JP2006517390A - 頭部および頸部扁平上皮癌における免疫療法のための標的としてのＷｎｔおよびフリズルド受容体 - Google Patents

頭部および頸部扁平上皮癌における免疫療法のための標的としてのＷｎｔおよびフリズルド受容体 Download PDF

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Abstract

本出願は、Wnt/フリズルドシグナリング経路に関与するタンパク質に関する。さらに詳しくは、本発明は増殖性障害におけるこれらのタンパク質の役割に関する。

Description

関連出願の相互参照
本特許出願は、参照として本明細書に組み入れられる、2002年11月1日に出願された米国特許出願第10/285,976号の出願日の利益を主張する。関連する出願である2001年5月1日に出願された米国特許仮出願第60/287,995号；2002年5月1日に出願されたPCT US02/13802；2001年5月1日に出願されたUSSN 09/847,102；および2002年5月1日に出願されたPCT/IB02/02887も参照として本明細書に組み入れられる。
連邦政府の援助の下での研究または開発でなされた発明に対する権利に関する陳述
本発明は、National Institutes of Healthより授与された補助金AR44850の下で米国政府の援助によってなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有しうる。
発明の分野
本出願はWnt/フリズルド（frizzled）シグナリング経路に関与するタンパク質に関する。さらに詳しくは、本発明は増殖性障害におけるこれらのタンパク質の役割に関する。
発明の背景
多くの癌は、ゆっくりと分裂する分化した組織から生じる。最初の悪性集団は、残存する組織の幹細胞、または余り分化していない細胞下プロフィールを有する細胞の小さな迅速に増殖する集団から発生する可能性がある。成熟した分化細胞から抗原的に区別される腫瘍細胞を標的化する戦略は、特に疾患の顕微鏡的拡大を制御するために癌の治療で有用と考えられる。悪性細胞は、胚パターニングに用いられる受容体を発現している可能性があり、これを成熟分化組織から区別される免疫学的標的として用いることができる可能性がある。
胚形成においては、身体のパターニングは異なるタンパク質の軸方向の発現に関係する。基部側-末端側軸は線維芽細胞成長因子（Vogel,A.et al.,「Involvement of FGF-8 in initiation, outgrowth and patterning of the vertebrate limb,」Development, 122:1737-1750（1996）；Vogel,A. and Tickle,C,「FGF-4 maintains polarizing activity of posterior limb bud cells in vivo and in vitro,」Development 119:199-206（1993）；Niswander,L.et al.,「FGF-4 replaces the apical ectodermal ridge and directs outgrowth and patterning of the limb,」Cell 75:579-587（1993））、ソニック・ヘッジホッグ（Sonic hedgehog）による前後軸（Riddle,R.D.et al.,「Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA,」Cell 75:1401-1416（1993））、およびウイングレス（wingless）による背腹軸（Parr,B.A.et al.,「Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds,」Development 119:247-261（1993）；Riddle,R.D.et al.,「Induction of the LIM homeobox gene Lmx1 by Wnt7a establishes dorsoventral pattern in the vertebrate limb,」Cell 83:631-640（1995）；Vogel,A,et al.,「Dorsal cell fate specified by chick Lmx1 during vertebrate limb development,」Nature 378:716-720（1995））によって制御される。これらの因子は発生において綿密に交差調節されている。Wnt（ウイングレス）の分泌はソニック・ヘッジホッグ（SHH）シグナリングによって刺激され、逆に、SHHの発現はウイングレスの継続的な存在によって支持される。次にSHHは、線維芽細胞成長因子（FGF）発現に影響する（Niswander,L.et al.,「A positive feedback loop coordinates growth and patterning in the vertebrate limb,」Nature 371:609-612（1994）；Niswander,L.,et al.,「Function of FGF-4 in limb development,」Mol Reprod Dev 39:83-88；discussion 88-89（1994）；Laufer,E.et al.,「Sonic hedgehog and Fgf-4 act through a signaling cascade and feedback loop to integrate growth and patterning of the developing limb bud,」Cell 79:993-1003（1994））。ウイングレスは、複雑なシグナリングカスケードを媒介するフリズルドと命名されたG-共役タンパク質受容体に対するリガンドである（Vinson,C.R. and Adler,P.N.,「Directional non-cell autonomy and the transmission of polarity information by the frizzled gene of Drosophila,」Nature 329:549-551（1987））。転写調節はそのリガンドPatchedとのSHH細胞表面相互作用によっても媒介される。Patchedは、それがSHHに結合するまでSmoothenedを通じてシグナリングを張性により（tonically）阻害する。これらの経路を図1に示す（これは他者の概説から適合させたものである。）（Hunter,T.「Oncoprotein networks,」Cell 88:333-346（1997）；Ng,J.K. et al.,「Molecular and cellular basis of pattern formation during vertebrate limb development,」Curr Top Dev Biol 41:37-66（1999）；Ramsdell A.F.and Yost H.J.,「Molecular mechanisms of vertebrate left-right development,」Trends Genet 14:459-465（1998））。
頭部および頸部扁平上皮癌（HNSCC）は先進国において6番目に多く見られる癌であり、合衆国で報告された44,000の年間症例のうち、ほぼ11,000が好ましくない結果となる（Landis,S.H.et al.,「Cancer statistics,」CA Cancer J Clin.49,8-31（1999）；Parkin,D.M.et al.,「Global cancer statistics,」CA Cancer J Clin.49,33-64（1999））。転移性HNSCCは化学療法および放射線療法に応答しうるが、それが十分に制御されることはほとんどない。従って、化学療法または免疫療法に対する潜在的標的でありうるHNSCCに対する新しい分子決定因子を同定することが重要である。
APC欠損結腸癌腫においては、β-カテニンが蓄積し、核Tcf-4と構成的に複合体化する（Sparks,A.B.et al.,「Mutational analysis of the APC/beta-catenin/Tcf pathway in colorectal cancer,」Cancer Res 58:1130-1134（1998））。他の結腸癌腫およびメラノーマもまた、それをAPCおよびGSK3βによる下方調節に対して非感受性とするβ-カテニンのN末端における突然変異の結果として構成的核Tcf4/β-カテニン複合体を含む（Morin,P.J.et al.,「Activation of beta-catenin-Tcf signaling in colon cancer by mutations in beta-catenin or APC,」Science 275:1787-1790（1997）；Rubinfeld,B.et al.「Stabilization of beta-catenin by genetic defects in melanoma cell lines,」Science 275:1790-1792（1997））。これは、c-myc、サイクリンD1およびc-junのようなTcf-4発癌性標的遺伝子の調節されない発現をもたらす（He,T.C.et al.,「Identification of c-MYC as a target of the APC pathway,」Science 281:1509-1512（1998）；Shtutman,M.et al.,「The cyclin D1 gene is a target of the beta-catenin/LEF-1 pathway,」Proc.Nat'l.Acad Sci.USA 96:5522-5527（1999）；Li,L.et al.,「Disheveled proteins lead to two signaling pathways. Regulation of LEF-1 and c-Jun N-terminal kinase in mammalian cells,」J Biol Chem 274:129-134（1999））。共有結合されたβ-カテニンおよびLEF1の発現は、ニワトリ線維芽細胞の発癌性トランスフォーメーションをもたらすことが直接的に示されている（Aoki,M.et al.,「Nuclear endpoint of Wnt signaling: neoplastic transformation induced by transactivating lymphoid-enhancing factor 1,」Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 96:139-144（1999））。Tcf標的遺伝子活性の脱調節に導く同様なメカニズムが、メラノーマ（Rimm,D.L.et al.,「Frequent nuclear/cytoplasmic localization of beta-catenin without exon 3 mutations in malignant melanoma,」Am J Pathol 154:325-329（1999））、乳癌（Bui,T.D.et al.,「A novel human Wnt gene, WNT10B, maps to 12q13 and is expressed in human breast carcinomas,」Oncogene 14:1249-1253（1997））、肝細胞癌腫（de La Coste,A.et al.,「Somatic mutations of the beta-catenin gene are frequent in mouse and human heptocellular carcinomas,」Proc Nat'l.Acad.Sci.USA 95:8847-8851（1998））、卵巣癌（Palacios J.,and Gamallo,C.,「Mutations in the beta-catenin gene（CTNNB1）in endometrioid ovarian carcinomas,」Cancer Res 58:1344-1347（1998））、子宮内膜癌（Ikeda,T.,「Mutational analysis of the CTNNB1（beta-catenin）gene in human endometrial cancer:frequent mutations at codon 34 that cause nuclear accumulation,」Oncol Rep 7:323-326（2000））、髄芽細胞腫（Hamilton,S.R.et al.,「The molecular basis of Turcot's syndrome,」N.Engl J Med 332:839-847（1995））、毛質性上皮腫（Chan,E.F.et al.「A common human skin tumour is caused by activating mutations in beta-catenin,」Nat.Genet 21:410-413（1999））、および前立腺癌（Iozzo,R.V.et al.,「Aberrant expression of the growth factor Wnt-5A in human malignancy,」Cancer Res 55:3495-3499（1995））に関与している可能性が高い。
腫瘍における他の増殖調節経路も最近の興味をひいている。多くの上皮腫瘍は過剰量の表皮成長因子受容体チロシンキナーゼ、特に表皮成長因子受容体（EGFR、またはErbB-1）、およびHER2（ErbB-2）を発現する（Coussens,L.et al.,「Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene,」Science 230:1132-1139（1985）；King,C.R.et al.,「Amplification of a novel v-erbB-related gene in a human mammary carcinoma,」Science 229:974-976（1985））。HER2は膜貫通チロシンキナーゼ受容体であり、これはEGFRファミリーのもう1つのメンバーとで二量体化して活性なダイマー受容体を形成する（Akiyama,T.et al.,「The product of the human c-erbB-2 gene: a 185-kilodalton glycoprotein with tyrosine kinase activity,」Science 232:1644-1646（1986））。結果として生じるチロシン残基のリン酸化は複雑なシグナリング経路を開始させ、最終的には細胞分裂に導く。HER2は、通常遺伝子増幅の結果として、乳癌の25〜30％で過剰発現される（Slamon,D.J.et al.,「Studies of the HER-2/neu proto-oncogene in human breast and ovarian cancer,」Science 244:707-712（1989））。高レベルのこのタンパク質は有害な予後に関係する（Slamon,D.J.et al.,「Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene,」Science 235:177-182（1987）；Ravdin,P.M. and Chamness G.C.,「The c-erbB-2 proto-oncogene as a prognostic and predictive marker in breast cancer: a paradigm for the development of other macromolecular markers--a review,」Gene 159:19-27（1995））。
過去10年間に、悪性細胞のトランスフォーメーションの間に起こる遺伝子および分子変化を同定することにかなりの進歩があった。多くの悪性細胞は、成人組織における正常なものよりも余り分化していない表現型、およびより高い成長割合を有する。これらの基本的な特徴は未成熟または胚細胞と同様である。胚の発生の間に、種々の細胞表面受容体およびリガンドは組織のパターン形成、および細胞の分化を指令する（Hunter,T.,「Oncoprotein networks,」Cell 88,333-346（1997）；Ng,J.K.et al.,「Molecular and cellular basis of pattern formation during vertebrate limb development,」Curr Top Dev Biol.41,37-66（1999）；Ramsdell,A.F. and Yost,H.J.,「Molecular mechanisms of vertebrate left-right development,」Trends Genet.14,459-465（1998））。これらの受容体およびリガンドの発現は、十分に成熟した成人組織では必要とされないことが多い。それらは細胞の表面で発現されるので、形態パターンニングおよび組織分化に重要な受容体およびリガンドは、残存する未成熟細胞から生起した、あるいは脱分化を受けた腫瘍の免疫療法のための標的となりうるであろう。
ウィングレス（Wnt）およびフリズルド（Fzd）クラスの遺伝子は細胞の形態形成および細胞分化において確立された役割を有する（Parr,B.A.et al.,「Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds,」Development,119,247-261（1993）；Riddle,R.D.et al.,「Induction of the LIM homeobox gene Lmx1 by WNT7a establishes dorsoventral pattern in the vertebrate limb,」Cell 83,631-640（1995）；Vogel,A.et al.,（1995）「Dorsal cell fate specified by chick Lmx1 during vertebrate limb development,」Nature 378,716-720（1995））。Wntタンパク質は、典型的なGタンパク質共役受容体（GPCR）に似たFzd受容体に対する細胞外リガンドである。19の公知のヒトWnt遺伝子のうちの最初のメンバーであるWnt-1は、その発癌特性のため最初に発見された（Nusse,R.and Varmus,H.E.,「Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome,」Cell 31,99-109（1982））。Wnt糖タンパク質は10の公知の7回膜貫通ドメインGタンパク質共役Fzd受容体の一つまたは複数に結合して、しばしば、β-カテニンの安定化および核移動で最高点に達し、転写因子のLEF/TCFファミリーの4つのメンバーのうちの1つとのヘテロ二量体化の結果を伴う、一連のシグナリング事象を開始させる（Cadigan,K.M. and Nusse,R.,「Wnt signaling: a common theme in animal development,」Genes Dev.,11,3286-3305（1997）；Miller,J.R.et al.,「Mechanism and function of signal transduction by the Wnt/β-catenin and Wnt/Ca2+ pathways,」Oncogene 18,7860-7872（1999））。これらの転写因子複合体は、発生レギュレーター、および細胞増殖、細胞間相互作用、および細胞-マトリックス相互作用を協調させることに関与する他の遺伝子を含む特異的Wnt標的遺伝子の活性を制御する（Vogel,A. and Tickle,C.,「FGF-4 maintains polarizing activity of posterior limb bud cells in vivo and in vitro,」Development 119:199-206（1993））。β-カテニンおよびLEF-1の過剰発現は、ニワトリ線維芽細胞の発癌性トランスフォーメーションをもたらすことが示されている（Aoki,M.et al.,「Nuclear endpoint of Wnt signaling: neoplastic transformation induced by transactivating lymphoid-enhancing factor 1,」Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 96,139-144（1999））。
マイクロアレイ技術を用いた最近の調査により、ほとんどのHNSCCがWntファミリーのmRNAを過剰発現することが示された（Leethanakul,C.et al.,「Distinct pattern of expression of differentiation and growth-related genes in squamous cell carcinomas of the head and neck revealed by the use of laser capture microdissection and cDNA arrays,」Oncogene 19,3220-3224（2000））。しかしながら、種々のWnt mRNAは非常に相同性が高く、マイクロアレイにおけるハイブリダイゼーションは、しばしば、密接に関連する鋳型の間を識別できない。
ネズミモノクローナル抗体4DSは、高い親和性をもって、HER2の細胞外ドメインに結合し、それにより、シグナル伝達におけるその機能をブロックする（Hudziak,R.M.et al.,「P185HER2 monoclonal antibody has antiproliferative effects in vitro and sensitizes human breast tumor cells to tumor necrosis factor,」Mol Cell Biol 9:1165-1172（1989）；Fendly,B.M.et al.,「Characterization of murine monoclonal antibodies reactive to either the human epidermal growth factor receptor or HER2/neu gene product」Cancer Res 50:1550-1558（1990）；Fendly,B.M.et al.「The extracellular domain of HER2/neu is a potential immunogen for active specific immunotherapy of breast cancer,」J Biol Response Mod 9:449-455（1990））。乳癌の実験モデルにおいて、それはインビトロおよびインビボで活性であり、化学療法と組み合わせた場合により大きな抗腫瘍効果を有した（Hudziak,R.M.et al.「p185HER2 monoclonal antibody has antiproliferative effects in vitro and sensitizes human breast tumor cells to tumor necrosis factor,」Mol Cell Biol 9:1165-1172（1989）；Pietras,R.J.et al.,「Antibody to HER-2/neu receptor blocks DNA repair after cisplatin in human breast and ovarian cancer cells,」Oncogene 9:1829-1838（1994）。4DSモノクローナル抗体のヒト化形態trastuzumab（Herceptin；Genentech,Inc, South San Francisco, CA）の最近完成されたフェーズ3ランダム化臨床試験は、HER2を過剰発現する乳癌のいくつかの形態に対して効力を示した（Slamon,D.J.et al.,「Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2,」N Engl J Med 344:783-792（2001））。
発明の概要
本発明は、癌細胞で過剰発現される特異的Wntおよび/またはFzdタンパク質を同定する方法を提供する。過剰発現とは、同一組織型の非癌細胞における同じWntおよび/またはFzdタンパク質のレベルに対して、癌細胞における特定のWntおよび/またはFzdタンパク質レベルの増大したレベルを指しうる。または、過剰発現とは、同一癌細胞における異なるWntおよび/またはFzdタンパク質のレベルに対する、癌細胞における特定のWntおよび/またはFzdレベルの増大したレベルを指しうる。加えて、いくつかの癌において、Wntおよび/またはFzdタンパク質は、同一組織型の非癌細胞における同一Wntおよび/またはFzdタンパク質と、同一癌細胞における異なるWntおよび/またはFzdタンパク質の双方と比較して、過剰発現されている。
1つの局面において、本発明は、Wnt/Fzdシグナリング経路においてWntタンパク質を過剰発現する乳癌細胞において、非癌細胞と比較した場合に、乳癌細胞の増殖または生存を阻害する方法を提供する。Wntタンパク質は、Wnt7b、Wnt-10bまたはWnt-14でありうる。乳癌細胞は、癌細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤と接触させる。いくつかの態様において、薬剤はWnt/Fzdシグナリング経路のアンタゴニストである。好ましい態様において、薬剤は、Wnt7b、Wnt-10bまたはWnt-14に特異的に結合する抗Wnt抗体である。さらなる態様において、抗Wnt抗体は補体による細胞毒性または殺傷を促進する。本発明のもう1つの局面において、Wntタンパク質は、同一癌細胞におけるもう1つのWntタンパク質と比較した場合に過剰発現されている。さらなる局面において、Wntタンパク質は癌細胞の増殖または生存に必要である。
また、本発明は、癌細胞が非癌細胞と比較した場合にWnt/Fzdシグナリング経路においてWntタンパク質を過剰発現している乳癌を有する患者を治療する方法を提供する。Wntタンパク質は、Wnt7b、Wnt-10bまたはWnt-14でありうる。乳癌細胞は、癌細胞におけるWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤と接触させる。いくつかの態様において、薬剤はWnt/Fzdシグナリング経路のアンタゴニストである。好ましい態様において、薬剤は、Wnt7b、Wnt-10bまたはWnt-14に特異的に結合する抗Wnt抗体である。さらなる態様において、抗Wnt抗体は補体による細胞毒性または殺傷を促進する。本発明のもう1つの局面において、Wntタンパク質は、同一癌細胞におけるもう1つのWntタンパク質と比較した場合に過剰発現されている。さらなる局面において、Wntタンパク質は癌細胞の増殖または生存に必要である。
1つの局面において、本発明は、非癌細胞と比較した場合にWnt/Fzdシグナリング経路においてWntタンパク質を過剰発現する慢性リンパ性白血病細胞の増殖または生存を阻害する方法を提供する。Wntタンパク質はWnt3およびWnt-16でありうる。慢性リンパ性白血病細胞は、癌細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤と接触させる。いくつかの態様において、薬剤はWnt/Fzdシグナリング経路のアンタゴニストである。好ましい態様において、薬剤は、Wnt3またはWnt-16に特異的に結合する抗Wnt抗体である。さらなる態様において、抗Wnt抗体は補体による細胞毒性または殺傷を促進する。本発明のもう1つの局面において、Wntタンパク質は、同一癌細胞におけるもう1つのWntタンパク質と比較した場合に過剰発現されている。さらなる局面において、Wntタンパク質は癌細胞の増殖または生存に必要である。
また、本発明は、慢性リンパ性白血病細胞が非癌細胞と比較した場合にWnt/Fzdシグナリング経路においてWntタンパク質を過剰発現している、慢性リンパ性白血病を有する患者を治療する方法を提供する。Wntタンパク質はWnt3およびWnt-16でありうる。慢性リンパ性白血病細胞は、癌細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤と接触させる。いくつかの態様において、薬剤はWnt/Fzdシグナリング経路のアンタゴニストである。好ましい態様において、薬剤は、Wnt3またはWnt-16に特異的に結合する抗Wnt抗体である。さらなる態様において、抗Wnt抗体は補体による細胞毒性または殺傷を促進する。本発明のもう1つの局面において、Wntタンパク質は、同一癌細胞におけるもう1つのWntタンパク質と比較した場合に過剰発現されている。さらなる局面において、Wntタンパク質は癌細胞の増殖または生存に必要である。
1つの局面において、本発明は、非癌細胞と比較した場合にWnt/Fzdシグナリング経路においてWntタンパク質を過剰発現するマントルゾーンのリンパ腫細胞の増殖または生存を阻害する方法を提供する。Wntタンパク質はWnt-16でありうる。前記マントルゾーンリンパ腫細胞は、癌細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤と接触させる。いくつかの態様において、薬剤はWnt/Fzdシグナリング経路のアンタゴニストである。好ましい態様において、薬剤はWnt-16に特異的に結合する抗Wnt抗体である。さらなる態様において、抗Wnt抗体は補体による細胞毒性または殺傷を促進する。本発明のもう1つの局面において、Wntタンパク質は、同一癌細胞におけるもう1つのWntタンパク質と比較した場合に過剰発現されている。さらなる局面において、Wntタンパク質は癌細胞の増殖または生存に必要である。
また、本発明は、マントルゾーンリンパ腫細胞が非癌細胞と比較した場合にWnt/Fzdシグナリング経路においてWntタンパク質を過剰発現する、マントルゾーンリンパ腫を有する患者を治療する方法を提供する。Wntタンパク質はWnt-16でありうる。マントルゾーンリンパ腫細胞は、癌細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤と接触させる。いくつかの態様において、薬剤はWnt/Fzdシグナリング経路のアンタゴニストである。好ましい態様において、薬剤はWnt-16に特異的に結合する抗Wnt抗体である。さらなる態様において、抗Wnt抗体は補体による細胞毒性または殺傷を促進する。本発明のもう1つの局面において、Wntタンパク質は、同一癌細胞におけるもう1つのWntタンパク質と比較した場合に過剰発現されている。さらなる局面において、Wntタンパク質は癌細胞の増殖または生存に必要である。
1つの局面において、本発明は、非癌細胞と比較した場合にWnt/Fzdシグナリング経路においてFzdタンパク質を過剰発現する乳癌細胞の増殖または生存を阻害する方法を提供する。Fzdタンパク質は、Fzd3、Fzd4、Fzd6、Fzd7、またはFzd10でありうる。乳癌細胞は、癌細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤と接触させる。いくつかの態様において、薬剤はWnt/Fzdシグナリング経路のアンタゴニストである。好ましい態様において、薬剤は、Fzd3、Fzd4、Fzd6、Fzd7またはFzd10に特異的に結合する抗Fzd抗体である。さらなる態様において、抗Fzd抗体は補体による細胞毒性または殺傷を促進する。もう1つの局面において、Fzdタンパク質は、同一癌細胞におけるもう1つのFzdタンパク質と比較した場合に過剰発現されている。さらなる局面において、Fzdタンパク質は癌細胞の増殖または生存に必要である。
また、本発明は、乳癌細胞が非癌細胞と比較した場合にFzdタンパク質を過剰発現する、乳癌を有する患者を治療する方法を提供する。Fzdタンパク質は、Fzd3、Fzd4、Fzd6、Fzd7、またはFzd10でありうる。乳癌細胞は、癌細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤と接触させる。いくつかの態様において、薬剤はWnt/Fzdシグナリング経路のアンタゴニストである。好ましい態様において、薬剤は、Fzd3、Fzd4、Fzd6、Fzd7、またはFzd10に特異的に結合する抗Fzd抗体である。さらなる態様において、抗Fzd抗体は補体による細胞毒性または殺傷を促進する。もう1つの局面において、Fzdタンパク質は、同一癌細胞におけるもう1つのFzdタンパク質を比較した場合に過剰発現されている。さらなる局面において、Fzdタンパク質は癌細胞の増殖または生存に必要である。
1つの局面において、本発明は、非癌細胞と比較した場合にWnt/Fzdシグナリング経路においてFzdタンパク質を過剰発現する慢性リンパ性白血病細胞の増殖または生存を阻害する方法を提供する。Fzdタンパク質はFzd3でありうる。慢性リンパ性白血病細胞は、慢性リンパ性白血病細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤と接触させる。いくつかの態様において、薬剤はWnt/Fzdシグナリング経路のアンタゴニストである。好ましい態様において、薬剤はFzd3に特異的に結合する抗Fzd抗体である。さらなる態様において、抗Fzd抗体は補体による細胞毒性または殺傷を促進する。もう1つの局面において、Fzdタンパク質は同一癌細胞におけるもう1つのFzdタンパク質と比較した場合に過剰発現されている。さらなる局面において、Fzdタンパク質は癌細胞の増殖または生存に必要である。
また、本発明は、慢性リンパ性白血病細胞が非癌細胞と比較した場合にWnt/Fzdシグナリング経路においてFzdタンパク質を過剰発現する、慢性リンパ性白血病を有する患者を治療する方法を提供する。Fzdタンパク質はFzd3でありうる。慢性リンパ性白血病細胞は、慢性リンパ性白血病細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤と接触させる。いくつかの態様において、薬剤はWnt/Fzdシグナリング経路のアンタゴニストである。好ましい態様において、薬剤はFzd3に特異的に結合する抗Fzd抗体である。さらなる態様において、抗Fzd抗体は補体による細胞毒性または殺傷を促進する。もう1つの局面において、Fzdタンパク質は、同一癌細胞におけるもう1つのFzdタンパク質と比較した場合に過剰発現されている。さらなる局面において、Fzdタンパク質は癌細胞の増殖または生存に必要である。
1つの局面において、本発明は、非癌細胞と比較した場合にWntタンパク質を過剰発現し、非癌細胞と比較して下流のwnt/fzd調節遺伝子産物も過剰発現する癌細胞の増殖または生存を阻害する方法を提供する。癌細胞は、癌細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤と接触させる。いくつかの態様において、薬剤は、過剰発現されたWntタンパク質に対する抗体である。さらなる態様において、Wntタンパク質は、同一癌細胞におけるもう1つのWntタンパク質と比較した場合にも過剰発現されている。もう1つの態様において、Wntタンパク質は癌細胞の増殖または生存に必要である。例えば、Wnt7b、Wnt-10b、またはWnt-14を過剰発現し、サイクリンD1、c-myc、およびWISPファミリーメンバーも過剰発現する乳癌細胞の増殖は、Wnt7b、Wnt-10b、またはWnt-14に特異的に結合する抗体によって阻害することができる。
また、本発明は、非癌細胞と比較した場合にWntタンパク質を過剰発現し、非癌細胞と比較して下流のwnt/fzd調節遺伝子産物をやはり過剰発現する細胞を含有する癌を有する患者を治療する方法を提供する。癌細胞は、癌細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤と接触させる。いくつかの態様において、薬剤は、過剰発現されたWntタンパク質に対する抗体である。さらなる態様において、Wntタンパク質は同一癌細胞におけるもう1つのWntタンパク質と比較した場合にやはり過剰発現されている。もう1つの態様において、Wntタンパク質は癌細胞の増殖または生存に必要である。例えば、Wnt7b、Wnt-10b、またはWnt-14を過剰発現し、サイクリンD1、c-myc、およびWISPファミリーメンバーをやはり過剰発現する細胞を含有する乳癌を有する患者は、Wnt7b、Wnt-10b、またはWnt-14に特異的に結合する抗体によって阻害することができる。
もう1つの局面において、本発明は、非癌細胞と比較した場合にFzdタンパク質を過剰発現し、非癌細胞と比較して下流wnt/fzd調節遺伝子産物をやはり過剰発現する癌細胞の増殖または生存を阻害する方法を提供する。癌細胞は、癌細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤と接触させる。いくつかの態様において、薬剤は、過剰発現されたFzdタンパク質に対する抗体である。さらなる態様において、Fzdタンパク質は同一癌細胞におけるもう1つのFzdタンパク質と比較した場合にやはり過剰発現されている。もう1つの態様において、Fzdタンパク質は癌細胞の増殖または生存に必要である。その例として、Fzd3、Fzd4、Fzd6、Fzd7、またはFzd10を過剰発現し、サイクリンD1、c-myc、およびWISPファミリーメンバーをやはり過剰発現する乳癌細胞の増殖は、Fzd3、Fzd4、Fzd6、Fzd7、またはFzd10に特異的に結合する抗体によって阻害することができる。
また、本発明は、非癌細胞と比較した場合にFzdタンパク質を過剰発現し、非癌細胞と比較して下流wnt/fzd調節遺伝子産物をやはり過剰発現する細胞を含有する癌を有する患者を治療する方法を提供する。癌細胞は、癌細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤と接触させる。いくつかの態様において、薬剤は、過剰発現されたFzdタンパク質に対する抗体である。さらなる態様において、Fzdタンパク質は、同一癌細胞におけるもう1つのFzdタンパク質と比較した場合にやはり過剰発現されている。もう1つの態様において、Fzdタンパク質は癌細胞の増殖または生存に必要である。その例として、Fzd3、Fzd4、Fzd6、Fzd7またはFzd10を過剰発現し、サイクリンD1、c-mycおよびWISPファミリーメンバーをやはり過剰発現する細胞を含有する乳癌を有する患者は、Fzd3、Fzd4、Fzd6、Fzd7、およびFzd10に特異的に結合する抗体によって阻害することができる。
もう1つの局面において、本発明は、Wnt-1をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、Wnt-1核酸とのハイブリダイゼーションを検出することができるように、試料に単離されたポリヌクレオチドを接触させることによって、生物学的試料中のWnt-1をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Wnt-2をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するWnt-2をコードする核酸とのハイブリダイゼーションを検出することができるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のWnt-2をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Wnt-2bをコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するWnt-2bをコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出することができるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のWnt-2bをコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Wnt-3をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するWnt-3をコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出することができるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のWnt-3をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Wnt-3aをコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するWnt-3aをコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出することができるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のWnt-3aをコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Wnt-4をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するWnt-4をコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出することができるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のWnt-4をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Wnt-5aをコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するWnt-5aをコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出することができるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のWnt-5aをコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Wnt-5bをコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するWnt-5bをコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出することができるのを可能とする条件下で、試料と請求項99の単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のWnt-5bをコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Wnt-6をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するWnt-6をコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出できるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のWnt-6をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Wnt-7aをコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するWnt-7aをコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出できるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のWnt-7aをコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Wnt-7bをコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するWnt-7bをコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出できるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のWnt-7bをコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Wnt-8aをコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するWnt-8aをコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出できるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のWnt-8aをコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Wnt-8bをコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するWnt-8bをコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出できるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のWnt-8bをコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Wnt-10aをコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するWnt-10aをコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出できるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のWnt-10aをコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Wnt-10bをコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するWnt-10bをコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出できるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のWnt-10bをコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Wnt-11をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するWnt-11をコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出できるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のWnt-11をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Wnt-14をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するWnt-14をコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出できるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のWnt-14をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Wnt-16をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するWnt-16をコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出できるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のWnt-16をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Fzd1をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するFzd1をコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出できるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のFzd1をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Fzd2をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するFzd2をコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出できるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のFzd2をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Fzd3をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するFzd3をコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出できるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のFzd3をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Fzd4をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するFzd4をコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出できるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のFzd4をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Fzd5をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するFzd5をコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出できるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のFzd5をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Fzd6をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するFzd6をコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出できるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のFzd6をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Fzd7をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するFzd7をコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出できるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のFzd7をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Fzd8をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するFzd8をコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出できるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のFzd8をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Fzd9をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するFzd9をコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出できるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のFzd9をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
もう1つの局面において、本発明は、Fzd10をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、ポリヌクレオチド:
Figure 2006517390
と同一の配列に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、存在するFzd10をコードする核酸との特異的ハイブリダイゼーションを検出できるように、試料と単離されたポリヌクレオチドとを接触させることによって、生物学的試料中のFzd10をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法を提供する。
定義
用語「Wntタンパク質」または「Wntリガンド」とは、Drosophilaセグメント極性遺伝子ウイングレスに関連する哺乳動物タンパク質のファミリーをいう。ヒトにおいては、Wnt遺伝子ファミリーは、典型的には、疎水性シグナル配列、および保存されたアスパラギン結合オリゴ糖コンセンサス配列を有する38〜43kDaシステインリッチの糖タンパク質をコードする（例えば、Shimizu et al Cell Growth Differ 8:1349-1358（1997）参照）。Wntファミリーは少なくとも19の哺乳動物タンパク質メンバーを含む。例示的なWntタンパク質は、Wnt-1、Wnt-2、Wnt-2b（Wnt-13としても知られる）、Wnt-3、Wnt-3A、Wnt-4、Wnt-5A、Wnt-5B、Wnt-6、Wnt-7A、Wnt-7B、Wnt-8A、Wnt-8B、Wnt-10A、Wnt-10B、Wnt-11、Wnt14、Wnt15、およびWnt16を含む。例示的なwntタンパク質の配列は、非公式な配列表に記載されている。後に説明するように、ある種の癌は特定のWntタンパク質に関連する。例えば、頭部および頸部扁平細胞癌腫細胞はWnt-5a、Wnt-7a、Wnt-10b、またはWnt-13と関連する。神経膠芽細胞腫はWnt-1またはWnt-10bに関連する。バーキットリンパ腫および慢性リンパ性白血病はWnt-1またはWnt-10bに関連する。悪性リンパ球はWnt-6、Wnt-14、またはWnt-16を過剰発現する。乳癌はwnt5a、wnt7b、wnt10bおよびwnt14の過剰発現に関連する。
用語「フリズルドタンパク質」または「フリズルド受容体」とは、組織極性の発達において役割を演じるDrosophilaフリズルド（frizzled）遺伝子に関連する哺乳動物タンパク質のファミリーをいう。フリズルドファミリーは少なくとも10の哺乳動物遺伝子を含む。例示的なヒトフリズルド受容体はフリズルド1、フリズルド2、フリズルド3、フリズルド4、フリズルド5、フリズルド6、フリズルド7、フリズルド8、フリズルド9およびフリズルド10を含む。例示的なフリズルド受容体の配列は非公式な配列表に記載されている。Drosophilaフリズルドタンパク質の哺乳動物ホモログは多数の共通構造モチーフを共有する。細胞外膜表面に位置するN末端に続いて、シグナル配列、10システイン残基の不変パターンを有する120アミノ酸のドメイン、および40〜100のかなり変化する親水性アミノ酸の高度に多様な領域が続く。推定疎水性セグメントは、親水性ループに連結し、膜の細胞内面に位置するC末端で終了する7回膜貫通ヘリックスを形成する。システインリッチなドメイン（CRD）および膜貫通セグメントは高度に保存されており、細胞外CRDが可変リンカー領域によって7回膜貫通ヘリックスの束に連結された作動モデルを示唆する。従って、フリズルドタンパク質受容体は、アミノ末端リガンド結合ドメインを有するGタンパク質共役受容体に類似する膜貫通シグナル伝達の動的モデルに関与する。
Wntリガンドに加えて、分泌フリズルド関連タンパク質（sFRP）のファミリーが単離されている。sFRPは、分泌Wntリガンドの結合に対して膜貫通フリズルド受容体と競合することによって、Wntシグナリングの可溶性内因性モジュレーターとして機能するようである。従って、sFRPはアポトーシス感受性を変調し、プログラムされた細胞死に対する拮抗効果を発揮する。sFRPは、タンパク質に結合してその細胞表面シグナリング受容体に対する接近をブロックすることによってWnt機能に拮抗するか、あるいは、フリズルド受容体へのリガンドの提示を促進することによってWnt活性を高めることができる。現在、sFRPは癌に原因的にはリンクされてはいない。
用語「薬剤」または本明細書中で用いる文法的に同等なものは、Wnt/Fzdシグナリング経路を直接的にまたは間接的に阻害する、天然に生じるまたは合成によるいずれかの分子、例えば、タンパク質（例えば、抗体またはsFRP）、オリゴペプチド（例えば、長さが約5〜約25アミノ酸、好ましくは長さが約10〜20、または12〜18アミノ酸、好ましくは長さが12、15または18アミノ酸）、小化学分子、多糖、脂質（例えば、スフィンゴ脂質）、脂肪酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド等をいう。
Wntシグナリングの、またはwnt/Fzdシグナリング経路の「アンタゴニスト」または「阻害剤」とは、Wnt/Fzdシグナリングについての公知のアッセイで測定して（例えば、βカテニンレベル、またはTcfおよびLef転写因子もしくは他の下流wnt/fzd調節遺伝子産物によって制御された癌遺伝子発現の測定）、例えば、Wntもしくはフリズルドタンパク質に結合する、またはWnt/Fzdシグナリングを部分的にもしくは全体的にブロックし、または阻害する化合物をいう。阻害剤は、WntまたはFzdタンパク質、およびWntまたはフリズルドタンパク質の修飾されたバージョン、ならびに天然に生じる、および合成リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体、小化学分子等に対する抗体を含む。本発明の阻害剤またはアンタゴニストを検出するためのアッセイは後により詳細に記載する。
「Wntまたはフリズルドタンパク質を過剰発現する癌細胞」は、特定のWntタンパク質の発現が、同一組織タイプからの非癌細胞における発現のレベルの少なくとも約2倍、通常少なくとも約5倍である癌細胞である。いくつかの態様において、癌細胞におけるwntおよび/またはfzd発現は、異なる組織型の非癌細胞、または異なる組織型の非癌細胞のパネルにおけるwntおよび/またはfzd発現と比較する。また、特定のWntおよび/またはフリズルドタンパク質の発現は、同一細胞における他のWntおよび/またはフリズルドタンパク質と比較することができる。非癌細胞と比較して癌細胞で過剰発現され、同一癌細胞における他のWntおよび/またはフリズルドタンパク質と比較して過剰発現されるタンパク質が一般に好ましい。特定の遺伝子の発現レベルを測定する方法は当技術分野において周知である。そのような方法として、RT-PCR、リアルタイムPCR、遺伝子産物に対する抗体の使用等が挙げられる。
用語「wntシグナリング」、「wnt/fzd」シグナリング、および「fzdシグナリング」は相互に交換可能に使用される。
「Wnt/Fzdシグナリング経路」とは、特異的Wntタンパク質および特異的Fzdタンパク質の間の相互作用によって開始される細胞内シグナル伝達経路の活性化をいう。一般に、Wnt/Fzd相互作用はWntタンパク質のFzd受容体への結合であり、シグナル伝達経路の活性化につながる。いくつかの例において、Wnt/Fzdシグナリング経路の活性化は、下流wntおよび/またはfzd誘導性遺伝子の誘導につながる。「下流wnt/fzd調節遺伝子産物」は、wnt/fzd伝達経路によるシグナリングの結果として、上方調節されるか、あるいはそうでなければ調節されるタンパク質またはRNAである。
「癌細胞の増殖」とは、細胞分裂、および癌細胞の数の増加をいう。「増殖の阻害」とは増殖の速度（例えば、細胞分裂）、増殖の停止（例えば、G0相または老化に入ること）、または壊死細胞死滅を含む細胞の死滅をいう。
「癌細胞の生存の阻害」とは、プログラムされた細胞死滅プロセス、例えばアポトーシスの阻害の誘導または救済をいう。
用語「接触」または「接触する」は、本明細書中では、「と組み合わせる」、「に加える」、「と混合する」、「を通過させる」、「と共にインキュベートする」、「に流す」等と相互交換的に用いられる。
「核酸」とは、一本鎖または二本鎖いずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーをいう。例示的wntおよびfzd核酸は非公式な配列表に見出される。この用語は、合成、天然、および非天然の、参照核酸と同様な結合特性を有する、参照ヌクレオチドと同様に代謝される、公知のヌクレオチドアナログまたは修飾された骨格残基または結合を含む核酸を含む。そのようなアナログの例は、限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル-メチルホスホネート、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（PNA）を含む。
特に断りのない限り、特定の核酸配列は、明示的に示された配列に加え、保存的に修飾されたその変種（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列を暗黙的に含む。従って、用語「Wntをコードする核酸」および「Fzdをコードする核酸」は、コーディングおよび相補的非コーティング配列を共に含む。具体的には、縮重コドン置換は、一つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第3の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作ることによって達成することができる（Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081（1991）；Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608（1985）；Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes 8:91-98（1994））。用語「核酸」は、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと相互交換的に用いられる。
本明細書中で用いるように、「抗体」は、特定の抗原と免疫学的に反応性の免疫グロブリン分子に対する言及を含み、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を共に含む。また、この用語はキメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）およびヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二特異的抗体）のような遺伝子工学的に作成された抗体も含む。また、用語「抗体」は、抗原結合能力を有する断片（例えば、Fab’、F（ab’）2、Fab、FvおよびrIgG）を含む抗体の抗原結合形態も含む。また、Pierce Catalog and Handbook,1994-1995（Pierce Chemical Co.,Rockford,IL）も参照されたい。また、例えば、Kuby,J.,Immunology,3rd Ed.,W.H.Freeman & Co.,New York（1998）も参照されたい。この用語は、組換え単鎖Fv断片（scFv）をも指す。用語「抗体」は、二価または二特異的分子、ダイアボディー、トリアボディー、およびテトラボディーも含む。二価および二特異的分子は、例えば、Kostelny et al.（1992）J Immunol 148:1547,Pack and Pluckthun（1992）Biochemistry 31:1579,Hollinger et al.,1993,supra,Gruber et al.（1994）J Immunol:5368,Zhu et al.（1997）Protein Sci 6:781,Hu et al.,（1996）Cancer Res.56:3055,Adams et al.（1993）Cancer Res.53:4026,and McCartney et al.（1995）Protein Eng.8:301に記載されている。
特定の抗原と免疫学的に反応性の抗体は、ファージまたは同様なベクター中の組換え抗体のライブラリーの選択のような組換え法によって（例えば、Huse et al.,Science 246:1275-1281（1989）；Ward et al.,Nature 341:544-546（1989）；およびVaughan et al.,Nature Biotech.14:309-314（1996））、または抗原もしくは抗原をコードするDNAで動物を免疫化することによって作り出すことができる。
典型的には、免疫グロブリンは重鎖および軽鎖を有する。各重鎖および軽鎖は定常領域および可変領域を含む（これら領域は「ドメイン」としても知られている）。軽鎖および重鎖の可変領域は「相補性決定領域」または「CDR」とも呼ばれる3つの超可変領域によって中断される4つの「フレームワーク」領域を含む。フレームワーク領域およびCDRの広がりは規定されている。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内では比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち、構成軽鎖および重鎖の組み合わせたフレームワーク領域は、三次元空間においてCDRを位置決定し、整列させるように働く。
CDRは、主に抗原のエピトープへの結合を担う。各鎖のCDRは典型的には、N末端から順に番号付けされたCDR1、CDR2、およびCDR3といい、また典型的には、特定のCDRが位置する鎖によって同定される。従って、VHCDR3はそれが見出される抗体の重鎖の可変ドメインに位置し、他方、VLCDR1はそれが見出される抗体の軽鎖の可変ドメインからのCDR1である。
「VH」または「VH」への言及は、Fv、scFv、またはFabの重鎖を含めた、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域をいう。「VL」または「VL」への言及は、Fv、scFv、dsFvまたはFabの軽鎖を含めた免疫グロブリン軽鎖の可変領域をいう。
用語「単鎖Fv」または「scFv」とは、伝統的な2鎖抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインが1つの鎖を形成するように結合された抗体をいう。典型的には、リンカーペプチドは2つの鎖の間に挿入されて、適切な折畳みおよび活性な結合部位の創製を可能とする。
「キメラ抗体」は、（a）抗原結合部位（可変領域）が異なるまたは改変されたクラス、エフェクター機能、および/または種の定常領域、または新しい特性をキメラ抗体に付与する全く異なる分子、例えば、酵素、トキシン、ホルモン、成長因子、薬物等に連結するように、定常領域またはその部分が改変された、置換された、または交換された；または（b）可変領域またはその部分が、異なるまたは改変された抗原特異性を有する可変領域で改変された、置き換えられた、または交換された、免疫グロブリン分子である。
「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む免疫グロブリン分子である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補的決定領域（CDR）からの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のCDRからの残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体は、レシピエント抗体または取り入れられたCDRまたはフレームワーク配列に見出されない残基も含むことができる。一般に、ヒト化抗体は、CDR領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、かつフレームワーク（FR）領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれである少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも部分、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれを含むであろう（Jones et al.,Nature 321:522-525（1986）；Riechmann et al.,Nature 332:323-329（1988）；およびPresta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596（1992））。ヒト化は本質的には、Winterおよび共同研究者の方法（Jones et al.,Nature 321:522-525（1986）；Riechmann et al.,Nature 332:323-327（1988）；Verhoeyen et al.,Science 239:1534-1536（1988））に従って、ヒト抗体の対応する配列をげっ歯類のCDRまたはCDR配列に置き換えることによって行うことができる。従って、そのようなヒト化抗体は、実質的により少ない無傷ヒト可変ドメインが非ヒト種からの対応する配列によって置換されているキメラ抗体（米国特許第4,816,567号）である。
「エピトープ」または「抗原決定基」とは、それに抗体が結合する抗原上の部位をいう。エピトープは、連続アミノ酸またはタンパク質の三次折畳みにより並置された非連続アミノ酸の双方から形成することができる。連続アミノ酸から形成されたエピトープは典型的には、変性溶媒への暴露に際して保持され、他方、三次折畳みによって形成されたエピトープは典型的には、変性溶媒での処理に際して失われる。エピトープは典型的には、ユニークな空間的立体配座の少なくとも3、より普通には少なくとも5または8〜10アミノ酸を含む。エピトープの空間立体配座を測定する方法としては、例えばx線結晶学および二次元核磁気共鳴が挙げられる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66,Glenn E.Morris,Ed（1996）を参照されたい。
本明細書中で用いる「生物学的試料」は、例えば、Wntタンパク質、ポリヌクレオチドまたは転写物の核酸またはポリペプチドを含む生物学的組織または流体の試料である。そのような試料は、限定されるものではないが、霊長類、例えばヒトまたはげっ歯類、例えばマウスおよびラットから単離された組織を含む。生物学的試料はバイオプシーおよびオートプシー試料、組織学的目的で採取された凍結セクション、血液、血漿、血清、痰、糞、涙、粘液、毛髪、皮膚等のような組織のセクションを含むことができる。また、生物学的試料は患者組織に由来する外植体ならびに初代および/または形質転換細胞培養物も含む。生物学的試料は、典型的には、真核生物、最も好ましくは霊長類のような哺乳動物、例えばチンパンジーまたはヒト；ウシ；イヌ；ネコ；げっ歯類、例えばモルモット、ラット、マウス；ウサギ；または鳥類；爬虫類；または魚類から得られる。
「生物学的試料を提供する」は、本発明に記載される方法に用いられる生物学的試料を得ることを意味する。最も多くは、これは、動物から細胞試料を取り出すことによって行われるが、従前に単離された細胞（例えば、もう1つの個人によって、もう1つの時点においておよび/またはもう1つの目的で単離されたもの）を用いることによって、または本発明の方法をインビボで行うことによって達成することもできる。治療または結果履歴を有する保存組織は特に有用である。
複数の核酸またはポリペプチド配列の意味での用語「同一」またはパーセント「同一性」は、後記するデフォルトパラメーターでのBLASTまたはBLAST2.0配列比較アルゴリズムを用いて、または手動整列および視覚精査（例えば、NCBIウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/等参照）によって測定して、同じである、あるいは同じアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージ（すなわち、比較ウインドウまたは指定された領域にわたって最大対応性につき比較し、整列させた場合に、特定の領域にわたって約60％同一性、好ましくは70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれよりも高い同一性）を有する複数の配列またはサブ配列をいう。従って、そのような配列は「実質的に同一」であるといわれる。また、この定義はテスト配列の相補体もいい、あるいはそれに適用することができる。また、前記定義は、欠失および/または付加を有する配列、ならびに置換を有するもの、ならびに天然に生じる、例えば、多形または対立遺伝子変種、および人造変種も含む。後記するように、好ましいアルゴリズムはギャップなどを説明することができる。好ましくは、同一性は、長さが少なくとも約25アミノ酸またはヌクレオチドである領域、より好ましくは、長さが50〜100アミノ酸またはヌクレオチドである領域にわたって存在する。
配列比較には、典型的には、ある配列を、それに対してテスト配列が比較される参照配列として用いる。配列比較アルゴリズムを用いる場合、テストおよび参照配列はコンピューターに入力され、サブ配列座標が指定され、必要であれば、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。好ましくは、デフォルトプログラムパラメーターを用いることができ、あるいは別のパラメーターを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対するテスト配列についてのパーセント配列同一性を計算する。
本明細書中で用いるように「比較ウインドウ」は、典型的には、20〜600、通常約50〜約200、より普通には約100〜約150からなる群より選択される連続位置の数の1つのセグメントへの言及を含み、配列は、2つの配列を最適に整列させた後に連続位置の同一数の参照配列と比較することができる。比較用の配列の整列方法は当技術分野において周知である。比較用の配列の最適整列は、例えば、Smith & Waterman,Adv.Appl.Math.2:482（1981）の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch,J.Mol.Biol.48:443（1970）の相同性整列アルゴリズムによって、Pearson & Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444（1988）の類似性方法についてのサーチによって、これらのアルゴリズムのコンピューター化実行によって（GAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA、Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI）、または手動整列および視覚精査によって（例えば、Current Protocols in Molecular Biology（Ausubel et al.,eds.1995 supplement）参照）実行することができる。
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの好ましい例としてはBLASTおよびBLAST2.0アルゴリズムが挙げられ、これはAltschul et al.,Nuc.Acids Res.25:3389-3402（1977）およびAltschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410（1990）に記載されている。BLASTおよびBLAST2.0は、本明細書中に記載されたパラメーターにて、本発明の核酸およびタンパク質についてパーセント配列同一性を決定するために用いられる。BLAST分析を行うためのソフトウエアはNational Center for Biotechnology Information（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同一長のワードと整列させた場合に何らかの陽性値閾値スコアTにマッチし、またはそれを満足する、クエリ配列における長さWの短いワードを同定することによって、高スコアリング配列対（HSP）を同定することを含む。Tは隣接ワードスコア閾値をいう（Altschul et al.,supra）。これらの初期隣接ワードヒットは、サーチを開始させるためのシードとして作用して、それらを含有するより長いHSPを見出す。ワードヒットは、累積整列スコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向に拡大される。累積スコアは、例えば、ヌクレオチド配列については、パラメーターM（マッチする残基の対に対する報酬スコア；常に＞0）およびN（ミスマッチする残基についてのペナルティスコア；常に＜0）を用いて計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向でのワードヒットの拡大は、累積整列スコアがその最大達成値から量Xだけ降下すると停止され；累積スコアは、一つまたは複数の陰性スコアリング残基整列の累積のため0以下となり；またはいずれかの配列の末端に到達する。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXは整列の感度およびスピードを決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、ワード長（W）11、予測（E）10、M＝5、N＝-4および双方の鎖の比較をデフォルトとして用いる。アミノ酸配列に関しては、BLASTPプログラムは、ワード長3、および予測（E）10、およびBLOSUM62スコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915（1989）参照）整列（B）50、予測（E）10、M＝5、N＝-4、および双方の鎖の比較をデフォルトとして用いる。
BLASTアルゴリズムも2つの配列の間の類似性の統計学的分析を行う（例えば、Karlin & Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787（1993）参照）。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの尺度は最小合計確率（P（N））であり、これは、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のマッチが偶然起こる確率の指標を提供する。例えば、もし参照核酸に対するテスト核酸の比較における最小合計確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満であれば、核酸は参照配列に類似するとみなされる。log値は大きな負の数、例えば、5、10、20、30、40、40、70、90、110、150、170等でありうる。
2つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一である指標は、最初の核酸によってコードされたポリペプチドが、第2の核酸によってコードされたポリペプチドに対して作製された抗体と免疫学的に交差反応性であることであり、抗体は後記するように、第2の核酸によってコードされたポリペプチドに対して特異的である。従って、例えば、2つのペプチドが保存的置換だけ異なる場合、ポリペプチドは、典型的には、第2のポリペプチドに対して実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であるもう1つの指標は、2つの分子またはそれらの相補体が、後記するように、ストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズすることである。2つの核酸が実質的に同一であるさらにもう1つの指標は、同一プライマーを用いて、配列を増幅することができることである。
用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、典型的には、核酸の複合混合物においてその標的配列にプローブがハイブリダイズするが、他の配列に対してはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であって、異なる状況では異なるであろう。より長い配列はより高い温度において特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範なガイドはTijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes,「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」（1993）に見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度pHにおいて特異的配列についての融解温度（Tm）から約5〜10℃低くなるように選択される。Tmは、標的に相補的なプローブの50％が平衡において標的配列にハイブリダイズする（規定されたイオン強度、pH、および核濃度下での）温度である（標的配列は過剰に存在するので、Tmにおいては、プローブの50％が平衡で占められる）。また、ストリンジェント条件はホルムアミドのような脱安定化剤の添加で達成することもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションでは、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも約2倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍である。例示的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は以下のものでありうる。50％ホルムアミド、5×SSC、および1％SDS、42℃におけるインキュベーション、または5×SSC、1％SDS、65℃におけるインキュベーション、0.2×SSC、0.1％SDS、65℃におけるでの洗浄。
用語「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」とは、その天然状態で見出されるようにそれに通常伴う成分が実質的にまたは本質的にない物質をいう。純度および均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーのような分析化学技術を用いて測定される。調製物に存在する主要な種であるタンパク質または核酸は実質的に精製されている。特に、単離された核酸は、天然では遺伝子に近接し、その遺伝子によってコードされるタンパク質以外のタンパク質をコードするいくつかのオープンリーディングフレームから分離される。用語「精製された」は、いくつかの態様において、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に1つのバンドを生じることを示す。好ましくは、核酸またはタンパク質は少なくとも85％純粋、より好ましくは少なくとも95％純粋、最も好ましくは少なくとも99％純粋であることを意味する。「純度」または「精製」は、他の態様においては、精製すべき組成物からの少なくとも1つの汚染物の除去を意味する。この意味では、精製は、精製された化合物が均一、例えば、100％純粋であることを必要としない。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、ここでは、アミノ酸残基のポリマーをいうのに相互交換的に用いる。これら用語は、一つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に生じるアミノ酸の人工化学ミメティックであるアミノ酸ポリマーに適用され、ならびに天然に生じるアミノ酸ポリマー、修飾された残基を含有するもの、および天然に生じないアミノ酸ポリマーに適用される。
用語「アミノ酸」とは、天然に生じるおよび合成アミノ酸、ならびに天然に生じるアミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸ミメティックをいう。天然に生じるアミノ酸は遺伝暗号によってコードされるもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、およびO-ホスホセリンである。アミノ酸アナログとは、天然に生じるアミノ酸と同一の基本的化学的構造、例えば、水素、カルボキシル基、アミノ基、R基に結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムをいう。そのようなアナログは修飾されたR基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたヘプチド骨格を有することができるが、天然に生じるアミノ酸と同一の基本的化学的構造を保持することができる。アミノ酸ミメティックスとは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なるが、天然に生じるアミノ酸と同様に機能する化学化合物をいう。
アミノ酸とは、本明細書では、その通常に知られた三文字記号、またはIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionによって推奨される一文字記号いずれかによって示されることがある。同様に、ヌクレオチドはその通常に認められた一文字コードによって示されうる。
「保存的に修飾された変種」はアミノ酸および核酸配列双方に適用される。特定の核酸配列に関しては、保存的に修飾された変種は、同一または実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、実質的に同一または関連する、例えば、天然に連続する配列をいう。遺伝暗号の縮重のため、非常に多数の機能的に同一の核酸がほとんどのタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCGおよびGCUは全てアミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンによって特定される場合の各位置においては、コドンは、コードされたポリペプチドを改変することなく記載された対応するコドンの別のものに改変することがきる。そのような核酸変種は「サイレント変種」であり、これは、保存的に修飾された変種の1つの種である。本明細書中においては、ポリペプチドをコードする各核酸配列は核酸のサイレント変種も記載する。当業者であれば、ある意味においては、（通常はメチオニンに対する唯一のコドンであるAUG、および通常はトリプトファンに対する唯一のコドンであるTGGを除いて）核酸における各コドンは、機能的に同一の分子を生じるように修飾することができることが認識される。従って、ポリペプチドをコードする核酸のサイレントであることが多い変異は、発現産物に関しては記載された配列におけることは黙示的であるが、現実のプローブ配列に関してはそうではない。
アミノ酸配列に関しては、当業者であれば、コードされた配列において単一のアミノ酸、または小さなパーセンテージのアミノ酸を改変し、付加しまたは欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加は「保存的に修飾された変種」であり、前記改変は化学的に同様なアミノ酸でのアミノ酸の置換をもたらすことが認識される。機能的に同様なアミノ酸を提供する保存的置換の表は当技術分野において周知である。そのような保存的に修飾された変種は、加えて、本発明の多形変種、種間ホモログ、および対立遺伝子を排除しない。典型的には、もう1つのものに対する保存的置換:1）アラニン（A）、グリシン（G）；2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；4）アルギニン（R）、リシン（K）；5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）；7）セリン（S）、スレオニン（T）；および8）システイン（C）、メチオニン（M）（例えば、Creighton,Proteins（1984）参照）。
ポリペプチド構造のような高分子構造は、種々の組織化レベルに関して記載することができる。この組織化の一般的な議論については、例えば、Alberts et al.,Molecular Biology of the Cell（3rd ed.,1994）およびCantor & Schimmel,Biophysical Chemistry Part I:The Conformation of Biological Macromolecules（1980）参照。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「二次構造」とは、ポリペプチド内の局所的に秩序立った、三次元構造をいう。これらの構造は通常はドメインとして知られている。ドメインは、ポリペプチドのコンパクトなユニットを形成することが多い、典型的には、25〜約500アミノ酸長であるポリペプチドの部分である。典型的なドメインは（-シートおよび（-ヘリックスのストレッチのようなより低い組織化のセクションからなる。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造をいう。「四次構造」とは、通常は、独立した三次ユニットの非共有結合によって形成された三次元構造をいう。非等方性項目はエネルギー項目としても知られている。
「標識」または「検出可能部分」は、分光、光化学、生化学、免疫化学、化学または他の物理的手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識は蛍光色素、電子密度試薬、（例えば、ELISAで通常用いられるような）酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンおよびタンパク質、あるいは、例えば、放射性標識をペプチドに取り込むことによって検出可能とすることができるか、あるいはペプチドに特異的に反応性である抗体を検出するのに用いることができる存在物を含む。放射性同位体は、例えば、3H、14C、32P、35Sまたは125Iでありうる。いくつかの場合には、特に、本発明のタンパク質に対する抗体を用い、放射性同位体を後に述べるように毒性部分として用いる。標識は、いずれかの位置にて、核酸、タンパク質および抗体に取り込むことができる。標識に抗体をコンジュゲートするための当技術分野において知られたいずれの方法を用いることもでき、これは、Hunter et al.,Nature,144:945（1962）；David et al.,Biochemistry,13:1014（1974）；Pain et al,.J.Immunol.Meth.,40:219（1981）；およびNygren,J.Histochem. and Cytochem.,30:407（1982）によって記載された方法を含む。放射性標識ペプチドまたは放射性標識抗体の組成物の寿命は、放射性標識ペプチドまたは抗体を安定化し、それを分解から保護する物質の添加によって延長することができる。放射性標識ペプチドまたは抗体を安定化するいずれかの物質または物質の組合せを用いることができ、これは、米国特許第5,961,955号に開示された物質を含む。
「エフェクター」または「エフェクター部分」または「エフェクター構成要素」は、リンカーまたは化学結合を介して抗体に共有結合し（または連結し、またはコンジュゲートし）、あるいは、イオン結合、ファンデルワールス結合、静電結合、または水素結合を介して抗体に非共有結合した分子である。「エフェクター」は、例えば、放射性化合物、蛍光化合物、酵素または基質、エピトープタグのようなタグ、トキシンを含む検出部分；活性可能部分、化学療法剤；リパーゼ；抗生物質；または「硬い」、例えば、β放射線を放射する放射性同位体を含む種々の分子でありうる。
例えば、細胞、または核酸、タンパク質、もしくはベクターへの言及で用いる場合の用語「組換え体」は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸またはタンパク質の導入、または天然核酸またはタンパク質の改変によって修飾されていること、あるいは細胞がそのように修飾された細胞に由来されることを示す。従って、例えば、組換え体細胞は、細胞の天然（非組換え体）形態内で見出されない遺伝子を発現し、あるいは異常に発現され、発現下で、あるいは全く発現されない天然遺伝子を発現する。本明細書中において、用語「組換え体核酸」は、一般に、核酸の操作によって、例えば、天然に通常は見出されない形態で、ポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いて、インビトロで元来形成された核酸を意味する。このように、異なる配列の操作可能な結合が達成される。従って、線状形態の単離された核酸、あるいは通常は連結されないDNA分子を連結することによってインビトロで形成された発現ベクターは共に、本発明の目的では組換え体と考えられる。一旦組換え体核酸が作成され、宿主細胞または生物に導入されれば、それは、非組換え的に、すなわち、インビトロ操作ではなく宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて複製される；しかし、そのような核酸は、一旦組換えにより作成されれば、引き続いて非組換え的に複製されるが、本発明の目的では依然として組換え体と考えられる。同様に、「組換え体タンパク質」は、組み換え技術を用いて、すなわち、前記した組換え体核酸の発現を介して作成されたタンパク質である。
用語「異種」は、核酸の部分に言及して用いる場合、前記核酸が、天然で相互に対して同一の関係で通常見出されない複数のサブ配列を含むことを示す。例えば、新しい機能的核酸を作成するために配置された無関係遺伝子からの複数の配列、例えば、1つの源からのプロモータおよびもう1つの源からのコーディング領域を有する核酸が典型的には組換えにより生産される。同様に、異種タンパク質は、しばしば、天然では相互に対して同一の関係では見出されない複数のサブ配列（例えば、融合タンパク質）をいう。
抗体に「特異的に（または選択的に）結合する」、または「特異的に（または選択的に）免疫反応性である」とは、タンパク質またはペプチドをいう場合には、タンパク質および他の生物学的な異種集団においてタンパク質の存在を決定する結合反応をいう。従って、示された免疫アッセイ条件下では、特定の抗体は、バックグラウンドの少なくとも2倍の特定のタンパク質配列に結合し、より典型的には、バックグラウンドの10〜100倍を超えて結合する。本発明の抗体は、wnt/fzdシグナリング経路においてWntまたはフリズルドタンパク質または他のタンパク質に特異的に結合する。本明細書中においては、「特異的に結合する」とは、抗体が、少なくとも約0.1mM、より普通には少なくとも約1μM、好ましくは少なくとも約0.1μM以上、最も好ましくは0.01μM以上のKDにてタンパク質に結合することを意味する。
そのような条件下での抗体への特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性で選択された抗体を必要とする。例えば、特定のタンパク質、多形変種、対立遺伝子、オルソログ、およびその保存的に修飾された変種、またはスプライス変種、または部分に対して作製されたポリクローナル抗体を選択して、特異的Wntまたは特異的フリズルドタンパク質、またはwnt/fzdシグナリング経路における他のタンパク質に特異的に免疫反応性であるが、他のタンパク質に対してはそうではないポリクローナル抗体を得ることができる。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を差し引くことによって達成することができる。種々の免疫アッセイフォーマットを用いて、特定のタンパク質に特異的に免疫反応性である抗体を選択することができる。例えば、固相ELISA免疫アッセイをルーチン的に用いて、タンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択する（例えば、特異的免疫反応性を測定するのに用いることができる免疫アッセイフォーマットおよび条件の記載についてはHarlow & Lane,Antibodies,A Laboratory Manual（1988）参照）。
「腫瘍細胞」とは、腫瘍における前癌性、癌性、および正常細胞をいう。
組織培養における「癌細胞」、「形質転換」細胞または「トランスフォーメーション」とは、新しい遺伝物質の摂取を必ずしも含まない自然発生的または誘導された表現型の変化をいう。トランスフォーメーションは形質転換ウイルスでの感染、および新しいゲノムDNAの取込み、または外因性DNAの摂取から生じうるが、それは自然発生的に、または発癌物質への暴露に続いて生じることもあり、それにより、内因性遺伝子を突然変異させる。本発明においては、トランスフォーメーションは、典型的には、Wntおよび/またはフリズルドタンパク質の過剰発現に関係する。トランスフォーメーションは細胞の不死化、異常な増殖制御、非形態学的変化および/または悪性化のような他の表現型変化に関連する（Freshney,Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique（3rd ed.1994）参照）。
図面の詳細な説明
図1
発生シグナリング経路の模式図を示す。Wnt/ウイングレスおよびHedgehog/ソニック・ヘッジホッグのシグナリング経路を示す。リガンドの双方の組は細胞表面受容体と相互作用する。シグナリング経路に関与するタンパク質、例えば、LEF1およびGSK3を示す。
図2
フリズルド2mRNAについてのHNSCCおよびB細胞系のサブセットのRT-PCR分析
全RNAはHNSCC系（PCI13、Detroit 562、RPMI 2650、SNU1076、KB、AMC4）、CLL系（Lesch）、バーキットリンパ腫系（Ramos）、神経膠細胞腫系（U87MG、およびU373MG）、正常ヒト気管支上皮細胞系（Clonetics,San Diego,CA）および正常口腔扁平上皮（OSE）細胞からRNAzol（Gibco BRL,Grand Island,NY）を用いて抽出した。逆転写は、各試料からの1μgのRNAおよびSuperscript（商標）Preamplificationキット（Gibco BRL）を用いて行った。フリズルド2は25サイクルのPCRで増幅した。G3PDH mRNAは各試料につき別々の反応で増幅した。
図3
フリズルド2、wnt5Aおよび10bについての腫瘍および正常細胞の試料ウェスタンブロット分析
培養中の接着性細胞を回収し、25mMトリスHCl、150mM KCl、5mM EDTA、1％NP-40、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム、1mM NaVO3、1mM NaF、20mM β-グリセロホスフェートおよびプロテアーゼ阻害剤を含有する溶液で溶解した。各細胞系からの20μgのタンパク質をSDS-PAGEによって分離し、PVDF膜に移した。前記膜をPBS中の2％I-block、0.05％Tween Xに浸漬し、次いで、ポリクローナルヤギ抗ヒトWnt1、Wnt10b、またはフリズルド2IgG（Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA）の1:500希釈と共にインキュベートした。次いで、これらの一次抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ-コンジュゲーテッドロバ抗ヤギIgG（Santa Cruz）およびケミルミネッセンス（ECL検出試薬、Amersham Life Science,Aylesbury,UK）によって検出した。各レーンに移されたタンパク質の相対的な量を確認するために、アクチンの存在をアクチンモノクローナル抗体（Chemi-Con International Inc,Temecula,CA）で測定した。
図4A、4Bおよび4C
HNSCC系における増幅の阻害
簡単に述べれば、ウェル当たり7.5×103または10×103 SNU1076細胞いずれかを96ウェルプレートに蒔いた。24時間後に、段階的量のポリクローナルヤギ抗ヒトフリズルド2、Wnt1、またはWnt10b IgG（sAB）（Santa Cruz' Biotechnology,Santa Cruz,CA）、または対照ヤギ抗ヒトIgG（cAB）（Fisher Scientific,Pittsburgh,PA）を加えた。1、2、3または4日に、20μlのMTT（3-［4,5-ジメチルチアゾール-2-イル］-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）ベースの溶液を、15％SDS、0.015M HClでの溶解に先立って4時間ウェルに加えた。570および650nmの吸光度を測定した。
図5
HNSCC系におけるWnt/フリズルドシグナリング経路の阻害のアポトーシス効果
10％FBSを補足したRPMI-1640中で増殖するHNSCC系SNU1076を、300ng/mlの抗フリズルド2、Wnt-1、Wnt-10b、または対照非特異的ポリクローナル抗体で72時間処理した。これらの抗体の細胞傷害性効果を、生存染料保持およびDNA含有量によって評価した。パネルA:細胞をトリプシン処理によってフラスコから剥がし、5μg/mlのヨウ化プロピジウム（PI）および40nMのDiOC6と共に増殖培地中で10分間インキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。生きた細胞（縞）は高いDiOC6（FL-1）および低いPI（FL-3）蛍光を有し、アポトーシス細胞（点）は低いDiOC6（FL-1）および低いPI（FL-3）蛍光を有した。パネルB:細胞をトリプシン処理によってフラスコから剥がし、50μg/mlのPIおよび100μg/mlのRNaseを含有する低張緩衝液（0.1％クエン酸塩、0.1％SDS）中で一晩インキュベートした。次いで、フローサイトメトリーによってDNAの量を測定し、アポトーシス細胞は、G0G1レベルよりも低いDNA含有量を有するものと定義された（サブ-G0細胞）。
図6
ヒトフリズルド受容体の第一の細胞外領域の一部の配列整列
具体的には、HFZ1〜BTZ10のアミノ酸配列を整列させて、類似性を示す。
図7Aおよび7B
図7A:Wnt1またはWnt10b抗体での処理後における免疫ブロット。SNU1076細胞を2μg/mlの抗Wnt1、Wnt10b、または対照抗体で72時間処理した。20μgの各細胞系からのタンパク質をSDS-PAGEによって分離し、PVDF膜に移した。膜をPBS中の2％I-block、0.05％ Tween Xに浸漬し、次いで、モノクローナル抗ヒトβ-カテニン、サイクリンD1、またはフィブロネクチンIgGと共にインキュベートした。次いで、これらの一次抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ-コンジュゲーテッド抗IgGおよびケミルミネッセンスによって検出した。各レーンにおけるタンパク質の相対的な量を確認および比較するために、PVDF膜をRe-Blot（商標）ウェスタンブロットリサイクリングキットで剥がし、他の抗体またはアクチンモノクローナル抗体につき再度プローブした。図7B:Wnt1抗体での処理はTCF/LEF遺伝子の転写を低下させる。SNU1076細胞を2μg/mlの抗Wnt-1、または対照抗体で36時間処理した。SNU1076細胞を0.5μg/mlのpTOPFLASH-LucまたはpFOPFLASH-Lucおよび0.5μg/mlのpCMV-βGalと共に共トランスフェクトした。細胞をトランスフェクションから24時間後に回収し、溶解緩衝液中で溶解させた。ルシフェラーゼおよびβ-ガラクトシダーゼの活性を、Dual-Light（商標）レポーター遺伝子アッセイシステムを用いて測定した。pTOPFLASH-LucまたはpFOPFLASH-Lucの各々のルシフェラーゼ活性およびpCMV-βGalのβ-ガラクトシダーゼ活性をルミノメーターによって同一試料中で測定した。各試料のトランスフェクション効率を、β-ガラクトシダーゼ活性によって標準化した。
図8Aおよび8B
図8A:癌細胞系におけるWnt/FZDファミリーについてのRT-PCR増幅。レーン1:DNA標準、レーン2:H2O、レーン3および4:神経膠芽腫、レーン5〜14:頭部および頸部癌、レーン15および16:B細胞癌。図8B:正常細胞におけるWnt/FZDファミリーについてのRT-PCR増幅。レーン1:DNA標準、レーン2:H2O、レーン7および14:正常ヒト気管支上皮細胞、他のレーン:正常口腔扁平細胞。
図9Aおよび9B
正常および悪性細胞におけるFZD2、Wnt1、Wnt10b、β-カテニンおよびアクチンのタンパク質発現
正常口腔扁平上皮（OSE）、正常ヒト気管気管支上皮細胞（NHBE）、HNSCC系、および他の固形およびB細胞腫瘍系を溶解させ、SDS-pageによって分離し、PDVF膜にブロットし、順次、示された抗体でプローブした。
図10
SNU1076細胞系の増殖の阻害
ウェル当たり7.5×103 SNU1076細胞を96ウェルプレート中に蒔いた。24時間後、段階量のポリクローナルヤギ抗ヒトWnt1、Wnt10b、または対照ヤギ抗ヒトIgGを加えた。1、2、3または4日に、20μlのMTT溶液を、15％SDS、0.015M HClでの溶解に先立って4時間ウェルに加えた。570および650nmの吸光度を測定した。データは、少なくとも4回の独立した実験の平均±SDとして表す。
図11
可溶性WNTアンタゴニスト、分泌されたフリズルド関連タンパク質（SFRP）での増殖阻害
2つのHNSCC系の細胞生存率を、2μg/mlの組換え体ヒトSFRP1の添加から72時間後にMTTアッセイで測定した。データを2回の独立した実験の平均±SDとして表す。
図12
HNSCC系におけるWnt/フリズルドシグナリング経路の阻害のアポトーシス効果
SNU1076を2μg/mlの抗Wnt1、Wnt10b、または対照抗体で72時間処理した。これらの抗体の細胞傷害性効果を、生存染料保持およびDNA含有量によって評価した。細胞をトリプシン処理によってフラスコから剥がし、5μg/mlのヨウ化プロピジウム（PI）および40nM DiOC6を含む増殖培地中で10分間インキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。生細胞は高いDiOC6（FL-1）および低いPI（FL-3）蛍光を有し、アポトーシス細胞は低いDiOC6（FL-1）および低いPI（FL-3）蛍光を有した。
図13Aおよび13B
wnt、fzd、およびwnt関連遺伝子分析のためのプライマー配列
図13Aは、wntおよびfzd核酸発現の分析で用いるプライマーおよびプローブを示す。図13Bは、Frp、WISP、DKK、および他のwnt/fzd誘導性遺伝子または対照の発現の分析で用いるプライマーおよびプローブを示す。wnt fzdおよびwnt関連遺伝子のレベルは、示したプライマーおよびプローブを用いてリアルタイムPCRで測定した。
図14
非腫瘍および腫瘍組織におけるwntの発現
wnt16、wnt1、wnt3、wnt7b、wnt8a、およびwnt10bのレベルを肺、結腸、腎臓、脳、副腎、甲状腺、胎盤、脾臓、胸腺、肝臓、心臓、骨髄、および末梢血液リンパ球からの正常細胞において測定した。また、wnt16、wnt1、wnt3、wnt7b、wnt8a、およびwnt10bのレベルを一次CLL細胞において、および乳癌腫瘍において測定した。図面中のデータは相対的なものであって、最低の正常組織レベルに1の値を割り当てた。従って、乳癌またはCLLにおける100の相対的な値は、癌細胞が、リアルタイムPCRによって報告して、最低正常組織の値の100倍を有したことを意味する。
図15
正常および非腫瘍組織におけるwnt14の発現
wnt14のレベルを、肺、結腸、腎臓、脳、副腎、甲状腺、胎盤、脾臓、胸腺、肝臓、心臓、骨髄、および末梢血液リンパ球からの正常細胞において測定した。また、wnt14のレベルを一次CLL細胞において、および乳癌腫瘍においても測定した。データを図14と同様に分析した。
図16
非腫瘍および腫瘍組織におけるfzdの発現
fzd1、fzd2、fzd3、fzd4、fzd5、fzd6、fzd7、fzd8、fzd9、およびfzd10のレベルを肺、結腸、腎臓、脳、副腎、甲状腺、胎盤、脾臓、胸腺、肝臓、心臓、骨髄、および末梢血液リンパ球からの正常細胞において測定した。また、fzd1、fzd2、fzd3、fzd4、fzd5、fzd6、fzd7、fzd8、fzd9、およびfzd10のレベルを一次CLL細胞において、および乳癌腫瘍においても測定した。データを図14と同様に分析した。
図17
非腫瘍および腫瘍組織におけるfzd3の発現
fzd3のレベルを肺、結腸、腎臓、脳、副腎、甲状腺、胎盤、脾臓、胸腺、肝臓、心臓、骨髄、および末梢血液リンパ球からの正常細胞において測定した。また、fzd3のレベルを一次CLL細胞において、および乳癌腫瘍においても測定した。データを図14と同様に分析した。
図18
非腫瘍および腫瘍組織におけるfzd6の発現
fzd6のレベルを肺、結腸、腎臓、脳、副腎、甲状腺、胎盤、脾臓、胸腺、肝臓、心臓、骨髄、および末梢血液リンパ球からの正常細胞において測定した。また、fzd6のレベルを一次CLL細胞において、および乳癌腫瘍においても測定した。データを図14と同様に分析した。
図19
非腫瘍および腫瘍組織におけるfzd10の発現
fzd10のレベルを肺、結腸、腎臓、脳、副腎、甲状腺、胎盤、脾臓、胸腺、肝臓、心臓、骨髄、および末梢血液リンパ球からの正常細胞において測定した。また、fzd10のレベルを一次CLL細胞において、および乳癌腫瘍においても測定した。データを図14と同様に分析した。
図20
非腫瘍および腫瘍組織におけるDKKの発現
DKK-1、DKK-2、DKK-3、およびDKK-4のレベルを肺、結腸、腎臓、脳、副腎、甲状腺、胎盤、脾臓、胸腺、肝臓、心臓、骨髄、および末梢血液リンパ球からの正常細胞において測定した。また、DKK-1、DKK-2、DKK-3、およびDKK-4のレベルを一次CLL細胞において、および乳癌腫瘍においても測定した。データを図14と同様に分析した。
図21
非腫瘍および腫瘍組織におけるFRP2/4の発現
FRP-2およびFRP4のレベルを肺、結腸、腎臓、脳、副腎、甲状腺、胎盤、脾臓、胸腺、肝臓、心臓、骨髄、および末梢血液リンパ球からの正常細胞において測定した。また、FRP-2およびFRP-4のレベルを一次CLL細胞において、および乳癌腫瘍においても測定した。データを図14と同様に分析した。
図22
非腫瘍および腫瘍組織におけるWISP3の発現
WISP3のレベルを肺、結腸、腎臓、脳、副腎、甲状腺、胎盤、脾臓、胸腺、肝臓、心臓、骨髄、および末梢血液リンパ球からの正常細胞において測定した。また、WISP3のレベルを一次CLL細胞において、および乳癌腫瘍においても測定した。データを図14と同様に分析した。
図23
非腫瘍および腫瘍組織におけるサイクリンD1の発現
サイクリンD1のレベルを肺、結腸、腎臓、脳、副腎、甲状腺、胎盤、脾臓、胸腺、肝臓、心臓、骨髄、および末梢血液リンパ球からの正常細胞において測定した。また、サイクリンD1のレベルを一次CLL細胞において、および乳癌腫瘍においても測定した。データを図14と同様に分析した。
図24
非腫瘍および腫瘍組織におけるc-mycの発現
c-mycのレベルを肺、結腸、腎臓、脳、副腎、甲状腺、胎盤、脾臓、胸腺、肝臓、心臓、骨髄、および末梢血液リンパ球からの正常細胞において測定した。また、c-mycのレベルを一次CLL細胞において、および乳癌腫瘍においても測定した。データを図14と同様に分析した。
図25
非腫瘍および腫瘍組織におけるIL-6の発現
IL-6のレベルを肺、結腸、腎臓、脳、副腎、甲状腺、胎盤、脾臓、胸腺、肝臓、心臓、骨髄、および末梢血液リンパ球からの正常細胞において測定した。また、IL-6のレベルを一次CLL細胞において、および乳癌腫瘍においても測定した。データを図14と同様に分析した。
図26
非腫瘍および腫瘍組織におけるMMP3の発現
MMP3のレベルを肺、結腸、腎臓、脳、副腎、甲状腺、胎盤、脾臓、胸腺、肝臓、心臓、骨髄、および末梢血液リンパ球からの正常細胞において測定した。また、MMP3のレベルを一次CLL細胞において、および乳癌腫瘍においても測定した。データを図14と同様に分析した。
図27
非腫瘍細胞および乳癌細胞におけるwnt、fzd、およびwnt関連遺伝子の発現
wnt、fzd、およびwnt関連遺伝子のレベルを正常細胞および乳癌細胞において測定した。結果を誘導倍率として表す。データを図14と同様に分析した。
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的には、特定のWntおよびフリズルドタンパク質が異なる癌に関連するという発見に基づいている。Wntタンパク質は、癌において高レベルの発現を有することが多いことが知られている。しかしながら、特定のWntおよびフリズルドタンパク質の発現についてはほとんど知られていない。本開示は、Wntおよびフリズルドタンパク質の発現を評価する方法を提供する。また、Wntタンパク質を過剰発現する癌を治療するのに有用な薬剤も開示する。本発明は、Wnt‐Fzdシグナリングが癌細胞の増殖または生存に影響する；あるいは特異的wnt遺伝子産物および/または特異的fzd遺伝子産物が過剰発現されるいずれの癌においても有用である。本発明は頭部および頸部癌、神経膠芽細胞種、慢性リンパ性白血病、乳癌、マントルゾーンリンパ腫、バーキットリンパ腫、および他のリンパ腫悪性疾患のような癌を治療するのに有用である。
出願人らは、選択された系におけるwntおよび/またはfzd発現レベルを評価するのに有用な新規なプライマーを提供する。幾つかの態様において、wntおよび/またはfzdレベルは、一次癌細胞に、例えば、固形腫瘍に、または造血系癌に由来する細胞系で測定される。他の態様においては、wntおよび/またはfzdレベルは一次組織、例えば、固形腫瘍または造血系癌細胞で測定される。正常な組織からの、または非形質転換細胞系からの細胞を対照として用いる。wntおよび/またはfzd過剰発現は、特異的wntまたはfzdタンパク質に対する抗体を用いることによって測定して、発現レベルを測定することができる。
癌細胞における特異的wntまたはfzd遺伝子産物の過剰発現は、とりわけ、2つの異なる比較に基づくことができる。まず、特異的wntおよび/またはfzd遺伝子産物は、同一組織型からの非癌性細胞における特異的wntおよび/またはfzd遺伝子産物のレベルに対して癌細胞で過剰発現されうる。または、特異的wntおよび/またはfzd遺伝子産物は、同一癌細胞における異なる特異的wnt遺伝子産物のレベルに対して癌細胞で過剰発現されうる。いくつかの態様において、特異的wntおよび/またはfzdタンパク質は、同一組織型からの非癌性細胞における特異的wntおよび/またはfzd遺伝子産物に対して、および同一癌細胞における異なる特異的wnt遺伝子産物のレベルに対して癌細胞で過剰発現される。
wntおよび/またはfzd過剰発現の結果、癌細胞についての少なくとも2つの異なる結果がもたらされうる。いくつかの態様においては、特異的wntおよび/またはfzd遺伝子産物の発現は癌細胞の生存に必要がなく、むしろ、癌細胞のマーカーとして働くことができる。他の態様においては、特異的wntおよび/またはfzdの発現は癌細胞の増殖もしくは生存に、またはそのアポトーシスの阻害に必要である（例えば、特異的抗体またはwntアンタゴニストとのwnt/fzd結合またはwnt/fzdシグナリングのブロッキングの結果、細胞増殖が減少し、またはアポトーシスが誘導される）。理論に拘束されるつもりはないが、特異的wntおよび/またはfzd遺伝子産物の発現はシグナル伝達経路の活性化、および下流wntおよび/またはfzd誘導性遺伝子の調節を導くことができる。いくつかの態様においては、シグナル伝達経路の活性化ならびに下流遺伝子および遺伝子産物の誘導は、癌細胞の増殖もしくは生存、またはそのアポトーシスの阻害に必要である。例えば、乳癌細胞では、特異的wntおよび/またはfzdタンパク質の発現は、サイクリンD1、c-mycおよびWISPファミリー遺伝子を含む必要な遺伝子を誘導するようである。一部の細胞においては、wnt発現はTCF/LEF転写因子を活性化して特異的遺伝子の誘導に導くようである。他の態様においては、シグナル伝達経路の活性化、および下流遺伝子および遺伝子産物の誘導は、癌細胞の増殖または生存、あるいはそのアポトーシスの阻害に必要ではない。
少なくとも2つの療法がwntおよび/またはfzd過剰発現の検出に基づきうる。細胞の増殖、生存またはアポトーシスの阻害に必要なwntおよび/またはfzd遺伝子産物では、wnt/fzd相互作用のようなwnt/fzdシグナリング経路を阻害する特異的抗体、または特異的アンタゴニストを用いて細胞を殺傷し、またはアポトーシスを誘導することができる。過剰発現されるが、細胞の生存に必要ではないwntおよび/またはfzd遺伝子産物では、wntおよびまたはfzd特異的抗体を放射性標識し、またはトキシンにコンジュゲートできるか、あるいはそれを用いて補体カスケードを誘導することができる。過剰発現されたwntおよび/またはfzd遺伝子産物は、マーカーとして作用して、抗体を癌細胞へとガイドする。特異的放射性標識またはトキシン-コンジュゲーテッド抗体、または補体カスケードの誘導を用いて、細胞増殖に必要な特異的wntおよび/またはfzdを過剰発現する癌細胞の殺傷を助けることもできる。
wntおよび/またはfzd発現は、wnt/fzd誘導遺伝子の発現（例えば、下流wnt/fzd調節遺伝子産物）に関係付けることができる。例えば、乳癌細胞においては、特異的wntおよびfzdタンパク質の発現は、サイクリンD1、c-myc、およびWISPファミリー遺伝子を含む必要な遺伝子を誘導するようである。リンパ球細胞においては、wntの発現は、TCF/LEF転写因子を活性化して、特異的遺伝子を誘導するようである。従って、異なる癌は異なるwntおよびfzd遺伝子産物、ならびに異なる下流wnt/fzd調節遺伝子産物を過剰発現しうる。特異的wntおよび/またはfzd遺伝子の発現と特異的下流遺伝子との相関は、過剰発現されたwntおよび/またはfzd遺伝子産物が活性である指標である。従って、wnt/fzd下流遺伝子産物の誘導された発現とカップリングされたWnt過剰発現を検出するアッセイは、wnt/fzdシグナリングをブロックする薬剤での処理が適切であるという証拠を提供する。
Wntおよびフリズルドタンパク質に対する抗体
以上に述べたように、本発明は、癌細胞においてWntシグナリングを含むwnt/fzd経路を阻害する方法を提供する。本発明のいくつかの態様において、抗体を用いて、Wntリガンドおよびフリズルド受容体の間の結合をブロックし、あるいはそうでなければ、wnt/fzdシグナリング経路における工程をブロックする。また、抗体を用いて、標的抗原を発現する標的細胞に対して補体カスケードを誘導することができるか、あるいは抗体は、放射性標識、またはトキシンとコンジュゲートすることができる。これは、特に抗原が標的癌細胞上に過剰発現されたフリズルド受容体である場合に特に有用である。抗体は、Wntまたはフリズルドタンパク質のいずれか、あるいはいくつかの態様においてはwnt/fzd経路における他のタンパク質に対して作製することができる。あるいは、抗体は、細胞表面のWnt/フリズルド複合体に対して作製することができる。そのような抗体は、標的Wntおよびフリズルドタンパク質が結合した細胞のみと結合することによってより高い特異性を提供し、また、修飾することなく用いることができ、あるいは放射性標識またはトキシンとコンジュゲートすることができる。
ポリクローナル抗体を調製する方法は当業者に知られている。（例えば、Coligan,supra；およびHarlow & Lane,supra）。ポリクローナル抗体は、例えば、免疫化剤および所望によりアジュバントの一つまたは複数の注射によって哺乳動物で作製することができる。典型的には、免疫化剤および/またはアジュバントは、複数の皮下または腹腔内注射によって哺乳動物に注射される。免疫化剤は図面の核酸によってコードされるタンパク質、またはその断片、またはその融合タンパク質を含むことができる。免疫化すべき哺乳動物において免疫原性であることが知られているタンパク質に免疫化剤をコンジュゲートすることが有用であろう。そのような免疫原性タンパク質の例は、限定されるものではないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、および大豆トリプシン阻害剤を含む。使用することができるアジュバントの例としては、フロイントの完全アジュバントおよびMPL-TDMアジュバント（モノホスホリルリピドA、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。免疫化プロトコルは過度な実験なしで当業者が選択することができる。
抗体はあるいは、モノクローナル抗体でありうる。モノクローナル抗体はKohler & Milstein,Nature 256:495（1975）によって記載されたようなハイブリドーマ法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法においては、マウス、ハムスター、または他の適当な宿主動物を、典型的には、免疫化剤で免疫化して、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生産する、または生産することができるリンパ球を誘導する。または、リンパ球はインビトロで免疫化することができる。一般に、もしヒト起源の細胞が所望であれば、末梢血液リンパ球（「PBL」）が用いられ、あるいはもし非ヒト哺乳動物源が望まれれば、脾臓細胞またはリンパ節細胞が用いられる。次いで、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化細胞系と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103（1986））。不死化細胞系は通常は、形質転換された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウス骨髄腫細胞系が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の増殖または生存を阻害する一つまたは複数の物質を含有する適当な培養基中で培養することができる。例えば、もし親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRTまたはHPRT）を欠くならば、ハイブリドーマに対する培養基は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含み（「HAT培地」）、その物質はHGPRT欠損細胞の増殖を妨げる。
いくつかの態様においては、モノクローナル抗体を用いる。もう1つの抗体と同一のエピトープを認識する特定の抗体の能力は、典型的には、抗原への第二の抗体の結合を競合的に阻害する1つの抗体の能力によって決定される。多数の競合結合アッセイのいずれかを用いて、同一抗原に対する2つの抗体の間の競合を測定することができる。例えば、この目的ではサンドイッチELISAアッセイを用いることができる。これは、ウェルの表面を被覆する捕獲抗体を用いることによって行われる。次いで、飽和以下の濃度のタグ付抗原を捕獲表面に加える。このタンパク質は、特異的抗体:エピトープ相互作用を介して抗体に結合する。第二の洗浄後、検出可能部分（例えばHRP、標識された抗体は検出抗体と定義される）に共有結合した第二の抗体をELISAに加える。もしこの抗体が捕獲抗体と同一のエピトープを認識するならば、それは標的タンパク質に結合できないであろう。というのは、その特定のエピトープはもはや結合で利用できないからである。しかしながら、もしこの第二の抗体が標的タンパク質上の異なるエピトープを認識するならば、それは結合することができ、この結合は、関連基質を用いて活性（よって、結合した抗体）のレベルを定量することによって検出することができる。バックグラウンドは捕獲および検出抗体双方として単一の抗体を用いることによって規定され、他方、最大シグナルは、抗原特異的抗体で捕獲し、抗原上のタグに対する抗体で検出することによって確立することができる。バックグラウンドおよび参照としての最大シグナルを用いることによって、抗体を対様式で評価して、エピトープの特異性を決定することができる。
前記アッセイのいずれかを用いて、第一の抗体の存在下で、抗原に対する第二の抗体の結合が、少なくとも30％、通常少なくとも約40％、50％、60％または75％、多くの場合少なくとも約90％低下する場合に、第一の抗体が第二の抗体の結合を競合的に阻害するとみなされる。
いくつかの態様において、Wntまたはフリズルドタンパク質に対する抗体はキメラまたはヒト化抗体である。前記のように、抗体のヒト化形態はキメラ免疫グロブリンであり、ヒト抗体の相補的決定領域（CDR）中の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種のCDR中の残基によって置き換えられている。
ヒト抗体はファージディスプレイライブラリーを含む当技術分野において公知の種々の技術を用いて生産することができる（Hoogenboom & Winter,J.Mol.Biol.227:381（1991）；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581（1991））。Cole et al.およびBoerner et al.,の技術もまたヒトモノクローナル抗体の調製で利用できる（Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,p.77（1985）およびBoerner et al.,J.Immunol.147（1）:86-95（1991））。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、トランスジェニック動物、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活化されているマウスに導入することによって作成することができる。チャレンジに際して、遺伝子再編成、組立、および抗体レパートリーを含む全ての点においてヒトで観察されるものに酷似するヒト抗体生産が観察される。このアプローチは、例えば、米国特許第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号、および以下の科学刊行物:Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783（1992）；Lonberg et al.,Nature 368:856-859（1994）；Morrison,Nature 368:812-13（1994）；Fishwild et al.,Nature Biotechnology 14:845-51（1996）；Neuberger,Nature Biotechnology 14:826（1996）；Lonberg & Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93（1995）に記載されている。
いくつかの態様においては、抗体は単鎖Fv（scFv）である。scFv抗体のVHおよびVL領域は単鎖を含み、これは折り畳まれて、2鎖抗体で見出されるのと同様な抗原結合部位を作り出す。一旦折り畳まれると、非共有結合相互作用が単鎖抗体を安定化させる。いくつかの抗体態様のVHおよびVL領域は直接結合することができるが、当業者であれば、前記領域は一つまたは複数のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって隔てられうることを認識するであろう。ペプチドリンカーおよびそれらの使用は当技術分野において周知である。例えば、Huston et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 8:5879（1988）；Bird et al.,Science 242:4236（1988）；Glockshuber et al.,Biochemistry 29:1362（1990）；米国特許第4,946,778号、米国特許第5,132,405号およびStemmer et al.,Biotechniques 14:256-265（1993）参照。一般には、ペプチドリンカーは、前記領域に結合するか、またはVHおよびVLの間のいくつかの最小距離または他の空間的関係を保持する以外の特異的生物学的活性は有さない。しかしながら、ペプチドリンカーの構成アミノ酸は、折畳み、正味の電荷、または疎水性のような、分子の何らかの特性に影響するように選択することができる。単鎖Fv（scFv）抗体は、任意に、長さが50アミノ酸以下、一般には40アミノ酸以下、好ましくは30アミノ酸以下、より好ましくは20アミノ酸以下のペプチドリンカーを含む。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、配列Gly-Gly-Gly-Gly-Serのコンカテマー、好ましくは2、3、4、5または6のそのような配列でありうる。しかしながら、リンカー内のいくつかのアミノ酸を置換することができることは認識されるべきである。例えば、グリシンをバリンに置き換えることができる。
scFv抗体を作成する方法は報告されている。Huse et al.,supra；Ward et al.,supra；およびVaughan et al.,supraを参照されたい。簡単に述べれば、免疫化動物のB細胞からmRNAを単離し、cDNAを調製する。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域に対して特異的なプライマーを用いてcDNAを増幅する。PCR産物を精製し、核酸配列を結合させる。もしリンカーペプチドが望まれれば、ペプチドをコードする核酸配列を重鎖および軽鎖核酸配列の間に挿入する。scFvをコードする核酸をベクターに挿入し、適当な宿主細胞で発現させる。所望の抗原に特異的に結合するscFvは、典型的には、ファージディスプレイライブラリーのパニングによって見出される。パニングはいくつかの方法のうちいずれかによって行うことができる。パニングは、表面に所望の抗原を発現する細胞を用い、あるいは所望の抗原で被覆された固体表面を用いて簡便に行うことができる。簡便には、表面は磁性ビーズでありうる。未結合ファージを固体表面から洗い落とし、結合ファージを溶出させる。
選択されたパニングの方法にかかわらず、ファージディスプレイによって提供された遺伝子型および表現型の間の物理的リンクは、クローンの大きなライブラリーであっても、抗原に対する結合につきcDNAライブラリーの各メンバーをテストすることが可能である。
いくつかの態様においては、抗体は二特異的抗体である。二特異的抗体はモノクローナルの、好ましくはヒトまたはヒト化抗体であり、これは、少なくとも2つの抗原に対する結合特異性を有し、あるいは同一抗原上の2つのエピトープに対する結合特異性を有する。1つの態様において、結合特異性の1つは、Wntまたはフリズルドタンパク質に対するものであり、他の1つは別の癌抗原に対するものである。または、テトラマータイプの技術により多価試薬を作り出すことができる。
前記のように、いくつかの態様においては、抗体は補体を固定することができる。または、抗体はエフェクター部分にコンジュゲートする。エフェクター部分は、放射性標識または蛍光標識のような標識部位を含む任意の数の分子とすることができ、あるいは治療部分とすることができる。もしエフェクター部分が治療部分であれば、それは典型的には細胞傷害性剤である。本方法においては、癌細胞に対して細胞傷害性剤を標的化すると、標的細胞の直接的殺傷がもたらされる。この態様は、好ましくは、フリズルド受容体に対する抗体を用いて行われる。細胞傷害性剤は多数あり、変化し、限定されるものではないが、細胞傷害性薬物またはトキシン、あるいはそのようなトキシンの活性な断片を含む。適当なトキシンおよびそれらの対応する断片は、ジフテリアA鎖、エキソトキシンA鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシン、オーリスタチンなどを含む。細胞傷害性剤はWntまたはフリズルドタンパク質に対して作製された抗体に放射性同位体をコンジュゲートさせるか、あるいは抗体に共有結合されたキレート化剤に放射性核種を結合させることによって作成された放射性化学物質も含む。
特定のWnt/Fzdタンパク質の同定
前記のように、本発明は、いずれのWntおよび/またはフリズルドタンパク質が特定の癌細胞によって過剰発現されるかを決定する手段を提供する。好ましい態様において、特定の癌細胞で発現された各Wntまたはフリズルドタンパク質の発現を、同一細胞型の非癌細胞における対応する発現と比較する。同一型の非癌細胞におけるものと比較して癌細胞で過剰発現されるWntまたはフリズルドタンパク質を、標的として選択する。加えて、細胞の増殖または生存を担う可能性が最も高いタンパク質を同定するために、癌細胞によって発現されたWntまたはフリズルドタンパク質も比較する。正常細胞と比較して過剰発現されるタンパク質および癌細胞における他のWntまたはフリズルドタンパク質と比較して過剰発現されるタンパク質を標的として選択する。
遺伝子発現またはタンパク質活性を検出し測定する手段は、当技術分野において周知である。そのような方法は、遺伝子転写物（例えばmRNA）の検出、翻訳されたタンパク質量の測定、または遺伝子産物の活性の測定を含む。もう1つの好ましい態様においては、転写物（例えばmRNA）は、DNAのコピー数を直接的に評価するための前記した増幅（例えばPCR）ベースの方法を用いて測定することができる。好ましい態様においては、転写物のレベルは逆転写PCR（RT-PCR）によって評価される。所望のWntまたはフリズルドタンパク質の増幅に特に有用なPCRプライマーを以下に提供する。
もう1つの好ましい態様においては、転写物レベルはリアルタイムPCRを用いることによって評価される。RNAは対象となる試料から単離される。PCRプライマーは、対象となる特定の遺伝子を増幅するように設計される。PCR産物の蓄積は、デュアル標識蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブを用いて測定される。プローブは2つの異なる蛍光色素、5’末端レポーター色素および3’末端消光色素で標識される。オリゴヌクレオチドプローブは、PCRアンプリコンに存在する内部標的配列に相同なように選択される。プローブが無傷であると、2つのフルオロフォアの間でエネルギー移動が起こり、蛍光発光は消光される。PCRの伸長相の間に、プローブはTaqポリメラーゼの5’ヌクレアーゼによって切断される。従って、レポーターはもはやクエンチャーに隣接しておらず、発光強度の増加が測定される。所望のWntまたはフリズルドタンパク質または下流wnt/fzd調節遺伝子産物の増幅用の例示的PCRプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを、図13Aおよび図13Bに提供する。また、プライマーを、DNAを増幅するための他の方法、例えばRT-PCRに用いることもできる。このアッセイは、核酸の定量的尺度を提供する。
他の態様においては、一旦所望の増幅産物が生産されれば、通常は生成物がゲル上で分離された後に、核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて、遺伝子転写物を検出しおよび/または定量することができる。そのようなアッセイで用いるプローブはタンパク質をコードする核酸配列の全長、または全長未満でありうる。より短いプローブは特異性につき経験的にテストされる。好ましくは、核酸プローブは長さが20塩基以上であるが、より短いプローブを用いることもできる。ハイブリダイズした部分を可視化することにより、mRNAの存在または非存在の定性的測定が可能である。
また、Wntまたはフリズルド遺伝子の「活性」は、発現されたポリペプチドを検出し、または定量することによって検出し、および/または定量することもできる。ポリペプチドは、当業者に周知の多数の手段のうちのいずれかによって検出し、定量することができる。これらは電気泳動、毛細管電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、超拡散クロマトグラフィーなどのような分析生化学方法を含むことができる。また、標準的な技術に従って、単離されたタンパク質を配列決定し、多形を同定することもできる。
本発明の抗体を用いて、多数の十分に認められた免疫学的結合アッセイのいずれかを用いて、Wntまたはフリズルドタンパク質、あるいはそれらを発現する細胞を検出することもできる（例えば、米国特許第4,366,241号；第4,376,110号；第4,517,288号；および第4,837,168号参照）。一般的な免疫アッセイのレビューについては、Methods in Cell Biology,Vol.37,Asai,ed.Academic Press,Inc.New York（1993）；Basic and Clinical Immunology 7th Edition,Stites & Terr,eds.（1991）も参照されたい。
また、本発明の方法は診断に用いることもできる。従って、本発明は、特定の癌を有することが疑われる患者においてWntまたはフリズルドタンパク質を過剰発現する細胞を検出する方法を提供する。1つの方法において、対象にバイオプシーを行い、収集した組織をインビトロでテストする。次いで、前記組織または前記組織からの細胞を本明細書中に開示されたPCRプライマーと接触させて、発現のレベルを測定する。または、本発明の抗Wntまたは抗フリズルド抗体を用いることができる。得られる免疫複合体はいずれも、バイオプシー試料中の標的タンパク質の存在を示す。そのような検出を促進するために、抗体を、放射性標識することができるか、あるいは放射性標識のような検出可能な標識であるエフェクター分子にカップリングさせることができる。もう1つの方法において、典型的なイメージングシステムを用いて細胞をインビボで検出することができる。次いで、標識を検出するための公知の方法のいずれかによって、標識の局在を決定する。診断イメージングを可視化するための従来の方法を用いることができる。例えば、常磁性同位体をMRIで用いることができる。抗体の内部移行は、循環クリアランスにカップリングした細胞外酵素環境によるクリアランスに対して感受性である、細胞外結合によって提供されるものを超えて生物の寿命を延長するのに重要な可能性がある。
Wntシグナリングの阻害剤の同定
Wntまたはフリズルドタンパク質（またはそれらを発現する細胞）を薬物スクリーニングアッセイに用いて、Wnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤を同定することができる。従って、本発明は、癌を阻害する組成物をスクリーニングする新規方法を提供する。
Wnt/Fzdシグナリングについてのアッセイを設計して、Wntシグナリング経路のいずれかの部分を検出しおよび/または定量することができる。例えば、細胞内β-カテニンレベルに影響し、またはアポトーシスを誘導し、または標的細胞において細胞増殖を減少させるか、またはブロックする薬剤の能力を測定することができる。これらの目的に適したアッセイを以下に記載する。
アッセイは、Wntリガンドまたはフリズルド受容体いずれかに対する結合活性をテストするために設計されたアッセイを含むことができる。これらのアッセイは、Wnt活性を変調する薬剤を同定するのに特に有用である。実質的にいずれの薬剤もそのようなアッセイでテストすることができる。そのような薬剤は、限定されるものではないが、天然または合成ポリペプチド、抗体、天然または合成小有機分子などを含む。
前記のように、分泌性フリズルド関連タンパク質（sFRP）のファミリーは、分泌されたWntリガンドの結合につきフリズルド受容体と競合することによって、Wntシグナリングの可溶性の内因性モジュレーターとして機能する。従って、いくつかのフォーマットにおいては、テスト剤はフリズルド受容体の天然リガンド（例えば、WntリガンドまたはsFRP）に基づく。
Wntシグナリングを検出するためのアッセイのいずれもハイスループットスクリーニングに用いることができる。ハイスループットアッセイ結合アッセイおよびレポーター遺伝子アッセイは同様に周知である。例えば、米国特許第5,559,410号はタンパク質についてのハイスループットスクリーニング方法を開示しており、米国特許第5,585,639号は（すなわち、アレイでの）核酸結合についてのハイスループットスクリーニング方法を開示し、米国特許第5,576,220号および第5,541,061号は、リガンド/抗体結合につきスクリーニングするハイスループット方法を開示する。
加えて、ハイスループットスクリーニングシステムは商業的に入手可能である（例えば、Zymark Corp.,Hopkinton,MA；Air Technical Industries,Mentor,OH；Beckman Instruments,Inc.Fullerton,CA；Precision Systems,Inc.,Natick,MAなど参照）。これらのシステムは、典型的には、全ての試料および試薬ピペッティング、液体分注、適時のインキュベーション、およびアッセイに適した検出器におけるマイクロプレートの最終の読みを含めた全手法を自動化している。これらの配置可能なシステムはハイスループットおよび迅速な立ち上がりならびに高度な柔軟性およびカスタマイゼーションを提供する。そのようなシステムの製造業者は、種々のハイスループットシステムのための詳細なプロトコルを提供する。従って、例えば、Zymark Corp.は、遺伝子転写、リガンド結合などの変調を検出するためのスクリーニングシステムを記載する技術的情報を提供する。
本発明に有用な他のアッセイは、癌細胞の新生物表現型をテストするように設計されたものである。これらのアッセイは、軟寒天での細胞増殖；足場依存性；増殖の接触阻止および密度限定；細胞増殖；細胞死（アポトーシス）；細胞形質転換；成長因子または血清依存性；腫瘍特異的マーカーレベル；マトリゲルへの侵入；インビボでの腫瘍成長および転移；転移する細胞におけるmRNAおよびタンパク質の発現、および癌細胞の他の特徴を含む。
細胞増殖を阻害するためのテスト剤の能力は、テストを疾患の動物モデルに導入し、次いで、インビボで癌細胞の増殖を評価することによって評価することもできる。例えば、ヒト腫瘍細胞を、「ヌードマウス」のような、免疫無防備状態の動物に導入することができる。テスト剤（例えば、小分子または抗体）を動物に投与し、動物において形成された腫瘍の数および/またはサイズによって評価して--腫瘍を形成する腫瘍細胞の能力を、前記薬剤のない対照動物での腫瘍増殖と比較する。
診断、研究および治療的適用に用いるキット
前記のように、本発明は、ある種の癌における特定のWntまたはフリズルドタンパク質の過剰発現の証拠を提供する。従って、キットは、本明細書中に開示された特定の核酸またはタンパク質の検出に用いることができる。診断および研究適用においては、そのようなキットは、アッセイ試薬、緩衝液、Wnt特異的またはフリズルド特異的核酸または抗体、ハイブリダイゼーションプローブおよび/またはプライマーなどのいずれかまたは全てを含むことができる。治療的製品は滅菌生理食塩水またはもう1つの薬学的に許容されるエマルジョンおよび懸濁液基剤を含むことができる。
加えて、キットは、本発明の方法の実施のための指示書（すなわち、プロトコル）を含む指示材料を含むことができる。指示材料は典型的には書かれたまたは印刷された材料を含むが、それに限定されない。そのような指示を記録し、それを最終のユーザーに伝達することができるいずれの媒体も本発明において考慮される。そのような媒体は、限定されるものではないが、電子記録媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、CD ROM）などを含む。そのような媒体は、そのような指示材料を提供するインターネットサイトへのアドレスを含むことができる。
また、本発明は、Wntシグナリングの阻害剤をスクリーニングするためのキットも提供する。そのようなキットは容易に入手可能な材料および試薬から調製することができる。例えば、そのようなキットは以下の材料:Wntまたはフリズルドポリペプチドまたはポリヌクレオチド、試薬チューブ、および所望のWntシグナリング機能（例えば、βカテニンレベル）をテストするための指示書のうちの一つまたは複数を含むことができる。
治療方法
阻害剤の投与
Wntシグナリングを阻害する薬剤（例えば、抗体）は、限定されるものではないが、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および皮下経路）、局所、経口、局所的、または経皮投与を含む種々の方法によって投与することができる。これらの方法は予防的および/または治療的処置で用いることができる。
前記のように、本発明の阻害剤を用いて、Wntシグナリングに関連する癌を治療することができる。投与用の組成物は、通常、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体に溶解させた阻害剤を含む。種々の水性担体、例えば、緩衝化生理食塩水等を用いることができる。これらの溶液は滅菌され、一般には、望まれない物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌することができる。組成物は、pH調整剤、緩衝化剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどのような生理学的条件に近似させるために必要な薬学的に許容される補助的物質を含むことができる。これらの処方中の活性剤の濃度は広く変化させることができ、主に、選択された特定の投与形態および患者の必要性に従って、流体容量、粘度、体重などに基づいて選択される。
静脈内投与のための典型的な薬学的組成物は1日につき患者当たり約0.1mg〜100gであろう。1日につき患者当たり0.1mg〜100gの投与量は、特に、薬物を隔離された部位に投与し、体腔または器官のルーメンのような血流には投与しない場合に用いることができる。非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法は当業者に知られているか、または明らかであり、これは、Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed.,Mack Publishing Company, Easton,Pennsylvania（1980）のような刊行物により詳細に記載されている。
薬学的組成物は、投与方法に応じて、種々の単位投与形態で投与することができる。例えば、経口投与に適した単位投与形態は、限定されるものではないが、粉末、錠剤、丸剤、カプセル剤およびロゼンジを含む。抗体は、経口投与される場合には、消化から保護すべきであることが認識される。これは、典型的には、分子を組成物と複合体化して、それを酸および酵素加水分解に対して抵抗性とすることによって、あるいはリポソームまたは保護バリアーのような適切な抵抗性担体に分子をパッケージングすることによって達成される。消化から薬剤を保護する手段は当技術分野において周知である。
本発明の阻害剤（例えば抗体）を含有する組成物は治療または予防処置のために投与することができる。治療的適用においては、組成物は、疾患およびその合併症を治癒し、または少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で、疾患（例えば乳癌）に罹った患者に投与される。これを達成するのに適当な量は「治療上有効量」と定義される。この使用のために有効な量は、疾患の重症度、および患者の全体的な健康状態に依存する。組成物の単回または複数回投与は、必要であって患者に許容される投与量および頻度に依存して投与することができる。いずれにせよ、組成物は、患者を効果的に治療するための本発明の薬剤の十分な量を提供するべきである。患者において癌の発生を予防し、または遅延させることができる阻害剤の量を、「予防上有効量」という。予防的処置に必要な特定の用量は、患者の医学的状態および履歴、予防すべき特定の癌、ならびに年齢、体重、性別、投与経路、効率などのような他の因子に依存する。そのような予防的処置は、例えば、以前癌を有した患者に用いて癌の再発を予防することができるか、あるいは癌を発生する有意な確率を有することが疑われる患者に用いることができる。
本発明の目的の「患者」はヒトおよび他の動物双方、特に哺乳動物を含む。従って、前記方法はヒトの治療および動物への適当の双方に適用可能である。好ましい態様においては、患者は哺乳動物、好ましくは霊長類であり、最も好ましい態様においては、患者はヒトである。
他の公知の癌療法を、本発明の方法と組み合わせて用いることができる。例えば、Wntシグナリングの阻害剤を用いて、細胞を、5FU、ビンブラスチン、アクチノマイシンD、シスプラチン、メトトレキセートなどのような他の癌治療剤に対して標的化し、または感受性とすることもできる。他の態様において、本発明の方法は放射線療法などと共に用いることができる。
いくつかの例においては、抗体は、膜貫通タンパク質と複合体化すると、血清補体を活性化し、それにより、細胞傷害性または抗原依存性細胞傷害性（ADCC）を媒介するサブタイプに属する。従って、癌は、癌細胞表面のWntまたはフリズルドタンパク質に対する抗体を患者に投与することによって治療することができる。抗体標識はコトキシン（co-toxin）を活性化し、トキシン負荷を局所化し、あるいはそうでなければ細胞を局所的に除去する手段を提供することができる。これらの態様において、抗体はエフェクター部分にコンジュゲートされる。エフェクター部分は放射性標識または蛍光標識のような標識部分を含む任意数の分子でありうるか、あるいは細胞傷害性剤のような治療部分でありうる。
Wntまたはフリズルドポリペプチドのワクチンとしての使用
wntシグナリング阻害剤の投与に加えて、Wntまたはフリズルドタンパク質またはそれらの免疫原性断片はワクチン組成物として投与して、内因性タンパク質に対するHTL、CTL、および抗体応答を刺激することができる。そのようなワクチン組成物は、例えば、脂質化ペプチド（例えば、Vitiello,et al.（1995）J.Clin.Invest.95:341-349参照）、ポリ（D,L-ラクチド-コ-グリコリド、「PLG」）ミクロスフェアに封入されたペプチド組成物（例えば、Eldridge,et al.（1991）Molec.Immunol.28:287-294；Alonso,et al.（1994）Vaccine 12:299-306；Jones,et al.（1995）Vaccine 13:675-681参照）、免疫刺激複合体
Figure 2006517390
に含まれたペプチド組成物を含むことができる。
ワクチン組成物はアジュバントを含むことが多い。多くのアジュバントは水酸化アルミニウムまたは鉱油のような迅速な異化から抗原を保護するように設計された物質、およびリピドA、Bortadella pertussis、またはMycobacterium tuberculosis由来タンパク質のような免疫応答刺激剤を含む。ある種のアジュバント、例えばフロイントの不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Difco Laboratories,Detroit,MI）；Merckアジュバント65（Merck and Company,Inc.,Rahway,NJ）；AS-2（SmithKline Beecham,Philadelphia,PA）；水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩；カルシウム、鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；カチオン的にまたはアニオン的に誘導体化された多糖；ポリホスファゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドAおよびquil Aとして商業的に入手可能である。GM-CSF、インターロイキン-2、-7、-12のようなサイトカイン、および他の同様な成長因子もアジュバントとして用いることができる。
ワクチンは、核酸組成物として投与することができ、WntまたはフリズルドポリペプチドをコードするDNAまたはRNA、またはその断片が患者に投与される。例えば、Wolff et al.（1990）Science 247:1465-1468；米国特許第5,580,859号；第5,589,466号；第5,804,566号；第5,739,118号；第5,736,524号；第5,679,647号；および国際公開公報第98/04720号を参照されたい。DNAベースの送達技術の例は、「裸のDNA」、促進された（bupivicaine、ポリマー、ペプチド媒介）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介（「遺伝子銃」）または圧力媒介送達（例えば、米国特許第5,922,687号参照）を含む。
DNAワクチンとしての遺伝子の使用のための方法は周知であり、所望の遺伝子またはその一部を患者における発現用の調節可能なプロモーターまたは組織特異的プロモータの制御下に置くことを含む。DNAワクチンに用いる遺伝子は、全長Wntまたはフリズルドタンパク質をコードすることができるか、あるいはタンパク質の部分をコードすることができる。
いくつかの態様において、DNAワクチンはDNAワクチンと共にアジュバント分子をコードする遺伝子を含む。そのようなアジュバント分子は、DNAワクチンによってコードされたポリペプチドに対する免疫原性応答を増加させるサイトカインを含む。
治療的または予防的免疫化目的では、本発明のペプチドはウイルスまたは細菌ベクターによって発現させることができる。発現ベクターの例はワクシニアまたは鶏痘のような弱毒化ウイルス宿主を含む。このアプローチは、例えば、Wntまたはフリズルトポリペプチドまたはポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとしての、ワクシニアウイルスの使用を含む。宿主への導入に際して、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それにより、免疫応答を誘導する。免疫化プロトコルで有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば、米国特許第4,722,848号に記載されている。もう1つのベクターはBCG（Bacille Calmette Guerin）である。BCGベクターはStover,et al.（1991）Nature 351:456-460に記載されている。治療的投与または免疫化で有用な広く種々の他のベクター、例えば、アデノおよびアデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌ベクター、解毒炭疽トキシンベクターなどが明らかであろう。例えば、Shata,et al.（2000）Mol.Med.Today 6:66-71；Shedlock,et al.（2000）J.Leukoc.Biol.68:793-806；およびHipp,et al.（2000）In Vivo 14:571-85を参照されたい。
実施例
様々なHNSCCクローン集団は、それらの起源が未成熟細胞のため、およびオートクリンまたはパラクリンWnt/Fzdシグナリングによって提供された成長および生存の利点のため、WntおよびFzdファミリーの種々の受容体を過剰発現する。我々は、5つのWntおよび2つのFzd遺伝子の発現用のHNSCCおよび正常ヒト上皮細胞系を調べた。結果は、ほとんどのHNSCCは一つまたは複数のWntおよびFzd mRNAを過剰発現することを示した。さらに、LEF/TCFレポーター遺伝子の構成的発現によって示されるように、Wnt/Fzd経路はHNSCC細胞のいくつかにおいて機能的であった。SNU 1076細胞系において、抗Wnt-1または抗Wnt-10b抗体はβ-カテニンおよびサイクリンD1の発現を減少させ、細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導した。従って、WntおよびFzd遺伝子はHNSCCで頻繁に発現され、免疫療法および薬物療法双方で魅力的な標的である。
我々は、胚発生に関与するタンパク質用の腫瘍および正常細胞系を調べた。これらの研究は、少なくとも1つのG-共役タンパク質受容体フリズルド2が多くの腫瘍細胞系によって過剰発現されることを示唆する。正常および悪性細胞のより広いパネルを調べることができ、この抗原に対して受動的および能動的免疫療法に向けられた免疫化戦略を開発することができる。
前記した付属的受動免疫療法としてのトラスツズマブの成功した経験に基づき、商業的に入手可能なポリクローナル抗体でのHNSCC系の増殖に対するWnt-フリズルドシグナリング経路のブロッキングの評価を行った（図4および5）。フリズルドの可溶性阻害剤は、フリズルドシグナリングのそれらの阻害に対して二次的なアポトーシスを誘導することが記載されている（Zhou,Z.J.et al.,「Up-regulation of human secreted frizzled homolog in apoptosis and its down-regulation in breast tumors,」Int J Cancer 78:95-99（1998））。テストした抗体は、腫瘍系の成長を示し、アポトーシスをもたらしたように見える（図4および5）。
頭部および頸部扁平細胞癌（HNSCC）における潜在的腫瘍関連抗原としてのWntおよびFzd受容体を評価するために、我々は、RT-TCRおよび免疫ブロッティング双方によって、種々の腫瘍および正常細胞系をスクリーニングした。最初のスクリーニングは、フリズルド2およびフリズルド5が共に頭部および頸部扁平細胞癌（HNSCC）、神経膠細胞腫、および慢性リンパ性白血病（CLL）で発現されることを明らかにした（図2）。さらに、結果は、正常ヒト気管支上皮（NHBE）細胞と比較して、Fzd-2が多くのHNSCC細胞で過剰発現されることを明らかにした（表1）。Fzd-2のアミノ酸配列はFzd-1および7に非常に相同である（Sagara,N.et al.「Molecular cloning, differential expression, and chromosomal localization of human frizzled-1, frizzled-2, and frizzled-7,」Biochem Biophys Res Comm 252,117-122（1998））。フリズルド2が腫瘍において特異的に増殖されることを確認するために、
Figure 2006517390
選択された反応からのRT-PCR産物に対する系をTAベクター（Invitrogen,Carlsbad,CA）にクローン化し、配列決定した。BLASTサーチによって、ヒトフリズルド2配列とでインサートの100％同一性があった。加えて、免疫ブロッティングはNHBEの溶解物において検出可能なFzd-2タンパク質の欠如を示し、そこでは、RT-PCRによる弱く検出可能なまたは検出できない産物があった。ヒトFzd-2遺伝子は、元来、Sagaraとその同僚によって単離された（Sagara 1998,infra）。また、これらの研究者は、Fzd-2についてのmRNAは、心臓は例外である可能があるが、15の異なる正常なヒト成人組織のいずれにおいても検出できなかったことも見出した。対照的に、胚組織ならびに8つの悪性細胞系のうちの6つは豊富なFzd-2 mRNAを発現した。しかしながら、これらの調査はフリズルドFzd-2タンパク質の発現につきテストせず、mRNAのレベルはタンパク質発現とは必ずしも相関しない。我々の研究は、Fzd-2タンパク質発現が、正常なNHBE細胞と比較すると、HNSCC細胞系で顕著であることを示す。よって、Fzd-2の細胞外ドメインの特異的決定基に対する抗体を用いて、そのような悪性細胞に結合し、それを標的とできよう。
NHBE細胞と比較して、HNSCC細胞系はかなり高いメッセージレベルのWnt-1、Wnt-5a、Wnt-10bおよびWnt-13を発現した。これらのWntタンパク質のうち、Wnt-1、5A、および10bは専ら悪性細胞系によって発現され、テストした正常な組織では検出されなかった。免疫ブロッティング実験では、いくつかのHNSCC細胞系におけるWnt-1およびWnt-10bの過剰発現を確認した（図3）。腫瘍は高レベルのリガンドおよびそれらのFzd-2受容体双方を有したので、Wnt/FzdシグナリングがHNSCC細胞において、構成的に活性であるかを決定するのは重要であった。標準的Wnt/Fzdシグナリングカスケードは、細胞質β-カテニンの蓄積およびその核への移動に導く。核においては、β-カテニンはリンパ系増強因子/T細胞因子（LEF/TCF）のN末端における特異的配列モチーフに結合して、転写的に活性な複合体を生じる（Behrens J et al.「Functional interaction of beta-catenin with the transcription factor LEF-1,」Nature 382,638-642（1996））。LEF/TCF受容体遺伝子TOPFLASHを用いる実験は、LEF/TCF依存性転写がSNU 1076細胞において活性であることを示した。
Wnt/フルズルド経路は、以前に腫瘍形成に関連付けられている。可溶性Wnt糖タンパク質は、7回膜貫通ドメインGタンパク質共役受容体フリズルドに結合することによって、シグナルを伝達することが示されている（図1）（Bhanot,P. et al.「A new member of the frizzled family from Drosophila functions as a Wingless receptor,」Nature 382:225-230（1996）；Yang-Snyder,J.et al.「A frizzled homolog functions in a vertebrate Wnt signalining pathway,」Curr Biol 6:1302-1306（1996）；Leethanakul,C. et al.「Distinct pattern of expression of differentiation and growth-related genes in squamous cell carcinomas of the head and neck revealed by the use of laser capture microdissection and cDNA arrays,」Oncogene 19:3220-3224（2000））。Wntシグナリングに際して、カスケードが開始され、細胞質β-カテニンの蓄積およびその核への移動をもたらす。核においては、β-カテニンはリンパ系増強因子/T細胞因子（LEF/TCF）のN末端の特異的配列モチーフに結合して、転写的に活性な複合体を生じる（Behrens,J.et al.「Functional interaction of beta-catenin with the transcription factor LEF-1,」Nature 382:638-642（1996））。β-カテニンは細胞骨格に連結するカドヘリンのような複数の他のタンパク質と相互作用する（Hoschuetzky,H.et al.「Beta-catenin mediates the interaction of the cadherin-catenin complex with epidermal growth factor receptor,」J Cell Biol 127:1375-1380（1994）；Aberle,H. et al.,「Assembly of the cadherin-catenin complex in vitro with recombinant proteins,」J Cell Sci 107:3655-3663（1994））。また、それは大腸腺腫性ポリポーシス（APC）腫瘍サプレッサータンパク質およびグリコーゲンシンテターゼ3β（GSK3β）とも会合する（Rubinfeld,B. et al.,「Binding of GSK3beta to the APC-beta-catenin complex and regulation of complex of assembly,」Science 272:1023-1026（1996））。これらのタンパク質は、アミノ末端近くでのリン酸化を促進し、そのタンパク質分解を加速することによって、βカテニンを負に調節するよう機能する（Yost,C.et al.,「The axis-inducing activity, stability, and subcellular distribution of beta-catenin is regulated in Xenopus embryos by glycogen synthase kinase 3,」Genes Dev 10:1443-1454（1996））。
スクリーニングすることができる腫瘍細胞のパネルは、National Institutes of Health Developmental Therapeutics Programで特徴付けられつつある60の系のパネルに由来する。現在入手可能な細胞系は、（非小細胞肺癌）A549/ATCC、NCI-11226、NCI-11460、HOP-62、HOP-92、（結腸癌）HT29、HCT-116、（乳癌）MCF7、NCI/ADR-RES、MDA-MB-23 1/ATCC、T-47D、（卵巣癌）OVCAR-3、OVCAR-4、SK-OV-3、（白血病）CCRF-CEM、K-562、MOLT-4、HL-60（TB）、RPMI-8226、（腎臓細胞）786-0、TK-10、（前立腺癌）PC-3、DU-145を含む。正常対照細胞系はCloneticsから購入することができる。
WntおよびFzdはHNSCC細胞で発現されたが、それらは細胞の成長および生存になくてもよい可能性がある。従って、Wnt-1およびWnt-10bの細胞外ドメインに対する抗体の効果は、受容体を発現することが知られている3つのHNSCC系で実験した。対照抗体と比較すると、双方の抗Wnt抗体はHNSCC細胞系の1つ（SNU 1076）の増殖を示し、アポトーシスをもたらした。高レベルのSFRP1（Wntアンタゴニスト）での処理は同様な結果を奏した。さらに、SNU 1076細胞におけるWnt/フリズルドシグナリングの干渉はLEF/TCF受容体遺伝子の活性を減少させ、β-カテニンサイクリンD1およびフィブロネクチンのレベルを低下させた。これらの結果は、継続したオートクリンまたパラクリンWnt/Fzdシグナリングが、HNSCC細胞のサブセットの増殖および生存に必要であろうことを示唆する。
これらの結果は、Wntおよびフリズルド受容体に対する抗体がインビボにおいてHNSCC癌で2つの異なる効果を奏する可能性を示唆する。生存するためにWnt/Fzdシグナリングに依存する悪性細胞では、抗体は腫瘍増殖を直接的に遅延させおよび/またはアポトーシスを誘導するであろう。受容体を付随的に過剰発現するが増殖にはそれを必要としないHNSCC細胞においても、抗体は依然として、補体または抗体依存性細胞毒性による殺傷につき腫瘍細胞を標的とすることができる可能性がある。これらのデータに基づき、我々は、受動的免疫療法は、一つまたは複数のWntおよびFzd受容体を過剰発現するHNSCCにおいて有用な補助的療法でありうると信じる。
実験方法
細胞系および培養:10のHNSCC、2つのBリンパ腫および2つの神経膠細胞腫細胞系を調べた。Detroit-562（咽頭癌）、KB（口床における癌腫）、RPMI-2650（鼻中隔癌）、SCC-25（舌癌）、U87MGおよびU373MG（神経膠芽腫）、Ramos（リンパ腫）、Detroit-551（ヒト皮膚線維芽細胞様細胞）およびWI-38（ヒト肺線維芽細胞）はAmerican Type Culture Collection（Manassas,VA）から購入した。PCI-1、13、および50細胞系は、T.Whiteside博士（Univ.of Pittsburgh,PA）（Whiteside,T.L.et al.,「Human tumor antigen-specific T lymphocytes and interleukin-2-activated natural killer cells:comparisons of antitumor effects in vitro and in vivo,」Clin Cancer Res.4,1135-1145（1998）；Yasumura,S.et al.,「Human cytotoxic T-cell lines with restricted specificity for squamous cell carcinoma of the head and neck,」Cancer Res.53,1461-1468（1993））からいただいた。HNSCC細胞系SNU1066、SNU1076およびAMC4細胞系は、各々、J.G.Park博士（Seoul National University,Korea）およびS.Y.Kim博士（University of Ulsan,Korea）によって提供された（Ku,J.L.et al.,「Establishment and characterization of human laryngeal squamous cell carcinoma cell lines,」Laryngoscope 109,976-82（1999）；Kim,S.Y.et al.「Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines,」Acta Otolaryngol.117,775-784（1997））。異なる個人に由来する2つの異なる正常なヒト気管気管支上皮（NHBE）細胞はClonetics（San Diego,CA）から購入した。全ての癌細胞は、供給業者推奨のとおり、10％胎児ウシ血清を補足したRPMI1640、DMEM（ダルベッコの修飾イーグル培地）、またはハム12-DMEM培地いずれかにおいて、5％CO2の湿潤化雰囲気中で37℃にて培養した。NHBE細胞は前記会社によって供給された気管支上皮細胞培養基中で培養した。正常な上皮細胞は10人の正常な健康なボランティアの口腔粘膜を掻きとって得られた。全ての細胞系はマイコプラズマの汚染がないことが判明した。
RT-PCR分析:全RNAは製造業者の指示に従って、Trizol（登録商標）（Gibco BRL,Grand Island,NY）を用いることによって抽出した。クローン化したヒトWntおよびFzd遺伝子のGenBank配列に基づいた遺伝子特異的フライマーの異なる対を逆転写酵素-PCR（RT-PCT）分析で用いた。逆転写はSuperscript（商標）Preamplificationキット（Gibco BRL）で行った。1マイクログラムのRNAを各試料から用い、25〜35サイクルのPCRを行った。PCR産物は電気泳動によって分離し、紫外線光下で可視化し、レーザーデンシトメーターでスキャンした。WntおよびFzdバンドの強度を、ハウスキーピング遺伝子G3PDHのアンプリコンと比較した。予備的実験は、PCR増幅が結果で報告された全てのデータにつきプラトーに到達しなかったことを確認した。以下のリストは用いたプライマー対をまとめる。
Figure 2006517390
WntおよびFzd PCR産物の特異性は、TOPO TAクローニングキットおよびM13プライマー（Invitrogen Carlsbad,CA）を用いて産物をクローニングし、配列決定することによって確認した。
免疫ブロッティング:培地の除去後、対数増殖中の細胞を、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む溶解緩衝液［25mMトリスHCl、150mM KCl、5mM EDTA、1％NP-40、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム］中で破壊した。SDS-PAGEゲルの各レーンに20μgのタンパク質を負荷した。電気泳動後、タンパク質をポリビニリデンジフルオライド（PVDF）膜に移し、PBS中の0.05％Tween-Xを含有する2％I-block（商標）（Tropix Inc,Bedford,MA）でブロックし、次いで一次抗体と共にインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ-コンジュゲーテッド抗IgG（Santa Cruz Laboratories,Santa Cruz,CA）を二次抗体として用いた。ケミルミネッセンスシステム（ECL検出試薬:Amersham Life Science,Aylesbury,UK）を用いて膜を展開し、レーザーデンシトメーターでスキャンした。膜をRe-Blot（商標）ウェスタンブロットリサイクリングキット（Chemi-Con International Inc,Temecula,CA）で剥がし、他の抗体およびアクチンモノクローナル抗体（Chemi-Con International Inc）を対照として用いて再度プローブした。予め染色した分子量マーカー（New England Biolabs,Beverly,MA）を参照として用いた。
抗体:Wnt-1およびWnt-10bのアミノ末端細胞外ドメインに対して、およびFzd-2のカルボキシ末端領域に対して特異的なポリクローナル抗体をSanta Cruz Laboratoriesから購入し、β-カテニンおよびフィブロネクチンに対して特異的なモノクローナル抗体はTransduction Laboratories（Lexington,KY）から購入した。サイクリンD1およびアクチンに対する抗体は、各々、PharMingen（San Diego, CA）およびChemi-Con International Inc.から購入した。精製された組換えヒト可溶性フリズルド関連タンパク質-1は前記のようにJ.Rubin博士の研究所で調製された（Uren,A.et al.,「Secreted frizzled-related protein-1 binds directly to Wingless and is a biphasic modulator of Wnt signaling,」J.Biol Chem.275,4374-4382（2000））。
MTT（3-［4,5-ジメチルチアゾール-2-イル］-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）ベースの細胞アッセイ:細胞増殖は比色MTTアッセイによって測定した。簡単に述べれば、7.5〜10×103細胞いずれかを96ウェルプレートの各ウェルに分散させた。培養から20時間後、4つの異なる濃度の抗Wnt-1または抗Wnt-10b抗体（2μg/ml、0.2μg/ml、20ng/mlおよび2ng/ml）を培養に加えた。同一濃度のヤギ抗ヒトIgG（Fisher Scientific）をイソタイプ対照として用いた。使用に先立って、抗体を組織培養基に対して透析して、保存剤を除去した。インキュベーションから1、2、3または4日後に、20μlのMTT溶液を各ウェルに加えた。4時間後、細胞を溶解させ、570nMおよび650nMにおける吸光度を測定し、対照のパーセンテージとして増殖を式:
対照増殖の％＝（B-A）/（C-A）×100
［式中、Aはインキュベーションの開始における吸光度であり、Bはテストした抗体と共にインキュベートした後の吸光度であり、Cは対照抗体と共にインキュベートした後の吸光度である］
から決定した。前記アッセイは三連で行い、結果は4つの独立した実験からの平均値±標準偏差を表す。
フローサイトメトリー:細胞アポトーシスはヨウ化プロピジウム（PI）およびDIOC6染色、続いてのフローサイトメトリーによってアッセイした。HNSCC系、SNU1076を2μg/mlの抗Wnt-1、抗Wnt-10または対照IgGで72時間処理した。細胞をトリプシン処理によってフラスコから剥がし、5μg/mlのPIおよび40nMのDiOC6を含む培地中で10分間インキュベートし、次いで、FACScaliber（Becton-Dickinson,San Jose,CA）にてフローサイトメトリーによって分析した。生細胞は高いDiOC6（FL-1）および低いPI（FL-3）蛍光を有し、他方、アポトーシス細胞は低いDiOC6（FL-1）および低いPI（FL-3）蛍光を有した。
フリズルド2を発現する腫瘍および正常細胞系は同定することができる。フリズルド2を発現する10の細胞系および発現しない少なくとも2つの細胞系は図4につき前記のようにテストすることができる。最高の力価および特異性につきテストするマウス血清を細胞培養で用いる。細胞は段階量のポリクローナル抗フリズルド2マウス血清および正常な対照血清に暴露する。1、2、3および4日に、複製ウェルの4つのサブセットを増殖能につきアッセイする。引き続く日に、20μlのMTT（3-［4,5-ジメチルチアゾール-2-イル］-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）ベースの溶液を、15％SDS、0.015M HClでの溶解に先立って4時間ウェルに添加する。570および650nmの吸光度を測定する。これらの測定は三連で行い、統計学的関連性をP＜0.05についてスチューデンドのt検定によって評価する。
また、選択された細胞系にヨウ化プロピジウム（PI）染色によってDNA含有量についての分析を受けさせる。段階的濃度の正常または免疫化マウス血清の存在下で72時間テストした細胞系をトリプシン処理し、5μg/mlのPIおよび40nMのDiOC6と共に10分間インキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。生細胞はDiOC6（FL-1）が高く、PI（FL-3）が低く、アポトーシス細胞はDiOC6（FL-1）が低く、PI（FL-3）が低い。加えて、細胞をトリプシンでフラスコから剥がし、50μg/mlのPIおよび100μg/mlのRNaseを含有する低張緩衝液（0.1％クエン酸塩、0.1％SDS）中で一晩インキュベートする。DNAの量はフローサイトメトリーによって測定する。アポトーシス細胞は、G0G1レベルよりも低いDNA含有量を有するものとして定義される（サブ-G0細胞）。
一過性ルシフェラーゼアッセイ:pTOPFLASH-Lucレポーター遺伝子ベクターおよびpFOPFLASH-Luc対照は、親切にも、Hans Clevers博士（University Medical Center Utrecht,The Netherlands）によって供給された。TOPFLASH/FOPFLASHレポーター遺伝子アッセイでは、SNU1076細胞を0.5μgのpTOPFLASH-LucまたはpFOPFLASH-Lucおよび0.5μgのpCMV-βGalで、従前に記載されているように共トランスフェクトした（Korinek,V.et al.,「Constitutive transcriptional activation by a beta-catenin-Tcf complex in APC-/- colon carcinoma,」Science 275,1784-1787（1997））。トランスフェクションから24時間後に細胞を回収し、溶解緩衝液中で破壊し、Dual-Lightレポーター遺伝子アッセイシステム（Applied Biosystems,Fostar City,CA）を用いてルシフェラーゼおよびβ-ガラクトシダーゼ活性を測定した。各pTOPFLASH-LucまたはpFOPFLASH-Lucトランスフェクト培養のルシフェラーゼ活性、およびpCMV-βGalトランスフェクト細胞のβ-ガラクトシダーゼ活性を、ルミノメーターを用いて同一試料中で測定した。試料のトランスフェクション効率はβ-ガラクトシダーゼの活性によって標準化した。
実施例1：フリズルド2の単離された非相同領域の免疫原性
フリズルド2の第一の細胞外ドメインは、タンパク質構造に基づき、他のフリズルドタンパク質ファミリーメンバーに最も相同でない領域を含む（図6）（Sagara,N.et al.「Molecular cloning,differential expression,and chromosomal localization of human frizzled-1,frizzled-2,and frizzled-7,」Biochem Biophys Res Commun 252:117-122（1998））。このポリヌクレオチド配列は、天然タンパク質に対する抗体応答を生じさせるのに十分な三次構造を有することができる。B細胞刺激を高めるために、このエピトープは、T細胞援助を生じさせることが記載されているT細胞エピトープにカップリングされる。
全体的な戦略は、フリズルドタンパク質の最も保存されていない領域を用い、最も天然の構造を可能なように維持し、最も優れた免疫応答を生じさせるよう試みることである。規定された領域のワクチンを設計するための最も多様な方法は裸のプラスミドDNAである。その利点は、ベクターが、発現される配列の長さを変化させるように迅速に再度設計でき、タンパク質の不連続領域を共発現でき、タンパク質のDNA配列を他のエピトープに融合させて、抗原性を高めることができることである（O'Hem,P.A.et al.「Colinear synthesis of an antigen-specific B-cell epitope with a 'promiscuous' tetanus toxin T-cell epitope:a synthetic peptide immunocontraceptive,」Vaccine 15:1761-1766（1997）；Paterson,M.et al.,「Design and evaluation of a ZP3 peptide vaccine in a homologous primate model.」Mol Hum Reprod 5:342-352（1999）；Dakappagari,N.K. et al.,「Prevention of mammary tumors with a chimeric HER-2 B-cell epitope peptide vaccine,」Cancer Res 60:3782-3789（2000））。それは、可溶性の膜結合タンパク質、または小さなペプチド断片の発現の多様性を提供する。また、この技術による遺伝子導入は、複数のタンパク質エレメントを同一または別々の位置に導入するための強力なツールである。このシステムにおいては、単一または複数のタンパク質を局所的に発現させることができる。抗原ならびにB7.1およびB7.2のような共刺激因子を発現するプラスミドの組合せの注入の結果、増強された免疫応答が得られる（Corr,M.et al.,「Costimulation provided by DNA immunization enhances antitumor immunity,」J Immunol 159:4999-5004（1997）；Chan,K.et al.,「The roles of mhc class ii,cd40,and b7 costimulation in ctl induction by plasmid dna（DNA?）,」J Immunol 166:3061-3066（2001））。
注入された筋肉での高レベルの抗原発現を可能とすることが判明したサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの制御下にあるいくつかのプラスミドが構築されている。pCMVintベクターはサイトメガロウイルス（CMV）E1プロモーター、シミアンウイルス（SV40）t-イントロン、およびSV-40ポリアデニル化部位を含む（Corr,M.et al.「Gene vaccination with naked plasmid DNA:mechanism of CTL priming,」J Exp Med 184:1555-1560（1996））。ACBベクターは、ポリアデニル化配列がウシ成長ホルモン遺伝子からのものであることを除き同一のエレメントを有する（Sato,Y.et al.「Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization,」Science 273:352-354（1996））。計画したプラスミド構築体の第一の組は、9番目および10番目のシステインの間のフリズルド2の相同性の最も低い領域をコードする。これらのシステインはこのシリーズの構築体で保持されるであろう。というのは、それらは、天然タンパク質への抗体結合を可能とする立体配置を安定化できるからである。このポリペプチド断片はアミノ末端にてまたはカルボキシ末端にて短いリンカーを介して破傷風毒素または麻疹ウイルス融合（MVF）タンパク質Tヘルパーエピトープ（後記参照）に融合される（O'Hem,P.A.et al.「Colinear synthesis of an antigen-specific B-cell epitope with a 'promiscuous' tetanus toxin T-cell epitope:a synthetic peptide immunocontraceptive,」Vaccine 15:1761-1766（1997）；Paterson,M.et al.「Design and evaluation of a ZP3 peptide vaccine in a homologous primate model,」Mol Hum Reprod 5:342-352（1999）；Dakappagari,N.K.et al.,「Prevention of mammary tumors with a chimeric HER-2 B-cell epitope peptide vaccine,」Canecer Res 60:3782-3789（2000））。これらのミニ遺伝子は重複するオリゴヌクレオチドで構築される。オリゴヌクレオチドは室温にてT4キナーゼで30分間5’プライムリン酸化され、2つの相補的オリゴマーの等モル混合物を沸騰させ、ゆっくり冷却させることによってアニールする。次いで、二本鎖オリゴヌクレオチドをインフレームにてEcoR47111部位への、およびpBluescript SKIIベクターのBamH1部位への組織プラスミノーゲンリーダー（TPA）のリーダーに3’連結する。次いで、従前に記載されているように、ミニ遺伝子を、pCMVおよびpACBベクターのPst1およびXba1部位の間にサブクローンする（Corr,M.et al.,「Costimulation provided by DNA immunization enhances antitumor immunity,」J Immunol 159:4999-5004（1997））。
ベクター用のインサートは前記のように設計する。フリズルド推定B細胞エピトープは公表された配列からのものである。破傷風毒素および麻疹MVF Tヘルパーエピトープは、アミノ酸当たり最も頻繁に使用されるコドンによるヒトコドン使用につき最適化されている。DNA構築体は、各々、5’および3’末端に負荷された開始メチオニンおよび停止コドンを有する。アミノ酸およびDNAの配列は、太文字の短いGPSLリンカー配列および下線を施したT細胞ヘルパーエピトープと共に以下にまとめる。
フリズルドドメインに融合した破傷風毒素エピトープ
Figure 2006517390
フリズルドドメインに融合した麻疹MVFエピトープ
Figure 2006517390
プラスミドDNAは、それをカラムに適用するに先立って、1/10容量の10％トリトンX-114（Sigma,St.Louis,MO）を清澄化された細菌溶解物に添加する修飾を施して、Qiagen Maxiprep（Chatsworth,CA）キットを用いて調製する。注入に先立って、残存するエンドトキシンのレベルは、カブトガニ抽出物クロットアッセイ（Associates of Cape Cod,Woods Hole,MA）を用いて定量する。動物で用いるのに先立って、5ngエンドトキシン/μgDNA未満またはそれと等しいレベルを得る必要がある（Corr,M.et al.「In vivo priming by DNA injection occurs predominantly by antigen transfer,」J Immunol 163:4721-4727（1999））。DNAは、注射用の滅菌された発熱物質なしの生理食塩水に再懸濁させる。
28匹の雌マウスを各々4匹のマウスの群に分ける。それらの尾の真皮に、0、1および2週に、正規生理食塩水に希釈した共刺激因子（B7-1またはB7-2）をコードする50pgのプラスミドおよび50μgのリンカープラスミドの組合せを注射する。空のベクターを有する群を陰性対照として含ませる。群は以下の通りである。
Figure 2006517390
同様な群におけるマウスのもう1つの群を、連結されたエピトーププラスミドのpMMVF-FZD2およびpFZD2-MMVF組を用いて免疫化する。nCMVB7-1およびnCMVB7-2構築体は、親切にもG.Freeman（Dana-Farber Cancer Institute,Boston,MA）によって供給されたネズミCD80およびCD86につきcDNAをコードする（Corr,M.et al.,「Costimulation provided by DNA immunization enhances antitumor immunity,」J Immunol 159:4999-5004（1997））。
実験の開始に先立って、マウスから血液を採取し、次いで、その後2週間毎に採血する。血清を分離し、テストに先立って-20℃で貯蔵する。10週目（最後の注射から7週間後）マウスを犠牲死させる。抗ペプチドELISAによって抗体の力価をテストする。96ウェルプレート（Costar）を4℃にて一晩でリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中の50μl/ウェル20μg/mlペプチドで被覆する。次いで、プレートを洗浄し、PBS中の200μl/ウェル2％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロックする。血清はPBS中の2％BSAに希釈する。4℃での一晩のインキュベーション後に、プレートを洗浄する。結合したネズミIgGを、アルカリホスファターゼコンジュゲーテッド-ヤギ抗ネズミIgG（Jackson Immunoresearch Laboratories）、続いてp-ニトロフェニルホスフェート基質で検出する。各血清についての力価測定曲線をDeltaSOFT II v.3.66（Biometallics,Princeton,NJ）を用いて比較する。
ペプチドに結合する抗体の十分に高い力価を呈するマウスを、トランスフェクションによりタンパク質を発現する細胞、およびmRNAを有する既知の腫瘍細胞での蛍光サイトメトリーによってフリズルド2に対する特異性につきテストする。また、我々は、このイソ形態を発現する細胞の、および他のフリズルドファミリーメンバーを発現することが判明している細胞へのウェスタンブロット分析による結合をテストする。簡単に述べれば、免疫ブロッティングを前記のように行う。細胞を、25mMトリスHCl、150mM KCl、5mM EDTA、1％NP-40、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム、1mM NaVO3、1mM NaF、20mM β-グリセロホスフェートおよびプロテアーゼ阻害剤を含有する溶液で溶解させる。各細胞系からの20μgのタンパク質をSDS-PAGEによって分離し、PVDF膜に移す。前記膜をPBS中の2％I-ブロック、0.05％Tween Xに浸漬し、次いで、1:500希釈でのポリクローナルプレまたはポスト免疫化マウス血清の1:500希釈と共にインキュベートする。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ-コンジュゲーテッドラット抗マウスIgGおよびケミルミネッセンス（ECL検出試薬）によってマウス抗体結合を検出する。各レーンに導入されたタンパク質の相対量を確認するために、次いで、ブロットをストリップし、アクチンの存在をアクチンモノクローナル抗体で測定する。
異なる免疫化戦略が、液性免疫応答を誘導するにおけるその効率につき評価されつつある。もし抗体の応答が弱いならば、ベクターは他の既知の優れたTヘルパーエピトープで再度設計することができる。フリズルド2からのポリペプチドがより短く、かつ最も望ましい立体配座を阻害しうるシステインを含まない場合、他のベクターを設計することができる。もう1つの免疫化戦略は、プライムブースト方法を用いることであろう。動物を最初にプラスミドDNAで注射し、次いで、フロイントの不完全アジュバント中のペプチドまたは組換えタンパク質でブーストする。各構築体中のB細胞エピトープは、他のフリズルドイソ形態に対する液性応答において交差反応性がなくなるまで再度設計する必要があろう。
実施例2：HNSCCにおけるWntおよびFzd mRNAの発現
10の異なるHNSCC細胞系、2つの正常ヒト気管支上皮（NHBE）細胞系、および正常口腔扁平上皮細胞を、5つのWnt（Wnt-1、Wnt-5a、Wnt-7a、Wnt-10b、Wnt-13）、および2つのFzd（Fzd-2および5）の発現につき、RT-PCRによってテストした。代表的な結果を図8に示し、表1にまとめる。ハウスキーピング遺伝子G3PDHと比較すると、全てのWnt、ならびにFzd-2は正常細胞におけるよりもHNSCCにおいてより頻繁に発現され、他方、Fzd-5遺伝子発現では差はなかった。Wnt遺伝子のうち、Wnt-1、5a、および10bは悪性細胞によって最も強力に発現されたが、テストした正常組織ではほとんど検出できなかった。我々は、次いで、さらにWnt-1およびWnt-10bを調べた。というのは、これらのWntは標準的β-カテニンおよびLEF/TCFを通じてシグナリングを行うからであり、また、細胞外ドメインに対する抗体が入手可能だったからである。
実施例3：HNSCCにおけるWnt/Fzdタンパク質の発現
細胞系を溶解させ、免疫ブロッティングによって、Wnt-1、Wnt-10b、Fzd-2、およびβ-カテニンタンパク質の発現につき分析した（図9）。RPMI2650を例外として、テストしたHNSCCと比較して、正常細胞はこれらのWntまたはFzdタンパク質をかなり少なく発現した。注目すべきは、RT-PCRによる弱く検出可能な産物を有するNHBE細胞系の溶解物における検出可能なFzdタンパク質の欠如である。β-カテニンは、HNSCCおよびNHBE系を含めた、全ての試料で検出された。
実施例4：抗Wnt抗体およびSFRP1の効果
Wnt-1またはWnt-10bの細胞外ドメインに対する抗体での処理は、SNU1076HNSCC細胞系の増殖を減少させ（図10）、他方、PCI13細胞では効果はほとんど観察されなかった（データは示さず）。抗体による細胞増殖の阻害は濃度およびインキュベーション時間に依存した。対照抗体ではなく、抗Wnt抗体でのSNU1076HNSCC細胞系の処理もまたアポトーシスを誘導した（図12）。抗Wnt抗体と同様に、組換えSFRPIタンパク質（2μg/ml）、Wntシグナリングの天然アンタゴニストでの処理は、SNU1076細胞の増殖を阻害した（図11）。
SNU1076細胞に対する抗Wnt抗体の効果がWntシグナリングの阻害に関連するかを判断するために、我々は、Wnt調節遺伝子サイクリンD1およびフィブロネクチンのレベルを比較した（図7A）。対照IgGではなく抗Wnt-1抗体は、SNU1076細胞のサイトゾルにおけるサイクリンD1、フィブロネクチン、β-カテニンのレベルを低下させた。これらの結果を確認するために、TOPFLASH-Luc、TCF/LEF結合部位を含むレポータープラスミド、またはFOPFLASH-Luc、突然変異体結合部位を有する陰性対照プラスミドを、pCMV-β-galプラスミドと共にSNU1076細胞に導入した（トランスフェクション効率を評価するため）。ルシフェラーゼ活性はFOPFLASHトランスフェクト細胞よりもTOPFLASHにおいてより高く、これは、LEF/TCF依存性転写が構成的に活性であることを示す。FOPFLASHでトランスフェクトされた細胞は、抗Wnt1抗体での処理後に低いベースラインのルシフェラーゼ活性において変化を示さず、他方、TOPFLASHでトランスフェクトされた細胞は低下したルシフェラーゼ活性を呈した（図7B）。
実施例5：抗フリズルド抗体の効果
フリズルド受容体を介するWntシグナリングはアポトーシスを阻害すると記載されている（Chen,S.et al.,「Wnt-1 signaling inhibits apoptosis by activating beta-catenin/T cell factor-mediated transcription,」J Cell Biol 152:87-96（2001））。また、TCF/β-カテニンによって調節される遺伝子のいくつかは細胞周期および細胞増殖に関連することが知られている。Wntタンパク質の、フリズルドの細胞外部分に向けられた抗体を介するその受容体への結合をブロックすることによって、この経路を中断できる。β-カテニンの核への下流移動を減少させると、より遅い腫瘍増殖または細胞の死滅がもたらされうる。
次いで、細胞培養において増殖を遅延させる特異的抗体の作製において有用でありうる免疫化戦略を、マウスにおける潜在的インビボ効率につきテストする。以前、我々は、C57B1/6マウスにおける同系腫瘍としてH-2b胸腺腫系EL4を用いた（Corr,M.et al.,「Costimulation provided by DNA immunization enhances antitumor immunity,」J Immunol 159:4999-5004（1997））；（Cho,H.J.et al.,「Immunostimulatory DNA-based vaccines induce cytotoxic lymphocyte activity by a T-helper cell-independent mechanism,」Nat Biotechnol 18:509-514（2000））。この系をヒトフリズルド2発現ベクターでトランスフェクトし、ネオマイシンで選択する。発現ベクターは、Nde1およびBamH1で、1つの発現ベクターからのインサートを含有するフリズルド2を切り出し、CMVプロモーターおよびネオマイシン選択カセットを有するpcDNA3（Invitrogen）に前記インサートを連結することによって作成する。32匹の雌C57B1/6マウスを各々8匹マウスの群に分ける。それらに、0、1および2週にて、正規生理食塩水中に希釈した共刺激因子をコードする50μgのプラスミドおよび50μgのリンカープラスミドの組合せを尾の真皮に注射する。空のベクターを有する群を陰性対照として含ませる。28日に、マウスの脇腹に、20×106のフリズルド2トランスフェクトEL4細胞または未トランスフェクト細胞を皮下注射する（Cho,H.J.et al.,「Immunostimulatory DNA-based vaccines induce cytotoxic lymphocyte activity by a T-helper cell-independent mechanism,」Nat Biotechnol 18:509-514（2000））。マウスを体重につき1週間に3回モニターし、腫瘍の増殖をキャリパーで測定する。腫瘍の容量は従前に記載されているように長さ×幅2×π/6によって計算する（Radulovic,S.et al.,「Inhibition of growth of HT-29 human colon cancer xenografls in nude mice by treatment with bombesin/gastrin releasing peptide antagonist（RC-3095）,」Cancer Res 51:6006-6009（1991））。腫瘍チャレンジから4週間後に、またはもし腫瘍負荷がほぼ2000mm3に到達すれば、マウスを犠牲にする。腫瘍増殖の阻害はANOVAによって測定する。
免疫化戦略によって作られるポリクローナル抗体は結合を呈することができるが、生物学的効果を有するのにはポリクローナル血清中に十分には濃縮することができない。いくつかの免疫化戦略からの血清は、腫瘍防止のためのインビボ活性免疫化戦略を進める前に、その潜在的治療有用性につきインビトロでテストする必要があろう。ネズミモデルにおける腫瘍増殖の阻害は、細胞応答ならびに液性応答によるものであり、これは、さらなる調査に導くであろう。これらのアッセイは、フリズルド発現細胞系がポリクローナル抗フリズルドIgGの抗増殖活性に感受性であるかを判断するのに有用であろう。
実施例6：Wnt14および16の過剰発現
公のヒトDNA遺伝子データベース中の配列に基づき、我々は、全ての既知のヒトWntおよびフリズルド遺伝子につき遺伝子特異的プライマーを調製した。我々は、一次ヒト慢性リンパ性白血病細胞または正常ヒトリンパ球からmRNAを得た。リアルタイムPCRを用い、次いで、我々は、対照遺伝子GAPDHおよび18SのmRNAと比較した、正常および悪性リンパ球におけるWntおよびフリズルド遺伝子の相対的発現を比較した。我々は、Wnt16が悪性リンパ球では70〜100倍過剰発現されていることを発見した。Wnt14は悪性リンパ球では400倍過剰発現された。我々は、アンプリコンを配列決定して、それらの同一性を判断した。正常ヒト組織のノーザンブロットにより、非リンパ系細胞における、および末梢血液リンパ球におけるWnt16 mRNAの有意な発現の欠如が確認された。前記した手法の後、我々は、非交差反応抗体を用いて悪性細胞におけるWnt16の過剰発現を確認し、同様にしてWnt14の過剰発現を確認するであろう。我々は正常リンパ球を対照として用いて、インビトロにて細胞生存に対する抗Wnt16抗体の効果をテストし、同様にして抗Wnt14抗体をテストするであろう。加えて、我々の結果をレビューすると、我々は、治療剤としてのこれらの抗体および抗原を開発することができる。
実施例7：インテグリンによるリンパ球生存の調節
リンパ球の生存は、その周囲のミクロ環境において間質細胞によって生産された細胞外マトリックスタンパク質との相互作用を必要とする。これらの相互作用は細胞を自然発生および薬物誘導アポトーシスに対して抵抗性とすることがある。VLA4インテグリン媒介細胞接着は、いくつかの白血病細胞系において細胞生存を調節するに関与していることが知られている。我々は、初代血液リンパ球の生存に対するインテグリンの効果を研究しつつある。我々のデータは、フィブロネクチンのα4-CS1断片が血液リンパ球の生存を有意に改良することを示している。インテグリンアンタゴニストを細胞傷害性薬物と組み合わせる優れた治療的戦略を開発するために、我々は、いくつかのインテグリンα4特異的アンタゴニストのメカニズムを調査中である。これらの化合物はB慢性リンパ性白血病細胞のフィブロネクチンへの接着を特異的に阻害する。我々は、現在、一次ヒトリンパ球におけるこれらのインテグリンアンタゴニストによって影響されるシグナリング事象を研究しつつある。
実施例8：正常および悪性リンパ球におけるWnt遺伝子発現
多様なWnt遺伝子ファミリーの分泌されたタンパク質が、細胞の増殖および分化において重要な役割を演じることが知られている。証拠は、Wntシグナリングがアポトーシスを調節できることを示唆する。以下に記載する実験は、休止リンパ球で最も高度に発現されるWnt遺伝子を同定し、次いで、細胞生存におけるその潜在的役割を決定するように設計した。
全RNAを調製し、RNaseフリーのDNaseで処理した。cDNAは、Superscript逆転写酵素およびオリゴdTを用いて5μgの全RNAから合成した。ゲノムDNA汚染がないことを確認するために、逆転写酵素を加えない対照も実施した。TaqManリアルタイムPCRは、ABI PRISM 7700配列検出器を用いて行った。46のWntファミリーメンバーについてのプライマーおよびプローブならびにそれらの関連遺伝子は、Primer Expressバージョン1.0（Applied Biosystems）を用いて設計した。プライマーを図13Aおよび13Bに示す。反応条件は以下の通りであった。50℃で2分（1サイクル）、95℃で10分（1サイクル）、および95℃で15秒、ならびに60℃で1分（45サイクル）。各遺伝子について二連で行った。
TaqManリアルタイムPCRアッセイを開発し、有効化して、wntファミリーおよびその関連遺伝子の遺伝子発現プロフィールを定量して、我々は、3つのB-CLL、2つの正常末梢血液リンパ球集団、および1つの精製されたB細胞試料における遺伝子発現プロフィールを測定した。我々は、wnt6、wnt14およびwnt16が、正常PBLまたは精製されたB細胞と比較して、B-CLLにおいて過剰発現されることを見出した。B-CLLにおけるWnt14 mRNAのレベルはPBLおよびB細胞試料のそれの16〜178倍であった。B-CLL試料におけるwnt6 mRNAの濃度は正常PBLおよびB-CLL試料におけるそれよりも8〜32倍高かった。Wnt16 mRNAはPBLにおけるよりもB-CLLにおいて32〜178倍高いレベルで発現された。Fzd、Frp、WispおよびDKKのような他のWnt関連ファミリーについては、我々はいずれの有意な差も観察しなかった。従って、Wnt遺伝子の過剰発現はユニークなようである。
我々は、一次ヒトリンパ球と細胞外マトリックスタンパク質とのインテグリン依存性相互作用を研究するためのモデル系を確立し、結合が細胞生存を促進することを示した。こうして正常および悪性細胞双方において細胞のシグナリングおよびアポトーシスに対するインテグリンアンタゴニストの効果をテストすることができる。
他の実験は、正常末梢血液リンパ球と比較して、B-CLLを有する患者のリンパ球において過剰発現される3つのwnt遺伝子を明らかにした。wntタンパク質は分泌されるので、それらは悪性細胞に対する生存因子として機能することができる。
老化およびアポトーシスを遅延させるフィーダー細胞リンパ球相互作用の特異性は、精製されたリンパ球亜集団（CD4、T細胞、CD8、T細胞、B細胞）を用い、異なるフィーダー細胞（単球、樹状細胞、内皮細胞、線維芽細胞）と共に共培養し、次いで、自然発生および薬物誘導アポトーシス双方を測定することによって同定される。
リンパ球の延長された生存を担う特異的表面分子および/または分泌された因子は、フィーダー細胞およびリンパ球に対する表面抗原に対する抗体をブロッキングする効果をテストし、サイトカインおよび成長因子に対する抗体を中和する効果を測定し、次いで、フィーダー細胞のセンスおよびアンチセンストランスフェクトーマ（transfectoma）を生じさせて、記載した最初の2つの方法に関与する特異的相互作用の役割を確認することによって同定される。
フィーダー細胞との接触によって改変され、かつそれらの生存を増大させる休止リンパ球における細胞内シグナリング経路は、鍵となる活性化経路におけるタンパク質（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ、STAT、NF-Kb、b-カテニン）のレベルおよびリン酸化状態を測定し、アポトーシスを調節するタンパク質（bcl2ファミリーメンバー、カスパーゼ、IAP、SMAC/DIABLO）のレベルおよびリン酸化状態を評価し、次いで、単独、あるいは細胞傷害性剤と組み合わせた、フィーダー細胞で培養された休止リンパ球の生存に対するシグナル伝達の薬理学的阻害剤の効果をテストすることによって同定される。
実施例9：一次乳癌腫瘍およびCLL細胞におけるWntおよびFzd遺伝子の発現
WntおよびFzdレベルは、乳癌腫瘍およびCLL細胞からの一次癌細胞において比較した。結果を図14〜27に示す。プライマーおよびハイブリダイゼーションプローブは図13Aおよび13Bに示す。遺伝子の発現レベルはリアルタイムPCRを用いて測定した。簡単に述べれば、全RNAはRNA STAT-60を用いて顕微解剖した組織から単離し、ランダムヘキサマープライマーおよびSuperscript Preamplificationシステムを用いて逆転写した。次いで、18S RNAを対照遺伝子として用いてリアルタイムPCRを行った。PCRは、95℃で15秒間および60℃で10分間の初期活性化と、95℃で15秒間および60℃で1分間を40サイクルでTaqman Universal PCR MasterMixで行った。蛍光シグナルをサイクル数に対してプロットし、閾値サイクルを決定した。12の正常組織のプールからのcDNAの希釈物を陽性対照として用いた。相対的メッセージレベルを、通常はSCORの異なる成分によって用いられ、かつResearch Resources Coreによって共働される標準キャリブレーション曲線に対して計算した。テストした組織における異なる部位の間の対様式比較を、統計学的解析で用いた。図13Aおよび13Bは、分析した遺伝子についてのプライマー組およびTaqmanハイブリダイゼーションプローブを示す。これらのプライマーは、正常ヒト組織および未分画RA滑液検体の分析で従前に有効化された
図面中のデータは相対的なものであり、最低の正常組織のレベルに1の値が割り当てられた。従って、乳癌腫瘍またはCLL細胞における100の相対的値は、癌細胞が、リアルタイムPCRによって報告して、最低正常組織の値の100倍を有したことを意味する。
CLL細胞は高いwnt16レベルを有し、wnt3をやはり過剰発現する（図14）。CLL細胞もやはりFzd3を発現する。（図16〜17）
乳癌細胞は非常に高いwnt7bレベルを発現した。（図14および27）乳癌における正常細胞レベルよりも5倍を超えて大きなレベルで発現される他の特異的Wntはwnt5a、wnt10b、wnt14を含む。（Id.）乳癌腫瘍は、fzd3、fzd4、fzd6、fzd7、およびfzd10を含む特異的Fzdを高レベルで発現した。（図16〜19）
Wnt下流シグナリング遺伝子およびWntアンタゴニストの発現レベルもまた正常細胞、CLL細胞、および一次乳癌で測定した。これらの遺伝子のレベルは発現されたwnt遺伝子およびタンパク質の活性に相関する。DKKおよびFRP2/4は、wntまたはフリズルド共受容体LRP5いずれかに結合するwnt/fzdシグナリング経路のアンタゴニストである。DKKレベルはいくつかの乳癌腫瘍で増加した。（図20）FRP2/4はいくつかの乳癌腫瘍で過剰発現された。（図21）
Wnt誘導性遺伝子はサイクリンD1、c-myc、およびWISPを含む。WISPとはwnt誘導性血清タンパク質をいい、WISP2とはwnt誘導性血清タンパク質2をいう。WISP2の発現は乳癌細胞で増大していた。（図27）サイクリンD1およびc-mycのレベルもやはり正常細胞における発現レベルに対して高かった。（図23〜24および27）サイクリンD1のレベルもまた正常リンパ球に対してCLL細胞で上昇した。（図23〜24）これは、乳癌で観察された特異的wntおよびfzd発現が、wnt/fzdシグナルから下流の遺伝子およびタンパク質の誘導に導くことを示す。すなわち、特異的wntおよびfzdタンパク質は活性であって、それらの発現の結果シグナル伝達がもたらされる。対照遺伝子産物IL-6およびMMP3、乳癌マーカーのレベルも測定した。（図25〜27）
特異的wnt/fzdシグナルによって誘導されるいくつかの遺伝子が、癌細胞を含む特異的細胞型における増殖に必要であるので、2つの分子の結合をブロックすることによる特異的wnt/fzdシグナルのブロッキングを用いて、細胞の増殖を阻害することができる。例えば、サイクリンD1は、いくつかの細胞型においてG1/S転移を介する継代に必要である。従って、単独で、または組み合わせて、特異的wntまたはfzdに対する抗体を用いて、特異的wnt/fzd相互作用をブロックすることができ、その結果、細胞増殖が阻害され、あるいはいくつかの場合には、アポトーシスが誘導される。
wnt5a、wnt7b、wnt10b、およびwnt14発現のレベルを、乳癌腫瘍からの試料で測定する。もしwnt遺伝子またはタンパク質が高度に発現されれば、過剰発現された遺伝子産物（例えば、wnt5a、wnt7b、wnt10b、またはwnt14）に対する抗体を患者に投与する。wnt特異的抗体の投与はwntシグナリングをブロックし、その結果、必要な下流wnt調節遺伝子およびタンパク質（例えば、サイクリンD1、c-myc、およびWISPファミリーのメンバー）の発現が減少し、あるいはなくなり、乳癌細胞の死滅に導く。ある場合には、wnt特異的抗体を放射性標識し、トキシンにコンジュゲートして、癌細胞の殺傷を促進する。補体カスケードまたは放射性標識またはトキシン-コンジュゲーテッド抗体の誘導を用いて、特異的wntを過剰発現するが、増殖または生存または増殖に対するその特異的wntに必要としない乳癌細胞を殺傷する。
fzd3、fzd4、fzd6、fzd7、およびfzd10の発現のレベルを、乳癌腫瘍からの試料において測定する。もしfzd遺伝子またはタンパク質が高度に発現されれば、過剰発現された遺伝子産物（例えば、fzd3、fzd4、fzd6、fzd7、およびfzd10）に対する抗体を患者に投与する。fzd特異的抗体の投与はfzdシグナリングをブロックし、その結果、必要な下流fzd調節遺伝子およびタンパク質（例えば、サイクリンD1、c-myc、およびWISPファミリーのメンバー）の発現が減少し、またはなくなり、乳癌細胞の死滅に導く。いくつかの場合において、fzd特異的抗体を放射性標識し、トキシンにコンジュゲートして、癌細胞の殺傷を促進する。補体カスケードまたは放射性標識またはトキシン-コンジュゲーテッド抗体の誘導を用いて、特異的fzdを過剰発現するが、生存につきその特異的fzdに頼らない乳癌細胞を殺傷する。
wnt16およびwnt3発現のレベルを、CLL細胞からの試料において測定する。もしwnt16またはwnt3遺伝子またはタンパク質が高度に発現されれば、過剰発現された遺伝子産物（例えば、wnt16またはwnt3）に対する抗体を患者に投与する。wnt特異的抗体の投与はwntシグナリングをブロックし、その結果、必要な下流wnt調節遺伝子およびタンパク質の発現を減少させ、またはなくし、CLL細胞の死滅に導く。いくつかの場合においては、wnt特異的抗体を放射性標識し、あるいはトキシンにコンジュゲートして、癌細胞の殺傷を促進する。補体カスケードまたは放射性標識またはトキシン-コンジュゲーテッド抗体の誘導を用いて、特異的wntを過剰発現するが、生存にはその特異的wntに頼らないCLL細胞を殺傷する。
Fzd3発現のレベルをCLL細胞からの試料において測定する。もしFzd3遺伝子またはタンパク質が高度に発現されれば、過剰発現された遺伝子産物（例えば、Fzd3）に対する抗体を患者に投与する。Fzd3特異的抗体の投与はFzd3シグナリングをブロックし、その結果、必要な下流fzd調節遺伝子およびタンパク質の発現を減少させ、またはなくすることができ、CLL細胞の死滅に導く。いくつかの場合においては、Fzd3特異的抗体を放射性標識し、あるいはトキシンにコンジュゲートして、癌細胞の殺傷を促進する。補体カスケードまたは放射性標識またはトキシン-コンジュゲーテッド抗体の誘導を用いて、特異的fzdを過剰発現するが、生存にその特異的fzdには頼らないCLL細胞を殺傷する。
実施例10：ヒト扁桃およびマントルゾーンリンパ腫におけるWntおよびFzd遺伝子の発現
抗wnt16抗体を用い、正常ヒト扁桃を染色した。抗体は、未成熟または活性化B細胞と考えられるマントルゾーンおよび生殖中心におけるB細胞を主として染色した（データは示さず）。
マントルゾーンリンパ腫は治癒できない攻撃的B細胞新形成であり、特異的wnt16抗体についての標的を表す。マントルゾーンリンパ腫細胞は、前記したリアルタイムPCRを用い、かつwnt16特異的抗体を用いてwnt16発現につきアッセイする。正常B細胞に対し、または、マントルゾーンリンパ腫細胞における他の特異的wntの発現に対してwnt16を過剰発現するマントルゾーンリンパ腫。特異的wnt16を過剰発現するマントルゾーンリンパ腫を、wnt16特異的抗体で処置して、下流wnt/fzd誘導遺伝子の発現に頼るリンパ腫細胞の増殖を阻害する。いくつかの場合には、マントルゾーンリンパ腫細胞を放射性標識またはトキシン-コンジュゲーテッドwnt16特異的抗体で処置して、細胞増殖を阻害し、またはマントルゾーンリンパ腫細胞のアポトーシスを誘導する。
その基本的技術から逸脱することなく、多数の修飾をこれまでのシステムに対してなすことができる。本発明を一つまたは複数の特別な態様を参照してかなり詳細に記載してきたが、当業者であれば、本出願で具体的に開示された態様に対して変更を加えることができ、これらの修飾および改良は請求の範囲に記載した本発明の範囲および精神内のものであることを認識するであろう。本明細書中で引用した全ての刊行物または特許書類は、あたかも各それらの刊行物または書類が、参照として本明細書に組み入れられるように具体的かつ個々に示されたように参照として本明細書に組み入れられる。
前記刊行物または書類の引用は、これまでのいずれかが重要な先行技術であることを自認する意図ではなく、またそれはこれらの刊行物または書類の内容または日付に関して何らかの自認を構成するものでもない。
いくつかの発生シグナリング経路を示す。 フリズルド2mRNAについてのHNSCCおよびB細胞系のサブセットのRT-PCR分析を示す。 フリズルド2、wnt1および10bについての腫瘍および正常細胞のウェスタンブロット分析を示す。 HNSCC系における増殖アッセイの阻害を示す。具体的には、抗フリズルド2、抗wnt1、および抗wnt10bを、増殖を阻害するそれらの能力につきテストする。 HNSCC系におけるWnt/フリズルドシグナリング経路の阻害のアポトーシス効果を示す。 ヒトフリズルド受容体の第一の細胞外領域の一部の配列整列を示す。 図7Aは、Wnt1またはWnt10b抗体での処理後の免疫ブロットを示す。SNU1076細胞を2μg/mlの抗Wnt1、Wnt10b、または対照抗体で72時間処理した。図7Bは、Wnt1抗体での処理がTCF/LEF遺伝子の転写を低下させることを示す。 図8Aは、癌細胞系におけるWnt/FZDファミリーについてのRT-PCR増幅を示す。図8Bは、正常細胞におけるWnt/FZDファミリーについてのRT-PCR増幅を示す。 正常および悪性細胞におけるFZD2、Wnt1、Wnt10b、β-カテニンおよびアクチンのタンパク質発現を示す。 SNU1076細胞系Wnt1およびWnt10bの増殖の阻害を示す。 可溶性WNTアンタゴニスト、分泌されたフリズルド関連タンパク質（SFRP）での増殖阻害を示す。 HNSCC系におけるWnt/フリズルドシグナリング経路の阻害のアポトーシス効果を示す。 wnt、fzd、およびwnt関連遺伝子の分析のためのプライマー配列を示す。 非腫瘍および腫瘍組織におけるwntの発現を示す。 非腫瘍および腫瘍組織におけるwnt14の発現を示す。 非腫瘍および腫瘍組織におけるfzdの発現を示す。 非腫瘍および腫瘍組織におけるfzd3の発現を示す。 非腫瘍および腫瘍組織におけるfzd6の発現を示す。 非腫瘍および腫瘍組織におけるfzd10の発現を示す。 非腫瘍および腫瘍組織におけるDKKの発現を示す。 非腫瘍および腫瘍組織におけるFRP2/4の発現を示す。 非腫瘍および腫瘍組織におけるWISP3の発現を示す。 非腫瘍および腫瘍組織におけるサイクリンD1の発現を示す。 非腫瘍および腫瘍組織におけるc-mycの発現を示す。 非腫瘍および腫瘍組織におけるIL-6の発現を示す。 非腫瘍および腫瘍組織におけるMMP3の発現を示す。 非腫瘍細胞および乳癌細胞におけるwnt、fzd、およびwnt関連遺伝子の発現を示す。
【配列表】
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Claims (140)

  1. 乳癌細胞の増殖または生存を阻害する方法であって、癌細胞は非癌細胞と比較してWnt/Fzdシグナリング経路においてWntタンパク質を過剰発現し、Wntタンパク質は、Wnt7b、Wnt-10b、およびWnt-14からなる群より選択される、癌細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤と癌細胞とを接触させる工程を含む方法。
  2. 薬剤がWnt/Fzdシグナリング経路のアンタゴニストである、請求項1記載の方法。
  3. 薬剤が、Wnt-7b、Wnt-10b、またはWnt-14に特異的に結合する抗Wnt抗体である、請求項2記載の方法。
  4. 抗Wnt抗体が補体による細胞毒性または殺傷を促進する、請求項3記載の方法。
  5. Wntタンパク質が同一癌細胞における別のWntタンパク質と比較して過剰発現される、請求項1記載の方法。
  6. Wntタンパク質が癌細胞の増殖または生存に必要である、請求項1記載の方法。
  7. 乳癌を有する患者を治療する方法であって、癌細胞は非癌細胞と比較してWnt/Fzdシグナリング経路においてWntタンパク質を過剰発現し、Wntタンパク質は、Wnt7b、Wnt8a、およびWnt-14からなる群より選択され、癌細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤と癌細胞とを接触させる工程を含む方法。
  8. 薬剤がWnt/Fzdシグナリング経路のアンタゴニストである、請求項7記載の方法。
  9. 薬剤が、Wnt7b、Wnt-10b、またはWnt-14に特異的に結合する抗Wnt抗体である、請求項8記載の方法。
  10. 抗Wnt抗体が補体による細胞毒性または殺傷を促進する、請求項9記載の方法。
  11. Wntタンパク質が同一癌細胞における別のWntタンパク質と比較して過剰発現される、請求項7記載の方法。
  12. Wntタンパク質が癌細胞の増殖または生存に必要である、請求項7記載の方法。
  13. 慢性リンパ性白血病細胞の増殖または生存を阻害する方法であって、癌細胞は非癌細胞と比較してWnt/Fzdシグナリング経路においてWntタンパク質を過剰発現し、Wntタンパク質はWnt3およびWnt-16からなる群より選択され、癌細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤と癌細胞とを接触させる工程を含む方法。
  14. 薬剤がWnt/Fzdシグナリング経路のアンタゴニストである、請求項13記載の方法。
  15. 薬剤がWnt3またはWnt-16に特異的に結合する抗Wnt抗体である、請求項14記載の方法。
  16. 抗Wnt抗体が補体による細胞毒性または殺傷を促進する、請求項15記載の方法。
  17. Wntタンパク質が同一癌細胞における別のWntタンパク質と比較して過剰発現される、請求項13記載の方法。
  18. Wntタンパク質が癌細胞の増殖または生存に必要である、請求項13記載の方法。
  19. 慢性リンパ性白血病を有する患者を治療する方法であって、癌細胞は非癌細胞と比較してWnt/Fzdシグナリング経路においてWntタンパク質を過剰発現し、Wntタンパク質はWnt3およびWnt-16からなる群より選択され、癌細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤と癌細胞とを接触させる工程を含む方法。
  20. 薬剤がWnt/Fzdシグナリング経路のアンタゴニストである、請求項19記載の方法。
  21. 薬剤がWnt3またはWnt-16に特異的に結合する抗Wnt抗体である、請求項20記載の方法。
  22. 抗Wnt抗体が補体による細胞毒性または殺傷を促進する、請求項21記載の方法。
  23. Wntタンパク質が同一癌細胞における別のWntタンパク質と比較して過剰発現される、請求項19記載の方法。
  24. Wntタンパク質が癌細胞の増殖または生存に必要である、請求項19記載の方法。
  25. マントルゾーンリンパ腫細胞の増殖または生存を阻害する方法であって、癌細胞は非癌細胞と比較してWnt/Fzdシグナリング経路においてWntタンパク質を過剰発現させ、Wntタンパク質はWnt-16であり、癌細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤と癌細胞とを接触させる工程を含む方法。
  26. 薬剤がWnt/Fzdシグナリング経路のアンタゴニストである、請求項25記載の方法。
  27. 薬剤がWnt-16に特異的に結合する抗Wnt抗体である、請求項26記載の方法。
  28. 抗Wnt抗体が補体による細胞毒性または殺傷を促進する、請求項27記載の方法。
  29. Wntタンパク質が同一癌細胞における別のWntタンパク質と比較して過剰発現される、請求項25記載の方法。
  30. Wntタンパク質が癌細胞の増殖または生存に必要である、請求項25記載の方法。
  31. マントルゾーンリンパ腫を有する患者を治療する方法であって、癌細胞は非癌細胞と比較してWnt/Fzdシグナリング経路においてWntタンパク質を過剰発現し、Wntタンパク質はWnt-16であり、癌細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤と癌細胞とを接触させる工程を含む方法。
  32. 薬剤がWnt/Fzdシグナリング経路のアンタゴニストである、請求項31記載の方法。
  33. 薬剤がWnt-16に特異的に結合する抗Wnt抗体である、請求項32記載の方法。
  34. 抗Wnt抗体が補体による細胞毒性または殺傷を促進する、請求項33記載の方法。
  35. Wntタンパク質が同一癌細胞における別のWntタンパク質と比較して過剰発現される、請求項31記載の方法。
  36. Wntタンパク質が癌細胞の増殖または生存に必要である、請求項31記載の方法。
  37. 乳癌細胞の増殖または生存を阻害する方法であって、癌細胞は非癌細胞と比較してWnt/Fzdシグナリング経路においてFzdタンパク質を過剰発現し、Fzdタンパク質は、Fzd3、Fzd4、Fzd6、Fzd7、またはFzd10からなる群より選択され、癌細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤と癌細胞とを接触させる工程を含む方法。
  38. 薬剤がWnt/Fzdシグナリング経路のアンタゴニストである、請求項37記載の方法。
  39. 薬剤が、Fzd3、Fzd4、Fzd6、Fzd7、またはFzd10に特異的に結合する抗Fzd抗体である、請求項38記載の方法。
  40. 抗Fzd抗体が補体による細胞毒性または殺傷を促進する、請求項39記載の方法。
  41. Fzdタンパク質が同一癌細胞における別のFzdタンパク質と比較して過剰発現される、請求項37記載の方法。
  42. Fzdタンパク質が癌細胞の増殖または生存に必要である、請求項37記載の方法。
  43. 乳癌を有する患者を治療する方法であって、癌細胞は非癌細胞と比較してFzdタンパク質を過剰発現し、Fzdタンパク質は、Fzd3、Fzd4、Fzd6、Fzd7、またはFzd10からなる群より選択され、癌細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤を患者に投与する工程を含む方法。
  44. 薬剤がWnt/Fzdシグナリング経路のアンタゴニストである、請求項43記載の方法。
  45. 薬剤が、Fzd3、Fzd4、Fzd6、Fzd7、またはFzd10に特異的に結合する抗Fzd抗体である、請求項44記載の方法。
  46. 抗Fzd抗体が補体による細胞毒性または殺傷を促進する、請求項45記載の方法。
  47. Fzdタンパク質が同一癌細胞における別のFzdタンパク質と比較して過剰発現される、請求項43記載の方法。
  48. Fzdタンパク質が癌細胞の増殖または生存に必要である、請求項43記載の方法。
  49. 慢性リンパ性白血病細胞の増殖または生存を阻害する方法であって、癌細胞は非癌細胞と比較してWnt/Fzdシグナリング経路においてFzdタンパク質を過剰発現し、Fzdタンパク質はFzd3であり、癌細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤と癌細胞とを接触させる工程を含む方法。
  50. 薬剤がWnt/Fzdシグナリング経路のアンタゴニストである、請求項49記載の方法。
  51. 薬剤がFzd3に特異的に結合する抗Fzd抗体である、請求項50記載の方法。
  52. 抗Fzd抗体が補体による細胞毒性または殺傷を促進する、請求項51記載の方法。
  53. Fzdタンパク質が同一癌細胞における別のFzdタンパク質と比較して過剰発現される、請求項49記載の方法。
  54. Fzdタンパク質が癌細胞の増殖または生存に必要である、請求項49記載の方法。
  55. 慢性リンパ性白血病を有する患者を治療する方法であって、癌細胞は非癌細胞と比較してWnt/Fzdシグナリング経路においてFzdタンパク質を過剰発現し、Fzdタンパク質はFzd3であり、癌細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤と癌細胞とを接触させる工程を含む方法。
  56. 薬剤がWnt/Fzdシグナリング経路のアンタゴニストである、請求項55記載の方法。
  57. 薬剤がFzd3に特異的に結合する抗Fzd抗体である、請求項56記載の方法。
  58. 抗Fzd抗体が補体による細胞毒性または殺傷を促進する、請求項57記載の方法。
  59. Fzdタンパク質が同一癌細胞における別のFzdタンパク質と比較して過剰発現される、請求項55記載の方法。
  60. Fzdタンパク質が癌細胞の増殖または生存に必要である、請求項55記載の方法。
  61. 癌細胞の増殖または生存を阻害する方法であって、癌細胞は非癌細胞と比較してWntタンパク質を過剰発現し、また癌細胞は非癌細胞と比較して下流wnt/fzd調節遺伝子産物を過剰発現し、癌細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤と癌細胞とを接触させる工程を含む方法。
  62. Wntタンパク質が同一癌細胞における別のWntタンパク質と比較して過剰発現される、請求項61記載の方法。
  63. Wntタンパク質が癌細胞の増殖または生存に必要である、請求項61記載の方法。
  64. 癌が乳癌である、請求項61記載の方法。
  65. Wntタンパク質が、Wnt7b、Wnt-10b、およびWnt-14からなる群より選択される、請求項61記載の方法。
  66. 下流wnt/fzd調節遺伝子産物が、サイクリンD1、c-myc、およびWISP2からなる群より選択される、請求項61記載の方法。
  67. 癌細胞の増殖または生存を阻害する方法であって、癌細胞は非癌細胞と比較してFzdタンパク質を過剰発現し、また癌細胞は下流wnt/fzd調節遺伝子産物を過剰発現し、癌細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤と癌細胞とを接触させる工程を含む方法。
  68. Fzdタンパク質が同一癌細胞における別のFzdタンパク質と比較して過剰発現される、請求項67記載の方法。
  69. Fzdタンパク質が癌細胞の増殖または生存に必要である、請求項67記載の方法。
  70. 癌が乳癌である、請求項67記載の方法。
  71. Fzdタンパク質が、Fzd3、Fzd4、Fzd6、Fzd7、およびFzd10からなる群より選択される、請求項67記載の方法。
  72. 下流wnt/fzd調節遺伝子産物が、サイクリンD1、c-myc、およびWISP2からなる群より選択される、請求項67記載の方法。
  73. 癌を有する患者を治療する方法であって、癌細胞は非癌細胞と比較してWntタンパク質を過剰発現し、また癌細胞は非癌細胞と比較して下流wnt/fzd調節遺伝子産物を過剰発現し、癌細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤を患者に投与する工程を含む方法。
  74. Wntタンパク質が同一癌細胞における別のWntタンパク質と比較して過剰発現される、請求項73記載の方法。
  75. Wntタンパク質が癌細胞の増殖または生存に必要である、請求項73記載の方法。
  76. 癌が乳癌である、請求項73記載の方法。
  77. Wntタンパク質が、Wnt7b、Wnt-10b、およびWnt-14からなる群より選択される、請求項73記載の方法。
  78. 下流wnt/fzd調節遺伝子産物が、サイクリンD1、c-myc、およびWISP2からなる群より選択される、請求項73記載の方法。
  79. 癌を有する患者を治療する方法であって、癌細胞は非癌細胞と比較してFzdタンパク質を過剰発現し、また癌細胞は非癌細胞と比較して下流wnt/fzd調節遺伝子産物を過剰発現し、癌細胞においてWnt/Fzdシグナリング経路を阻害する薬剤を患者に投与する工程を含む方法。
  80. Fzdタンパク質が同一癌細胞における別のFzdタンパク質と比較して過剰発現される、請求項79記載の方法。
  81. Fzdタンパク質が癌細胞の増殖または生存に必要である、請求項79記載の方法。
  82. 癌が乳癌である、請求項79記載の方法。
  83. Fzdタンパク質が、Fzd3、Fzd4、Fzd6、Fzd7、およびFzd10からなる群より選択される、請求項79記載の方法。
  84. 下流wnt/fzd調節遺伝子産物が、サイクリンD1、c-myc、およびWISP2からなる群より選択される、請求項79記載の方法。
  85. Wnt-1をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  86. 生物学的試料中のWnt-1をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料中に存在するWnt-1をコードする核酸と請求項85記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  87. Wnt-2をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  88. 生物学的試料中のWnt-2をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料中に存在するWnt-2をコードする核酸と請求項87記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  89. Wnt-2bをコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  90. 生物学的試料中のWnt-2bをコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するWnt-2bをコードする核酸と請求項87記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  91. Wnt-3をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  92. 生物学的試料中のWnt-3をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するWnt-3をコードする核酸と請求項91記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  93. Wnt-3aをコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  94. 生物学的試料中のWnt-3aをコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するWnt-3aをコードする核酸と請求項93記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  95. Wnt-4をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  96. 生物学的試料中のWnt-4をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するWnt-4をコードする核酸と請求項95記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  97. Wnt-5aをコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  98. 生物学的試料中のWnt-5aをコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するWnt-5aをコードする核酸と請求項97記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  99. Wnt-5bをコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  100. 生物学的試料中のWnt-5bをコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するWnt-5bをコードする核酸と請求項99記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  101. Wnt-6をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  102. 生物学的試料中のWnt-6をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するWnt-6をコードする核酸と請求項101記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  103. Wnt-7aをコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  104. 生物学的試料中のWnt-7aをコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するWnt-7aをコードする核酸と請求項103記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  105. Wnt-7bをコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  106. 生物学的試料中のWnt-7bをコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するWnt-7bをコードする核酸と請求項105記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  107. Wnt-8aをコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  108. 生物学的試料中のWnt-8aをコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するWnt-8aをコードする核酸と請求項107記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  109. Wnt-8bをコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  110. 生物学的試料中のWnt-8bをコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するWnt-8bをコードする核酸と請求項109記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  111. Wnt-10aをコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  112. 生物学的試料中のWnt-10aをコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するWnt-10aをコードする核酸と請求項111記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  113. Wnt-10bをコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  114. 生物学的試料中のWnt-10bをコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するWnt-10bをコードする核酸と請求項113記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  115. Wnt-11をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  116. 生物学的試料中のWnt-11をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するWnt-11をコードする核酸と請求項115記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  117. Wnt-14をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  118. 生物学的試料中のWnt-14をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するWnt-14をコードする核酸と請求項117記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  119. Wnt-16をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  120. 生物学的試料中のWnt-16をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するWnt-16をコードする核酸と請求項119記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  121. Fzd1をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  122. 生物学的試料中のFzd1をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するFzd1をコードする核酸と請求項121記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  123. Fzd2をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  124. 生物学的試料中のFzd2をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するFzd2をコードする核酸と請求項123記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  125. Fzd3をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  126. 生物学的試料中のFzd3をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するFzd3をコードする核酸と請求項125記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  127. Fzd4をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  128. 生物学的試料中のFzd4をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するFzd4をコードする核酸と請求項127記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  129. Fzd5をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  130. 生物学的試料中のFzd5をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するFzd5をコードする核酸と請求項129記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  131. Fzd6をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  132. 生物学的試料中のFzd6をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するFzd6をコードする核酸と請求項131記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  133. Fzd7をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  134. 生物学的試料中のFzd7をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するFzd7をコードする核酸と請求項133記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  135. Fzd8をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  136. 生物学的試料中のFzd8をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するFzd8をコードする核酸と請求項135記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  137. Fzd9をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  138. 生物学的試料中のFzd9をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するFzd9をコードする核酸と請求項137記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
  139. Fzd10をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする約100ヌクレオチド未満の単離されたポリヌクレオチドであって、
    Figure 2006517390
    からなる群より選択されるポリヌクレオチドと同一の配列に特異的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。
  140. 生物学的試料中のFzd10をコードする核酸の存在または非存在を特異的に検出する方法であって、試料に存在するFzd10をコードする核酸と請求項139記載のポリヌクレオチドとの間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で試料とポリヌクレオチドとを接触させる工程と、特異的ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出する工程とを含む方法。
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