JP2006526573A - ハヘラ・チェジュエンシス由来の殺藻効果を有する赤色色素 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ハヘラ・チェジュエンシス（Ｈａｈｅｌｌａ ｃｈｅｊｕｅｎｓｉｓ）由来の殺藻効果を有する赤色色素に係り、より詳しくは、ハヘラ・チェジュエンシス９６ＣＪ１０３５６菌株（ＫＣＴＣ ２３９６）を培養して赤色色素（ＲＰ１０３５６）を製造する方法に関する。更にこの発明は、この方法により調整する、殺藻効果を有する赤色色素（ＲＰ１０３５６）、前記赤色色素を有効成分として含む殺藻製剤、及び前記菌株培養液の有機溶媒抽出物又は前記赤色色素を用いることを特徴とする赤潮生物の除去方法に関する。
本発明に係る赤色色素（ＲＰ１０３５６）は、コクロヂニウム・ポリクリコイデス、ジャイロジニウム・インプジクム、ヘテロシグマ・アカシオなどの赤潮原因種に対して優れた殺潮効果を有していることから、赤潮生物を除去する殺藻製剤の有効成分として有用である。
本発明に係る赤色色素（ＲＰ１０３５６）は、コクロヂニウム・ポリクリコイデス、ジャイロジニウム・インプジクム、ヘテロシグマ・アカシオなどの赤潮原因種に対して優れた殺潮効果を有していることから、赤潮生物を除去する殺藻製剤の有効成分として有用である。
Description
本発明は、ハヘラ・チェジュエンシス（Ｈａｈｅｌｌａ ｃｈｅｊｕｅｎｓｉｓ）由来の殺藻効果を有する赤色色素に係り、より詳しくは、ハヘラ・チェジュエンシス９６ＣＪ１０３５６菌株（ＫＣＴＣ ２３９６）を培養して赤色色素（ＲＰ１０３５６）を製造する方法に関する。更に本発明は、この方法により調整された、殺藻効果を有する赤色色素（ＲＰ１０３５６）、前記赤色色素を有効成分として含む殺藻製剤、及び前記菌株培養液または前記赤色色素を用いることを特徴とする赤潮生物の除去方法に関する。
１９８０年代以来、韓国の南海岸の富栄養化海域を中心に有害・有毒性赤潮が発生している。一部の微細藻類種により引き起こされる赤潮は、毎年養殖漁業に莫大な被害を与えており、特に、毎年８月以降に出現するコクロヂニウム・ポリクリコイデス（Ｃｏｃｈｌｏｄｉｎｉｕｍ ｐｏｌｙｋｒｉｋｏｉｄｅｓ）は、韓国の沿岸養殖に大きな被害を与えている（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｋｏｒｅａｎ Ｆｉｓｈ． Ｓｏｃ．，３１：７６７−７３，１９９８）。この理由から、赤潮発生の原因となる微細藻類種の死滅と成長抑制に関する研究が進んでいる（Ｙｏｓｈｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｊａｐａｎ Ｆｉｓｈ Ｓｃｉ．，６１：７８０−６，１９９５）。
海洋生態系において、微生物群は赤潮の発生と消滅に対して重要な役割を果たし（Ｆｕｒｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｒｉｎｅ Ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｌｌ．，２３：１８９−９３，１９９２）、殺藻細菌の数は、赤潮発生海域において宿主生物に依存し、赤潮が消滅される段階で最高の濃度に達する（Ｙｏｓｈｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｊａｐａｎ Ｆｉｓｈ Ｓｃｉ．，６１：７８０−６，１９９５）。
殺藻能力を有している細菌としては、アルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｔｅｒｉｕｍ）、シュードアルテロモナス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）、スポロスピラ（Ｓｐｏｒｏｓｐｉｒａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属などが知られている。これらの細菌は、赤潮の消滅に直接的又は間接的に関与すると報告されている（Ｌｏｖｅｊｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４：２８０６−１３，１９９３）。殺藻細菌は、各種の種の藻類を殺藻または溶藻することができ、各細菌ごとに種独自の殺藻範囲を有している。例えば、殺藻細菌サイトファーガ種（Ｃｙｔｏｐｈｏｇａ ｓｐ．）は、珪藻（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、針鞭毛藻（Ｒａｐｈｙｄｏｐｈｙｃｅａｅ）及び渦鞭毛藻（Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）に効く様々な殺藻効力を有している（Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｒ．Ｂｉｏｌ．，１１６：５２７−３２，１９９３）。
しかしながら、殺藻細菌の殺藻メカニズムに関する研究には大きな進展が見られず、赤潮生物の急減は、生物細胞の溶解（Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｒ．Ｂｉｏｌ．，１１６：５２７−３２，１９９３）、成長抑制による生物の死滅（Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｒ．Ｂｉｏｌ．，１１６：５２７−３２，１９９３）及びアレクランドリウム・カタネラ（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ ｃａｔａｎｅｌｌａ）でのように無性生殖から有性生殖への交配段階の阻害による死滅（Ｓａｗａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｉｐｐｏｎ Ｓｕｉｓａｎ Ｇａｋｋａｉｓｈｉ，５９：２９１−４，１９９３）などに起因すると報告されている。
殺藻細菌の殺藻メカニズムは、（１）殺藻細菌が赤潮生物の表面に付着して赤潮生物を溶解するという接触によるメカニズム（Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｒ．Ｂｉｏｌ．，１１６：５２７−３２，１９９３）、及び（２）殺藻細菌が殺藻物質を細胞外に分泌して赤潮生物の成長を抑制または溶解するメカニズムに大別できる。ほとんどの殺藻細菌は後者のメカニズムに含まれ、抗生剤（Ｋａｗａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５：２２５−９，１９９７）、低分子のオリゴペプチド（ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ）（Ｓａｗａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｉｐｐｏｎ Ｓｕｉｓａｎ Ｇａｋｋａｉｓｈｉ，５９：２９１−４，１９９３）、タンパク質（Ｂａｋｅｒ ａｎｄ Ｈｅｒｓｏｎ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５：７９１−６，１９７８）及び熱に不安定な細胞外物質（Ｍｉｔｓｕｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｉｐｐｏｎ Ｓｕｉｓａｎ Ｇａｋｋａｉｓｈｉ，５８：２１５９−６９，１９９２）などによる殺藻メカニズムが報告されている。このような微細藻類の減少は、ほとんどの殺藻細菌を接種後数時間から数日後に現れる。このように反応時間が遅く現れるのは殺藻物質の活性と直接的に関連しており、殺藻物質生成の違いと誘導物質に応じて様々な時間差を示す。
このため、このような殺藻微生物が生産する殺藻物質を用いて赤潮の原因となる微細藻類の成長を抑えることにより、赤潮による養殖業の被害を減らすために、各種の研究が盛んに行われつつある。特に、１９８２年に初めて赤潮を引き起こしたと言われているコクロヂニウム・ポリクリコイデスは、１９９０年から絶えず赤潮を引き起こしている。さらに、１９９５年以来には１０，０００細胞／ｍＬ以上の高密度赤潮を韓国の南海岸から東南海域に至るまで大規模に引き起こし、莫大な水産被害を与えていて、これをきっかけに、赤潮被害を最小化させるための赤潮防除対策への研究が行われている。しかし、色素を殺藻物質として用いるという試みは報告されていない。
色素は天然色素と合成色素に区別されていて、食品工業、化粧品、医薬品及び家畜の飼料添加剤など各種の用途にて使われている。中でも、微生物を用いた天然色素は、動植物が生産する色素に比べて発酵による大量生産が可能であり、且つ、安定的な品質を有する製品が生産可能である。微生物色素は、培養方法、使用培地に応じて様々な色の色素が得られ、たとえ同じ菌株であるとしても、培地の成分、培養温度、及びｐＨなどに応じて各種多様な色調の色素が得られる（Ｃａｒｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２３：１３６０−７２，１９７７）。特に、色素は２次代謝物質であり、抗生剤、毒素などの２次代謝産物の発酵による典型的な調節メカニズムにより生成されると言われているし、炭素源、窒素源、リン酸及び微量の元素によって色素の生成に大きな影響を受けると報告されている（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｙｃｌｏｇｉａ，７３：６４９−５４，１９８１）。
ハヘラ・チェジュエンシス９６ＣＪ１０３５６菌株（ＫＣＴＣ ２３９６＝ＩＭＳＮＵ １１１５７）は、韓国済州道の海岸から集められた海底堆積物から分離された海洋性微生物であって、グラム陰性の運動性桿菌である。また、これらは、多量のエキソポリサッカライド（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）及び赤色色素（ｒｅｄ ｐｉｇｍｅｎｔ）を生成する（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５１：６６１−６，２００１）。
しかしながら、前記ハヘラ・チェジュエンシス９６ＣＪ１０３５６菌株を含むハヘラ属微生物由来の色素により得られる殺藻効果については、未だ知られていない。
よって、本発明者らは、優れた殺藻効果を有する新規な微生物を得るために鋭意努力した結果、前記ハヘラ・チェジュエンシス９６ＣＪ１０３５６菌株から得られる赤色色素（ＲＰ１０３５６）が優れた殺藻効果を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
そこで、本発明の主たる目的は、ハヘラ属微生物を培養することを特徴とする、殺藻効果を有する赤色色素の製造方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、殺藻効果を有する赤色色素（ＲＰ１０３５６）及びこれを有効成分として含む殺藻製剤を提供することにある。
前記目的を達成するために、本発明は、ハヘラ属微生物を培養する段階と、前記培養液から有機溶媒を用いて殺藻効果を示す色素物質を分離・精製する段階とを含む、殺藻効果を有する色素物質の製造方法を提供する。
本発明において、前記ハヘラ属微生物はハヘラ・チェジュエンシスであることが好ましく、特に、ハヘラ・チェジュエンシス９６ＣＪ１０３５６菌株（ＫＣＴＣ ２３９６）であることが好ましい。
また、本発明は、前記方法により製造され、シリカゲル薄膜クロマトグラフィ（ＴＬＣ）により、Ｒｆ値０．９８（石油エーテル：アセトン：メタノール＝５：３：２）を示し、及び約５３９ｎｍにおいて最大の吸光度を示すことを特徴とする、殺藻効果を有する赤色色素を提供する。
さらに、本発明は、前記赤色色素を有効成分として含む殺藻製剤を提供する。
本発明において、前記赤色色素は、コクロヂニウム・ポリクリコイデス（Ｃｏｃｈｌｏｄｉｎｉｕｍ ｐｏｌｙｋｒｉｋｏｉｄｅｓ）、ジャイロジニウム・インプジクム（Ｇｙｒｏｄｉｎｉｕｍ ｉｍｐｕｄｉｃｕｍ）、またはヘテロシグマ・アカシオ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ ａｋａｓｈｉｗｏ）に対して殺藻効果を示すことを特徴とする。
また、本発明は、前記赤色色素、ハヘラ属微生物培養液、前記培養液の有機溶媒抽出物を用いることを特徴とする赤潮生物の除去方法を提供する。
本発明においては、ハヘラ・チェジュエンシス９６ＣＪ１０３５６菌株の培養液を有機溶媒で抽出することにより、赤色色素（ＲＰ１０３５６）の純粋な分離を行った。ハヘラ・チェジュエンシス９６ＣＪ１０３５６菌株から殺藻効果を有する赤色色素ＲＰ１０３５６を得るためには、栄養塩類、微量の無機塩類及び熟成海水を含む適当な培地において前記微生物を培養する必要がある。
本発明において、栄養培地としては、炭素源として５％のグルコース、窒素源として０．５％のペプトン、リン酸源として０．０８３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．０６７ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、１ｇ／ＬのＣａＣｌ２などを使用することができる。また、微量の無機塩類としては、好ましくは、０．００５ｇ／ＬのＦｅＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．００１ｇ／ＬのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．００１ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４、０．００１ｇ／ＬのＺｎＣｌ２などを含む。
前記微生物培養液から抽出される粗色素及び前記粗色素から精製されるＲＰ１０３５６が赤潮の原因種であるコクロヂニウム・ポリクリコイデス、ジャイロジニウム・インプジクム、ヘテロシグマ・アカシオ、アレクランドリウム・カタネラ及びプロセントリウム・マイカンスに対して有する殺藻効果を調査した結果、コクロヂニウム・ポリクリコイデス、ジャイロジニウム・インプジクム及びヘテロシグマ・アカシオに対して優れた殺藻効果を有していることが判明された。本発明に係る赤色色素ＲＰ１０３５６は、エタノールにおける最大吸光度が４８６ｎｍ、５３９ｎｍである脂溶性赤色色素である。
以下、実施例を挙げて本発明を詳述する。しかし、下記の実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲が下記の実施例により制限されないことは当業者にとって明らかである。
＜実施例１＞ＲＰ１０３５６の抽出及び分離
本実験に使われた菌株は、李ら（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．５１：６６１−６６６，２００１）が済州道海岸の堆積土から分離したハヘラ・チェジュエンシス（Ｈａｈｅｌｌａ ｃｈｅｊｕｅｎｓｉｓ ｇｅｎ．ｎｏｖ．，ｓｐ．ｎｏｖ．）９６ＣＪ１０３５６菌株（ＫＣＴＣ ２３９６＝ＩＭＳＮＵ １１１５７）である。ここでは、前記菌株をＳＴＮ固体培地（表１）に接種してから２５℃で４８時間培養後、４℃で冷蔵保管しながら、２週間おきに新しい培地に植え継ぎ培養して使用した。
本実験に使われた菌株は、李ら（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．５１：６６１−６６６，２００１）が済州道海岸の堆積土から分離したハヘラ・チェジュエンシス（Ｈａｈｅｌｌａ ｃｈｅｊｕｅｎｓｉｓ ｇｅｎ．ｎｏｖ．，ｓｐ．ｎｏｖ．）９６ＣＪ１０３５６菌株（ＫＣＴＣ ２３９６＝ＩＭＳＮＵ １１１５７）である。ここでは、前記菌株をＳＴＮ固体培地（表１）に接種してから２５℃で４８時間培養後、４℃で冷蔵保管しながら、２週間おきに新しい培地に植え継ぎ培養して使用した。
前記９６ＣＪ１０３５６菌株から赤色色素ＲＰ１０３５６を得るために、前記菌株を基本培地となるＳｚｏＢｅｌｌ培地（表２）に接種後２５℃で且つ１２０ｒｐｍにて３日間培養した。その後、培養液から赤色色素ＲＰ１０３５６を分離した。
前記９６ＣＪ１０３５６菌株の培養液から、図１の方法により赤色色素を抽出した。９６ＣＪ１０３５６菌株は、多量の細胞外多糖類を生産する微生物であり、培養液から多糖類を除去して色素を分離するために、前記菌株培養液１Ｌに２−イソプロパノールを２倍の量にて加えた。その後、超音波器（ブランソン８２１０、米国）を用いて１時間処理後、４℃で２４時間放置することにより、培養液から多糖類を除去した。多糖類の除去された培養液を１２，０００ｇ及び３０分の条件下で遠心分離した後、ＧＦ／Ｆ（ワットマン、φ４７ｍｍ、米国）を用いてろ過を行い、細胞の除去された粗色素を分離した。
多糖類及び細胞が除去された２−イソプロパノール色素抽出液（粗色素）からＲＰ１０３５６を分離するために、２−イソプロパノール色素抽出液を４５℃で真空濃縮して２−イソプロパノールを除去した。その後、残留している水溶層から水溶性成分と多量の塩を除去して脂溶性分画を抽出するために、水溶層に１倍の石油エーテルを加えて１時間振とう後、分液漏斗を用いて石油エーテル層を分離した。前記分離された石油エーテル層から水分を除去するために、前記分離された石油エーテル層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥しそして、ろ過紙（Ｎｏ ５，ワットマン、米国）でろ過した後、さらに４０℃で真空濃縮して石油エーテルを除去した（図１）。
粗色素抽出液から殺藻性を有する色素を分離するために、シリカ・クロマトグラフィ（ｓｉｌｉｃａ ｃｈｌｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行った。前記粗抽出液をシリカゲル（ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０，０．０４０〜０．０６３ｍｍ，メルク、ドイツ）に加え、同じレジンが入っているガラスカラム（φ２．５×３０ｃｍ）に石油エーテル：アセトン（７：３）の展開溶媒を通すことにより粗色素を分離した。その結果、分離された色素はそれぞれＲｆ ０．９８（明るい黄色）、Ｒｆ ０．９６（濃い赤色）、Ｒｆ ０．８８（明るい赤色）及びＲｆ ０．５９（青色）の４通りに分画された。中でも、０．８８のＲｆ値を有する色素が主色素であるため、これを”ＲＰ１０３５６”と名付け、その殺藻効果を調べてみた。
＜実施例２＞ＲＰ１０３５６の殺藻効果
本実験に用いられた藻類を表３に示した。微細藻類は、釜慶大學（ＢＫＵ：ＢｕＫｕｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ） 養殖学科及び韓国海洋研究所（ＫＯＲＤＩ： Ｋｏｒｅａ Ｏｃｅａｎ Ｒｅｓｅｒｃｈ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）赤潮研究チームから分譲された。その他、微細藻類は、赤潮発生地域で直接分離した。
本実験に用いられた藻類を表３に示した。微細藻類は、釜慶大學（ＢＫＵ：ＢｕＫｕｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ） 養殖学科及び韓国海洋研究所（ＫＯＲＤＩ： Ｋｏｒｅａ Ｏｃｅａｎ Ｒｅｓｅｒｃｈ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）赤潮研究チームから分譲された。その他、微細藻類は、赤潮発生地域で直接分離した。
微細藻類の培養のためにｆ／２培地を用いた（表４）。藻類培養は、温度２２．５℃、光度１５０μＥｉｎ／ｍ２／ｓ、１６時間：８時間の明暗光周期条件下における藻類培養器（Ｊｅ−ｉｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、韓国）において行った。殺藻効果を測定するための藻類培養としては、対数成長段階の細胞を利用した。藻類の成長は蛍光光度計（日立、Ｆ−２０００、日本）を用いて測定するか、２％のルゴール（Ｒｕｇｏｌ）用液で固定した後、倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ａｘｏｎ−１０００、ドイツ）を用いて計数を行った。
（１）粗色素の殺藻効果
実施例１で分離された粗色素及びＲＰ１０３５６を０，０．１，１．０，１０，５０及び１００μｇ／ｍＬの濃度にて１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬの赤潮原因である微細藻類（コクロヂニウム・ポリクリコイデス、ジャイロジニウム・インプジクム、ヘテロシグマ・アカシオ、アレクランドリウム・カタネラ及びプロセントリウム・マイカンス）培養液に加えた。３０分、１時間、２時間及び２４時間経過後、それぞれの処理微細藻類を２％ルゴール液で固定し、倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ａｘｏｎ１００、ドイツ）を用いて未溶解細胞数を計数した。初期接種細胞数から溶解細胞数を計数し、下記計算式１により殺藻効果を算出した。
実施例１で分離された粗色素及びＲＰ１０３５６を０，０．１，１．０，１０，５０及び１００μｇ／ｍＬの濃度にて１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬの赤潮原因である微細藻類（コクロヂニウム・ポリクリコイデス、ジャイロジニウム・インプジクム、ヘテロシグマ・アカシオ、アレクランドリウム・カタネラ及びプロセントリウム・マイカンス）培養液に加えた。３０分、１時間、２時間及び２４時間経過後、それぞれの処理微細藻類を２％ルゴール液で固定し、倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ａｘｏｎ１００、ドイツ）を用いて未溶解細胞数を計数した。初期接種細胞数から溶解細胞数を計数し、下記計算式１により殺藻効果を算出した。
エタノールに溶解した粗色素の殺藻効果を調査した結果、コクロヂニウム・ポリクリコイデスを０．１μＬ／ｍＬ濃度の粗色素にて処理した場合、３０分及び２４時間経過後、それぞれ３．８％及び７２．１％の殺藻効果を示した。１．０μＬ／ｍＬ濃度にて処理した場合、３０分及び２４時間経過後、それぞれ６３．８％及び９８．７％の殺藻効果を示した。最大処理濃度となる１００μＬ／ｍＬ濃度にて処理した場合、３０分経過後、９１．３％の殺藻効果を示した。結果として、赤潮被害が最大のコクロヂニウム・ポリクリコイデスウンに対して０．１μＬ／ｍＬの濃度以上で殺藻効果を示し、特に粗色素は低濃度において優れた初期殺藻能を示した（図２）。
ジャイロジニウム・インプジクムを０．１μＬ／ｍＬ濃度の粗色素にて処理した場合、３０分及び２４時間経過後、それぞれ１．４％及び４０．８％の殺藻効果を示し、１．０μＬ／ｍＬ濃度にて処理した場合、３０分及び２４時間経過後、それぞれ２８．７％及び９３．０％の殺藻効果を示した。最大処理濃度となる１００μＬ／ｍＬ濃度にて処理した場合、３０分経過後、６０．６％の殺藻効果を示した。この結果から、ジャイロジニウム・インプジクムには、コクロヂニウム・ポリクリコイデスに対するよりもやや低い殺藻能を示すことがわかった（図３）。
ヘテロシグマ・アカシオを０．１μＬ／ｍＬ濃度の粗色素で処理した場合、３０分及び２４時間経過後、それぞれ６．５％及び７８．８％の殺藻効果を示し、１．０μＬ／ｍＬ濃度にて処理した場合、それぞれ２３．８％及び９６．３％の殺藻効果を示した。最大処理濃度となる１００μＬ／ｍＬ濃度にて処理した場合、３０分経過後、４６．４％の殺藻効果を示した（図４）。
その他、アレクランドリウム・カタネラ及びプロセントリウム・マイカンスに対しては、粗色素は微弱な殺藻能力を示した。結果として、９６ＣＪ１０３５６菌株の培養液から抽出した粗色素は、赤潮原因となる菌株に対して相異なる殺藻効果を示し、このうちコクロヂニウム・ポリクリコイデスに対して極めて高い殺藻効果を示した。
（２）ＲＰ１０３５６の殺藻効果
毎年韓国に赤潮被害を起こし、粗色素による殺藻試験において最も優れた殺藻効果を示したコクロヂニウム・ポリクリコイデスに対して、前記の４つの分画の殺藻効果を調査した。前記４個分画の殺藻効果試験は、前記粗色素の殺藻効果試験と同様にして行った。粗色素の殺藻効果と比較した結果、４つの色素分画の中でＲＰ１０３５６のみが殺藻効果を有することがわかった。３０分処理を基準として殺藻効果を比較した結果、１μＬ／Ｌの濃度の場合、粗色素は６３．８％の殺藻効果を示す一方、ＲＰ１０３５６は一層高い８３．５％の殺藻効果を示した。特に、５０％の殺藻能を示すＲＰ１０３５６の濃度は、３０分処理では０．６５μＬ／Ｌを示し、２４時間処理では０．１７μＬ／Ｌを示した（図５及び表５）。
毎年韓国に赤潮被害を起こし、粗色素による殺藻試験において最も優れた殺藻効果を示したコクロヂニウム・ポリクリコイデスに対して、前記の４つの分画の殺藻効果を調査した。前記４個分画の殺藻効果試験は、前記粗色素の殺藻効果試験と同様にして行った。粗色素の殺藻効果と比較した結果、４つの色素分画の中でＲＰ１０３５６のみが殺藻効果を有することがわかった。３０分処理を基準として殺藻効果を比較した結果、１μＬ／Ｌの濃度の場合、粗色素は６３．８％の殺藻効果を示す一方、ＲＰ１０３５６は一層高い８３．５％の殺藻効果を示した。特に、５０％の殺藻能を示すＲＰ１０３５６の濃度は、３０分処理では０．６５μＬ／Ｌを示し、２４時間処理では０．１７μＬ／Ｌを示した（図５及び表５）。
（３）微細藻類の観察
粗色素及びＲＰ１０３５６処理による細胞形状の変化を倒立顕微鏡を用いて観察した。ＲＰ１０３５６処理による細胞形状の変化は、成長阻害（ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）、細胞の膨潤（ｓｗｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｃｅｌｌ）、細胞の溶解（ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｅｌｌ）、外被の脱離（ｅｃｄｙｓｉｓ ｏｆ ａｒｍｏｒ）を基準として観察した。
粗色素及びＲＰ１０３５６処理による細胞形状の変化を倒立顕微鏡を用いて観察した。ＲＰ１０３５６処理による細胞形状の変化は、成長阻害（ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）、細胞の膨潤（ｓｗｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｃｅｌｌ）、細胞の溶解（ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｅｌｌ）、外被の脱離（ｅｃｄｙｓｉｓ ｏｆ ａｒｍｏｒ）を基準として観察した。
９６ＣＪ１０３５６菌株由来の粗色素を１．０μＬ／Ｌの濃度にて処理した場合、粗色素が殺藻効果を示すコクロヂニウム・ポリクリコイデス、ジャイロジニウム・インプジクム及びヘテロシグマ・アカシオでは経時によって細胞の膨潤と細胞の溶解が観察された（図６のＡ、Ｂ、Ｃ）。これに対し、粗色素が低い殺藻効果を有するアレクランドリウム・カタネラでは一部の外被の脱離が観察され（図６Ｄ）、プロセントリウム・マイカンスでは形状変化があまり見られなかった（図６Ｅ）。
また、微細藻類をＲＰ１０３５６で処理した場合も、コクロヂニウム・ポリクリコイデスにおいて図６Ａと同じ形状変異が観察された。この点から、殺藻物質は粗色素のＲＰ１０３５６色素によるものであることが確認できた。
＜実施例３＞ＲＰ１０３５６の生産
ハヘラ・チェジュエンシス９６ＣＪ１０３５６を用いて殺藻物質であるＲＰ１０３５６を大量生産するために、グルコース５重量％、０．１重量％のペプトン、０．４２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．３４ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、０．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、２．０ｇ／ＬのＣａＣｌ２、０．００１ｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．００１ｇ／ＬのＭｎＣｌ３、０．００１ｇ／ＬのＺｎＳＯ４、０．００１ｇ／ＬのＮａＭｏＯ４、蒸留水７５０ｍＬ及び寝かした海水を加えて最終容量３，０００ｍＬになるようにした後、前記９６ＣＪ１０３５６菌株を接種し、その次、５Ｌ回分式培養器において培養を行った。このとき、培養温度は２５℃にし、２００ｒｐｍにおける通気量は１．５ｖｖｍにした。
ハヘラ・チェジュエンシス９６ＣＪ１０３５６を用いて殺藻物質であるＲＰ１０３５６を大量生産するために、グルコース５重量％、０．１重量％のペプトン、０．４２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．３４ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、０．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、２．０ｇ／ＬのＣａＣｌ２、０．００１ｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．００１ｇ／ＬのＭｎＣｌ３、０．００１ｇ／ＬのＺｎＳＯ４、０．００１ｇ／ＬのＮａＭｏＯ４、蒸留水７５０ｍＬ及び寝かした海水を加えて最終容量３，０００ｍＬになるようにした後、前記９６ＣＪ１０３５６菌株を接種し、その次、５Ｌ回分式培養器において培養を行った。このとき、培養温度は２５℃にし、２００ｒｐｍにおける通気量は１．５ｖｖｍにした。
培養時間の経過に伴い多糖類生産が増え、培養８１時間後には最大値が保持された。培養４８時間までは菌体増殖が増加したが、７４時間以後には菌体増殖が減少した。生産されたＲＰ１０３５６の濃度を測定するために培養液１ｍＬに冷エタノール（ｃｏｌｄ ｅｔｈａｎｏｌ）２ｍＬを添加し、次いで超音波粉砕器で３０分間処理し、遠心分離（８，０００ｘｇ、１５分）を行い菌体を除去した。その後、分光光度計を用いて上澄み液の吸光度（Ａ５３９）を測定した。その結果、最終的に２０９ｍｇ／ＬのＲＰ１０３５６が得られた（図７）。
＜実施例４＞ＲＰ１０３５６の特性
（１）シリカ薄膜クロマトグラフィ（ＴＬＣ：ｔｈｉｎ−ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析
２−プロパノール粗抽出物からＲＰ１０３５６を精製するために、前記粗抽出物１μｇをエタノール１ｍＬに溶解し、その後、シリカ６０Ｆ２５４ＳＴＬＣプレート（メルク：Ｍｅｒｃｋ）に５μＬを滴下し、石油エーテル：アセトン：メタノール（５：３：２）混合液で１０ｃｍ展開した（図８）。その結果、Ｐｆ０．９８（明るい黄色）、Ｒｆ０．９６（濃い赤色）、Ｒｆ０．８８（明るい赤色）及びＲｆ０．５９（青色）の４通りの色素が得られた。
（１）シリカ薄膜クロマトグラフィ（ＴＬＣ：ｔｈｉｎ−ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析
２−プロパノール粗抽出物からＲＰ１０３５６を精製するために、前記粗抽出物１μｇをエタノール１ｍＬに溶解し、その後、シリカ６０Ｆ２５４ＳＴＬＣプレート（メルク：Ｍｅｒｃｋ）に５μＬを滴下し、石油エーテル：アセトン：メタノール（５：３：２）混合液で１０ｃｍ展開した（図８）。その結果、Ｐｆ０．９８（明るい黄色）、Ｒｆ０．９６（濃い赤色）、Ｒｆ０．８８（明るい赤色）及びＲｆ０．５９（青色）の４通りの色素が得られた。
（２）吸光光度計（ＵＶ）による吸収スペクトル分析
ＲＰ１０３５６の吸光型を調査するために、ＲＰ１０３５６１μｇ／ｍＬのエタノール溶液を分光光度計（島津、ＵＶ−ＶＩＳ２４０１ＰＣ、日本）を用いて３００〜７００ｎｍ波長の範囲で最大吸光波長を調査した（図９）。その結果、吸光光度計によるＲＰ１０３５６の最大吸光度は４８６ｎｍ及び５３９ｎｍであって、主ピークは５３９ｎｍであった。
ＲＰ１０３５６の吸光型を調査するために、ＲＰ１０３５６１μｇ／ｍＬのエタノール溶液を分光光度計（島津、ＵＶ−ＶＩＳ２４０１ＰＣ、日本）を用いて３００〜７００ｎｍ波長の範囲で最大吸光波長を調査した（図９）。その結果、吸光光度計によるＲＰ１０３５６の最大吸光度は４８６ｎｍ及び５３９ｎｍであって、主ピークは５３９ｎｍであった。
（３）シリカゲルクロマトグラフィ（Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による色素の大量精製
培養液から２−プロパノールで抽出した色素の大量分離及び精製を行うために、展開溶媒としてアセトン：メタノール（９：１）を使用してシリカ・クロマトグラフィ（ｓｉｌｉｃａ ｃｈｌｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０，０．０４０〜０．０６３ｍｍ、メルク、ドイツ）を行い粗色素を分離した（図１０）。シリカ・クロマトグラフィにより粗色素を分離・精製した結果、４通りに分画された。この分画は、ＴＬＣ結果と同様に明るい黄色、濃い赤色、明るい赤色及び青色の順になされ、これらのうち明るい赤色となるＲＰ１０３５６を分離した。
培養液から２−プロパノールで抽出した色素の大量分離及び精製を行うために、展開溶媒としてアセトン：メタノール（９：１）を使用してシリカ・クロマトグラフィ（ｓｉｌｉｃａ ｃｈｌｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０，０．０４０〜０．０６３ｍｍ、メルク、ドイツ）を行い粗色素を分離した（図１０）。シリカ・クロマトグラフィにより粗色素を分離・精製した結果、４通りに分画された。この分画は、ＴＬＣ結果と同様に明るい黄色、濃い赤色、明るい赤色及び青色の順になされ、これらのうち明るい赤色となるＲＰ１０３５６を分離した。
（４）高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ：Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析
精製色素をＨＰ１０５０システム（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ、米国）を用いて分析した。このとき、カラムとしてはシリカカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＳＩＬ、２５０×４．６ｍｍ、日本）を用いて、アセトン：メタノール（９：１）溶媒を毎分当たり１．０ｍＬずつ溶出し、ＤＡＤ−ＵＶ（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ、米国）を用いて５３９ｎｍ、４８６ｎｍ、及び３００〜８００ｎｍで、分析を行った（図１１及び図１２）。ＨＰＬＣによる分析によれば、ＲＰ１０３５６は、前記条件下で３．５２分の保持時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）を有し、３００〜８００ｎｍにおいても単一ピークが分離されることが確認できた。
精製色素をＨＰ１０５０システム（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ、米国）を用いて分析した。このとき、カラムとしてはシリカカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＳＩＬ、２５０×４．６ｍｍ、日本）を用いて、アセトン：メタノール（９：１）溶媒を毎分当たり１．０ｍＬずつ溶出し、ＤＡＤ−ＵＶ（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ、米国）を用いて５３９ｎｍ、４８６ｎｍ、及び３００〜８００ｎｍで、分析を行った（図１１及び図１２）。ＨＰＬＣによる分析によれば、ＲＰ１０３５６は、前記条件下で３．５２分の保持時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）を有し、３００〜８００ｎｍにおいても単一ピークが分離されることが確認できた。
上述したように、本発明は、ハヘラ・チェジュエンシス菌株由来の殺藻効果を有する赤色色素を提供する効果がある。本発明に係る赤色色素（ＲＰ１０３５６）は、コクロヂニウム・ポリクリコイデス、ジャイロジニウム・インプジクム、ヘテロシグマ・アカシオなどの赤潮原因種に対して優れた殺潮効果を有していることから、赤潮生物を除去する殺藻製剤の有効成分として有用である。
Claims (15)
- 次の段階を含む殺藻効果を有する色素物質の製造方法：
（ａ）ハヘラ属微生物を培養する段階；及び
（ｂ）前記培養液から有機溶媒を用いて殺藻効果を示す色素物質を分離・精製する段階。 - 前記ハヘラ属微生物はハヘラ・チェジュエンシスである請求項１に記載の殺藻効果を有する色素物質の製造方法。
- 前記ハヘラ・チェジュエンシスはハヘラ・チェジュエンシス９６ＣＪ１０３５６菌株（ＫＣＴＣ ２３９６）である請求項２に記載の方法。
- 請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法により製造され、シリカゲル薄膜クロマトグラフィ（ＴＬＣ）により、Ｒｆ値０．９８（石油エーテル：アセトン：メタノール＝５：３：２）を示し、及び約５３９ｎｍにおいて最大の吸光度を示すことを特徴とする、殺藻効果を有する赤色色素。
- 前記赤色色素がコクロヂニウム・ポリクリコイデス（Ｃｏｃｈｌｏｄｉｎｉｕｍ ｐｏｌｙｋｒｉｋｏｉｄｅｓ）、ジャイロジニウム・インプジクム（Ｇｙｒｏｄｉｎｉｕｍ ｉｍｐｕｄｉｃｕｍ）、またはヘテロシグマ・アカシオ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ ａｋａｓｈｉｗｏ）に対して殺藻効果を示す請求項４に記載の赤色色素。
- 前記赤色色素はＲＰ１０３５６である請求項４に記載の赤色色素。
- 請求項４に記載の赤色色素を有効成分として含む殺藻製剤。
- 前記赤色色素がコクロヂニウム・ポリクリコイデス（Ｃｏｃｈｌｏｄｉｎｉｕｍ ｐｏｌｙｋｒｉｋｏｉｄｅｓ）、ジャイロジニウム・インプジクム（Ｇｙｒｏｄｉｎｉｕｍ ｉｍｐｕｄｉｃｕｍ）、またはヘテロシグマ・アカシオ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ ａｋａｓｈｉｗｏ）に対して殺藻効果を示す請求項７に記載の殺藻製剤。
- ハヘラ属微生物培養液または前記培養液の有機溶媒抽出物を用いることを特徴とする赤潮生物の除去方法。
- 前記ハヘラ属微生物はハヘラ・チェジュエンシスである請求項９に記載の赤潮生物の除去方法。
- 前記ハヘラ・チェジュエンシスはハヘラ・チェジュエンシス９６ＣＪ１０３５６菌株（ＫＣＴＣ ２３９６）である請求項９に記載の赤潮生物の除去方法。
- 前記有機溶媒は２−イソプロパノールである請求項９に記載の赤潮生物の除去方法。
- 前記赤潮はコクロヂニウム・ポリクリコイデス（Ｃｏｃｈｌｏｄｉｎｉｕｍ ｐｏｌｙｋｒｉｋｏｉｄｅｓ）、ジャイロジニウム・インプジクム（Ｇｙｒｏｄｉｎｉｕｍ ｉｍｐｕｄｉｃｕｍ）、またはヘテロシグマ・アカシオ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ ａｋａｓｈｉｗｏ）によるものである請求項９に記載の赤潮生物の除去方法。
- 請求項４の赤色色素を用いることを特徴とする赤潮生物の除去方法。
- 前記赤潮はコクロヂニウム・ポリクリコイデス（Ｃｏｃｈｌｏｄｉｎｉｕｍ ｐｏｌｙｋｒｉｋｏｉｄｅｓ）、ジャイロジニウム・インプジクム（Ｇｙｒｏｄｉｎｉｕｍ ｉｍｐｕｄｉｃｕｍ）、またはヘテロシグマ・アカシオ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ ａｋａｓｈｉｗｏ）によるものである請求項１４に記載の赤潮生物の除去方法。
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