は約５：１である請求項８に記載の磁性ナノ粒子。
  11. 前記コアがＡｕのような不動態化金属原子だけを含むときに、コアが２．０ｎｍ以下の直径を有する請求項１，２，４又は５のいずれかに記載の磁性ナノ粒子。
  12. 前記配位子がランタニドを組み込んでいる請求項１から１１のいずれか一項に記載の磁性ナノ粒子。
  13. 前記配位子がガドリニウムを組み込んでいる請求項１２に記載の磁性ナノ粒子。
  14. ナノ粒子がＮＭＲ活性原子を備えた請求項１から１３のいずれか一項に記載の磁性ナノ粒子。
  15. 前記ＮＭＲ活性原子が、Ｍｎ＋２，Ｇｄ＋３，Ｅｕ＋２，Ｃｕ＋２，Ｖ＋２，Ｃｏ＋２，Ｎｉ＋２，Ｆｅ＋２，Ｆｅ＋２，又はランタノイド＋３である請求項１４に記載の磁性ナノ粒子。
  16. 前記配位子は糖質基を備えた請求項１から１５のいずれか一項に記載の磁性ナノ粒子。
  17. 前記配位子は多糖、オリゴ糖、又は、単糖の基を備えた請求項１から１６のいずれか一項に記載の磁性ナノ粒子。
  18. 前記配位子はグリカノコンジュゲートを備えた請求項１から１６のいずれか一項に記載の磁性ナノ粒子。
  19. 前記グリカノコンジュゲートが糖脂質又は糖タンパク質である請求項１８に記載の磁性ナノ粒子。
  20. 前記配位子がスルフィド基を介してコアに連鎖している請求項１から１９のいずれか一項に記載の磁性ナノ粒子。
  21. ナノ粒子がラベルを備えた請求項１から２０のいずれか一項に記載の磁性ナノ粒子。
  22. 前記ラベルは蛍光性基、放射性同位元素又はＮＭＲ活性原子である請求項２１に記載の磁性ナノ粒子。
  23. 前記ナノ粒子がペプチドを備えた請求項１から２２のいずれか一項に記載の磁性ナノ粒子。
  24. 前記ナノ粒子がＤＮＡ又はＲＮＡを備えた請求項１から２３のいずれか一項に記載の磁性ナノ粒子。
  25. 前記ナノ粒子が薬剤活性コンポーネントを備えた請求項１から２４のいずれか一項に記載の磁性ナノ粒子。
  26. 前記配位子が細胞上でレセプターと結合できる請求項１から２５のいずれか一項に記載の磁性ナノ粒子。
  27. 前記ナノ粒子が水溶性である請求項１から２６のいずれか一項に記載の磁性ナノ粒子。
  28. 請求項１から２７のいずれか一項に記載の一又は二以上のナノ粒子の集団を備えた組成物。
  29. 異なる配位子基を有する複数のナノ粒子を備えた請求項２８に記載の組成物。
  30. 医療上の治療方法で用いるものであって、請求項１から２７のいずれか一項に記載の一又は二以上のナノ粒子の集団を備えた組成物。
  31. 前記組成物がコロイドである請求項２８から３０のいずれか一項に記載の組成物。
  32. 前記ナノ粒子が２ｎｍ以下の平均直径を有する請求項３１に記載のコロイド。
  33. 前記ナノ粒子が少なくとも約１年間安定である請求項３１又は３２のいずれかに記載のコロイド。
  34. 配位子の投与によって改善する状態の処置のための薬剤を生成するための請求項１から２７のいずれか一項に記載のナノ粒子又は請求項２８から３３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  35. 前記配位子が病変を引き起こす糖質媒介相互作用を妨げる請求項３４に記載の使用。
  36. 前記ナノ粒子がこれに結合されて複数の配位子を有し、これによって多価の糖質媒介相互作用を妨げることができる請求項３４又は３５のいずれかに記載の使用。
  37. 抗原を用いて患者にワクチンを接種をするための薬剤を生成するための請求項１から２７のいずれか一項に記載のナノ粒子又は請求項２８から３３のいずれか一項に記載の組成物の使用であって、前記ナノ粒子のコアに連鎖した配位子がその抗原を備えたところの使用。
  38. 抗原をエンコーディングする核酸を用いて患者に予防接種をするための薬剤を生成するための請求項１から２７のいずれか一項に記載のナノ粒子又は請求項２８から３３のいずれか一項に記載の組成物の使用であって、前記ナノ粒子のコアに連鎖した配位子がその核酸を備えたところの使用。
  39. 前記ワクチンが磁場の印加によって投与される請求項３７又は３８のいずれかに記載の使用。
  40. 磁気共鳴イメージング用のコントラスト剤を作製するための請求項１から２７のいずれか一項に記載のナノ粒子又は請求項２８から３３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  41. 前記コントラスト剤が患者の肺をイメージングする際に使用されるものである請求項４０に記載の使用。
  42. 前記イメージング剤が喘息及び肺気腫の診断若しくは治療で使用されるされるものである請求項４１に記載の使用。
  43. 前記ナノ粒子がガドリニウムを備え、１．０ｎｍのコア直径を有する請求項４０から４２のいずれか一項に記載の使用。
  44. 癌治療用の薬剤を生成するための請求項１から２７のいずれか一項に記載のナノ粒子又は請求項２８から３３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  45. 癌が腫瘍である請求項４４に記載の使用。
  46. 腫瘍が高周波磁場、又は、赤外線に曝される請求項４４又は４５のいずれかに記載の使用。
  47. 前記ナノ粒子が、腫瘍関連抗原又は腫瘍自己分泌因子である配位子を備えた請求項４４から４６のいずれか一項に記載の使用。
  48. 前記配位子が糖質である請求項４７に記載の使用。
  49. 癌の治療が転移を阻止することである請求項４４から４８のいずれか一項に記載の使用。
  50. 前記配位子が、転移に対する特異性若しくは親和性を有する糖質、ホルモン、ＤＨＥＡ、細胞特定レセプターに結合できるペプチド、トールレセプターを結合するための脂質、又は、転移するメラノーマ細胞に結合するメチレンブルーを備えた請求項４９に記載の使用。
  51. 心筋救済のための薬剤を生成するための請求項１から２７のいずれか一項に記載のナノ粒子又は請求項２８から３３のいずれか一項に記載の組成物の使用
  52. 請求項１から２６のいずれか一項に記載のナノ粒子を作製する方法であって、該ナノ粒子は金原子と任意で鉄原子を含むコアを備え、該コアは複数の配位子に共有連鎖するものである方法において：
    （ａ）配位子のスルフィド誘導体を合成する段階と；
    （ｂ）粒子を製造するための還元剤の存在下で、前記スルフィド誘導体配位子を、ＨＡｕＣｌ４（テトラクロロ金酸）と任意でコア内に鉄原子が存在する第二鉄塩と反応させる段階と；を備えた方法。
  53. 段階（ｂ）は、リンカーを有する配位子を誘導する段階を備えた請求項５２に記載の方法。
  54. リンカーがジスルフィドリンカーである請求項５３に記載の方法。
  55. ジスルフィドリンカー基が一般式ＨＯ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｍ−ＯＨによって表されるものであって、ｎ及びｍは独立した１から５の整数である請求項５４に記載の方法。
  56. 前記配位子が保護されたジスルフィドとして誘導される請求項５５に記載の方法。
  57. 前記配位子が糖質の基を備えた請求項５２から５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 請求項５２から５７のいずれか一項に記載の方法によって得られたナノ粒子。
  59. 糖質と結合パートナーとの相互作用を壊す方法であって、糖質及び結合パートナーを請求項１から２７のいずれか一項に記載のナノ粒子に接触させる段階を備え、該ナノ粒子に結合された配位子が糖質と結合パートナーとの相互作用を壊することができる糖質基を備えたものである方法。
  60. 配位子に結合できる物質をスクリーニングする方法であって、（ａ）請求項１から２７のいずれか一項に記載のナノ粒子を一又は二以上の候補化合物と接触させる段階と、（ｂ）該候補化合物が前記配位子に結合するかどうかを決定する段階と、を備えた方法。
  61. 配位子に結合できる物質の試料における存在を決定する方法であって、（ａ）当該物質がナノ粒子の配位子に結合するように、当該試料を請求項１から２７のいずれか一項に記載のナノ粒子に接触させる段階と、（ｂ）結合が生ずるか否かを決定する段階と、を備えた方法。
  62. 前記段階が、結合の存否を物質の存在に関連した病気の状態の診断に相関させる段階をさらに備えた請求項６１に記載の方法。
  63. 前記物質が配位子に結合できる抗体である請求項６１又は６２のいずれかに記載の方法。
  64. 糖質媒介相互作用が生ずるか否かを決定する方法であって、（ａ）糖質媒介相互作用を介して相互作用するようにされた一又は二以上の種を請求項１から２７のいずれか一項に記載のナノ粒子に接触させる段階と、（ｂ）ナノ粒子が糖質媒介相互作用を変調するかどうかを決定する段階と、を備えた方法。
  65. ナノ粒子が核磁気共鳴（ＮＭＲ）、凝集、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって検出され、又は、ナノ粒子が銀原子を備えて銀（I）のナノ粒子促進還元を用いて信号増幅によって検出される請求項５９から６４のいずれか一項に記載の方法。
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