KR100495271B1

KR100495271B1 - 하헬라 제주엔시스 96ｃｊ10356 균주가 생산하는 적색색소의 살조효과 및 이로부터 적색색소를 생산하는 방법

Info

Publication number: KR100495271B1
Application number: KR10-2003-0029526A
Authority: KR
Inventors: 이홍금; 임정한; 김성진; 안세훈; 박규진; 이현상
Original assignee: 한국해양연구원
Priority date: 2003-05-09
Filing date: 2003-05-09
Publication date: 2005-06-14
Also published as: WO2004099391A1; CN1791667A; KR20040095563A; CN1791667B; JP2006526573A; JP4469840B2

Abstract

본 발명은 적색색소(red pigment)를 생산하는 하헬라 제주엔시스(Hahella chejuensis) 96CJ10356 균주(KCTC 2396) 및 이로부터 살조효과를 가지는 적색색소(RP10356)를 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의한 적색색소인 RP10356의 주 색소는 최대흡광도가 539nm이고, 적조원인 와편모조인 코크로디니움 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykricoids), 자이로디니움 임푸디쿰(Gyrodinium impudicum), 헤테로시그마 아카시오(Heterosigma akashiwo)에 살조효과가 있어 적조제어 분야에서 이용될 수 있다.

Description

하헬라 제주엔시스 96ＣＪ10356 균주가 생산하는 적색색소의 살조효과 및 이로부터 적색색소를 생산하는 방법{The algicidal effect of red pigment produced by Hahella chejuensis 96CJ10356 strain and a method for production of red pigment having algalcidal effect therefrom}

본 명세서에는 여러 편의 간행물이 참고문헌으로 인용되어 있는데, 이들 참고문헌은 명세서 중에 저자와 연도만을, 그의 상세한 내용은 특허청구범위 직전에 열거하여 놓았다.

1980년대 이후 남해안의 부영양화 해역을 중심으로 유해, 유독성 적조가 발생하고 일부 미세조류 종에 의하여 발생하는 적조는 양식어업에 있어 매년 큰 피해를 주고 있으며, 특히 매년 8월 이후 발생하는 코크로디니움 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykricoids)은 우리나라 연안양식에 큰 피해를 주고 있다(Park et al.,1998). 따라서 적조발생 원인 미세조류 종의 사멸과 생장억제에 대한 연구가 진행되고 있다(Yoshinaga et al., 1995).

해양생태계에서 미생물군집은 적조발생과 소명에 있어 중요한 역할을 담당하며(Furuka et al., 1992), 살조세균은 적조발생 해역에서 숙주생물에 의존하여 적조가 소멸되는 단계에서 최고농도에 이른다(Yoshinaga et al., 1995). 살조능력을 가지고 있는 세균은 Alteromonas, Cytophaga, Flavobaterium, Pseudoalteromonas, Saporospira 및 Vibrio로 알려져 있으며, 이들 세균이 적조의 소멸에 직·간접적으로 관여하는 것으로 보고되어 있다(Lovejoy et al., 1993). 살조세균은 다양한 종의 조류를 살상 또는 용조할 수 있으며, 각 세균마다 종 특이적인 살조범위를 가지고 있는데, 살조세균 Cytophoga sp.는 돌말류(Bacillariophyceae), 침편모조류(Raphydophyceae) 및 와편모조류(Dinophyceae)에 대한 다양한 살조능력을 가지고 있음이 보고되었다(Imai et al., 1993). 그러나 살조세균의 살조기작은 아직 연구가 미진하며, 이러한 예로, 적조생물의 급격한 감소는 세포의 용조(Imi et al., 1993), 성장억제에 의한 사멸(Imi et al., 1995) 및 알엑산드리움 카테넬라(Alexandrium catanella)에서와 같이 무성색식에서 유성생식으로의 교배단계 저해에 의한 사멸(Sawayama et a;., 1993) 등이 보고되어 있다.

살조세균의 살조기작은 두 가지로 정의되는데, 살조세균이 적조생물의 표면에 부착하여 적조생물을 용조하는 접촉에 의한 기작과(Imai et al., 1993) 살조세균이 살조물질을 세포외로 분비하여 적조생물의 생장을 억제, 또는 용조하는 기작으로 대부분의 살조세균은 이에 포함된다. 이 경우 항생제(Kawano et al., 1997), 저분자의 올리고펩티드(Sawayama et al., 1993), 단백질(Baker and Herson, 1978) 및 열에 불안정한 세포외 물질(Mitsutani et al., 1992) 등으로 조류의 감소는 대부분의 살조세균을 접종한 후 몇 시간에서 며칠 이내에 나타난다. 이러한 반응시간의 차이는 물질의 활성과 직접적으로 관련되어 있으며, 물질생성의 차이와 유도물질에 따라 다양하다. 그러나 색소를 살조물질로 이용하려는 시도는 보고되지 않았다.

색소는 천연색소와 합성색소로 나누어지며 식품공업, 화장품, 의약품 및 가축사료 첨가제 등으로 다양하게 사용되고 있는데, 이중 미생물을 이용한 천연색소는 동·식물이 생산하는 색소에 비교하여 발효에 의한 대량생산이 가능하고 품질이 안정된 제품의 생산이 가능하다. 미생물 색소는 배양방법, 사용배지에 따라서 다양한 색상의 색소가 생산되며, 동일한 균주에서도 배지성분, 배양온도, pH 등에 따라색조가 다른 색소가 생산된다(Carels et al., 1977). 특히 색소는 2차 대사물질로서 항생제, 독소등 2차대사산물의 발효에서 나타나는 전형적인 조절기작이 일어나는 것으로 알려져 있으며, 탄소원, 질소원, 인산 및 미량원소에 의하여 색소생성이 만은 영향을 받는 것으로 알려져 있다(Wong et al., 1981).

따라서, 이러한 살조미생물이 생산하는 살조물질을 이용하여 적조원인 미세조류의 생장을 억제하여 적조에 의한 양식피해를 줄이고자하는 연구가 활발히 진행되고 있다.

특히, 1982년에 적조를 일으킨 코크로디니움 폴리크리코이데스는 1990년부터 계속적인 적조를 일으켰으며, 1995년 이후로는 10,000 cells/㎖ 이상의 고밀도 적조로 남해안에서 동남해역까지 대규모로 발생하여 막대한 수산피해를 일으켜 사회, 경제적인 영향을 미쳐 이를 계기로 적조피해를 최소화하기 위한 적조방제 대책연구가 진행되고 있다(Kim et al. 1996).

이에 본 발명자들은 상기한 미생물에 의하여 생성되는 적색색소 및 다른 살조효과를 가지는 새로운 물질를 생산할 수 있는 미생물을 찾기 위하여 예의 연구한 결과, 살조물질을 생산하는 미생물인 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주를 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 살조특성을 가지는 적색색소를 생산하는 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기한 균주로부터 살조효과을 가지는 적색색소를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 작용은 하기 발명의 구성 및 작용으로부터 당업자에게 명백하게 드러날 것이다.

본 발명은 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주가 생산하는 적색색소의 살조효과 및 이로부터 살조효과를 가지는 적색색소를 생산하는 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명에서는 순수배양한 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주로부터 생산된 살조효과를 가지는 적색색소 RP10356을 분리한다.

하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396=IMSNU 11157)는 1996년 11월, 제주도에서 채집된 신속의 해양성 미생물로 그람음성의 운동성 간균이며, 이들은 다량의 세포외다당류(exopolysaccharide) 및 적색색소(red pigment)를 생산한다(Lee et al., 2001).

먼저, 본 발명에서는 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주에서 생산하는 적색색소를 에탄올로 추출한 후 이로부터 살조효과를 가지는 적색색소를 순수분리한다.

상기 RP10356를 생산하기 위한 조건은 다음과 같다:

1. pH 7.0 배양온도 25℃

2. 배양배지 조성은 영양염류, 미량의 무기염류 및 묵은 바닷물을 함유한다.

3. 생물배양기에서 배양한다.

여기에서, 영양염류로는 탄소원으로 글루코즈 5%, 질소원으로 펩톤 1%, 인산원으로 KH₂PO₄ 0.083g/ℓ, K₂HPO₄ 0.067g/ℓ, 다량의 무기원소로 MgSO₄ 5g/ℓ, CaCl₂ 1g/ℓ 등을 사용할 수 있다.

미량의 무기염류로는 FeCl₂ㆍ6H₂O 0.005g/ℓ, MnCl₂ㆍ4H₂O.001g/ℓ Na₂MoO₄0.001g/ℓ, ZnCl₂ 0.001g/ℓ 등을 처리하여 사용하는 것이 좋다.

본 발명에 의해 생산된 적색색소(RP10356)는 에탄올에서 최대흡광도가 486nm, 539nm인 지용성 적색색소로 조색소를 이용하여 코크로디니움 폴리크리코이데스, 자이로디니움 임푸디쿰, 헤테로시그마 아카시오, 알렉산드리움 카테넬라 (Alexandrium catenella) 및 프로센트리움 마이칸스 (Procentrum micans)에 살조효과를 조사하였고, 정제된 주 색소인 적색색소로 코크로디니움 폴리크리코이데스에 대한 살조효과를 조사하였다. 조사결과 적조원인종인 코크로디니움 폴리크리코이데스, 자이로디니움 임푸디쿰, 헤테로시그마 아카시오 등의 종에 대하여 살조효과를 갖는 것으로 조사되어 적조제어 분야에서 이용될 수 있다.

이하 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위한 것으로서, 본 발명이 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 적색색소(RP10356)의 추출 및 분리

① 사용균주

본 실험에 사용한 균주는 이 등(2001)이 제주도 해안 퇴적토에서 분리한 하헬라 제주엔시스(Hahella chejuensis gen.nov.,sp.nov.) 96CJ10356 균주(KCTC 2396=IMSNU 11157)로 STN 고체배지(표 1)에 접종하여 25℃에서 48시간 배양한 후 4℃에 냉장 보관하면서 2주마다 새로운 배지에 계대배양하여 사용하였다(도 1).

[표 1]

구성성분	농도
스쿠로오즈	20 g/ℓ
트립톤	10 g/ℓ
NaCl	10 g/ℓ
MgSO₄	5 g/ℓ
CaCl₂	1 g/ℓ
KH2PO₄	0.083 g/ℓ
K2HPO₄	0.067 g/ℓ
FeCl₃	0.005 g/ℓ
MnCl₂	0.001 g/ℓ
Na₂MoO₄	0.001 g/ℓ
ZnCl₂	0.001 g/ℓ
증류수	1,000 ㎖
pH	7.0

② 색소생산

96CJ10356 균주에서 적색색소를 생산하기 위한 기본배지는 SZoBell 배지로 그 조성은 표 2에 나타내었다. 96CJ10356 균주를 1ℓ 삼각플라스크에 2.0%로 상기배지에 접종한 후 25℃, 120 rpm으로 3일간 배양한 배양액에서 적색색소를 분리하였다.

[표 2]

구성성분	농도
글루코오스	20 g/ℓ
펩톤	5 g/ℓ
효모 추출물	1 g/ℓ
FePO₄	0.01 g/ℓ
묵힌 바닷물	750 ㎖
증류수	250 ㎖
pH	7.2

③ 색소추출

96CJ10356 균주 배양액에서 색소를 추출하기 위한 조건은 도 2와 같다. 96CJ10356 균주는 다량의 세포외다당류를 생산하는 미생물로 배양액으로부터 다당류를 제거하고 색소를 분리하기 위하여 배양액 1ℓ에 찬 2-이소프로판올을 2배 양으로 첨가한 후 초음파기(BRANSON 8210, USA)로 1시간 처리하고 4℃에서 24시간 방치하여 배양액으로부터 다당류를 제거하였다. 다당류가 제거된 배양액은 원심분리기(Sovall RC5C, Duppon, USA)를 12,000xg, 30분의 조건으로 원심분리하고 GF/F(Whatmann, φ47 mm, USA)로 여과하여 세포를 제거한 후 조 색소를 분리하였다.

③ 적색색소의 분리

96CJ10356 균주 배양액으로부터 다당류와 세포가 제거된 2-이소프로판올 색소 추출 액에서 적색색소를 분리하기 위한 조건은 도 2와 같다. 2-이소프로판올 색소 추출 액을 45℃에서 진공농축하여 2-이소프로판올을 제거한 후, 남아 있는 수용층에서 수용성 성분과 다량의 염(salt)을 제거하고 지용성 획분을 추출하기 위하여 1배의 석유에테르를 첨가하고, 1시간동안 진탕한 후 분액 깔대기를 이용하여 석유에테르 층을 분리하였다. 분리한 석유에테르 층은 수분제거를 위하여 무수 황산나트륨 및 여과지(No 5, Watmann, USA)로 거른 후, 다시 40℃에서 진공농축하여 석유에테르를 제거하였다. 색소 조추출액에서 살조특성을 가지는 색소를 분리하기 위하여 실리카 크로마토그래피(Silica chlomatography)를 수행하였다. 조 추출액은 실리카 겔(Silica gel 60, 0.040 - 0.063 mm, Merk, Germany)에 포매하여 동일 resin을 충전한 유리컬럼(φ2.5 x 30 cm)에 석유에테르:아세톤(7:3)을 전개용매로 조 색소를 분리하였다. 실리카 크로마토그래피에 의하여 분리된 색소의 TLC 결과를 표 3에 나타내었다. TLC 결과, 분리된 색소는 4개의 fraction으로 Rf 0.98(엷은 황색), Rf 0.96(엷은 적색), Rf 0.88(진한 적색) 및 Rf 0.59(청색)이었다. 이중 Rf 0.82(진한 분홍색)의 색소가 주 색소로 이를 "RP10356"으로 명명하고 살조효과를 조사하였다.

[표 3]

Rf	색
0.98	밝은 황색
0.96	엷은 적색
0.88	진한 적색
0.59	청색

[시험예 1] RP10356의 살조효과

① 미세조류

본 실험에 이용된 조류는 표 4와 같다. 미세조류는 부경대 양식학과 및 한국해양연구원 적조연구팀에서 분양 받았다. 이외 미세조류는 본 연구기간 적조발생 지역에서 직접 분리하였다.

[표 4]

분류	학명	배지	균주	분양원
Dinophyceae	Cochlodinium polykrikoides	f/2	-	BKU¹
	Gyrodinium impudicum	f/2	KG03	KORDI²
	Procentrum micans	f/2	-	KORDI
	Alexandrium catenella	f/2	-	KORDI
Raphidophyceae	Heterosigma akashiwo	f/2	-	KORDI

*1. BKU : Bu-Kung University, 2. KORDI : Korea Ocean Reserch & Development Institute.

② 미세조류의 배양

조류의 생장을 위한 배지는 f/2 배지를 이용하였고(Stein, 1973), 그 조성은 표 5에 나타내었다. 조류배양 조건은 온도 22.5℃, 광도 150 μEin/m²/s, 16 시간:8시간(명:암)의 광주기로 조절된 조류배양기(Je-il Science, Korea)에서 배양하였다. 살조효과을 측정하기 위한 조류 배양체는 대수 생장단계의 세포를 이용하였다. 조류의 생장은 형광광도계(Hitachi, F-2000, Japan)를 이용하여 측정하거나 2% Rugol 용액에 고정하여 도립현미경(Zeiss, Axon-1000, Germany)을 이용하여 계수 하였다.

[표 5]

1. f/2 배지

구성성분	농도
NaNO₃	0.075 g
NaH₂PO₄ㆍH₂O	0.005 g
Na2SiO₃ㆍ9H₂O	0.030 g
f/2 미량 금속 용액	1 ㎖
f/2 비타민 용액	1 ㎖
묵힌 바닷물	1,000 ㎖

2. f/2 미량원소 용액

구성성분	농도(g/ℓ)
MnCl₂ㆍ4H₂O	0.18
ZnSO₄ㆍ7H₂O	0.022
CuSO₄ㆍ5H₂O	0.01
Na₂MoO₄ㆍ2H₂O	0.007
CoCl₂ㆍ6H₂O	0.01
FeCl₂ㆍ6H₂O	3.15
Na₂-EDTAㆍ2H₂O	4.35

3. f/2 비타민 용액

구성성분	농도
비타민 B12	1 ㎍
바이오틴	1 ㎍
티아민-HCl	200 ㎎
증류수	1,000 ㎖

③ 조 색소의 살조효과

살조특성 조사는 다음과 같다. 분리한 조추출 색소 및 RP10356을 0, 0.1, 1.0, 10, 50 및 100 ㎍/㎖의 농도로 1 x 10³ cells/㎖의 코크로디니움 폴리크리코이데스, 자이로디니움 임푸디쿰, 헤테로시그마 아카시오, 알렉산드리움 카테넬라 및 프로센트리움 마이칸스 등의 적조원인 5종의 미세조류 배양액에 첨가하고 30분, 1시간, 2시간, 24시간 경과 후 처리구를 2% Rugol 용액에 고정하여 전도현미경 (Zeiss, Axon100, Germany)을 이용하여 세포용혈이 되지 않은 세포 수를 계수하고 초기 접종 세포수에서 용혈된 세포수를 계수하여 살조특성을 수학식 1에 의하여 조사한 결과를 도 3∼7 및 표 6에 나타내었다.

(초기 세포수 - 생존 세포수)

살조효과 (%) = --------------------------- x 100 (%)

초기 세포수

에탄올에 녹인 조 색소를 이용하여 살조효과를 조사한 결과, 코크로디니움 폴리크리코이데스는 0.1 ㎍/㎖ 농도의 경우, 30분에 3.8% 이었으며, 24시간 경과 후 72.1%이었으며, 1.0 ㎍/㎖ 농도에서 30분에 63.8% 이었으며, 24시간 경과 후 98.7%,최대처리 농도인 100 ㎍/㎖ 농도에서 30분에 91.3%로, 적조피해가 가장 심한 코크로디니움 폴리크리코이데스의 경우, 0.1 농도이상에서 살조효과가 있는 것으로 조사되었고, 특히 조 색소는 저 농도에서 초기 살조능이 우수한 것으로 조사되었다. 자이로디니움 임푸디쿰의 경우, 0.1 ㎍/㎖ 농도의 경우, 30분에 1.4% 이었으며, 24시간 경과 후 40.8%이었으며, 1.0 ㎍/㎖ 농도에서 30분에 28.7% 이었으며, 24시간 경과 후 93.0%, 최대처리 농도인 100 ㎍/㎖ 농도에서 30분에 60.6%로, 코크로디니움 폴리크리코이데스에 비교하여 다소 살조능력이 감소한 것으로 조사되었다. 헤테로시그마 아카시오의 경우, 0.1 ㎍/㎖ 농도의 경우, 30분에 6.5% 이었으며, 24시간 경과 후 78.8%이었으며, 1.0 ㎍/㎖ 농도에서 30분에 23.8% 이었으며, 24시간 경과 후 96.3%, 최대처리 농도인 100 ㎍/㎖ 농도에서 30분에 46.4%로 조사되었다. 이외 알렉산드리움 카테넬라 및 프로센트리움 마이칸스 등에 대하여는 살조능력이 미약한 것으로 조사되었다. 따라서 96CJ10356 균주의 조 색소는 적조원인 조사대상 5 균주에 대하여 서로 다른 살조효과를 가지고 있었으며, 이 중 코크로디니움 폴리크리코이데스에 대하여 살조효과가 매우 높은 것으로 관찰되었다.

④ RP10356의 살조효과

조 색소에 의한 살조시험 결과, 매년 우리나라에 적조피해를 일으키며 살조효과가 가장 우수한 종인 코크로디니움 폴리크리코이데스에 대하여 분리된 4개의 분획을 대상으로 살조효과를 조사하 결과는 도 8과 표 7과 같다. 살조효과의 시험은 상기 조 색소의 살조효과 시험과 동일하게 시험하였고, 조 색소의 살조효과와 비교한 결과는 도 및 표 와 같다. 4개 색소분획 중에 RP10356만이 살조효과를 가지고 있는 것으로 조사되었고 30분을 기준으로 살조효과를 비교한 결과, 1.0 ㎍/㎖의 농도에서 조 색소는 63.8%, RP10356은 83.5%로 증가하였고, 따라서 2-프로판올 조추출액내 존재하는 RP10356에 의한 살조효과인 것으로 조사되었다. 특히 30분에서 50%의 살조능력에 대한 RP10356의 농도는 0.65 ㎍/㎖이었으며, 24시간은 0.17 ㎍/㎖이었다.

[표 7]

농도㎕/ℓ/시간(h)	0.5	1	2	24
대조구	-2.37	0.79	-0.40	9.49
에탄올 (10^-3%)	-4.76	0.79	2.38	9.92
0.1	13.39	45.61	43.93	69.46
1.0	83.46	96.54	99.23	99.62
10	91.36	95.47	95.88	96.71
50	94.91	95.27	95.64	96.00
100	94.47	94.47	95.32	94.89

⑤ 미세조류의 관찰

RP10356을 농도별로 처리하고 농도별 시간당 살조효과에 따른 세포형태의 변화는 도립현미경을 이용하여 관찰하였다. RP10356에 의한 세포형태변화의 관찰기준은 성장억제(growth inhibition), 세포의 팽윤(swelling of cell), 세포의 용혈(lysis of cell), 외피의 탈리(edysis of armor)를 기준으로 관찰한 결과는 도 9와 같다. 96CJ10356 균주의 조 색소의 경우, 조사대상 균주 중 살조효과를 나타내는 코크로디니움 폴리크리코이데스, 자이로디니움 임푸디쿰 및 헤테로시그마 아카시오의 형태변화는 세포의 팽윤과 세포의 용혈이 관찰되었다(도 9A, 9B, 9C). 그러나 살조효과가 크지 않은 알렉산드리움 카테넬라는 외피의 탈리가 관찰되었으며(도 9D), 프로센트리움 마이칸스는 형태적 변화의 크지 않았다(도 9E). 특히, 알렉산드리움 카테넬라는 외피가 살조효과를 감소시키는 것으로 추측된다.

또한 RP10356의 경우, 코크로디니움 폴리크리코이데스에서도 도 9A와 동일한 형태적 변이가 관찰되어 살조물질은 조 색소의 RP10356 색소에 의한 것으로 조사되었다

[실시예 2] RP10356의 생산

① 전배양

ZoBell 고형배지에 도말하여 25℃에서 3일 배양하였다. 성장된 군락에서 루프(loop)를 이용하여 25㎖의 ZoBell 액체배지에 접종하여 25℃, 120rpm에서 12시간 진탕배양하였다.

② 세균 성장 측정

배양액을 100 mM 인산완충액(pH 7)으로 3회 세척한 후 분광광도계(UV-VIS 2401PC, Japan)를 이용하여 흡광도(A₆₆₀)를 측정하였다.

③ RP10356 측정

RP10356 측정하기 위하여 생산된 RP10356의 제거 및 다당류에 침적된 RP10356을 추출하고, 배양액 1 ㎖에 찬 에탄올(cold ethanol) 2 ㎖를 첨가한 후 초음파분쇄기에서 30분간 처리하고 원심분리(8,000xg, 15분)하여 균체 및 RP10356을 제거한 다음 분광광도계를 이용하여 흡광도(A₅₃₉)를 측정하였다.

④ RP10356을 생산하기 위한 최적배지의 조성

하헬라 제주엔시스 96CJ10356을 이용하여 살조물질인 RP10356을 생산하기 위한 최적 생산배지의 조성을 하기의 방법으로 조사하였다.

ⓐ 물리적 요인

RP10356의 생산에 요구되는 온도, 초발 pH, 배지양 및 접종량 등의 물리적 요인은 고 등(2000)의 조건을 이용하였으며, 아래의 표 8과 같다.

[표 8]

물리적 요인	조건
온도	25℃
초발 pH	pH 7
배지량	25㎖
접종량	2.0%

ⓑ 탄소원

100㎖ 삼각플라스크에 ZoBell 배지 25㎖를 기준으로 탄소원인 프럭토오스, 글루코오스, 갈락토오스 및 수크로오스를 각각 1 중량%(w/v) 농도로 첨가하고, 96CJ10356 균체를 2.0 중량%가 되도록 접종하여, 120rpm, 25℃의 조건으로 진탕 배양한 후 세포성장 및 RP10356의 생성을 조사한 결과를 도 10에 나타내었다. 탄소원 처리구별 RP10356의 생성은 글루코오스 3.102(A₅₃₉), 수크로오스 1.953(A₅₃₉), 프록토오즈 2.824(A₅₃₉)로 대조구인 ZoBell 배지에서의 1.864(A₅₃₉) 보다 갈락토오스 1.203(A₅₃₉)를 제외하고는 양호하였다. 균체 생장은 수크로오즈가 1.21(A₆₆₀)로가장 양호하였다. 균체의 생육은 글루코오스와 수크로오스 등에서 양호하였으며, RP-10356의 생산량 또한 균체량과 비례하여 생산되는 것으로 생각되며, 갈락토오스에서는 균체량과 다당류 생산량 등이 상대적으로 저조하였다. 따라서, 글루코오스를 탄소원으로 선별하였다.

RP10356의 생산에 적합한 글루코오스의 농도를 조사하기 위하여 글루코오스를 각각 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 중량%(w/v)의 농도로 첨가하고, 96CJ10356 균체를 2.0 중량%가 되도록 접종하여, 120rpm, 25℃의 조건으로 진탕 배양한 후 세포성장 및 RP10356의 생성을 조사한 결과를 도 11에 나타내었다. 과당 처리구별 RP10356의 생성은 5%에서 3.41 (A₅₃₉)로 가장 양호하였다.

100㎖ 삼각플라스크에 ZoBell 배지 25㎖를 기준으로 질소원으로 효모 추출물(yeast extract), 펩톤(pepton), 트립톤(tryptone), 맥아 추출물(malt extract), 쇠고기 추출물(beef extract), NH₄H₂PO₄, (NH₄)₂HPO₄, NH₄Cl, NH₄NO₃을 각각 0.2g/ℓ씩 첨가하고, 96CJ10356 균주 2.0 중량%가 되도록 접종하여, 진탕 배양기(120rpm, 30℃)에서 배양한 후 세포성장과 RP10356의 생성을 조사한 결과를 도 12에 나타내었다. 질소원 처리구별 RP10356의 생성은 펩톤이 3.70 (A₅₃₉)으로 모든 처리구 및 대조구 0.019 (A₅₃₉) 보다 양호하였으며, 균체 생장은 펩톤이 0.713 (A₆₆₀)이 양호하였으며, 전 처리구에서 낮은 균체 생장이 관찰되었다. pH는 전 처리구에 있어 6 - 7로 초기 pH보다 낮아졌다.

ⓓ 탄소원과 질소원의 비율

100㎖ 삼각플라스크에 ZoBell 배지 25㎖를 기준으로 C/N 비를 조사하기 위하여, 글루코오스 5%의 탄소원을 기준으로 펩톤의 농도를 C/N 비가 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 10.0으로 첨가하고, 96CJ10356 균주 2.0 중량%가 되도록 접종하여, 진탕 배양기(120rpm, 30℃)에서 배양한 후 세포성장과 RP10356의 생성을 조사한 결과를 도 13에 나타내었다. 탄소원대 질소원의 비(C/N ratio)는 C/N, 5에서 3.79(A₅₃₉)로 가장 양호한 RP10356의 생성이 이루어졌다.

ⓔ 무기인산

100㎖ 삼각플라스크에 ZoBell 배지 25㎖를 기준으로 무기인산인 KH₂PO₄ 및 KH₂PO₄를총 0.5, 1, 2, 5, 7, 10 mM 농도로 첨가하고, 96CJ10356 균체를 2.0 중량%가 되도록 접종하여, 120rpm, 25℃의 조건으로 진탕 배양한 후 세포성장 및 RP10356의 생성을 조사한 결과를 도 14에 나타내었다. KH₂PO₄ 및 KH₂PO ₄의 농도별 처리구에서 10배 희석액의 RP10356 생성은 0.5 mM에서 0.52(A₅₃₉)로 가장 양호하였다.

ⓕ 다량원소

100㎖ 삼각플라스크에 ZoBell 배지 25㎖를 기준으로 MgSO₄및CaCl₂를 각각 0.5, 1, 5g/ℓ 농도로 첨가하고, 96CJ10356 균체를 2.0 중량%가 되도록 접종하여, 120rpm, 25℃의 조건으로 진탕 배양한 후 세포성장 및 RP10356의 생성을 조사한 결과를 도 15 및 도 16에 나타내었다. MgSO₄처리구별 10배 희석액의 RP10356의 생성은 0.5% 이상 처리구에서 0.58(A₅₃₉)로 유지되었으며, 균체 생장은 0.6 (A₆₆₀)으로 유사한 생장이 관찰되었다. 또한 CaCl₂처리구별 10배 희석액의 RP10356의 생성은 2.0%에서 0.74(A₅₃₉)로 가장 양호하였으며, 균체 생장은 0.73(A₆₆₀)로 가장 높은 균체 생장이 관찰되었다.

ⓖ 미량원소

100㎖ 삼각플라스크에 ZoBell 배지 25㎖를 기준으로 FeCl₃, CuSO₄, MnCl₃, ZnSO₄, CoCl₂·6H₂O, NaMoO₄를 각각 0.001g/ℓ 농도로 첨가하고, 96CJ10356 균체를 2.0 중량%가 되도록 접종하여, 120rpm, 25℃의 조건으로 진탕 배양한 후 세포성장 및 RP10356의 생성을 조사한 결과를 도 17에 나타내었다. 각각의 미량원소별 10배 희석액의 RP10356 생성은 FeCl₃0.02(A₅₃₉), CuSO₄0.09(A₅₃₉), MnCl₃0.37(A₅₃₉), ZnSO₄0.27(A₅₃₉), CoCl₂·6H₂O 0.68(A₅₃₉), NaMoO₄0.44(A ₅₃₉)로 대조구 0.03(A₅₃₉)보다 MnCl_3,ZnSO_4,CoCl₂·6H₂O 및 NaMoO₄처리구에서 RP10356의 생산이 대조구보다 양호하였으며, 특히 CoCl₂·6H₂O가 RP10356의 생산을 촉진하는 것으로 조사되었다.

ⓗ RP10356 생산 최적 조건

RP10356 생산을 위한 최적 조건은 글루코오스 5 중량%, 펩톤 0.1 중량%, KH₂PO₄ 0.42g/ℓ, K2HPO4 0.34g/ℓ, MgSO₄ 0.5g/ℓ, CaCl₂ 2.0g/ℓ, CoCl₂·6H₂O 0.001g/ℓ, MnCl_3,0.001g/ℓ, ZnSO_4,0.001g/ℓ, NaMoO₄0.001g/ℓ및 묵은 바닷물을 첨가하여 최종 용량이 1,000㎖가 되도록 하고, pH 7, 온도 25℃, 접종량 2.0 중량%의 양으로 제조한 배지 조성을 본 발명에서는 "M-RP10356"이라 명명하였고, 상기 M-RP10356을 RP10356 생산 최적 배지 조건으로 하였다(표 9).

[표 9]

조성	농도
글루코오스	5 %
펩톤	1 %
KH₂PO₄	0.42 g
K₂HPO₄	0.34 g
MgSO₄	0.5 g
CaCl₂	2.0 g
CoCl₂·6H₂O_,	0.001 g
MnCl_3,	0.001 g
ZnSO₄	0.001 g
NaMoO₄	0.001 g
증류수	250 ㎖
묵힌 바닷물	750 ㎖
pH	7.0

② 5 ℓ 회분식 배양기에서 배양시간에 따른 다당류 생산

5ℓ 회분식 배양기를 이용하여 M-11568 배지에서 24시간 배양된 균주를 3ℓ의 working volume에 2% 접종하여 균주를 배양하고 균체의 성장 및 RP10356 생산 및 pH의 변화를 조사하였다. 이때 배양온도는 25℃이었고, 200rpm에서 통기량은 1.5vvm으로 설정하였다. 시간 경과에 따른 RP10356 생산 결과를 도 18에 나타내었다. 배양시간이 경과함에 따라 다당류 생산이 증가하는 것을 보였으며, 배양 81시간 후에는 최대치가 유지되었다. 최적조건에서 209 ㎎/ℓ의 최대 RP10356의 생산량이 얻어졌고, 배양 48시간까지 균체 생장이 증가하였으나, 74시간 이후에는 균체 증식이 감소하였다.

이상의 결과에서 본 연구에서 하헬라 제주엔시스 96CJ10356의 RP10356 생산을 위하여 물리적 요인, 탄소원, 질소원, 다량 무기염류, 미량무기염류 등의 요인 및 배양방법 등을 조사하여 최종적으로 209 ㎎/ℓ의 RP10356을 생산하였다.

[시험예 2] RP10356의 특성

① TLC(thin-layer chromatography)분석

2-프로판올 조 추출물에서 RP10356의 정제와 분석조건을 조사하기 위하여 1 ㎍을 에탄올 1 ㎖에 녹여 실리카 60F_254S TLC 판(Merck)에 5 ㎕ 점적한 후, 석유 에테르-아세톤-메탄올(5:3:2) 혼합액으로 10㎝ 전개시켜 분석한 결과를 도 19에 나타내었다. 전개결과, Rf치는 0.98(밝은 황색), 0.96(어두운 적색), 0.88(밝은 적색), 0.59(파랑)등의 4 fraction의 색소를 얻을 수 있었다.

② 흡광광도계(UV)에 의한 흡수스펙트럼 분석

RP10356의 흡광형을 조사하기 위하여 RP10356 1 ㎍/㎖의 에탄올 용액을 분광광도계(Shimadzu, UV-VIS2401PC, Japan)를 이용하여 300 - 700 nm 파장의 범위에서 최대 흡광파장을 조사한 결과는 도 20과 같다. 흡광광도계에 의한 RP10356의 최대흡광도는 486 nm 및 539 nm로서 주 피크는 539 nm이었다.

③ 크로마토그래피(Silica gel chromatography)에 의한 색소의 대량정제

배양액에서 2-프로판올로 추출한 색소의 대량분리 및 정제를 위하여 실리카 크레마토그라피(Silica gel 60, 0.040 - 0.063 mm, Merk, Germany) 조건을 조사한 결과, 실리카 크로마토 전개용매를 아세톤-메탄올(9:1)로 조 색소를 분리하여 TLC를 실시한 결과를 도 21에 나타내었다. 실리카 크레마토그라피에 의하여 조 색소를 정제한 결과, 각 분획은 4개의 분획으로 나뉘어졌으며, 각 분획은 TLC 결과와 동일하게 엷은 황색, 엷은 적색, 진한 분홍 적색 및 청색의 순서로 용출되어 이중 진한 분홍 적색인 RP10356을 분리하였다.

④ HPLC (high pressure liquid chromatography)분석

정제색소를 HP1050 시스템(Hewlett Packard, USA)를 이용하여 분석하였다. 이 때 사용한 컬럼은 실리카 컬럼(YMC-Pack SIL, 250 x 4.6 mm, Japan)이며 아세톤-메탄올(9 : 1)을 용매로 분당 1.0 ㎖씩 용출시켜 DAD-UV 검출기를(Hewlett Packard, USA) 이용하여 539nm, 486nm, 300nm - 800nm의 DAD로 분석한 결과를 도 22 및 도 23에 나타내었다. HPLC에 의한 분석에서 RP10356은 상기조건에서 RP10356은 상기 조건에서 머무름 시간(retention time)이 3.52 분이었으며, 300 - 800 nm에서도 단일 피크가 분리되는 것을 확인할 수 있었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 하헬라 제주엔시스(Hahella chejuensis) 96CJ10356 균주(KCTC 2396)는 적색색소를 생성하는 해양성 미생물로서, 이들이 생산하는 적색색소인 RP1036은 시험대상 균주인 코크로디니움 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykricoids), 자이로디니움 임푸디쿰(Gyrodinium impudicum), 헤테로시그마 아카시오(Heterosigma akashiwo)등의 적조원인 종에 살조효과를 가지고 있음을 알 수 있었으며, 따라서, 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)로부터 RP10356을 분리하여 살조물질(algicidal material) 및 살조제제로 이용할 수 있다.

<참고문헌>

1. 김학균·이삼근·안경호·윤성화. 1996, 한국연안의 유독성 Cochlodinium적조 발생과 변천. 제 2회 연구발표 및 귀국보고, 국립수산진흥원. 23-24.

2. 박영태·박지빈·정성윤·송병철·임월애·김창훈·이원재. 1998, 적조생물 살조세균 탐색 Ⅰ. 유해 적조생물 Cochlodinium polykrikoides 살조세균 Micrococcus sp. LG-1의 분리와 살조특성. J. Korean Fish. Soc. 31(5): 767-773.

3. Baker, K. H., and D. S. Herson. 1978, Interaction between the diatom Thalassiosira pseudomonanna and an associated Pseudomonad in a mariculture system. Appl. Environ. Microbiol. 35: 791-796.

4. Carels, M. and D. Shepherd. 1977, The effect of different nitrogen sources on pigment production and sporulation of Monascus species in submerged shaken culture. Can. J. Microbiol. 23: 1360-1372.

5. Furuki, M., and M. Kobayashi. 1991. Interaction between Chattonella and bacteria and prevention of this red tide. Marine Pollution Bull. 23: 189-193.

6. Imai, I., Y. Ishida, and Y. Hata. 1993. Killing of marine phytoplankton by a gliding bacterium Cytophaga sp. isolated from the costal sea of Japan. Mar. Biol. 116: 527-532.

7. Imai, I., Y. Ishida, K. Sakaguchi, and Y. Hata. 1995. Algicidal marine bacteria isolated from Northern Hiroshima Bay, Japan. Fisheries Scince. 61: 628-636.

8. Kawano, Y., Y. Nagawa, H. Nakanishi, H. Nakajima, M. Matsuo, and T. Higashihara. 1997. Production of thiotropocin by a marine bacterium, Caulobacter sp. and its antimicroalgal activities. J. Mar. Biotechnol. 5: 225-229.

9. Ko, S. H., H. S. Lee, S. H. Park, and H. K. Lee. 2000. Optimal condition for the production of exopolysaccharide by marine microorganism Hahella chejuensis. Biotechnol. Bioprocess Eng. 5:181-185.

10. Lee, H. K., Chun, J. S., Moon, E. Y., Ko, S. H., Lee, D. S., Lee, H. S. and Bea K. S. 2001, Hahella chejuensis gen. nov., sp. nov., an extracellular-polysaccharide-producing marine bacterium. Systematic and evolutionary Microbiology. 51: 661-666.

11. Lovejoy, C., J. P. Bowman, and G. M. Hallegraeff. 1998, Algicidal effect a novel marine Pseudoalteromonas isolate(Class Proteobacteria, Gamma subdivision) on harmful algal bloom species of the general Chattonella, Gymnodinium, and Herterosigam. Appl. Environ. Microbiol. 64: 2806-2813.

12. Mitsutani, A., K. Takesue, M. Kirita, and Y. Ishida. 1992. Lysis of Skeletonema costatum by Cytoplaga sp. isolated from the costal water of the Ariake sea. Nippon Suisan Gakkaishi. 58: 2159-2169.

13. Sawayama, S., Y. Sako and Y. Ishida. 1993, New inhibitor for mating reaction of Alexandrium catenella produced by marine Alteromonas sp. Nippon Suisan Gakkaishi. 59: 291-294.

14. Stein, J. R. 1973. Handbook of phycological methods; culture methods and growth measurements. Cambridge University Press., pp. 42-47.

15. Wong, H. C., Y. C. Lin, and P. E. Koeher. 1981, Regulation of growth and pigmentation of Monascus purpureus by carbon and nitrogen concentration. Myclogia 73: 649-654.

16. Yoshinaga, I., Kawai, T., Ishida, Y., Takeuchi, T., and Ishida, Y. 1995, Distribution and fluctuation of bacteria inhibiting the growth of a marine red tide phytoplankton Gymnodinium mikimotoi in Tanabe Bay. Wakayama Pref., Japan. Fish. Sci. 61(5): 780-786

도 1은 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)의 미생물 집락을 나타낸 그림이다.

도 2는 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)가 생산하는 적색색소의 추출 및 분리과정을 나타낸 그림이다.

도 3은 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)가 생산하는 조색소에 의한 코크로디니움 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)의 살조효과를 나타낸 그림이다.

도 4는 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)가 생산하는 조색소에 의한 자이로디니움 임푸디쿰(Gyrodinium impudicum)의 살조효과를 나타낸 그림이다.

도 5는 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)가 생산하는 조색소에 의한 헤테로시그마 아카시오(Heterosigma akashiwo)의 살조효과를 나타낸 그림이다.

도 6은 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)가 생산하는 조색소에 의한 알렉산드리움 카테넬라(Alexandrium catenella)의 살조효과를 나타낸 그림이다.

도 7은 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)가 생산하는 조색소에 의한 프로센트리움 마이칸스(Procentrum micans)의 살조효과를 나타낸 그림이다.

도 8은 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)가 생산하는 적색색소(RP10356)에 의한 코크로디니움 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)의 살조효과를 나타낸 그림이다.

도 9는 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)가 생산하는 조색소에 의한 살조작용에 있어 조사균주의 형태적 변화를 나타낸 그림이다(1. 코크로디니움 폴리크리코이데스, 2. 자이로디니움 임푸디쿰, 3. 헤테로시그마 아카시오, 4. 알렉산드리움 카테넬라, 5. 프로센트리움 마이칸스)

도 10은 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)가 탄소원에 의한 균체 생장 및 적색색소(RP10356)의 생산을 보여주는 그래프이다.

도 11은 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)가 글루코즈에 의한 균체 생장 및 적색색소(RP10356)의 생산을 보여주는 그래프이다.

도 12는 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)가 질소원에 의한 균체 생장 및 적색색소(RP10356)의 생산을 보여주는 그래프이다.

도 13은 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)가 탄소원대 질소원의 비(C/N ratio)에 의한 균체 생장 및 적색색소(RP10356)의 생산을 보여주는 그래프이다.

도 14는 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)가 무기인산에 의한 균체 생장 및 적색색소(RP10356)의 생산을 보여주는 그래프이다.

도 15는 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)가 NaCl에 의한 균체 생장 및 적색색소(RP10356)의 생산을 보여주는 그래프이다.

도 16은 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)가 MgSO₄에 의한 균체 생장 및 적색색소(RP10356)의 생산을 보여주는 그래프이다.

도 17은 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)가 CaCl₂에 의한 균체 생장 및 적색색소(RP10356)의 생산을 보여주는 그래프이다.

도 18은 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)가 미량원소에 의한 균체 생장 및 적색색소(RP10356)의 생산을 보여주는 그래프이다.

도 19는 5ℓ 배양기에서 M-RP10356 배지를 이용한 시간별 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)의 pH, 균체 생장 및 적색색소(RP10356)의 생산을 보여주는 그래프이다.

도 20은 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)가 생산하는 조 색소 및 분리된 적색색소(RP10356)의 박층 크로마토그래피에에 의한 분리된 색소를 보여준다(1:2-프로판올 조 색소, 2: RP10356).

도 21은 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)가 생산하는 적색색소(RP10356)의 분광광도계에 의한 UV 흡광광도를 보여준다.

도 22는 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)가 생산하는 적색색소(RP10356)의 대량생산을 위한 실리카 크레마토그래프조건에 의한 각 분획의 박층 크로마토그래피에에 의한 분리된 색소를 보여준다(1:2-프로판올 조 색소, 2: 분획 1, 3: 분획 2, 4: 분획 3, 5: 분획 4, 용매조건; 석유에테르:아세톤:메탄올=5:3:2).

도 23은 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)가 생산하는 적색색소(RP10356)의 고속크로마토그래피에 의한 분석을 나타내는 그림이다(1. 컬럼; YMC-Pack SIL, 250 x 4.6 mm, Japan, 2. 용매; 아세톤:메탄올=9:1, 3. 흐름속도; 1.0 ㎖/ℓ).

도 24는 하헬라 제주엔시스 96CJ10356 균주(KCTC 2396)가 생산하는 적색색소(RP10356)의 DAD 검출기에 의한 300 - 550nm에서의 고속크로마토그래피에 의한 분석을 나타내는 그림이다(1. 컬럼; YMC-Pack SIL, 250 x 4.6 mm, Japan, 2. 용매; 아세톤:메탄올=9:1, 3. 흐름속도; 1.0 ㎖/ℓ).

Claims

삭제
하헬라 제주엔시스(Hahella chejuensis) 96CJ10356 균주(KCTC 2396)를 배양하여 얻어지고, 하기 (1) 내지 (3)의 특징을 가지는 적색색소 RP10356:

(1) 최적온도 25℃

(2) 최적 pH 7

(3) 도 22 및 도 23에 도시된 HPLC(high pressure liquid chromatography) 분석 결과를 가짐.
제 2항에 있어서, 상기 적색색소가 살조능을 갖는 것을 특징으로 하는 적색색소.
글루코오스 5 중량%, 펩톤 0.1 중량%, KH₂PO₄ 0.34g/ℓ, K₂HPO₄ 0.34g/ℓ, MgSO₄ 0.5g/ℓ, CaCl₂ 2.0g/ℓ, CoCl₂·6H₂O 0.001g/ℓ, MnCl₃, 0.001g/ℓ, ZnSO₄, 0.001g/ℓ, NaMoO₄ 0.001g/ℓ, 묵은 바닷물 750㎖/ℓ 및 증류수 250㎖/ℓ로 이루어진 RP10356 배양배지에 하헬라 제주엔시스(Hahella chejuensis) 96CJ10356 균주(KCTC 2396)를 접종한 후, 20∼30℃, pH 7 조건에서 배양하여 상기 균주로부터 제 2항에 의한 적색색소인 RP10356을 생산하는 방법.
제 4항에 의한 방법으로 생산한 RP10356을 유효성분으로 함유하는 살조제제.