JP2006525508A - タンパク質バイオセンサ用の多重コートまたは多層取り込みマトリックス - Google Patents

Abstract

問題となっている分析物、特に糖に特異的な、任意選択でレポーター基と結合されている、結合タンパク質を、埋め込み、封入し、または取り込むことが可能な多重コートまたは多層マトリックス、ならびにそのようなマトリックスを作製および使用する方法。

Description

本発明は、問題となっている分析物に特異的な結合タンパク質を取り込むことができる、多重コートまたは多層マトリックス、およびそのようなマトリックスを作製し使用する方法を指向する。

様々な疾病および疾患の、診断および治療を改善するために、生理学的に関連ある化合物の生体内濃度をモニタすることは、望ましい目標であり、多くの個体の寿命が延びると考えられる。この分野における進歩は、糖尿病患者の適切な代謝制御を促進させるという分野で特に有望である。現在、ほとんどの糖尿病患者は、血糖値をモニタするのに「フィンガースティック」法を使用し、頻繁な（１日に数回）穿刺によって引き起こされる痛みが原因で、患者の服薬遵守が問題になっている。その結果、血糖またはその他のグルコース含有生物流体を頻繁に、および／または連続してモニタするための、非侵襲性または低侵襲性の生体内、より効率的には生体外の方法を開発する努力がなされている。

生理学的に関連ある化合物の生体内濃度をモニタするための、最も有望な方法のいくつかでは、バイオセンサの使用を包含する。バイオセンサは、変換（検出）要素と組み合わせた生物認識要素を使用して、特定の定量的なまたは半定量的な分析情報を提供することができる装置である。

タンパク質を使用した、試薬を含まない内蔵型の、および／または移植可能なおよび／または連続バイオセンサを開発するには、変換要素を検出装置と連絡させて、この変換要素に、またこの変換要素から、シグナルを発信させなければならない。典型的な方法は、固定化戦略を使用して、光ファイバまたは平面導波路の内部または表面にタンパク質を配置することを含む。そのような固定化戦略には、半透膜、有機ポリマーマトリックス、または無機ポリマーマトリックスの内部にタンパク質を取り込むことが含まれるが、これらに限定するものではない。使用される固定化戦略は、最終的に、作動するバイオセンサの性能を決定することができる。従来技術は、生体分子の固定化に関連した非常に数多くの問題について詳述している。例えば、多くのタンパク質は、不可逆的な構造変化、変性、および生化学的活性の損失を受ける。固定化したタンパク質は、任意の特定の表面で、多数の可能性ある向きで存在することができ、例えばいくつかのタンパク質は、その活性部位が露出するように配向し、その他のタンパク質は、それらの活性部位が露出しないように配向する（したがって、分析物との選択的結合反応を受けない）。固定化したタンパク質では、時間に依存した変性、固定化中の変性、および固定化の後の、取り込まれたタンパク質の浸出も生ずる。この結果、例えば、感知装置の較正を維持できないこと、およびシグナルドリフトを含めた問題が生ずる。外部からの色素またはレポーター基で修飾したタンパク質の固定化は、固定化法がレポーター基の機能を妨げてはならないので、さらなる問題を提示する。一般に、結合タンパク質は、効果的に使用することができるように、配向制御および構造の自由を必要とし、したがって文献に教示されている、多くの物理吸収と、ランダムもしくはバルク共有表面結合または固定化戦略は、一般に最適ではなく、または成功もしていない。

低温ゾル−ゲル処理法によって形成された単純な無機ケイ素マトリックスに、タンパク質およびその他の生体系を封入する、いくつかの報告がなされている（例えば、非特許文献１および２参照。）。機能的であるためには、取り込まれ、または固定化された結合タンパク質が、少なくとも若干の分析物誘導性構造変化を受けることができる状態になければならない。ゾル−ゲルが取り込まれたタンパク質は、劇的に変化した結合定数、または比較的短い時間で変化しもしくは様々な環境条件下で変化する結合定数を示すことができることが、報告されている（Ｂｒｅｎｎａｎ，１９９９）。さらに、ゾル−ゲルマトリックス内に取り込まれたタンパク質の活性は、時間依存性であることが報告されており、すなわちこの特徴によれば、生体外ならびに生体内での使用を目的としたバイオセンサに対するゾル−ゲルの一般的な適用可能性が、制限されることになる。ナノ多孔性ＴｉＯ_２被膜も、結合タンパク質を取り込むのに使用されてきたが、ケイ素由来のゾル−ゲルと同じ問題の多くが生じていた（例えば、非特許文献３参照）。

米国特許第５５１７３１３号明細書 米国特許第５９１０６６１号明細書 米国特許第５８９４３５１号明細書 米国特許第５３４２７８９号明細書 ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ/ＵＳ０３／００２００号明細書 ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ/ＵＳ０３／００２０１号明細書 ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ/ＵＳ０３／００２０３号明細書 Brennan,J.D. Journal of Fluorescence 1999,9(4),295-312 Flora他、Analytical Chemistry 1998,70(21),4505-4513 Topoglidis他、Analytical Chemistry 1998,70,5111-5113 Beach他、IEEE Transactions on Instrumentation and Measurement 1999,48(6) 1239-1245 「Biosensors Fundamentals and Applications」、A.D.F.Turner、I.Karube、およびG.S.Wilson編；Oxford University Press出版、1988 Quinn他、Biomaterials 1995,16(5),389-396 Quinn他、Biomaterials 1997,18(24),1665-1670 GillおよびBallesteros、Journal of the American Chemical Society 1998,120(34),8587-8598 Vyas他、Science 1988,242,1290-1295 Mowbray他、Receptor 1990,1,41-54 http://www.rcsb.org/pdb/ www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ Turcatti他、J Bio.Chem.1996,271(33),19991-19998 Greg T.Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press,1996,San Diego,pp.4-16 Gruber他、Bioconjugate Chem.2000,11,161-166 Gaertner&Offord 1996 Alouani他、1995 GeogheganおよびStroh、1992 Hoffman、1996 Hermanson、1996 Cass他、Anal.Chem.1994,66,3840-3847 Journal of the American Chemical Society 1998,120(34),8587-8598 Shoemaker他(1987)

したがって、当技術分野では、シグナル送受信要素を接続するために、特定の分析物に特異的な結合タンパク質を埋め込むことができ、取り込むことができ、または封入することのできる、改善された分析物透過性マトリックスを設計することが求められている。

本発明は、分析物濃度の実時間測定を、例えばレポーター基の蛍光を測定することによって行うことができるように、問題となっている分析物に特異的な結合タンパク質を、任意選択でレポーター基と共に埋め込むことができ、取り込むことができ、または封入することのできる、多重コートまたは多層マトリックスを提供する。多重コートまたは多層マトリックスは、好ましくは３種のコーティングまたは層を含み、すなわち（ｉ）結合タンパク質を物理的にまたは共有結合的に埋め込むことができ、取り込むことができ、または封入することのできるコアと、（ｉｉ）このコアを取り囲んでその一体性を確実にする、閉じ込め層またはコーティングと、（ｉｉｉ）問題となっている分析物に対してマトリックスの選択性をもたらす外層とを含む。また本発明は、マトリックスを生体適合性にするのに使用することのできる、任意選択の第４の層またはコーティングも提供する。いくつかの層またはコーティング組成物は、これらの性質の１つまたは複数を組み合わせることができ、例えば、１つの層が生体適合性と選択性の両方を提供することができ、または封じ込めと選択性の両方の性質を提供することができ、それによって、所望の性質を有する唯一固有の層の必要性がなくなる。

コアは、アルギネートもしくはキトサン、またはその他の適切なポリマーなど、埋込み、封入、または取込み化合物を含んだ組成物を含む。封じ込めコーティングまたは層は、ポリリジン、低分子量および高分子量のポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、Ｎ−メチル−４（４’−ホルミルスチリル）ピリジニウムメトスルフェートアセタール（ＳｂＱ−ＰＶＡ）、Ｎａｆｉｏｎ（登録商標）、またはポリウレタンなどの組成物を含む。外層またはコーティングは、ＳｂＱ−ＰＶＡ、メタクリル酸ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）、ＰＶＡ、アルギネート、ポリウレタン、または無機質ゾル−ゲルもしくは有機的に修飾した無機質ゾル−ゲルなど、問題となっている分析物に対して透過性のあるポリマーコーティングを含む。

本発明は、生体内または生体外で、問題となっている分析物の濃度を測定するのに適したバイオセンサも提供する。本発明のバイオセンサは、問題となっている分析物に特異的な少なくとも１種の結合タンパク質と、任意選択で、そこに関連付けられまたはそこに結合された、問題となっている分析物の濃度を決定することが可能な少なくとも１個のレポーター基とを有する、多層または多重コートマトリックスを含む。１つの好ましい実施形態で、測定される分析物は、グルコースおよび／または関係する糖である。

本発明はさらに、問題となっている分析物に対して透過性あるマトリックスに埋め込まれ、取り込まれ、または封入された、変異したグルコース／ガラクトース結合タンパク質と、任意選択で、結合タンパク質に結合された少なくとも１個のレポーター基とを含み、生体内で使用するのに適切な、グルコース濃度を測定するための装置であって、変異したグルコース／ガラクトース結合タンパク質が様々なグルコース濃度に曝されたときに、レポーター基が、検出可能で可逆的シグナルを提供するようになされている装置を提供する。

さらに本発明は、ｉ）結合タンパク質、および、任意選択でそこに結合されていてもよい少なくとも１個のレポーター基を含有する多重コートまたは多層マトリックスを、生体内または生体外で溶液と接触させるステップと、ｉｉ）このマトリックスを、シグナルを生成することが可能なエネルギー源に曝すステップと、ｉｉｉ）結合タンパク質、またはそこに関連付けられたレポーター基によって発せられたシグナルを測定するステップとを含む、問題となっている分析物の濃度を測定する方法を提供する。シグナルの強度は、溶液中に存在する分析物の量に、直接相関している。好ましくは、問題となっている分析物が、グルコースまたは関係する糖であり、結合タンパク質は、変異したグルコース／ガラクトース結合タンパク質である。

別の態様で、本発明は、（ａ）コアを形成するステップと、（ｂ）このコアを被覆しまたは層状化するのに十分な時間、このコアを第１のコーティング溶液に接触させるステップと、（ｃ）コアを分離し、コアの表面の第１のコーティングをし乾燥して、閉じ込め層またはコーティングを形成するステップと、（ｄ）閉じ込め層またはコーティングを、第２のコーティング溶液と接触させて、多重コート３次元構造を形成するステップと、（ｅ）多重コート３次元構造を分離し、多重コート３次元構造表面の第２のコーティングを乾燥して、多重コートまたは多層マトリックスを得るステップとを含む、多重コートまたは多層マトリックスの作製方法を提供する。問題となっている分析物に特異的な結合タンパク質は、コアに埋め込まれ、取り込まれ、または封入されることが好ましい。結合タンパク質は、任意で、マトリックスのコアに対して共有結合させてもよい。

本発明の以下の詳細な記述は、全ての実施形態を例示するものではない。本発明の好ましい実施形態について述べる際、明確にするために特定の用語を用いる。しかしながら、本発明は、そのように選択された特定の用語に限定しようとするものではない。特定の要素のそれぞれは、類似する目的を達成するために類似する手法で動作する、全ての技術的均等物を含むことが理解されよう。

本発明は、分析物濃度の実時間測定を行うことができるように、問題となっている分析物に特異的な結合タンパク質を、任意選択でレポーター基と共に、埋め込むことができ、取り込むことができ、または封入することのできる、多重コートまたは多層化されたマトリックスを提供する。

本明細書で使用する「マトリックス」は、１種または複数の分析物濃度に対応した検出可能なシグナルを測定することを目的に、少なくとも１種の結合タンパク質を、埋め込むことによって、取り込むことによって、または封入することによって固定化することが可能な、本質的に３次元の環境を指す。マトリックスの構成成分と結合タンパク質との間の関係には、共有、イオン、およびファンデルワールス相互作用、ならびにこれらの組合せが含まれるが、これらに限定するものではない。マトリックスは、患者または医療提供者に対して、一時的、連続的、またはプログラム化された読取りが可能になるように、例えば患者の組織内に装入されるファイバまたはその他の小さい低侵襲的プローブの遠位端に組み込むことのできる、結合タンパク質変換要素立体配置を提供する。変換要素から患者または医療提供者への情報は、教示されるように（例えば、特許文献１，２、３、および４、ならびに非特許文献４参照。）、例えば遠隔測定、視覚、聴覚、または当技術分野で知られているその他の手段によって、提供することができる。情報には、適切な場合、分析物濃度または濃度の変化を得るのに適切な、電気的、機械的、および化学的放射線が含まれる。

数多くのヒドロゲルが、マトリックス層の１つまたは複数に関し、本発明で使用することができる。ヒドロゲルは、例えば、アガロース、デキストラン、カラゲナン、アルギン酸、デンプン、セルロースなどの多糖類、またはこれらの誘導体であって、例えばカルボキシメチル誘導体などであり、または水膨潤性有機ポリマーであって、例えばポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、スチレンと無水マレイン酸のコポリマー、ポリウレタン、ビニルエーテルと無水マレイン酸のコポリマー、およびこれらの誘導体でよい。共有結合的に架橋した網状構造をもたらす誘導体が、好ましい。ポリペプチドを含むヒドロゲルの合成と、生物医学的なおよび医薬品としての利用が、当技術分野で知られている（例えば、非特許文献５参照。）。陽イオンスチバゾリウムヘミシアニンの分類に属する、水溶性の紫外線（ＵＶ）架橋型ポリマーから得られた例示的なヒドロゲルマトリックスは、ポリ（ビニルアルコール）、ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅ Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡから入手可能なＮ−メチル−４（４’−ホルミルスチリル）ピリジニウムメトスルフェートアセタール（ＣＡＳ登録番号［１０７８４５−５９−０］）を含む。チオール反応性ヒドロゲルポリマーは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）またはポリアクリル酸など、遊離カルボン酸基を持つ材料から容易に得ることができる。チオール反応性基を持つその他のポリマー、例えば、市販されている（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，アラバマ州）チオール反応性マレイミド基を持つ高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、使用してもよい。

ヒドロゲルのポリマー部分は、タンパク質またはレポーター基との水素結合または共有結合に適切な、１個または複数の官能基（例えば、ヒドロキシル基、アミノ基、エーテル結合、カルボン酸およびエステルなど）を含有することができる。

封入プロセスの一実施形態では、水中の１種または複数のヒドロゲルを、タンパク質に応じてｐＨが約４〜約１０の範囲内にある緩衝水溶液中で変異した結合タンパク質に、添加する。その後、マトリックスを硬化することによって、例えば架橋することによって、物理的形態が得られる。この技法および従来の製作プロセスを使用して（例えばブロック鋳造、逆乳化重合、スクリーン印刷または密着焼付け、流動床コーティング、および浸漬またはスピンコーティング）、生体外および生体内での使用に適切な、様々な構成のマトリックス（例えばビーズ、顆粒、ナノ粒子、ミクロ粒子、モノリス、厚膜、および薄膜）を得ることができる。

図１は、本発明のマトリックスを示す。コア１、閉じ込め層２、および外層３を含む多重コート粒子１０が、示されている。コアは、問題となっている分析物に特異的な結合タンパク質の、閉込め、埋込み、または封入を可能にする。一般に、マトリックスのコアは、例えばアルギネートまたはヒアルロネートなどのヒドロゲルのような、任意の適切な天然のまたは合成のポリマーからなる。好ましい実施形態で、コア１はアルギネートである。特に好ましい実施形態で、結合タンパク質は、任意選択で、問題となっている分析物との結合によってシグナルが生成されるよう選択された少なくとも１個のレポーター基と共に、コア内部に共有結合的に取り込まれ、埋め込まれ、または封入される。

埋め込まれ、封入され、または取り込まれた材料は、マトリックスのコアを形成するのに使用される。封入コアは、ヒドロゲル、特にアルギネートおよびヒアルロネート、または別の水溶性かつ架橋可能なポリマーが好ましく、これには酢酸セルロース、ペクチン、キトサン、およびセルロース由来のポリマー、すなわちセルロースエーテルなどが含まれるが、これらに限定するものではない。一実施形態で、コアは、結合タンパク質の共有結合に適した化合物からなる。コアがアルギネートを含む場合、架橋はカルシウムイオンとともにすることができるが、バリウム、ストロンチウム、およびマグネシウムを使用してもよい。結合タンパク質がコアに共有結合していない場合、コアは、結合タンパク質を物理的に埋め込み、取り込み、または封入するよう十分に架橋可能であるべきである。タンパク質が放出されないように、材料の十分な架橋レベルを決定することは、日常的な実験による当業者の範囲内である。

タンパク質とマトリックスとの共有結合の場合、まずタンパク質をマトリックスに共有結合し、その後、架橋することが望ましい。しかしながら、タンパク質の共有結合より前に行われ、またはタンパク質の共有結合と組み合わせて同時に行われる、マトリックスの架橋または部分架橋は、本発明の範囲内である。

多重コートまたは多層マトリックスの閉じ込め層２は、コアおよび／またはその内容物を含有するのに役立ち、その一体性は、例えば望ましくない反応（例えば溶解または分解）をもたらす可能性のある、外層または外部溶液の成分との接触および／または相互作用を防ぐことによって、保たれる。閉じ込め層２は、分子量または電荷に基づく分子による浸入を防ぐため、選択的障壁特性をもたらすこともできる。閉じ込め層２は、例えば、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−オルニチン、低および高分子量ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルアルコール）などの陽イオンスチバゾリウムヘミシアニン修飾ポリビニルアルコール、Ｎ−メチル−４（４’−ホルミルスチリル）ピリジニウムメトスルフェートアセタール（ＳｂＱ−ＰＶＡ）、およびＮａｆｉｏｎ（登録商標）（テトラフルオロエチレンおよびパーフルオロ−［２−（フルオロスルホニルエトキシ）プロピルビニルエーテル］コポリマー）などの過フッ化イオン交換コポリマーを含んでいてもよい。ポリ−Ｌ−リジンが特に適切である。

多重コートまたは多層マトリックスの外層３は、問題となっている分析物を、マトリックスに選択的に浸透させ、かつコア内の結合タンパク質と接触させまたは相互作用させるようにし、それと同時に、取り込まれまたは封入されたタンパク質が、マトリックス内部から浸出しないようにするのに役立つ。多重コートまたは多層マトリックスの外層３は、生体適合性材料から調製すること、または身体に対する副作用を最小限にすることが可能な材料を組み込むことが好ましい。移植片からの副作用には、とりわけ、炎症、タンパク質の汚れ、組織壊死、免疫応答、および有毒材料の浸出が含まれる。そのような材料または治療は、例えばＱｕｉｎｎ他により教示されているように（例えば、非特許文献６および７参照。）周知であり、当技術分野で実施されている。外層３は、例えば、架橋性ポリマーまたはポリマー前駆体、例えばポリ（ビニルアルコール）、Ｎ−メチル−４（４’−ホルミルスチリル）ピリジニウムメトスルフェートアセタール（ＳｂＱ−ＰＶＡ）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ｐＨＥＭＡ）などと、アルギネート、または有機または無機試薬で修飾した無機ゾル−ゲルを含むことができる。１つの特に好ましい実施形態で、外層３は、有機または無機試薬で修飾したケイ素またはチタンの無機ゾル−ゲルからなる。

本発明で有用なゾル−ゲルには、従来の周知のゾル−ゲル法によって調製された材料が含まれ、また、無機材料、有機材料、または混合有機／無機材料が含まれる。ゾル−ゲルの生成に使用される材料には、アルミネート、アルミノシリケート、およびチタネートを含めることができるが、これに限定するものではない。これらの材料を、有機的に修飾したシリケート（ｏｒｍｏｓｉｌｓ）および官能化シロキサンで強化して、親水性および疎水性、イオン電荷、タンパク質の共有結合などをもたらしかつ操作するための道筋を提供することができる。本明細書で使用するように、「加水分解的に縮合可能なシロキサン」という用語は、合計４個の置換基を有するゾル−ゲル前駆体を指し、少なくとも１個、好ましくは２個、最も好ましくは３個または４個の置換基が、酸素を介してシリコーンに共有結合しているアルコキシ置換基、およびこれらの混合物であるものである。３個、２個、および１個のアルコキシ置換基前駆体である場合、残りの置換基の少なくとも１個は、好ましくは炭素を介してシリコーンに共有結合しており、残りの置換基は、アルキル、アリール、アミン、アミド、チオール、シアノ、カルボキシル、エステル、オレフィン、エポキシ、シリル、ニトロ、およびハロゲンから選択された有機官能基を含有している。

修飾したゾル−ゲルは、少なくとも部分的に硬化した（またはゲル化した）製剤を含み、この製剤は、ゾル−ゲル前駆体材料の他に、好ましくは１種または複数の有機成分を含有する透過性金属酸化物ガラス構造からなるが、この有機成分は、ゾル−ゲル前駆体と共に加水分解的に縮合して、得られるゾル−ゲルマトリックスが例えば移植に適した性質をもたらすようになるものである。適切な性質には、経時的な体積収縮が低いこと、亀裂およびその他の物理的欠陥に対する抵抗性、タンパク質機能の維持、ならびにタンパク質および／またはレポーター基との適合性、ならびに移植することのできる動物または被験体に対する適合性が含まれる。適切な有機物質には、教示されるように（例えば、非特許文献８参照。）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのポリオールが含まれる。タンパク質−レポーター対の性能特性、および封入マトリックスの機能性能特性の最適化は、例えば、当技術分野で知られている組合せ方法またはその他の統計に基づく設計方法によって、実現することができる。

様々なポリマーは、閉じ込め層２（一般に、第２の層）および外層３（一般に、第３の層）に対して障壁を提供することができる。第３の層は浸出障壁を提供することができる一方、この障壁または第４の層は、生体適合性を提供することもできる。例えば意図される用途が生体内移植である場合には、追加の外層またはコーティングを、多重コートまたは多層マトリックスに付加して、生体適合性を改善することができる。任意選択の第４の層またはコーティングに使用することのできる、様々なポリマーの例のいくつかは、Ｎａｆｉｏｎ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ｐＨＥＭＡ）、およびアルギネートである。

いくつかの場合には、本発明の多重コートまたは多層マトリックスは、わずかに２つの層またはコーティングを有することができ、すなわち単一の組成物が、閉じ込め層２と外層３の両方の役割を果たすことができ、または、閉じ込め層が、コア１の性質により不要になる可能性がある。コアが混合組成である場合、例えば相互浸透網状構造では、様々な材料からなる２〜３層で十分と考えられる。

問題となっている１種または複数の分析物に関する、１種または複数の結合タンパク質は、任意選択で、この分析物との結合または相互作用によって検出可能なシグナルを提供するレポーター基と共に、コア１に組み込むことができる。例えば一実施形態で、変異したグルコース／ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）は、検出可能なレポーター基を含むが、このレポーター基の検出可能な特性が、グルコース結合によって生ずるタンパク質高次構造の変化によって変わるものである。好ましい実施形態で、レポーター基は、グルコースに対して親和性を有する変異ＧＧＢＰをもたらすルミネセンス標識であり、これはグルコース結合によって、ルミネセンス特性に検出可能なシフトを引き起こすものである。検出可能な特性の変化は、変異ＧＧＢＰに結合した標識の環境変化に起因すると考えられる。

「結合タンパク質」という用語は、分析物が存在しない状態でのシグナル、または経時的に濃度が変化する分析物が存在する状態でのシグナルと区別することが可能な、検出可能なおよび／または可逆的なシグナルを変換しまたは提供することが可能な手法で、または濃度依存的な手法で、本明細書に記載される方法を用いて、特定の分析物と相互作用するタンパク質を指す。変換事象には、１回または再使用可能な利用も含めた、連続的な手段、プログラムされた手段、または一時的な手段が含まれる。可逆的シグナル変換は、分析物の存在または濃度との相関が確立されるという条件で、瞬間的な、または時間依存的なものでよい。変換が行われるように変異した結合タンパク質が、好ましい。

結合タンパク質は、問題となっている分析物に特異的な任意のタンパク質であって、この分析物が可逆的に結合しまたは関連付けられるようになる任意のタンパク質（グルコース、ガラクトース、マルトース、遊離脂肪酸結合タンパク質などを含む）とすることができ、さらに、そのような結合が競合リガンドの無い状態で生ずるときに、直接的にまたはレポーター基を介してシグナルを提供するように誘導することのできる任意のタンパク質とすることができる。当業者は、糖およびその他の問題となっている分析物に対する非常に数多くの結合タンパク質を知っている。

本発明での使用に特に好ましいものは、グルコース、ガラクトース、およびマルトース結合タンパク質などの、糖結合タンパク質である。本明細書で使用する「ガラクトース／グルコース結合タンパク質」または「ＧＧＢＰ」または「マルトース結合タンパク質」または「ＭＢＰ」という用語は、細菌の細胞周辺区画に自然に見出されるタンパク質のタイプを指す。これらのタンパク質は、細胞質に向かう小分子（例えば糖、アミノ酸、および小ペプチド）の走化性および輸送に、自然に関与する。例えばＧＧＢＰは、３本のストランドにより接続されて蝶番を形成する２つの球状α／βドメインからなる、単鎖タンパク質である。結合部位は、２つのドメインの間隙に位置付けられる。グルコースが結合部位に入るとき、ＧＧＢＰは、蝶番を中心に構造変化を受け、そのため２つのドメインが一緒になって、結合部位にグルコースを取り込む。Ｘ線結晶構造は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば、非特許文献９参照。）および鼠チフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（例えば、非特許文献１０参照。）からのＧＧＢＰの閉じた形態について決定されており、それぞれ２ＧＢＰおよび３ＧＢＰとしてＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（例えば、非特許文献１１参照。）から入手可能である。野生型大腸菌ＧＧＢＰのＤＮＡおよびアミノ酸配列は、受入番号Ｄ９０８８５（ゲノムクローン）および受入番号２３０５２０（アミノ酸配列）に見出すことができる（例えば、非特許文献１２参照。）。好ましいＧＧＢＰは、大腸菌からのものである。

結合タンパク質は、問題となっている分析物に特異的に結合する、任意の天然に生ずるタンパク質、改変タンパク質、または変異タンパク質とすることができる。本明細書で使用する「変異結合タンパク質」（例えば「変異ＧＧＢＰ」）は、天然に生ずるタンパク質中に存在するアミノ酸と置換され、またはそのアミノ酸から欠失し、またはそのアミノ酸に付加されたアミノ酸を含有する、細菌からの結合タンパク質を指す。そのような置換、欠失、または挿入は、１次タンパク質配列内の５個よりも少ないアミノ酸残基に関与することが好ましい。これらの変化の他に、変異結合タンパク質は、精製中に使用するために、タンパク質末端に付加されたポリヒスチジン配列などの融合パートナーと組み合わせてもよい。結合タンパク質の例示的な変異には、電気化学的なまたは光応答性のレポーター基を共有結合させるため、天然に生じないアミノ酸であるシステイン基の付加または置換と（例えば、非特許文献１３参照。）、実質的に非反応性のアミノ酸の、反応性アミノ酸との置換が含まれる。「反応性」アミノ酸とは、チオール反応性色素によるシステインの標識に類似した、標識剤で修飾されるアミノ酸を意味する。非反応性アミノ酸には、タンパク質に組み込まれた後は容易に修飾することのできない側鎖を有するアラニン、ロイシン、フェニルアラニンなどが含まれる（例えば、アミノ酸側鎖反応性の分類に関する非参考文献１４参照）。例えば、記載されている（例えば、特許文献５、６、および７参照。）変異グルコース／ガラクトース結合タンパク質およびレポーター基を、アルギネートコアに封入しまたは取り込むことができる。前述のＰＣＴ出願に記載される、システイン残基を含有するよう変異したガラクトース／グルコース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）が、特に好ましい。

ＧＧＢＰタンパク質の例示的な変異には、位置１１でのリジンからシステインへの置換（Ｋ１１Ｃ）；位置１４でのアスパラギン酸からシステインへの置換（Ｄ１４Ｃ）；位置１９でのバリンからシステインへの置換（Ｖ１９Ｃ）；位置４３でのアスパラギンからシステインへの置換（Ｎ４３Ｃ）；位置７４でのグリシンからシステインへの置換（Ｇ７４Ｃ）；位置１０７でのチロシンからシステインへの置換（Ｙ１０７Ｃ）；位置１１０でのトレオニンからシステインへの置換（Ｔ１１０Ｃ）；位置１１２でのセリンからシステインへの置換（Ｓ１１２Ｃ）；位置１１２でのセリンからシステインへの置換と、位置２３８でのロイシンからセリンへの置換を含む、２重変異体（Ｓ１１２Ｃ／Ｌ２３８Ｓ）；位置１１３でのリジンからシステインへの置換（Ｋ１１３Ｃ）；位置１３７でのリジンからシステインへの置換（Ｋ１３７Ｃ）；位置１４９でのグルタミン酸からシステインへの置換（Ｅ１４９Ｃ）；位置１４９でのグルタミン酸からシステインへの置換と、位置２３８でのロイシンからセリンへの置換を含む、２重変異体（Ｅ１４９／Ｌ２３８Ｓ）；位置１５２でのヒスチジンからシステインへの置換と、位置１８２でのメチオニンからシステインへの置換を含む、２重変異体（Ｈ１５２Ｃ／Ｍ１８２Ｃ）；位置１４９でのグルタミン酸からシステインへの置換と、位置２１３でのアラニンからシステインへの置換を含む、２重変異体（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｃ）；位置２１３でのアラニンからセリンへの置換と、位置１５２でのヒスチジンからシステインへの置換を含む、２重変異体（Ｈ１５２Ｃ／Ａ２１３Ｓ）；位置１８２でのメチオニンからシステインへの置換（Ｍ１８２Ｃ）；位置２１３でのアラニンからシステインへの置換（Ａ２１３Ｃ）；位置２１３でのアラニンからシステインへの置換と、位置２３８でのロイシンからシステインへの置換を含む、２重変異体（Ａ２１３Ｃ／Ｌ２３８Ｃ）、位置２１６でのメチオニンからシステインへの置換（Ｍ２１６Ｃ）；位置２３６でのアスパラギン酸からシステインへの置換（Ｄ２３６Ｃ）；位置２３８でのロイシンからシステインへの置換（Ｌ２３８Ｃ）；位置２８７でのアスパラギン酸からシステインへの置換（Ｄ２８７Ｃ）；位置２９２でのアルギニンからシステインへの置換（Ｒ２９２Ｃ）；位置２９６でのバリンからシステインへの置換（Ｖ２９６Ｃ）；位置１４９でのグルタミン酸からシステインへの置換と、位置２１３でのアラニンからセリンへの置換と、位置２３８でのロイシンからセリンへの置換を含む、３重変異体（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｓ／Ｌ２３８Ｓ）；位置１４９でのグルタミン酸からシステインへの置換と、位置２１３でのアラニンからアルギニンへの置換と、位置２３８でのロイシンからセリンへの置換を含む、３重変異体（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／Ｌ２３８Ｓ）；位置１４９でのグルタミン酸からシステインへの置換と、位置２１３でのアラニンからシステインへの置換と、位置２３８でのロイシンからシステインへの置換を含む、３重変異体（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｃ／Ｌ２３８Ｃ）；位置１でのセリン、位置１４９でのシステイン、位置２１３でのアルギニン、および位置２３８でのセリンを含む、４重変異体（Ａ１Ｓ／Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／Ｌ２３８Ｓ）；位置１でのセリン、位置１４９でのシステイン、位置２１３でのセリン、および位置２３８でのセリンを含む、４重変異体（Ａ１Ｓ／Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｓ／Ｌ２３８Ｓ）；ならびに位置１４９でのシステイン、位置１８２でのシステイン、位置２１３でのシステイン、および位置２３８でのセリンを含む、４重変異体（Ｅ１４９Ｃ／Ｍ１８２Ｃ／Ａ２１３Ｃ／Ｌ２３８Ｓ）が含まれる。追加の例を、以下の表２に列挙する。アミノ酸残基の数は、以下に詳述するような３０９残基を有する大腸菌の公開配列、または代替供給源からの任意の実質的に相同な配列中の対応するアミノ酸残基（例えば、シクロバクターフロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）もしくは鼠チフス菌からのグルコース／カラクトース結合タンパク質、それぞれの配列受入番号はＰ２３９２５およびＰ２３９０５）を指す。

「コーティング」という用語は、本明細書では、１つもしくは複数の層またはコーティングが、均一にまたは不均一に分散し、分配され、物理的または非物理的に接続しまたは接触し、互いに対して空間的に配置され、隣接し、または一体的になることを意味する限りにおいて、「層」という用語と同義であるとして使用する。

本明細書で使用する「エネルギー源」という用語は、化学線を指す（すなわち、原子または分子に光化学的反応、遷移、または処理をもたらすことのできる電磁放射線）。そのようなエネルギー源は、ルミネセンスを生成しまたはもたらすことができる。ルミネセンスには、リン光、蛍光、およびバイオルミネセンスが含まれる。

本明細書で使用する「検出可能なシグナルを提供する」ことは、問題となっている分析物を検出することができ、またはそのような分析物に対応する濃度を検出することができるような手法で、レポーター基の特性の変化を認識できることを指す。

マトリックスのコア内に含まれるレポーター基は、問題となっている分析物が結合タンパク質に関連付けられまたは結合するようになるときに、検出可能なシグナルを提供することになる任意の基でよい。１つの好ましい実施形態で、レポーター基は蛍光体である。本明細書で使用する「蛍光体」は、エネルギーを吸収し、次いで光を放出する分子を指す。本発明においてレポーター基として有用な、蛍光体の非限定的な例には、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、テトラメチルローダミン−５−ヨードアセトアニド（５−ＴＭＲＩＡ）、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｒｅｄ（商標）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（商標）、Ｃｙ（商標）−３、Ｎ−（（２−ヨードアセトキシ）エチル）−Ｎ−メチル）アミノ−７−ニトロベンゾキスアジアゾール（ＩＡＮＢＤ）、６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン（アクリロダン）、ピレン、Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ、Ｃｙ（商標）−５、Ｄａｐｏｘｙｌ（登録商標）（２−ブロモアセトアミドエチル）スルホンアミド、（Ｎ−（４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラインエチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−イル）ヨードアセトアミド（Ｂｏｄｉｐｙ５０７／５４５ＩＡ）、Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−Ｎ−ヨードアセチルエチレンジアミン（ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０ＩＡ）、５−（（（（２−ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸（１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ）、カルボキシ−Ｘ−ローダミン、５／６−ヨードアセトアミド（ＸＲＩＡ５，６）、および緑色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質が含まれる。ＩＡＮＢＤを使用することが好ましい。

蛍光体レポーター基の、多くの検出可能な固有特性をモニタして、分析物の結合を検出することができる。分析物結合による変化を示すことができるいくつかの特性には、蛍光寿命、蛍光強度、蛍光異方性または偏光、および蛍光発光のスペクトルシフトが含まれる。これら蛍光特性の変化は、タンパク質構造の変化から生ずるような、蛍光体環境の変化から引き起こすことができる。ＩＡＮＢＤなど、環境に対して感受性のある色素は、この点に関して特に有用である。蛍光体特性のその他の変化は、分析物そのものとの相互作用から、または第２のレポーター基との相互作用から、例えば２つの蛍光体間の距離変化をモニタするのにＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を使用する場合に得ることができる。

蛍光標識の使用が好ましいが、その他のレポーター基を使用できることも考えられる。例えば、レポーター基の環境変化によってその酸化還元状態に変化が生ずる場合は、電気化学的なレポーター基を使用することができる。そのような変化は、例えば電極を使用することによって検出することができる。その他の例には、レポーターに対するリンカーとして、またはレポーター基そのものとして、非天然アミノ酸が含まれる。

レポーター基は、当技術分野で知られている任意の従来の手段によって、分析物結合タンパク質に結合させることができる。例えばレポーター基は、タンパク質のアミンまたはカルボキシル残基を介して結合することができる。システイン残基のチオール基を介した共有結合が、特に好ましい。当技術分野で知られている任意のチオール反応性基は、結合タンパク質のシステインに、蛍光体などのレポーター基を結合させるのに使用することができる。ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、またはマレイミドは、この目的で使用することのできる周知のチオール反応性部分である。

分子センサを生体内で使用する場合、例えば移植可能なバイオセンサデバイスに組み込む場合は（皮膚は、６００ｎｍ未満で不透明である）、長い励起および発光波長（例えば、約６００ｎｍ以上の励起または発光波長）で動作する蛍光体が好ましい。現在のところ、このスペクトル領域で利用可能な、環境に対して感受性のあるプローブはほとんどなく、チオール反応性官能基に関してはおそらく存在しない。しかしながら、例えば教示されるように（例えば、非特許文献１５参照。）、Ｃｙ−５のチオール反応性誘導体を調製することができる。例えば、変異したＧＧＢＰ中に含有される様々なシステイン基に結合したこれらの蛍光体を含有する結合体を、スクリーニングし、それによって、グルコース結合時の蛍光における最大の変化を得る結合体を特定することができる。

本発明は、問題となっている分析物に特異的な結合タンパク質を、埋め込み、取り込み、または封入する方法を開示する。この方法は、結合タンパク質を修飾することを含み、この修飾においては、結合タンパク質の分析物結合特性およびシグナル生成特性を維持しながら、蛍光体などのレポーター基による定方向標識、および／または共有結合固定化が実現される。ＧＧＢＰなど、結合タンパク質の共有結合固定化は、バイオセンサとして使用することができるように、タンパク質の構造特性に及ぼす影響が最小限に抑えられる必要がある。これらの構造特性は、ＧＧＢＰ結合タンパク質が、リガンド結合時に検出可能なシグナルを生成するのに必要である。

結合タンパク質がバイオセンサマトリックスと共有結合するための方法は、一般に、（ａ）結合タンパク質の特定のアミノ酸残基とマトリックス材料との間に、直接または適切なリンカー分子を介して共有結合が形成される、定方向共有結合法、または（ｂ）結合タンパク質上にある、より大きい数の可能性がある反応性部位からの、１つまたは複数の共有結合が、直接または適切なリンカーを介してマトリックスと共に形成される、ランダム共有結合法、のいずれかであると言うことができる。

定方向共有結合法は、タンパク質の既存のアミノ酸を使用することができ、あるいは、部位特異的変異誘発などのタンパク質工学技法を介してタンパク質に導入された、これまで存在していないアミノ酸または誘導体を使用することができる。例えば、１つまたは複数のシステインをタンパク質配列に導入して、チオール反応性試薬に対して特異的な反応性を有する部位と、ヨードアセトアミジル、ヨードアセトキシル、またはマレイミジル官能基などの基を持つリンカー基を提供することができる。そのようなリンカー基は、色素分子またはマトリックスに関連付けることができ、あるいはそのような色素分子またはマトリックスの一部にすることができる。

タンパク質の２個以上のシステインの１つに対する化学的選択性または反応上の選択性は、１つのシステインが他よりも著しく利用しにくい場合に操作することができる。本明細書で使用するこの方法、すなわち「リガンドマスキング」は、タンパク質の少なくとも１つのシステインを、チオール反応性試薬からは実質的に利用しにくくなるようにし、同時にタンパク質はリガンドの存在下にあるものと定義される。システインは、まず適切なリガンドの存在下で、次いで適切なリガンドが存在しない状態で、順次修飾される。色素の結合と、共有結合固定化は、図５に示すどちらの順序でも行うことができる。

上述の手法の変形例は、タンパク質内に２つのシステインを導入することであり、それによって、少なくとも一方のシステインが、実質的にタンパク質の内部折畳み（ｉｎｔｅｒｉｏｒ ｆｏｌｄｓ）内にある疎水性環境もしくは領域に存在するように、および少なくとももう１つのシステインが、タンパク質の、より親水性の高い表面環境もしくは領域またはその付近に存在するようにすることである。例としてタンパク質は、まず親水性表面領域内のシステインと優先的に反応する親水性色素またはリンカー基を使用して、修飾する。その後の、疎水性色素またはリンカー基との反応によって、疎水性領域内の少なくとも１つの未反応のシステインに対して、選択的に共有結合を形成する。

別の実施形態では、タンパク質のＮ末端にあるアミンを、そのｐＫａと、リジン側鎖のεアミンのような別のアミンのｐＫａとの差に基づいて、選択的に修飾することができる。これは、修飾中にタンパク質環境のｐＨを制御することによって実現することができる。

別の実施形態において、例として、結合タンパク質のＮ末端での部位選択的修飾は、第１の位置でのセリンまたはトレオニンの１，２アミノアルコール基を過ヨウ素酸塩で選択的に酸化して、Ｎ末端にグリオキサール基を生成することにより実現することができるが、これは、ヒドラジド、ヒドラジン、またはアミノオキシ基含有リンカー基またはマトリックスと反応することのできるものである（例えば、非特許文献１６、１７、および１８参照。）。特に有用な変異結合タンパク質には、ＧＧＢＰのＡ１Ｓ誘導体が含まれるが、これに限定するものではない。

さらに別の実施形態では、マトリックスまたはリンカー基に対する結合タンパク質のランダム共有結合法で、類似した反応性を持つタンパク質アミノ酸の群のうち、１つまたは複数を用いることができる。例えばタンパク質リジンは、アルキル化を介して、またはＮ−ヒドロキシ−スクシンイミジルエステルなどの活性化アシル基とのアシル化反応によって、共有結合的に修飾することができる。グルコース／ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）は、例えば、その表面に、そのような活性化エステルとの反応に利用可能な多数のリジンを有する。

マトリックス上の結合タンパク質に適切な共有結合点には、多糖類のカルボキシレート基が含まれるが、これに限定するものではない。非限定的な例には、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、ヒアルロン酸のグルクロン酸反復単位、コラーゲン、またはアルギネートのマンヌロン酸およびグルロン酸単位上に見出されるカルボキシレート基が含まれる。これらの例示的なカルボキシレート基は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、またはＥＤＣとＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とを組み合わせたもの、またはＥＤＣとＮ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）とを組み合わせたもので活性化することができる。多糖類マトリックスに対する結合タンパク質の別の共有結合法は、多糖類ビシナルジオール基の過ヨウ素酸塩酸化を介するものである。得られるアルデヒド基は、結合タンパク質上のアミン基と反応することができ、結果的にそのように形成されたイミンは、シアノ水素化ホウ素ナトリウムで還元して、タンパク質と多糖類マトリックスとの間に安定な第２級アミン結合を形成することができる。

これらの例は、限定を意図するものではない。共有結合するための、多くの別の方法は、マトリックスまたはリンカー基に対する結合タンパク質のランダム結合または特異的結合に対して使用することができる。タンパク質をマトリックスに結合させるための、その他の適切な一般的方法および戦略については、記述されている（例えば、非特許文献１９および２０参照。）。

本発明の一態様で、多重コートまたは多層マトリックスは、生体内で分析物を感知するために使用されるバイオセンサを含む。この態様で、バイオセンサは、マトリックスに封入され、取り込まれ、または埋め込まれ、次いでこれを、単独でまたは追加の構成要素と組み合わせて、移植可能な装置として使用することができる。マトリックスは、分析物に対して透過性があることを条件として、ビーズ、ディスク、シリンダ、パッチ、ナノ粒子、微小球、多孔質ポリマー、オープンセルフォーム（ｏｐｅｎ ｃｅｌｌ ｆｏａｍ）の１つまたは複数を含む任意の所望の形態または形状でよい。マトリックスはさらに、バイオセンサの浸出を防止する。マトリックスは、光源からの光、あるいは、レポーター基に対するまたはレポーター基からの、任意のその他の応答光を、バイオセンサに通すことが好ましい。生体内での適用例に使用する場合、バイオセンサは、実質的に生理的な領域の分析物に曝されることになり、分析物濃度の変化の決定または検出が望ましいが、この決定または検出には、連続的な、プログラム化された、および一時的検出手段が含まれる。したがって、本発明で考えられる生体内バイオセンサは、分析物透過性の取り込みマトリックスまたは封入マトリックス中に、少なくとも１種の結合タンパク質を含み、その結果、結合タンパク質が様々な分析物濃度に曝されたときに、この結合タンパク質は、検出可能で可逆的なシグナルを提供するようになり、検出可能で可逆的なシグナルは、分析物の濃度に相関させることができるようになる。移植可能なマトリックスまたは装置は、間質液、組織、またはその他の生体液と相互に作用するように、哺乳類の表皮−真皮接合部の皮膚内またはその皮膚よりも下に、移植することができる。移植物から患者または医療提供者への情報は、例えば前述のように、遠隔測定、視覚、聴覚、または当技術分野で知られているその他の手段によって得ることができる。

結合タンパク質の封入、埋め込み、または取り込みは、任意選択でレポーター基と共に、較正色素も含むことのできる適切な溶液中で合わせることができる。

以下の実施例は、本発明の、ある好ましい実施形態を示すが、全ての実施形態を説明することを意図したものではない。蛍光体レポータープローブで標識された変異結合タンパク質は、Ｃａｓｓ他によって示され（例えば、非特許文献２１参照。）または記述されるような手順に従って、本明細書で使用した。

変異した標識済みタンパク質の蛍光発光スペクトルは、ＳＬＭ Ａｍｉｎｃｏ蛍光計（オンタリオ州、カナダ）を使用して測定し（他に特に示さない限り）、このときのスリット設定は４７０ｎｍでの励起に対して８および４であり、ＭＣ２５０発光モノクロメータ上での設定は５および５で、それによって、様々なマトリックスに取り込まれた蛍光体標識タンパク質のリガンド結合性能を、溶液中の同じタンパク質の性能と比較した。初期蛍光発光強度をＩ_０と定義する。タンパク質のそれぞれのリガンドの存在下での発光強度最大値（Ｉ）とリガンドが存在しない場合（Ｉ_０）との相対比を、Ｉ／Ｉ_０と定義する。

実施例１：多重コートまたは多層マトリックス
Ａ：コア内に結合タンパク質がない場合
本発明の多重コートまたは多層マトリックスを、下記の手法で調製した。
１．１部のＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）と、２〜４部の３重量％アルギネート（ｖ／ｖ）とをシンチレーションバイアル中で混合し、低速で撹拌することによって、コアマトリックスを形成した。得られたアルギネート混合物３ｍＬをシリンジに入れ、１０ｍＬ／時の速度で、Ｒｏｔｏミックス上の１Ｍ ＣａＣｌ_２ ２００ｍｌに注入し、それによって、直径約０．４〜１．５ｍｍのビーズを形成した。これらのビーズを、１５〜６０分間、Ｒｏｔｏミックス上でＣａＣｌ_２溶液中で混合した。
２．上述のビーズを、ポリ−Ｌ−リジン０．０１％ｗ／ｖの水溶液約１０ｍＬ中に１時間入れ、次いでポリ−リジンでコーティングされたビーズを、１５〜３０分間、吸収剤タオル上で乾燥させることによって、閉じ込め層を形成した。
３．さらに３部の緩衝液（ｖ／ｖ）を、以下に示すように調製したＧＭＳＣ溶液に添加し、次いでアルギネート／ポリ−Ｌ−リジンビーズを約１２分間加えることによって、外層を形成した。混合物を１５秒間ゆっくりと混合し、次いでビーズを吸収剤タオル上に注ぎ、１５〜３０分間乾燥した。ビーズを、ＰＢＳ（約１００μＬ）で湿らせたシンチレーションバイアル内に貯蔵した。この方法によって作製された多重コートまたは多層マトリックスを、図１に示す。

グリセロールで修飾したシリケート縮合体（ＧＭＳＣ）ゾル−ゲルは、ＧｉｌｌおよびＢａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ（例えば、非特許文献２２参照。）の手順のうち、試薬の比を下記の比で修正したもの、すなわちテトラエトキシオルトシリケート（ＴＥＯＳ）またはテトラメトキシオルトシリケート（ＴＭＯＳ）：１；Ｈ_２Ｏ：１、メタノール：４、グリセロール：１を使用して、先に調製した。メタノールに溶かしたＴＥＯＳまたはＴＭＯＳをフラスコに添加し、氷上で０℃に冷却した。次いで０．６Ｍ ＨＣｌ４．１ｍＬを、この溶液に１滴ずつ添加した。撹拌から２０分後、グリセロールを１滴ずつ添加した。反応を、１〜２時間かけてゆっくりと２０〜２５℃に温めた。この後、反応容器をさらに加熱し、３６〜４２時間の間（最適な場合、４０時間）、窒素中で６０〜７０℃の温度範囲に維持した。６０〜７０℃での反応の後、溶液が粘性になり透明になるまで回転蒸発させることによって溶液の体積を減少させ、この時点で、メタノールを４：１の重量比で溶液に添加した。このＧＭＳＣ溶液は安定であり、フリーザ温度で貯蔵した場合、数カ月間にわたって一貫した結果をもたらす。ＧＭＳＣ溶液を使用した場合、メタノールは回転蒸発によって除去し、蒸留水を、ＧＭＳＣ試薬に対して１：１の重量比で添加した。

Ｂ：取り込まれた結合タンパク質がある場合
本発明の多重コートまたは多層マトリックスを、下記の手法で調製した。
１．１部の色素標識済み結合タンパク質（ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４中１５ｕＭ、特許文献７に記述されるように調製した）と、２〜４部の３重量％アルギネート（ｖ／ｖ）とを、シンチレーションバイアル内で混合し、低速で撹拌することによって、コアマトリックスを形成した。得られたタンパク質−アルギネート混合物３ｍＬをシリンジに入れ、１０ｍＬ／時の速度で、Ｒｏｔｏミックス上の１Ｍ ＣａＣｌ_２ ２００ｍｌに注入し、それによって、直径約０．４〜１．５ｍｍのビーズを形成した。これらのビーズを、１５〜６０分間、Ｒｏｔｏミックス上でＣａＣｌ_２溶液中で混合した（使用した２価の陽イオンの性質は、得られるコアに対し、わずかに異なる性質を与える。例えば、カルシウム硬化ビーズは、バリウム硬化ビーズ（Ｉ／Ｉ_０＝１．９±０．２９）よりも、蛍光に大きい変化をもたらした（Ｉ／Ｉ_０＝２．５±０．１７））。
２．上述のビーズを、ポリ−Ｌ−リジン０．０１％ｗ／ｖの水溶液約１０ｍＬ中に１時間入れ、次いでポリ−リジンでコーティングされたビーズを、１５〜３０分間、吸収剤タオル上で乾燥させることによって、閉じ込め層を形成した。
３．さらに３部の緩衝液（ｖ／ｖ）を、ＧＭＳＣ溶液（前述の実施例で調製した）に添加し、次いでアルギネート／ポリ−Ｌ−リジンビーズを約１２分間加えることによって、外層を形成した。混合物を１５秒間ゆっくりと混合し、次いでビーズを吸収剤タオル上に注ぎ、１５〜３０分間乾燥した。ビーズを、ＰＢＳ（約１００μＬ）で湿らせたシンチレーションバイアル内に貯蔵した。

実施例２：多重コートまたは多層マトリックスからのタンパク質浸出に、外層が及ぼす影響
多重コートまたは多層マトリックスを、実施例１Ｂと同様に調製した。ビーズ１グラムを、ＰＢＳ緩衝液３ｍＬが入っているシンチレーションバイアル内に入れた。ビーズ１グラム中の、色素標識済みタンパク質の濃度は、色素の吸光度に基づいて２００ｕＭであると計算された。ビーズが入っているバイアルを、ボルテックス上で振盪させた。読取りは、様々な時間間隔で行った。各時点で、一定分量の緩衝液を除去し、読取りを、蛍光計で行った。最小検出限界は、０．０５ｕＭで確立された。図２に示す結果は、ゾル−ゲルの薄層が、検出できないタンパク質の浸出レベルをもたらすのに十分であることを実証している。

実施例３：マトリックス性能に、様々なポリマー成分が及ぼす影響
多重コートまたは多層マトリックスを、閉じ込め層２を形成する様々なポリマーを使用して、実施例１と同様に調製した。実施例１から得られた生成物を、以下の水溶液に曝した：（ａ）低分子量ＰＶＡ（＜５ｋ ｍｗ）（１〜１０％ｗ／ｖ）；（ｂ）高分子量ＰＶＡ（＞２０ｋ ｍｗ）（１〜１０％ｗ／ｖ）；（ｃ）Ｎａｆｉｏｎ（登録商標）（０．１〜５．０％ｖ／ｖ）；および（ｄ）ＳｂＱ−ＰＶＡ（１〜５０％ｖ／ｖ）。Ｉ／Ｉ_０比は、上述のように測定した。図３は、第２の層として使用した種々のポリマーが、アルギネートに取り込まれたＮＢＤ−ＧＧＢＰからなるコアマトリックスに及ぼす影響を示す。グルコースに関するＩ／Ｉ_０応答を、溶液中のＮＢＤ−ＧＧＢＰ、アルギネートに取り込まれたもの、および第２の層と共にあるものに関して示す。図３に示す結果は、様々なポリマーが閉じ込め層として有効であることを実証している。

実施例４：混合コアを有する多重コートまたは多層マトリックス
本発明による、例示的な混合コアを持つ多重または多層マトリックスは、２部の結合タンパク質溶液（緩衝液中１５ｕＭ）と、２〜４部の３重量％アルギネート、および１〜２部の光硬化性ポリマー（ＳｂＱ−ＰＶＡ、１３．３重量％水溶液）とを混合し、さらに、追加のステップ、すなわち混合マトリックスを、５００〜６００ｎｍの間で発光する光源に当て、実施例１Ａまたは１Ｂのステップ２〜３と同様の処理することによって、調製することができる。混合マトリックスは、ＳｂＱ−ＰＶＡおよびＨＥＭＡなどの様々な光またはＵＶ硬化性材料で形成することができる。この光硬化性ポリマーの混合によって、コアの構造の調整をもたらされる。例えばコアの架橋密度は、使用する成分の比、光強度、および露光時間を調節してコアの剛性が変わるようにすることによって、様々に変えることができる。

実施例５：相互浸透網状構造コアの、多重コートまたは多層マトリックス
相互浸透網状構造コアマトリックスは、ポリマー２部と、２〜４部の３％アルギネートを混合し、必要なら付加すべき層の数に応じて、実施例１のステップ２〜３と同様に処理することによって調製することができる。この方法では、第２のポリマーが、アルギネート構造を物理的に保持できるようになる。ヒドロゲルの膨潤が最小限に抑えられ、浸出がなくなり、または浸出し難くなる。

実施例６：血液および血清中のグルコース濃度を測定するための、多重コートまたは多層マトリックスの使用
１部の結合タンパク質溶液と４部の３重量％アルギネートをコアに使用し、０．０１重量％のポリ−Ｌ−リジン溶液を第２の層の形成に使用し、１部のゾル−ゲルと２部（ｗ／ｖ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）を外層の形成に使用して、実施例１で述べた手順に従って、多重コートまたは多層マトリックスビーズを調製した。結合タンパク質溶液は、ＧＧＢＰ（約１３ｕＭ）をＰＢＳまたはトリス緩衝液に溶かしたもの約２０ｕｌからなるものであった。この結合タンパク質は、グルコースに特異的であり、レポーター基は、グルコースの結合に応答して蛍光を放つ。

ビーズを乾燥した後、Ｄｙｍａｘ１２８Ｍを用いて、約６個のビーズをＵＶ透過性黒色９６ウェルプレートの各ウェルの底部に接着し、周囲条件下で硬化させた。Ｃｙｔｏ Ｆｌｕｏｒシリーズ４００蛍光プレート読取り器を、アッセイで使用した。励起フィルタは４８５／２０ｎｍであり、発光フィルタは５３０／２０ｎｍであった。これらのウェルに、ウサギの血液または血清１００μｌを添加し、プレート読取器を使用して蛍光を読み取った。当初のサンプルは、基準濃度のグルコースを含有しており、その他のグルコースレベルは、濃縮したグルコース溶液をＰＢＳに添加することによって得られた。グルコース濃度は、比較用のＹＳＩ分析器でも決定した。図４に示す結果は、多重コートビーズが安定であり、グルコース濃度に比例して結合タンパク質の応答を維持することを実証している。この応答は、血液および血清などの複雑な生物流体の存在下でも堅固である。

実施例７：Ｎ末端セリンまたはトレオニンを介した、マトリックスに対する結合タンパク質の選択的結合
ＧＧＢＰの、Ａ１Ｓ／Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／Ｌ２３８Ｃ−Ｈｉｓ_６変異体の溶液を、５０倍過剰なメチオニン（補足剤として）を有するＰＢＳ（ｐＨ７．２）または０．１Ｍ ＮＨ_４ＨＣＯ_３（ｐＨ８．３）中で調製する。１０倍モル過剰な過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加し、その溶液を、１０分間、暗所でインキュベートする。反応を、エチレングリコール（２０，０００倍モル過剰）または亜硫酸ナトリウム（２５倍モル過剰）を添加することによって抑え、緩衝液を、透析法によって、またはＮＡＰ−５カラムに通すことによって、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）と置換する。タンパク質のグリオキサールと反応するヒドラジド、ヒドラジン、またはアミノオキシ基を含有するポリマーまたはマトリックス（１０倍モル過剰）に、タンパク質溶液を添加する。反応を１〜２４時間続行させ、反応混合物を、酢酸ナトリウム緩衝液で５回洗浄するによって、生成物を精製する。得られた結合体を、ＮａＢＨ_３ＣＮで還元して、リンカーの安定性を高めることができる。

実施例８：リガンドマスキングによる、結合タンパク質の多数のシステインの、定方向修飾
様々なシステイン含有ＧＧＢＰ変異体を、グルコースの存在下とグルコースが存在しない状態で、ＩＡＮＢＤで標識した。ＩＡＮＢＤ色素標識では、４〜１０ナノモルの間のＧＧＢＰタンパク質を、微量遠心分離管内で、ＰＢＳ緩衝液中で調製し（０．５〜１．５ｍｇ／ｍＬ）、タンパク質のシステイン当たり２．５モル当量のＤＴＴを添加した。２０〜３０分間混合した後、溶液をさらに２本の管に分け、そこに、グルコース（最終濃度８７ｍＭ）または等体積の緩衝液を添加し、その溶液をさらに１５〜３０分間混合した（リガンドマスキングステップ）。グルコースの最終濃度は、ＧＧＢＰ変異体のグルコース結合部位のほとんどが飽和するように選択した。色素標識では、ＩＡＮＢＤを、ＤＭＳＯに溶かした０．５ｍｇ／ｍＬ溶液（システイン当たり１０当量のＩＡＮＢＤ）として各管に添加し、全ての溶液を、暗所で１時間混合した。次いでＰＢＳ緩衝液で溶離するＮＡＰ−５サイズ排除カラムからの溶離によって、色素標識済みタンパク質を遊離色素から分離した。溶離したタンパク質分画の吸光度スペクトルを比較することによって、色素：タンパク質の比を決定した。グルコースを持ち（＋）、またグルコースを持たない（−）いくつかのＧＧＢＰ変異体タンパク質を標識するリガンドマスキング実験の結果を、表１に示す。

表１に示すように、グルコース存在下での標識効率と、グルコースが存在しない状態での標識効率との差は、Ａ２１３ＣおよびＬ２３８Ｃ変異を有するＧＧＢＰ変異体の場合に最大である。これは、リガンドマスキング戦略によって、これらシステインを反応に利用し難くすることができることを示している。比較すると、色素との反応に対するＥ１４９Ｃの利用し易さは、リガンドグルコースの存在によって著しく変化しないようであるが、それは色素：タンパク質の比が、グルコースが存在するときまたは存在しないときで同じ（０．３）であるからである。

少なくとも２つのシステインを有する別のＧＧＢＰ変異体を、ＮＢＤで首尾良く標識した。表１の結果に基づけば、グルコース存在下でのほとんどの色素標識は、変異体Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｃ／Ｌ２３８ＣおよびＥ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｃ上のＥ１４９Ｃの位置で生ずるようである。表２にまとめたこの結果は、本発明の方法による変異結合タンパク質の定方向標識を実証している。

残りの遊離システインを介したＣＭＣに対するタンパク質の選択的結合について、次に述べる。徹底的な透析法により、実施例８によって調製されたマスク標識済みタンパク質から、残りのグルコースを除去する。残りのシステインが、固定化前に自由に反応できることを保証するため、透析したタンパク質を、固定化トリス［２−カルボキシエチルホスフィン］塩酸塩（ＴＣＥＰ）試薬（ビーズ上、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）で処理し、還元タンパク質を、スピンカラムを使用して分離する。

チオール反応性ＣＭＣヒドロゲルは、以下のように調製する。等体積の１００ｍＭ ＮＨＳおよび４００ｍＭ ＥＤＣを合わせ、ＥＤＣ／ＮＨＳ混合物を、室温で１５分間、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）と合わせる（最終濃度は、ＣＭＣ、１３ｍｇ／ｍＬ；２６ｍＭ ＮＨＳ；２０４ｍＭ ＥＤＣ）。未反応のＥＤＣ／ＮＨＳを、ＮＡＰ−５カラムで除去し、活性化したＣＭＣを６．５ｍｇ／ｍＬまでさらに希釈する。活性化したＣＭＣを、室温で１５分間、２−（２−ピリジニルジチオ）−エタンアミン（ＰＤＥＡ）と合わせる（３００ｕＬ 活性化ＣＭＣ，６．５ｍｇ／ｍＬ＋２００ｕＬ ＰＤＥＡ（０．１Ｍホウ酸溶液中１８ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ８．５））。未反応のＰＤＥＡを、ＮＡＰ−５カラムを使用して除去する。これにより、ＰＤＥＡ活性化ＣＭＣが２ｍｇ／ｍＬまでさらに希釈される。

ＰＤＥＡ活性化ＣＭＣを、標識済みタンパク質の０．０５〜１．５ｍｇ／ｍＬの間の溶液に添加し、室温で２．５時間混合する。システイン（０．１Ｍギ酸ナトリウム中、５０ｍＭのシステイン１００ｕＬ、ｐＨ４．３、１Ｍ ＮａＣｌ）を各管に添加し、室温で１５分間混合して、反応を抑制する。未反応のシステインを、ＮＡＰ−５カラムで除去することにより、ＣＭＣ−タンパク質結合体が得られる。

実施例９：カルボキシメチルセルロースに対する結合タンパク質のランダム共有結合
以下のヒドロゲル材料を使用して、結合タンパク質の共有結合を行った：セルロース１モル当たりＣＯＯＨを０．７モル含有するカルボキシメチルセルロースナトリウム（ＮａＣＭＣ）（ｍｗ 約９０，０００ Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。

共有結合は、ヒドロゲルポリマー（ＣＭＣ）上のカルボキシメチル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とＮ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）との混合物で活性化することによって行った。これにより、アミンに対して反応性ある中間体が形成される。ＮＨＳ（１００ｍＭ）およびＥＤＣ（４００ｍＭ）の水溶液を、１：１の体積：体積比で混合した。等体積のヒドロゲルポリマー（Ｈ_２Ｏ中、２５ｍｇ／ｍＬのＣＭＣ）とＥＤＣ／ＮＨＳ混合物とを合わせ、室温で１５〜３０分間インキュベートした。未反応のＥＤＣおよびＮＨＳは、ＮＡＰ−５カラムからポリマーを溶離することによって、ヒドロゲルポリマーから除去した。様々な量の活性化ヒドロゲルポリマーを、蛍光標識したＧＧＢＰと合わせた（この実施例では、ＮＢＤ−Ａ２１３Ｃ／Ｌ２３８Ｃ−ＧＧＢＰ−Ｈｉｓ６変異体）。活性化したヒドロゲルポリマーおよびタンパク質を、１〜２時間、室温で穏やかに混合した。１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ８．５を添加することによって反応を抑制し、その後、ＮＡＰ−５カラムから溶離することによってエタノールアミンを除去した。分子量カットオフが１００ｋＤａである微量遠心フィルタを使用して、ＧＧＢＰ結合ヒドロゲルポリマーを濃縮した。１００ｋＤａフィルタによって維持されない溶液の吸光度スキャンは、結合していないタンパク質が残っていないことを示した。溶液中の濃縮ＮＢＤ−ＧＧＢＰ−ＣＭＣは、タンパク質ゲル電気泳動を使用して試験した。アガロースゲル（１×ＴＢＥ（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、０．０９Ｍホウ酸、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．４）中１％および１．５％、０．１％ＳＤＳを含む１×ＴＢＥのランニングバッファ）は、明らかに高い分子量（９７ｋＤａマーカーから３９０ｋＤａマーカーの間）のスミア（ｓｍｅａｒ）として移行するＮＢＤ−ＧＧＢＰ−ＣＭＣ結合体によって示されるように、タンパク質のほとんどがヒドロゲルマトリックスに結合したことを実証していた。結合していないＧＧＢＰの対照レーンは、最低ｍｗマーカー（９７ｋＤａ）よりも低い見掛けの分子量で移行していた。ＮＢＤ−ＧＧＢＰ−ＣＭＣの活性は、高濃度グルコース（２０ｍＭ）の存在下とグルコースが存在しない状態で、ＮＢＤ−ＧＧＢＰ−ＣＭＣの蛍光強度を測定することによって決定した。したがって、ＮＢＤ−ＧＧＢＰ−ＣＭＣの１００ｎＭ製剤について、結合していないＮＢＤ−ＧＧＢＰ（対照）と同様に、グルコースを添加する前と後で測定した（図６）。ＮＢＤ−ＧＧＢＰ−およびＮＢＤ−ＧＧＢＰ−ＣＭＣ材料は、様々な量のグルコースに対して滴定も行った。ＰＢＳ緩衝液に溶かした１１０ｎＭのＮＢＤ−ＧＧＢＰまたはＮＢＤ−ＧＧＢＰ−ＣＭＣを使用して、様々なグルコース濃度の一定分量を添加し、それによって、最終タンパク質濃度１００ｎＭが維持されるようにした。グルコースに対し、ヒドロゲルポリマー結合タンパク質および溶液相タンパク質に関して得られた平衡解離定数（図７）は、類似していた（それぞれ１０ｍＭおよび１４ｍＭ）。このデータは、ＮＢＤ−ＧＧＢＰ−ＣＭＣ複合体が、必要なリガンド誘導性の構造的特性を維持し、グルコースが存在しない場合よりもグルコースの存在下で強力なシグナルを提供したことを実証しおり、これは明らかに、実現可能なバイオセンサとしてのこの複合体が有用であることを実証している。

実施例１０：アルギネートコアマトリックスに対するグルコース結合タンパク質の、共有ランダム結合
カルボジイミドの化学的性質により、カルボキシルを介してＰｒｏｎｏｖａ（商標）ＵＰ ＬＶＧ（低粘度、マロンヌ酸に対するグルロン酸の比が高い）アルギネート（ＦＭＣ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）をアジピン酸ジヒドラジド（ＡＡＤ）に共有結合的に架橋させることによって、架橋したアルギネートベースの骨格を調製した。２％のアルギネートヒドロゲルおよび骨格の場合、アルギネート１グラムを５０ｍＬの０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、そこにＡＡＤ １１０ｍｇおよびヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）７９ｍｇを添加した。この溶液を、使用するまで４℃で貯蔵した。アルギネート溶液に、デュアルシリンジ混合技法を使用して、ＥＤＣ １４５ｍｇ（溶液１０ｍｌ当たり）を添加し、混合溶液を、２ｍｍのスペーサを有する並行なガラスプレート間に流延し、３時間かけてゲル化した。３％のアルギネートヒドロゲルおよび骨格の場合、ＡＡＤ、ＨＯＢｔ、およびアルギネートの量を、１．５倍にした。５ｍｍの生検パンチを使用して、２×５ｍｍのディスクを切り出し、これを水中で徹底的に洗浄して、塩および全ての反応物を除去した（３６〜４８時間、５〜６回の水交換により撹拌）。ヒドロゲルディスクをポリプロピレン表面に置き、−２０℃で一晩凍結させ、開口気孔構造の骨格が生成されるように凍結乾燥した。各ディスクの乾燥重量は、２％骨格の場合に約１ｍｇであり、ＥＤＣ／ＮＨＳでの修飾に利用可能な、理論的に最小限の３．８ｕｍｏｌのＣＯＯＨを含有していた。

共有結合的に架橋したアルギネートヒドロゲルおよび凍結乾燥した骨格に対する結合タンパク質の共有結合は、下記の通り行った。

１．上述のように調製したアルギネート骨格上のカルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびＮ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の混合物で活性化し、その後、標識したＧＧＢＰタンパク質変異体［（ＮＢＤ−Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／Ｌ２３８Ｓ−またはＮＢＤ−Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ−ＧＧＢＰ）］を、以下のように結合した。

Ａ．方法１：標識したＧＧＢＰをＰＢＳ緩衝液に溶かした溶液［ＮＢＤ−Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／Ｌ２３８Ｓ ＧＧＢＰ］（５３ｕＭ、１００ｕＬ）を、凍結乾燥した骨格と共に３０分間インキュベートし、その後、タンパク質溶液約６０ｕＬを除去した。これらの骨格に、ＥＤＣ／ＮＨＳ（２００ｍＭ／５０ｍＭ）またはＰＢＳ（ＥＤＣ負の対照なし）を４０ｕＬ注入し、６０分間インキュベートした。

Ｂ．方法２：ＥＤＣ／ＮＨＳの溶液（２００ｍＭ／５０ｍＭ、１００ｕＬ）を、凍結乾燥した骨格に注入し、１５分間インキュベートした後に、溶液約６０ｕＬを除去し、その後、標識したＧＧＢＰ（５３ｕＭ）４０ｕＬを注入し、６０分間インキュベートした。

インキュベーション後、方法１または２の骨格を、約１０ｍＬのＰＢＳ中で洗浄した（１×で１時間、１×で６４時間）。グルコースの存在下およびグルコースが存在しない状態での骨格の蛍光を、Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ機器で測定したが（実施例６に記述する）、グルコースにより蛍光が増大することが示された。以下の表は、アルギネート骨格に共有結合したＧＧＢＰタンパク質が、様々なグルコース濃度に対して蛍光応答をもたらすことを実証している。

ＥＤＣ無しは、タンパク質を添加したが、共有結合的な化学的性質は示されなかったことを意味する。これらのサンプルは、使用前に、ＰＢＳ中に７２時間貯蔵した。結果を、２重に行った実験に関して示す。

実施例１１：ヒドロゲルの実験
標識したＧＧＢＰ（ＰＢＳ中０．８５ｍｇ／ｍＬ、各ヒドロゲルディスクで５０ｕＬ）を、２％または３％の共有結合的に架橋したアルギネートヒドロゲルと共に、９０分間インキュベートした。ヒドロゲルディスクに、ＥＤＣ／ＮＨＳの溶液（２００ｍＭ／５０ｍＭ、５０ｕＬ）を注入し、２時間インキュベートした。その他のヒドロゲルに、負の対照として５０ｕＬの水を注入した。反応を、１Ｍのエタノールアミン、ｐＨ８．５（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）１０ｕＬで１５分間抑制した。インキュベーションおよび抑制の後、これらの骨格を、約１ｍＬのＰＢＳでそれぞれ１時間洗浄した。飽和量のグルコースの存在下とこのグルコースが存在しない状態で、骨格の蛍光を測定したが、そのデータは、グルコース濃度に対する蛍光活性を示した（表４参照）。

このように、ＥＤＣ／ＮＨＳ無しでのタンパク質およびヒドロゲルのインキュベーションは、タンパク質のいくらかの物理的取り込みを引き起こすようであるが、ＥＤＣ／ＮＨＳとの共有結合は、維持されるタンパク質の量を著しく増大させる。

実施例１２：アミン被覆表面に共有結合するヒドロゲルと、結合タンパク質との共有ランダム結合
全てのインキュベーションは、室温で行った。ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ、Ｈ_２Ｏ中１９．６ｍｇ／ｍＬ、５０ｕＬ）を、９６ウェルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、組織培養処理済み）でインキュベートして（２時間）、アミンで被覆された表面を生成した。ＰＬＬで被覆されたウェルを、２００ｕＬのＨ_２Ｏで３回洗浄して、結合していないＰＬＬを除去した。ヒドロゲル（アルギネート）を、以下のようにＥＤＣ／ＮＨＳ混合物と合わせて、アミンに対して反応性あるヒドロゲルを生成した。ＥＤＣ／ＮＨＳを、３１ｍｇのＥＤＣ、２１．５ｕＬの０．１Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）、およびＮＨＳ（Ｈ_２Ｏ中０．６ｇ／ｍＬ）７ｕＬを合わせることによって、調製した。アルギネート（Ｈ_２Ｏ中３％のアルギネートの０．２３ｍＬ、Ｐｒｏｎｏｖａ（商標）ＵＰ ＬＶＧ（低粘度、マンヌロン酸に対するグルロン酸の比が高い）、ＦＭＣ バイオポリマー）を、１Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．７５）３５ｕＬおよび上述のＥＤＣ／ＮＨＳ混合物１２ｕＬと合わせた。一定分量（約４０ｕＬ）のＥＤＣ活性化アルギネートをいくつかのウェルに添加し、１５分間インキュベートした。この時点で、以下の表５に記載するように、種々のサンプルごとに試薬の順序を変えた。これらの試薬は、共有結合架橋剤、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＡＤ、１０ｕＬ、Ｈ_２Ｏ中２００ｍＭ）、グルコース結合タンパク質ＮＢＤ−ＧＧＢＰ（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２３１Ｒ／Ｌ２３８Ｓ変異体、１０ｕＬ、ＰＢＳ中４６ｕＭ）、およびイオン性架橋剤、ＣａＣｌ_２（３．５ｕＬ、Ｈ_２Ｏ中１００ｍＭ）を含んでいた。

これらの反応後、ウェルを、１５０ｕＬのＰＢＳで洗浄した（１０分間インキュベーション）。エタノールアミン（１Ｍ水溶液１０ｕＬ、ｐＨ８．５）を各ウェルに添加して、反応を抑制した（２０分間インキュベーション）。ウェルを、１５０〜２００ｕＬのＰＢＳまたは１ｍＭ ＣａＣｌ_２を含むＰＢＳで、３回洗浄した（ＣａＣｌ_２を使用する場合、表５に示す通り）。ＰＢＳまたは１ｍＭ ＣａＣｌ_２を含むＰＢＳ（５０ｕＬ）を、ウェルに添加して、Ｃｙｔｏｆｌｏｕｒ機器による蛍光の読取りを行った。この読取りの後、１Ｍグルコース１０ｕＬをウェルに添加し（３０分間インキュベーション）、次いで別の蛍光測定を行った。表５に示す結果は、グルコースに対する固定化結合タンパク質の応答を、Ｉ／Ｉ_０として示す。

上述の実験結果は、アミン含有表面に共有結合するマトリックスに対して、タンパク質がランダム共有結合することを実証している。このデータは、結合タンパク質、例えばＮＢＤ−ＧＧＢＰが、その表面のリジンを介して、アミン含有表面に共有結合するヒドロゲルポリマーに共有結合できることを示す。このデータは、グルコース濃度に対する蛍光活性を示した。ＮＢＤ−ＧＧＢＰ／ヒドロゲルポリマー／アミン表面の複合体を、共有結合的に、イオン的に、および／またはこれら両方により架橋して、マトリックスに構造安定性を付加し、タンパク質濃度を増大させ、および／またはタンパク質の浸出を低下させまたは防止した。層の架橋およびタンパク質の共有結合は、順次行うことができ、または同時反応でよく；結合の順序、そのような反応のタイミング、および試薬の組合せは、固定化されるタンパク質の量およびタンパク質の活性に、影響を与えることができる。

実施例１３：タンパク質に共有結合するアクリレート基を介した、ポリマーマトリックスに対するランダム結合
２官能性リンカー基の例には、Ｎ−アクリロイルスクシンイミド、ポリエチレングリコールプロピオン酸のα−アクリロイルω−スクシンイミジルエステル、およびアクリロイル−アミノ−へキサン酸スクシンイミジルエステルが含まれるが、これらに限定するものではない。特定の例には、ＡＣＲＬ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（３４００ＭＷ ポリエチレングリコールプロピオン酸のα−アクリロイル，ω−スクシンイミジルエステル（製品番号０１２Ｚ０Ｆ０２、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ ＡＬ））、およびアクリロイル−Ｘ ＳＥ（６−（（アクリロイル）アミノ）ヘキサン酸、スクシンイミジルエステル（製品番号Ａ−２０７７０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ならびにＮ−アクリロイルスクシンイミド（ＮＡＳ、製品番号Ａ８０６０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）が含まれる。

前述の試薬または均等なヘテロ２官能性試薬のいずれかを使用することができ、またこれらは、本発明の範囲内にある。これらの試薬は、スクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルを介してタンパク質表面のリジンアミンと反応し、次いで、アクリロイル官能基を介して反応する適切なコポリマーと、共重合することができる。これら２つの反応は、結合タンパク質のランダム共有結合固定化のためにどちらの順序でも行うことができる。逐次反応および同時反応が考えられる。

共重合前の、ＮＡＳのスクシンイミジル基とのタンパク質の反応。色素標識した結合タンパク質（１〜１０ｍｇ／ｍＬ）を、１Ｍ ＮａＣｌを含む０．２〜０．３Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．３）に溶解する。ＮＡＳ（５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、この溶液を６０分間混合する。反応を、エタノールアミンでまたはトリス緩衝液で抑制し、アクリル修飾したタンパク質を、ＮＡＰ−５カラムからの溶離によって回収する。タンパク質当たりのアクリレート基の数の特徴付けは、記述されるような（例えば、非特許文献２３参照。）等電点電気泳動ゲルによって行うことができる。次いで修飾したタンパク質を、１〜１０ｍｇ／ｍＬ溶液として、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）などの適切なモノマーと、Ｎ，Ｎ−ジメチルパラ−トルイジンまたはアゾ−ビスイソブチルロニトリル（ＡＩＢＮ）などの開始剤と、トリメチロールプロパントリアクリレートまたはテトラエチレングリコールジアクリレート（ＴＥＧＤＡ）などの１〜５％の架橋試薬とを含む重合反応物に添加する。重合は、ランダムに結合した結合タンパク質を有するヒドロゲルポリマーが生成されるように十分な時間、嫌気条件下で、開始剤に応じてこの混合物を光または熱に曝すことによって実施した。

タンパク質反応性マトリックスを提供するための、ヒドロゲル中のＮＡＳの共重合。上述の最後のステップのように、同様の共重合ステップを実施するが、アクリル修飾した結合タンパク質の代わりにＮＡＳを使用した。ＮＡＳは、典型的な場合、全モノマー比の約１〜５％として添加する。これにより、反応性あるＮＨＳエステルを含んだヒドロゲルポリマーが生成される。この材料を、最長で２４時間、ＮＢＤ標識した結合タンパク質の溶液（１〜１０ｍｇ／ｍＬ）と平衡状態になるように置き、その後、緩衝液で洗浄する。このようにすると、コポリマーに組み込まれたＮＨＳ基と、ポリマーマトリックス中に拡散するタンパク質との反応によって、コポリマーとタンパク質とのランダム共有結合が生ずる。

参照：
Gaertner, H.F. and Offord, R.E.「Site-specific attachment of functionalized poly(ethylene glycol) to the amino terminus of proteins」 Bioconj. Chem. 1996, 7, 38-44.
Alouani, S., Gaertner, H.F., Mermod, J.-J., Power, C.A., Bacon, K.B., Wells, T.N.C., and Proudfoot, A.E.I. 「A fluorescent interleukin-8 receptor probe produced by targeted labeling at the amino terminus.」Eur.J.Biochem. 1995, 227, 328-334.
Geoghegan, K.F. and Stroh, J.G. 「Site-directed conjugation of nonpeptide groups to peptides and proteins via periodate oxidation of a 2-amino alcohol. Application to modification at N-terminal serine.」 Bioconj. Chem. 1992, 3, 136-146.
A.S.Hoffman, 「Biologically Functional Materials」 chapt. 2.11, pp.124-130, in 「Biomaterials Science: An Introduction to Materials in Medicine」, B.D. Ratner, A.S.Hoffman, F.J.Shoen, J.E.Lemons, editors, Academic Press, San Diego, CA, 1996.
G.T.Hermanson, 「Bioconjugate Techniques」, pp.605-630, Academic Press, San Diego, 1996.
Shoemaker, S.G, Hoffman, A.S., and Priest, J.H.「Synthesis and Properties of Vinyl Monomer/Enzyme Conjugate」, Appl. Biochem. Biotechnol. 1987,15:11-24.

本発明の一実施形態による、マトリックスの構造を示す図である。 本発明のマトリックスの実施形態からの結合タンパク質の浸出に、最外層が及ぼす影響を示す図である。 アルギネートに取り込まれた結合タンパク質の、コアマトリックス表面の第２の層として使用された、種々のポリマーのＩ／Ｉｏに対する影響を示す図である。 ウサギの血清および血液中のグルコースを測定する３層マトリックスバイオセンサの、蛍光応答を示す図である。 リガンドマスキングによる、結合タンパク質の定方向標識を示す図である。 グルコースが存在する場合（＋）と存在しない場合（−）での、結合タンパク質と、結合タンパク質−ヒドロゲルポリマー結合体との蛍光発光を示す図である。 結合タンパク質と、結合タンパク質−ヒドロゲルポリマー結合体とに関する、グルコース滴定および解離定数を示す図である。

Claims (22)

1. 結合タンパク質を取り込み、埋め込み、または封入することが可能な多重コートまたは多層マトリックスであって、
   結合タンパク質を、物理的にまたは化学的に取り込むことが可能なコアと、
   前記コアの一体性を確実にする閉じ込め層、問題となっている分析物に対して選択的に透過性を有する外層、または生体適合性である層の、１つまたは複数と
   を含む、多重コートまたは多層マトリックス。
2. 結合タンパク質を、物理的にまたは化学的に取り込むことが可能なコアと、
   前記コアの一体性を確実にする閉じ込め層と、
   問題となっている分析物に対して選択的に透過性を有する外層と
   を含む、請求項１に記載のマトリックス。
3. 前記コアと、生体適合性である層とを含む、請求項２に記載のマトリックス。
4. 前記コアは、架橋可能なポリマーを含む、請求項１に記載のマトリックス。
5. 前記架橋可能なポリマーは、アルギネートまたはヒアルロネートである、請求項４に記載のマトリックス。
6. 前記閉じ込め層は、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、低および高分子量ポリビニルアルコール、ＳｂＱ−ＰＶＡ、およびＮａｆｉｏｎ（登録商標）からなる群から選択される化合物を含む、請求項１に記載のマトリックス。
7. 前記外層は、ＳｂＱ−ＰＶＡ、ＨＥＭＡ、ＰＶＡ、アルギネート、および無機ゾル−ゲルまたは有機的に修飾した無機ゾル−ゲルからなる群から選択される化合物を含む、請求項１に記載のマトリックス。
8. 前記第４の層は、Ｎａｆｉｏｎ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ｐＨＥＭＡ）、およびアルギネートからなる群から選択される化合物を含む、請求項２に記載のマトリックス。
9. 前記コアは、結合タンパク質を含む、請求項１に記載のマトリックス。
10. 前記結合タンパク質は、前記コアに物理的に取り込まれる、請求項９に記載のマトリックス。
11. 前記結合タンパク質は、前記コアに共有結合している、請求項９に記載のマトリックス。
12. 前記結合タンパク質は、糖結合タンパク質である、請求項９に記載のマトリックス。
13. 前記糖結合タンパク質は、変異したグルコース／ガラクトースまたはマルトース結合タンパク質である、請求項１２に記載のマトリックス。
14. 前記結合タンパク質は、レポーター基をさらに含む、請求項９に記載のマトリックス。
15. 前記レポーター基は、ルミネセント基または蛍光基である、請求項１４に記載のマトリックス。
16. （ａ）コアを形成するステップと、
    （ｂ）前記コアをコーティングしまたは層状化するのに十分な時間、前記コアを第１のコーティング溶液に接触させるステップと、
    （ｃ）前記コアを分離し、前記コアの表面の第１のコーティングを乾燥して、閉じ込め層またはコーティングを形成するステップと、
    （ｄ）前記閉じ込め層またはコーティングを、第２のコーティング溶液に接触させて、多重コート３次元構造を形成するステップと、
    （ｅ）前記多重コート３次元構造を分離し、前記多重コート３次元構造の表面の第２のコーティングを乾燥して、多重コートまたは多層マトリックスを得るステップと
    を含む、多重コートまたは多層マトリックスの作製方法。
17. （ａ）請求項１４に記載のマトリックスを、溶液に接触させるステップと、
    （ｂ）前記マトリックスを、そこから検出可能なシグナルを生成することが可能なエネルギー源に曝すステップと、
    （ｃ）前記検出可能なシグナルを測定するステップと、
    （ｄ）前記検出可能なシグナルの測定値を、溶液中の分析物の濃度と相関させるステップと
    を含む、溶液中の分析物の濃度の測定方法。
18. 前記分析物は糖である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記マトリックスのコアは、アルギネートまたはヒアルロネートを含み、前記閉じ込め層は、ポリ−Ｌ−リジンを含み、前記外層は、無機ゾル−ゲルまたは有機的に修飾した無機ゾル−ゲルを含む、請求項１６または１７に記載の方法。
20. 前記検出可能なシグナルは、一時的に、連続的に、またはプログラム化して測定する、請求項１７に記載の方法。
21. 内部に埋め込まれ、取り込まれ、または封入された、問題となっている分析物に特異的な少なくとも１種の結合タンパク質を有する、請求項１に記載の多層または多重コートマトリックスと、
    変換要素と
    を含む、バイオセンサ。
22. （ａ）レポーター基が結合されている結合タンパク質を、埋め込み、封入、または取り込み化合物と合わせて、コアを形成するステップと、
    （ｂ）前記コアをコーティングしまたは層状化するのに十分な時間、前記コアを第１のコーティング溶液に接触させるステップと、
    （ｃ）前記第１のコーティング溶液を分離し、乾燥して、閉じ込め層を形成するステップと、
    （ｄ）前記閉じ込め層をコーティングしまたは層状化するのに十分な時間、前記閉じ込め層を第２のコーティング溶液に接触させるステップと、
    （ｅ）前記第２のコーティング溶液を分離し乾燥して、外層を形成することにより、バイオセンサを得るステップと
    を含む、バイオセンサの作製方法。
    

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