JP2006511461A - マイクロカプセル化された物質及びそれらを作成する方法 - Google Patents

Abstract

カプセル化される物質及びカプセル化する物質（例えばアルブミン）の可溶化形態を、植物油、鉱物油及び／又は低級アルコールを含む攪拌した冷却溶媒系中で噴霧することによって、生体活性物質、例えばタンパク質ポリマー又は薬剤のミクロスフィアを形成し、その結果、ミクロファージによって摂取される場合、形成されたミクロスフィアが細胞内生体活性を示す方法。

Description

本発明は、薬剤送達システムの分野に関する。具体的には、本発明は、非抗原性の、生分解性物質を用いてマイクロカプセル化された薬剤を調製するための方法、さらに、マクロファージ、内皮細胞、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞、樹状細胞などのような食細胞、又は疾患を持つ臓器（例えば、肝臓、腎臓、肺、心臓、脾臓）又は疾患部位（例えば、腫瘍、関節炎の関節）を標的とし、それらの標的部位で生分解性コーティングが消化され、元の状態のままの薬剤又は活性成分を細胞内又は蓄積部位に放出する、マイクロカプセル化組成物に関する。このような組成物は、疾患の処置及び予防において有用である。

（関連する出願の相互参照）
本出願は、同時係属中の米国出願番号第１０／２３１，７９１号（２００２年８月２９日出願、係属中）の優先権の利益を請求する。米国出願番号第１０／２３１，７９１号は、米国特許第６，５５５，１１０号（２００３年４月２９日登録）の一部継続出願であり、米国特許第６，５５５，１１０号は、出願番号第０８／４３４，５４２号（１９９５年５月４日出願）の継続出願であり、出願番号第０８／４３４，５４２号は、０７／９７７，０５７（１９９２年１１月１６日出願（現在は放棄されている））の一部継続出願であり、これら全ては本願と同一の譲受人に一般に譲渡された出願である。これらの出願の全ての開示内容は、本明細書中にその全体が参考として組み込まれる。

アルブミンミクロスフィア（「ＭＳ」）中に含有される水溶性化合物のマイクロカプセル化により、マクロファージ／単核細胞のような食細胞を標的化し、炎症誘発性のサイトカインに優位性をもつことが、本発明者らの実験によって示されている（以前の同時係属中の出願に開示されている）。この技術は、中和抗体のようなサイトカインを阻害する化合物の効力を高めることが示されている。本発明者らは、ＣＮＩ−１４９３（ｐ３８ ＭＡＰキナーゼを阻害するグアニルヒドラゾン化合物）、クロドロネート（ビスホスホネート）、酸化防止剤（例えば、ピロリジンジチオカルバメート）、及びＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴマーのような他のカテゴリーの薬剤を含有するアルブミンミクロスフィアを調製する方法をさらに評価した。これらの化合物のマイクロカプセル化は、in vitro全血モデル、内毒素ショックモデル、及び微生物敗血症性ショックモデルにおいて、ＴＮＦ、及びＩＬ１−βのようなサイトカインの阻害を高める。さらに、本発明者らは、マウスにおける腫瘍の予防において非常によく研究されている、黒色腫ワクチン調製物の調製及び完成した効力試験を評価した。

本発明の第１の実施形態では、以前に開発した乳化の方法論（上に引用される同時係属中の出願に記載されている）の種々のプロセスパラメーター、物質及び反応条件が拡張される。

特定の疾患部位への薬剤送達は、患者の副作用を減らすのに役立ち、それにより、毒性を減らすことができる。マイクロカプセル化形態の薬剤を使用することによって、疾患のない臓器及び組織に対する薬剤の暴露を防ぐことができる。

乳化媒体としてオリーブ油を使用する乳化方法によってマイクロカプセル化モノクローナル抗体を製造するための方法論は、同時係属中の出願において以前に開示されている。本発明者らは、本明細書中で、乳化媒体として種々の異なる油中で、異なる温度下で調整した、生体活性タンパク質薬剤、すなわち、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの追加データを開示し、さらに、薬剤を溶解するための異なる水性溶媒を使用したプロセスを評価する。

本発明の第２の実施形態では、ミクロスフィアは、異なる薬剤の例、異なる溶媒、異なる温度及び種々の方法論を用いて、新規な噴霧方法によって調製される。

この乳化方法を用いて評価される他の種類の薬剤を以下に示す：
（ａ）生体活性タンパク質薬剤：（例えば、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド）；
（ｂ）ワクチン調製物：抗腫瘍（黒色腫腫瘍）ワクチン調製物；
（ｃ）化学薬剤：例えば、ＣＮＩ−１４９３（グアニルヒドラゾン化合物）及びクロドロネート（ビスホスホネート）。

本実施形態において、本発明者らは、異なる溶媒、異なる温度及び種々の方法論を評価した。この噴霧方法を用いて評価される薬剤は、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

特定の実施形態では、本発明は、噴霧によって生体活性物質をカプセル化する方法を提供し、この方法は：
ａ．水中にアルブミンを溶解する工程；
ｂ．ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴマー）をリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中に溶解する工程；
ｃ．上記溶解させたアルブミン及び上記可溶化させたＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴマー）を混合する工程；
ｄ．工程ｃで形成された上記混合物を冷却する工程；
ｅ．溶媒を準備する工程；
ｆ．工程ｅの上記溶媒を冷却する工程；
ｇ．工程ｆの上記溶媒を冷却した温度に維持して溶媒系を形成する工程；
ｈ．工程ｇの上記溶媒を攪拌しながら、上記溶解させたアルブミン及び上記溶解させたＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴマー）を上記溶媒中に噴霧する工程；
ｉ．工程ｈのマイクロカプセル化したアルブミン−薬剤ミクロスフィアを含有する上記溶媒系中のミクロスフィアのサイズを評価して、ミクロスフィアを得る工程；
ｊ．上記溶媒系を冷却した温度に維持しながら、攪拌しつつ、上記ミクロスフィアとグルタルアルデヒドとを架橋させる工程；
ｋ．工程ｊの上記ミクロスフィアを溶媒を用いて洗浄する工程；
ｌ．工程ｋの上記ミクロスフィアのサイズを測定する工程；及び
ｍ．工程ｌの上記ミクロスフィアを凍結乾燥させる工程を含む。

上述の送達システムは、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、食細胞（例えば、マクロファージ、白血球、樹状細胞及び内皮細胞）が関与するサイトカインで媒介されるプロセスを抑制するのに非常に有用であることを示す。これらの研究から、以下のような適用に関連すると考えられる：

（Ａ）サイトカイン関連疾患：
（ａ）繊維化症候群：ＴＧＦ−βに対するアンチセンス化合物が、繊維化症候群におけるＴＧＦ−βの関与を阻害するために使用可能である。
（ｂ）慢性関節リウマチ：ＴＮＦ−α及びＩＬ−１−βに対するアンチセンス化合物は、慢性関節リウマチにおいて使用可能である。
（ｃ）移植拒絶：ＴＮＦ−α及びＩＬ−１−βに対するアンチセンス化合物が、臓器移植において、サイトカイン放出（例えば、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１−β）を抑制するために使用可能である
（ｄ）再潅流障害：ＴＮＦ−α及びＩＬ−１−βに対するアンチセンス化合物が、再潅流障害においてサイトカイン放出を抑制するために使用可能である。
（ｅ）敗血症性ショック：ピロリジンジチオカルバメート（抗酸化薬剤）は、サイトカイン放出（例えば、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１−β）を抑制するために使用可能である。この薬剤は、ＮＦ−ｋＢ活性化を抑制する。ＮＦ−ｋＢは、炎症誘発性のサイトカインの活性化の原因となる核転写因子である。

（Ｂ）ワクチン送達システム：
（ａ）抗腫瘍ワクチン：ミクロスフィアは、種々の型のワクチン（本明細書中で示される黒色腫腫瘍ワクチンと類似のもの）の効果的なワクチン送達システムとして使用可能である。
（ｂ）抗ＡＩＤＳワクチン：ミクロスフィアは、抗ＡＩＤＳウイルスのための効果的なワクチン送達システムとして使用可能である。ＡＩＤＳウイルスは、感染すると、マクロファージ内で増殖する。ミクロスフィアが非常に効率よくマクロファージ内に取り込まれるため、抗ＡＩＤＳワクチン調製物をミクロスフィア内に添加することにより、マクロファージを直接的に標的化することができる。さらに、これらのミクロスフィアは、抗ＡＩＤＳ薬剤（例えば、ＡＺＴ）を含有することができ、ＡＩＤＳウイルスが増殖することが知られている部位、すなわちマクロファージ内で、薬剤を直接放出できる。

（Ｃ）抗腫瘍持続性薬剤送達システム：
（ａ）癌の処置におけるインターロイキン−１２持続性放出ミクロスフィア
癌を処置するための治療薬剤の持続性放出は、治療が通常は長期間になるという事実を考えると有利である。この事実は、より低用量を用いて従来の持続性でない投薬形態と同じ治療効果を達成できる可能性を示唆する。バイオテクノロジーの登場及び分子生物学の技術の進歩とともに、我々の抗腫瘍兵器工場は、タンパク質薬剤、ペプチド及びサイトカインを含むように迅速に拡張された。これらの新規な武器は、強力ではあるが、適切な送達システムを必要とする。これらの薬剤はタンパク質であるので、血液中の酵素の標的であり得る。結果として、これらの薬剤の注射は、非常に高用量を必要とし、費用がかかるだけではなく、危険性も有する。インターロイキン−１２は、近年、発見された異種二量体サイトカインである。インターロイキン−１２は、癌の種々の動物モデルにおいて、非常に高い抗腫瘍能力を有することが示された。遺伝子操作された線維芽細胞を用いて、ＩＬ−１２がより低濃度で持続的に存在すること、非持続性の高濃度を投与した場合と同等の抗腫瘍効果が得られることが示された。しかし、遺伝子操作された細胞を製造することは容易ではなく、コスト及びそれにかかる手間を考慮すると、一般の治療にこれを適用するのは困難である。よりよい代替物として、特定の薬剤送達システムの形態、例えば、ミクロスフィアのように、タンパク質薬剤を血液中の酵素から遮蔽するだけでなく、それらを持続的に放出させることが可能な、微粒子的な薬剤送達システムが考えられる。さらに、ミクロスフィアは、広範囲の生分解性ポリマーを用いた調製に対して順応しやすいことに加えて、大量生産の利点を有する。

本発明者らは、ＩＬ−１２の持続放出を目的とした生分解性アルブミンミクロスフィアの使用を評価した。皮下黒色腫を有するＣ５７ＢＬ／６マウスに腹腔内投与した場合、ミクロスフィアは、ＩＬ−１２溶液処方物の１週間分の用量の半分の用量で、生存期間を有意に延長した。さらに、ミクロスフィアの投薬形態は、肝臓及び腎臓の酵素への影響が低く、毒性が低いことが示唆された。

（Ｄ）トランスフェクションシステム：
ミクロスフィアは、細胞内への遺伝物質のトランスフェクションのために有効なツールとして使用可能である。細胞トランスフェクションの現在の方法のいくつかは、マイクロポレーション（ｍｉｃｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）のようなトランスフェクションプロセスの間に、かなりの量の細胞死をまねく。本試験において使用されるミクロスフィアは、サイズが１ミクロン未満のものであり、それらは細胞内に容易に取り込まれ、ミクロスフィア内の薬剤／物質を細胞内に直接的に移すことができる。

本発明の他の特徴及び利点は、添付の特許請求の範囲と組み合わせて、以下の本発明の実施形態の詳細な記載を読めば明らかになる。

本発明は、図面において説明される。ここで、参照符号又は参照番号は、（他に注記されない限り）図面を通して同じ又は類似の部分又はパラメーターについて付される。

本発明者らは、最初に、従来の同時係属中の出願に元々開示されている乳化の方法論の拡張を記載する。

本発明者らは、種々の薬剤、油を用いて、種々のプロセス温度、薬剤を溶解するために使用する種々の水性溶媒を用いて調製されるミクロスフィアの試験をさらに拡張した。さらに、乳化の方法論を用いて、ポリマーマトリックスにアルブミンを用い、乳化媒体にオリーブ油を用いて、サイトカインアンタゴニストに対するモノクローナル抗体を含むミクロスフィアを調製した、初期の特許出願に基づく製造の方法論のバリエーションも評価した。

実施例１は、代表的な生体活性タンパク質、つまり核転写因子ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを乳化することによるカプセル化を記載する。プロセスパラメーターの拡張としては、キャノーラ油、綿実油及び鉱物油の試験が挙げられる。その結果、試験された油は十分に役割を果たすことが示された。特定の生体不活性特性に依存して、他の生体不活性植物油及び他の油、例えば、限定されないが、ヒマワリ油、ベニバナ油、大豆油、パーム油、パーム核油、ココナッツ油、ヒマシ油、ピーナッツ油、ギングリー（ｇｉｎｇｌｅｙ）油、魚の油、ゴマ油、ヌカ油など、及び、それらのサブコンポーネント、例えば、限定されないが、モノ不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）及び必須脂肪酸（ＥＦＡ）、ならびに上述の混合物。他の鉱物油としては、限定されないが、重及び軽及び種々のサブフラクション及びそれらの組み合わせが、本発明の範囲内であると考えられる。

溶媒を冷却する温度範囲が試験され、範囲が広がった。５〜４０℃の温度範囲が試験され、受容可能な結果が得られることがわかった。約５℃未満の温度は、少なくとも部分的に水性成分が凍結する場合があり、望ましくない場合がある。

さらに、水相の選択が広げられ、限定されないが、水、リン酸緩衝生理食塩液、水及びＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、及び生理食塩水が挙げられる。

実施例２は、代表的な腫瘍ワクチン薬剤、すなわち、細胞外抗原のミクロスフィアの形成、及び得られる生体活性を記載する。

実施例３は、水溶性薬剤、すなわち、ＣＮＩ−１４９３、グアニルヒドラゾンのミクロスフィアの形成、及び得られる生体活性を記載する。試験結果は、内毒素又はサイトカイン放出を弱めることにおいて、本発明の方法を用いるＣＮＩ−１４９３マイクロカプセル化形態が、溶液の、カプセル化されていない形態の対応する用量よりも効果的であることを示した。

実施例４は、代表的な化学薬剤、すなわち、クロドロネート、ビスホスホネートのミクロスフィアの形成、及び得られる生体活性を記載する。

実施例５は、代表的な生体活性タンパク質、薬剤、すなわち、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのミクロスフィアの形成、及び得られる生体活性を記載する。

実施例６は、本発明の新規な噴霧方法による、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのミクロスフィアの形成、及び得られる生体活性を記載する。

本発明は、以下の実施例と組み合わせてさらに説明され、これらは例示の目的のためにのみ記載されている。実施例においては、他に言及されない限り、重量部及び重量パーセントを示す。また、他に言及されない限り、オリーブ油を使用してミクロスフィアを形成する方法が用いられていることを注記する。
〔実施例（パート１）〕

生体活性タンパク質薬剤ＮＦ−ＫＢ
−敗血症性ショックにおける臨床的適用
−ＮＦ−ＫＢに対するアンチセンスオリゴマーの処方及び試験

（Ａ）導入
ＮＦ−ｋＢは核転写因子であり、ＩｋＢに対して錯体化された不活性形態で、サイトゾル中に存在する。内毒素は細胞内メディエーターを刺激し、ＩｋＢがリン酸化され、ＮＦ−ｋＢが核に転座し、次いで、ＤＮＡの活性化が起こる。複数の炎症誘発性のメディエーター（ＴＮＦ、ＩＬ１及びＩＬ６を含む）の合成のためのｍＲＮＡが迅速に産生される。本発明者らは、ＮＦ−ｋＢのｐ６５サブユニットに対するマイクロカプセル化アンチセンスオリゴマー（ＭＳＡＳＯ）がＴＮＦ、ＩＬ１及びＩＬ６をin vitroで阻害することを見出した。アンチセンス化合物は、特定のタンパク質合成を阻害することで非常に有用な治療薬剤となる可能性を有する。しかし、アンチセンス化合物による治療の限定因子は、これらの大きな化合物の十分な細胞内浸透を得ることが困難であることである。本発明者らの以前の研究は、マイクロカプセル化された細胞内送達による、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスを用いたサイトカイン阻害において、効果の改善が認められた。細胞内オリゴヌクレオチドは迅速に核に輸送されるため、マイクロカプセル化は、アンチセンス化合物の送達を改善する。本発明者らの以前の研究により、内毒素ショック及び敗血症のラットモデルにおいて、ＮＦ−ｋＢのｐ６５部分に対するマイクロカプセル化アンチセンスの効果が非常に向上したことによって、この仮説を確認した。

（Ｂ）アルブミンによる、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの調製
（１）ヒトアルブミン５０ｍｇを発熱性物質を含まない水２ｃｃに溶解した。
（２）ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴマー）を、２５ｍｇ／ｃｃの濃度でリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に別個に溶解した。
（３）上の２つの溶液をほぼ３０分間混合した。
（４）得られた混合物を５℃に冷却した。
（５）オリーブ油２０ｃｃを５０ｃｃビーカーにとり、５℃に冷却し、氷浴中でこの温度に維持した。
（６）アルブミン及びオリゴヌクレオチドの混合物を上記の油に添加し、Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ（登録商標／超音波ホモジナイザー）を中（ｍｅｄｉｕｍ）に設定して２０分間乳化させた。
（７）ミクロスフィアが直径約１ミクロンになるまで、レーザ粒子サイズ測定器を用いて、マイクロカプセル化アルブミン−薬剤ミクロスフィアを含有するエマルションのサイズを評価した。
（８）氷浴によって温度を約５℃に維持しながら、組織ホモジナイザーを高（ｈｉｇｈ）に設定してコンスタントに攪拌しつつ、１時間かけてグルタルアルデヒドの２５％ｗ／ｖ溶液０．５ｃｃでミクロスフィアを架橋した。
（９）ミクロスフィアをメタノール２０ｃｃで３回洗浄し、連続型ＨＰＬＣフィルター（５０、２０、１０、５、及び１ミクロン径）を用いて、最後のメタノール洗浄液中に懸濁させつつ、最終的なサイズを測定した。
（１０）ミクロスフィアを凍結乾燥させ、使用するまで冷蔵庫で保存した。

全ての場合において、使用前に、ミクロスフィアを発熱性物質を含まない水又は生理食塩水に懸濁させた。

乳化媒体として使用する油の種類を変えて評価するために上述の手順を繰り返し、上述の５℃に加えて、製造時の温度も変えて評価した。最後に、水に加えて、異なる溶媒もまた薬剤を溶解するための媒体として評価した。それぞれのパラメーターの特徴を以下のように評価した：

（ａ）油の違いによる影響：
異なる油、例えば、キャノーラ油、綿実油及び鉱物油を研究のために使用し、ミクロスフィアの製造のために以前に使用したオリーブ油と比較した。生体不活性な任意の植物油又は鉱物油が使用可能であることが理解される。

（ｂ）温度の違いによる影響：
広範囲に温度を変化させて（例えば、５、１０、３０及び４０℃）、ミクロスフィアを調製した。よって、本発明の方法は、約５〜４０℃の温度範囲で行うことができる。

（ｃ）薬剤を溶解するために使用する水相の違いによる影響：
水及びリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に加えて、Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標／ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）を含有する水及び生理食塩水を使用して、水相の違いが有意な影響を与えるか否かを試験した。

薬剤含量分析及びＴＮＦ−α抑制を評価する効力試験をin vitro全血モデルを用いて行った。製造手順における以下の変数を評価した。

（Ｃ）実験方法：
（ａ）薬剤含量分析：
薬剤含量分析を本発明者らの研究室において開発したＨＰＬＣ法によって行った。

（ｂ）in vitro全血モデルを用いたＴＮＦ−α抑制を評価する効力試験。

調製物を、全血モデルを用いて薬剤の効力について評価した。以下に概略を説明する：

血液をＥＤＴＡを含有するラベンダートップ管に入れておいた。この血液を５ｍｌのアリコート３個にわけ、ミクロスフィアの以下のバッチの１個を用いて１時間かけて前処理し、内毒素（１００ｍｃｇ／ｍｌ）を用いてチャレンジ試験した。内毒素チャレンジ後０時間及び４時間のサンプルを得て、これらのＴＮＦ−αレベルを測定した。ＮＦ−ｋＢにマイクロカプセル化オリゴマーを添加することに起因するサイトカイン抑制の効力を、同時係属中の特許出願に記載されるようなオリーブ油を用いて調製したミクロスフィアと比較した。

（Ｄ）結果：
薬剤含量分析における油の違いによる影響：

図１は、薬剤を溶解させるための水相として水を用いて、５℃で調製した異なる油を用いた、乳化法及び噴霧法によるＮＦ−ｋＢに対するアンチセンス（ＡＳ）オリゴマーのパーセント薬剤含量分析を示す。バッチ間でｐ<０．０５の有意差は認められなかった。重（この用語は、当業者に公知の意味である）鉱物油が使用されたが、軽鉱物油を使用することも意図され、また他の植物油を使用することも意図される。

薬剤含量分析における温度の違いによる影響：

図２は、薬剤を溶解させるための水相として水を用いて、油はオリーブ油を用い、異なる温度設定で調製したバッチの、乳化法及び噴霧法によるＮＦ−ｋＢに対するアンチセンス（ＡＳ）オリゴマーのパーセント薬剤含量分析を示す。バッチ間でｐ<０．０５の有意差は認められなかった。約５℃未満の温度では、水相が凍結し始め、生産性及び活性が低下する。

薬剤含量分析において使用される水相の違いによる影響：

図３は、オリーブ油を用い、１０℃で調製した異なる水相を用いた、乳化法及び噴霧法（以下実施例６において詳細に検討する）によるＮＦ−ｋＢに対するアンチセンス（ＡＳ）オリゴマーのパーセント薬剤含量分析を示す。バッチ間でｐ<０．０５で有意差は認められなかった。

ＴＮＦ−α抑制における油の違いによる影響：

図４は、乳化法及び噴霧法によってＮＦ−ｋＢに対するアンチセンス（ＡＳ）オリゴマーのミクロスフィアを製造するために異なる油を用いた場合の、ＴＮＦ−αレベルを示す。水を使用して薬剤を溶解し、温度は５℃に維持した。オリーブ油及び他の試験油を用いて調製した種々のバッチ間でｐ<０．０５の有意な違いはなかった。

ＴＮＦ−α抑制における温度変動による影響：

図５は、乳化法及び噴霧法によるＮＦ−ｋＢに対するアンチセンス（ＡＳ）オリゴマーの製造プロセスにおいて異なる温度を用いた場合の、ＴＮＦ−αレベルを示す。オリーブ油をこのプロセス中で使用した。異なる温度設定で調製したバッチ間でｐ<０．０５の有意な違いはなかった。

ＴＮＦ−α抑制において使用される水相の違いによる影響：

図６は、乳化法及び噴霧法によるＮＦ−ｋＢに対するアンチセンス（ＡＳ）オリゴマーの製造プロセスにおいて異なる水相を用いて試験した、ＴＮＦ−αレベルを示す。オリーブ油を用いてミクロスフィアを１０℃で調製した。異なる水相を用いて調製したバッチ間でｐ<０．０５の有意差は認められなかった。

−腫瘍ワクチン薬剤
−腫瘍ワクチンにおけるアジュバント又はコアジュバントとしてミクロ粒子を用いる腫瘍防御試験

（Ａ）導入
免疫応答の誘発は複雑であり、評価するためのインタクトな免疫システムを必要とする複雑なプロセスである。従って、マウス腫瘍モデルを使用して、マイクロカプセル化細胞外抗原（ＭＥＣＡ）ワクチン製剤を評価した。本ワクチンにおいて使用される抗原を、培地中で増殖するＢ１６マウス黒色腫細胞から誘導した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂ１６マウス黒色腫細胞と同系）を使用した。これは、腫瘍予防ワクチンで、マウスにまず抗腫瘍反応を起こさせるのに、最初にワクチンを投与する。次いで、マウスをチャレンジ試験し、マウス黒色腫の発生を阻止する能力を有しつつ、抗腫瘍応答が誘発されるか否かを判定した。

（Ｂ）黒色腫ワクチン製剤の調製
マイクロカプセル化ワクチン製剤を、実施例１に記載される方法に従って作成した。

（Ｃ）実験方法
免疫化及び腫瘍防御試験
ＭＥＣＡ（全量で８０μｇのＭＥＣＡ中に２０μｇのＥＣＡを含有する）及びブランクＭＰ（ミクロ粒子）を、架橋剤としてグルタルアルデヒドを用いて、油中水エマルジョン架橋技術によって調製した。第１の試験（全量で８０μｇのＭＥＣＡ）で使用されるミクロ粒子と当量の細胞外抗原２０μｇの抗腫瘍効果を評価するために、雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５、８〜１２週齢）３群にワクチンを皮下投与した。細胞外抗原（ＥＣＡ）２０μｇを含む全量で８０μｇのマイクロカプセル化細胞外抗原（ＭＥＣＡ）、細胞外抗原が入ったの溶液（ＥＣＡ ｓｏｌｎ）、ブランクミクロ粒子（Ｂｌａｎｋ ＭＰ）をそれぞれＰＢＳに懸濁させ全量で１００μｌとし３群にワクチンを皮下投与した。マウスを３週間、毎週再注射し、計４回注射した。最後の注射から７日後、上述のように、マウスの対側性部位に７×１０^５の生存Ｂ１６黒色腫細胞を皮下に接種しチャレンジ試験した。次いで、腫瘍の成長についてマウスを６０日間観察し、腫瘍のサイズ及び腫瘍の発現率を記録した。

（Ｄ）結果及び考察
雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＭＥＣＡ（全量で８０μｇのＭＥＣＡ中に２０μｇのＥＣＡを含有する）、ｂｌａｎｋ ＭＰ又はＥＣＡ ｓｏｌｎワクチンを皮下投与した。最初にワクチンを投与した後、マウスに３週間、週に１回再注射した。最後のワクチン注射の７日後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにワクチン接種部位と離れた部位に、７×１０^５の生存同系Ｂ１６黒色腫細胞を接種した。腫瘍の成長についてマウスの皮下を観察し、腫瘍の発現率を記録した（図７）。この試験でＭＥＣＡ群は、６０日で腫瘍なし８０％を維持していた。これとは対照的に、ブランクミクロ粒子群では腫瘍なし４０％、及び溶液中のＥＣＡ群では腫瘍なし０％であった。

この試験より、マイクロカプセル化した腫瘍抗原が、腫瘍特異抗原を標的化することによって、腫瘍免疫性を誘発するアジュバント効果を有し得ることが示唆される。

それに加えて、ブランクミクロ粒子群の６０日目で腫瘍なし４０％であることは、ＢＳＡミクロ粒子が、ＢＳＡとＢ７００腫瘍抗原とのホモロジーに起因して、Ｂ１６黒色腫のための優れたアジュバントである可能性を示唆している。

図７は、８０μｇのＭＥＣＡ中に２０μｇのＥＣＡが含有される群の腫瘍非発現率を示す。マウスに１００μｌのＰＢＳを計４回皮下注射しワクチンを投与した。この注射は週に１回行った。最後の注射の７日後、マウスに７×１０^５の生存腫瘍細胞（Ｂ１６）を移植してチャレンジ試験し、腫瘍非発現率をＭＥＣＡ群及びコントロール群、すなわち溶液中のＥＣＡ（ＥＣＡ ＳＯＬＮ）群及びブランクミクロ粒子（ＢＬＡＮＫ ＭＰ）群において観察した。

（Ｅ）結果
in vivo用量反応試験により、全量で８０μｇのＭＥＣＡ中に含有される２０μｇのＥＣＡの用量のワクチンがこの試験において非常によく作用することがわかった。この用量のＭＥＣＡワクチンにより、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、６０日の試験期間中、腫瘍なし８０％を維持している。この試験は、マイクロカプセル化した腫瘍抗原が、腫瘍特異抗原を標的化することにより腫瘍免疫性を誘発するアジュバント効果を有することを示唆する。それに加えて、６０日でブランクミクロ粒子グループの結果が腫瘍なし４０％であることは、ＢＳＡミクロ粒子が、ＢＳＡとＢ７００腫瘍抗原とのホモロジーに起因して、Ｂ１６黒色腫のための優れたアジュバントである可能性を示唆する。

Ｂ１６マウス黒色腫腫瘍は、非常に厳しい腫瘍モデルである。このため、ヒトの癌のモデルとなり得ると考えられる。これらの結果から、このミクロ粒子がさらに高い抗腫瘍効果を誘発すると推定される。

−化学薬剤、ＣＮＩ−１４９３：グアニルヒドラゾン化合物
−敗血症性ショックにおける適用
−マイクロカプセル化したＣＮＩ−１４９３の処方及び試験
−マイクロカプセル化したＣＮＩ−１４９３による、実験的敗血症ショックにおける炎症誘発性サイトカインの致死性の予防及び抑制

（Ａ）導入
動物における内毒素血症は、多面発現のサイトカイン（例えば、活性化マクロファージ及び多形核細胞由来のＴＮＦ−α及びＩＬ−１−β）の放出と関連する。これらのサイトカインの効果を阻害する実験的薬剤、例えば、モノクローナル中和抗体（ＴＮＦ−αモノクローナル抗体）、レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト）及びレセプター融合タンパク質の敗血症性ショックにおける効力が、動物及び臨床で評価されている。近年、新規に開発された水溶性四価グアニルヒドラゾン化合物（「ＣＮＩ−１４９３」と称される）（Ｎ，Ｎ'−ビス［３，５−ジアセチルフェニル］デカンジアミンアミジノヒドラゾンテトラヒドロコリン）が、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１−β及びＩＬ−６放出を誘発するリポ多糖類（ＬＰＳ）を減らし、動物における死亡率を減らす効果があることが示された。

本発明者らは、以前に、サイトカイン中和抗体のマイクロカプセル化により、サイトカイン中和抗体の溶解性形態と比較して、種々のin vitro及びin vivo疾患モデルにおけるそれらの効力が増加することを示す試験結果を報告した。同様にまた、他のサイトカインアンタゴニストのミクロスフィア形態は、マクロファージによるマイクロカプセル化薬剤の標的化された吸収のため、対応するサイトカインアンタゴニストの溶解性形態よりもさらに効力が高い場合がある。本実施例では、本発明者らは、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄによって、新規に開発された化合物ＣＮＩ−１４９３のミクロスフィア形態の効力を評価した。ＣＮＩ−１４９３の溶解性形態及びマイクロカプセル化形態の効力比較を、in vitro内毒素で誘発されたサイトカイン放出全血モデル、及び内毒素血症のin vivoモデル及び大腸菌で誘発された腹膜炎のin vivoモデルを用いて評価した。

（Ｂ）ＣＮＩ−１４９３ミクロスフィアの調製
マイクロカプセル化したＣＮＩ−１４９３調製物を実施例１に従って作成した。

（Ｃ）実験方法
（ａ）全血モデルにおけるin vitro内毒素で誘発されるサイトカイン放出：
各サンプル（ｎ）について、５匹のラットから血液をＥＤＴＡ（血液１ｍｌあたり１．５ｍｇ）中に集め、保存した。ベースライン血漿サンプルを取った後、残りの血液を５つのグループに分けた。各グループは６つ組であった。各グループに対し、以下の処理の１つを行った：生理食塩水又はＣＮＩ−１４９３の溶解性形態−０．２５、０．５もしくは１．０μｇ／ｍｌ又はブランクミクロスフィア（ＭＣ）又はＣＮＩ−１４９３のＭＣ形態−０．２５、０．５もしくは１．０μｇ／ｍｌ。全てのグループを３７℃、５％ＣＯ_２を含有する雰囲気下(atomosphere)でインキュベートした。インキュベーションの２時間後、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ（ケープコッド、ウッドホール（Ｗｏｏｄ Ｈｏｌｅ）、マサチューセッツの提携者）から得られた内毒素（１００ｎｇ／ｍｌ）０１１３を全てのグループに添加し、さらに２４時間インキュベートした。改変されたアルカリ性ホスファターゼＥＬＩＳＡ法を用いてＴＮＦ−α及びＩＬ−１−βの測定のために、内毒素添加の２、４、６及び２４時間後に、血漿サンプルを収集した。

（ｂ）内毒素血症のin vivoモデル：各群はラット４匹。各群のラットは、以下のいずれか１つを静脈内投与された：生理食塩水又は溶解性ＣＮＩ−１４９３−１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇ又はブランクＭＣ又はＣＮＩ−１４９３のＭＣ形態−１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇ。さらに、全てのラットに、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ（ケープコッド、ウッドホール（Ｗｏｏｄ Ｈｏｌｅ）、マサチューセッツの提携者）から得られた内毒素０１１３ １５ｍｇ／ｋｇを静脈注射し、生存率を７日間観察した。ＥＬＩＳＡを用いてＴＮＦ−α及びＩＬ−１−βの測定のために、内毒素投与の０、２、４、８、２４及び４８時間後に、血液をラットの尾静脈から収集した。

（ｃ）Ｅ．Ｃｏｌｉで誘発された腹膜炎のin vivoモデル：各群はラット６匹。各群のラットは、以下の処理の１つを受けた：生理食塩水（静脈内）、又はブランクＭＣ（静脈内）、又は溶解性ＣＮＩ−１４９３−２ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇ（静脈内）又はＣＮＩ−１４９３のＭＣ形態−２ｍｇ／ｋｇもしくは５ｍｇ／ｋｇ（静脈内）又は溶解性ＣＮＩ−１４９３−２ｍｇ／ｋｇもしくは５ｍｇ／ｋｇ（静脈内）及びゲンタマイシン１５ｍｇ／ｋｇ（腹腔内）又はＣＮＩ−１４９３のＭＣ形態−２ｍｇ／ｋｇもしくは５ｍｇ／ｋｇ（静脈内）及びゲンタマイシン１５ｍｇ／ｋｇ（腹腔内）。さらに、全てのラットに、生存Ｅ．Ｃｏｌｉ １×１０^１０ＣＦＵの注射をして（腹腔内）、５日間の生存率を観察した。ＥＬＩＳＡを用いてＴＮＦ−α及びＩＬ−１−βレベルを測定するために、Ｅ．ｃｏｌｉ投与の０、２、４、８、２４及び４８時間後に、血液をラットの尾の静脈から収集した。

（Ｄ）結果及び考察
全血モデルにおいて内毒素で誘発されるサイトカイン放出：内毒素で誘発されるＴＮＦ−α及びＩＬ−１−β放出に対するＣＮＩ−１４９３の影響をそれぞれ図８及び９に示す。ブランクＭＣの存在は、内毒素で誘発されるＴＮＦ−α及びＩＬ−１−β放出に対して有意な影響は与えなかった。ＣＮＩ−１４９３の溶解性形態０．２５μｇ／ｍｌの用量は、内毒素で誘発されるＴＮＦ−α及びＩＬ−１−β放出を変更しないが、ＣＮＩ−１４９３ ０．５μｇ／ｍｌ及び１．０μｇ／ｍｌは、内毒素で誘発されるＴＮＦ−α及びＩＬ−１−β放出を有意に抑制した。一方、ＣＮＩ−１４９３を０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ及び１．０μｇ／ｍｌ含有するＣＮＩ−１４９３のＭＣ形態の全ての用量は、内毒素で誘発されるＴＮＦ−α及びＩＬ−１−β放出を有意に抑制した（ｐ<０．０５）。それに加えて、ＭＣ形態の全ての用量群では、内毒素で誘発されるサイトカイン放出の抑制の程度は、ＣＮＩ−１４９３の対応する溶解性形態よりも有意に大きかった。

内毒素血症のin vivoモデル：生存データを表１に示す。

ＣＮＩ−１４９３の溶解性形態１、２、５ｍｇ／ｋｇを投与された全てのラットは、内毒素投与後２４時間以内に死亡した。一方、ＣＮＩ−１４９３の溶解性形態１０ｍｇ／ｋｇを投与されたラットの５０％及びＣＮＩ−１４９３のＭＣ形態１ｍｇ／ｋｇ用量を受けたグループの動物の２５％は、内毒素投与の７日後に生存していた。一方、ＣＮＩ−１４９３のＭＣ形態２、５及び１０ｍｇ／ｋｇを投与されたグループの全ての動物（１００％）は、内毒素投与７日後に生存していた。この試験についてのサイトカインレベルを図１０及び図１１に示す（図１２は意図的に削除した）。ＣＮＩ−１４９３の溶解性形態及びＭＣ形態は、内毒素血症で誘発されるＴＮＦ−αレベルをかなりの程度まで下げ、ＩＬ−１−βレベルを少し下げた。しかし、ＣＮＩ−１４９３のＭＣ形態は、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１−βレベル両方の抑制において、ＣＮＩ−１４９３の溶解性形態よりも有意に優れていた。

敗血症性ショックのＥ．Ｃｏｌｉで誘発された腹膜炎モデル：生存データを表２に示す。

生理食塩水又はブランクＭＣ又はＣＮＩ−１４９３の溶解性形態２ｍｇ／ｋｇ又は溶解性形態ＣＮＩ−１４９３ ５ｍｇ／ｋｇ又はＣＮＩ−１４９３のＭＣ形態２ｍｇ／ｋｇ前処理を受けた全てのラットは、Ｅ．ｃｏｌｉ投与後４〜８時間以内に死亡した。ＣＮＩ−１４９３のＭＣ形態５ｍｇ／ｋｇ又はＣＮＩ−１４９３の溶解性形態２ｍｇ／ｋｇ群＋ゲンタマイシン群では１７％の生存率を有し、致死性をわずかながら下げた。さらに、ゲンタマイシンの併用投与により、ＣＮＩ−１４９３の溶解性形態５ｍｇ／ｋｇ群で生存率を５０％まで、ＣＮＩ−１４９３のＭＣ形態２ｍｇ／ｋｇ群で６７％まで、ＣＮＩ−１４９３のＭＣ形態５ｍｇ／ｋｇ群で８３％まで高めた。ＣＮＩ−１４９３の溶解性形態及びＭＣ形態の両方は、Ｅ．ｃｏｌｉで誘発されたＴＮＦ−α及びＩＬ−１−βレベルを低下させたが、ＣＮＩ−１４９３のＭＣ形態の方が、ＣＮＩ−１４９３の溶解性形態よりも有意に優れていた。

ＣＮＩ−１４９３のマイクロカプセル化により、in vitroモデル及びin vivoモデルの両方において効果が高まった。この結果は、内毒素又はＥ．Ｃｏｌｉで誘発されるサイトカイン放出抑制及び死亡率低下において、ＣＮＩ−１４９３のＭＣ形態が、ＣＮＩ−１４９３の溶解性形態の対応する用量よりも効果的であったことを示す。マイクロカプセル化されたサイトカイン中和抗体を用いた以前の研究において、本発明者らは、中和抗体の対応する溶解性形態と比較して、内毒素又はＥ．Ｃｏｌｉで誘発される腹膜炎に起因して、内毒素で誘発されるサイトカインの放出阻害及び死亡率の抑制における効力が高まることを発見した。マイクロカプセル化された化合物（持続性放出形態を除く）の効力は、食細胞における細胞内放出によって増幅される場合があり得る。食細胞によって貪食されたミクロスフィアから放出されたＣＮＩ−１４９３は、細胞内の作用機構によって細胞内濃度が高まり、炎症誘発性のサイトカインを効果的に抑制する。以前の研究により、溶解性ＣＮＩ−１４９３が、本研究で示されるように、ＬＰＳで誘発されるサイトカイン、例えば、末梢血単核細胞からのＴＮＦ−α、ＩＬ−１−β及びＩＬ−６を抑制することができることが示された。ＣＮＩ−１４９３によるＴＮＦ−α合成阻害機構は、翻訳レベル又は翻訳後レベルであると推測される。本研究では、in vitro及びin vivoモデルの両方において、ＣＮＩ−１４９３のＭＣ形態は、内毒素で誘発されるＴＮＦ−α及びＩＬ−１−βレベルを強力に抑制した。一方、ＣＮＩ−１４９３の溶解性形態は、内毒素で誘発されるＴＮＦ−α及びＩＬ−１−βレベルを少し少ない程度まで抑制した。in vitroの全モデルにおいて、内毒素で誘発されるＴＮＦ−αのＣＮＩ−１４９３のＭＣ形態の最低用量（０．２５μＭ）の抑制の程度は、ＣＮＩ−１４９３の溶解性形態の最高用量（１．０μＭ）と同程度であった。このことは、内毒素で誘発されるＴＮＦ−α合成の阻害において、ＣＮＩ−１４９３のＭＣ形態は、理論的に、ＣＮＩ−１４９３の溶解性形態の少なくとも４倍の効力を持っていることを示す。

ＣＮＩ−１４９３のＭＣ形態（２ｍｇ／ｋｇ）は、致死性の内毒素血症から完全に防御し、一方、同用量のＣＮＩ−１４９３の溶解性形態（２ｍｇ／ｋｇ）を用いると生存率ゼロ、さらに５倍の用量のＣＮＩ−１４９３（１０ｍｇ／ｋｇ）の溶解性形態を用いても、５０％しか生存できなかった。内毒素血症に起因する死亡率に対するＣＮＩ−１４９３のＭＣ形態による完全な防御は、マイクロカプセル化送達システムが非常に効率的であることを示唆する。さらに、ＣＮＩ−１４９３の用量５ｍｇ／ｋｇで、Ｅ．Ｃｏｌｉで誘発された腹膜炎モデルにおける生存率は、ゲンタマイシン及びＣＮＩ−１４９３の溶解性形態の組み合わせ（５０％）と比較して、ゲンタマイシン及びＣＮＩ−１４９３のＭＣ形態の組み合わせ（８３％）で非常に高かった。死亡率の高いこの感染モデルで、溶解性形態及びＭＣ形態の両方が、ＣＮＩ−１４９３とゲンタマイシンを併用しない場合には、死亡を防げなかった。このことは、重篤な感染状態において抗生物質による処置が、必須であることを示す。腹膜炎の実験モデルは、抗生物質のみ、又はＴＮＦ−α中和抗体の溶解性形態のみには抵抗性であることがわかった。実際に、この実験モデルにおいて、抗生物質とマイクロカプセル化サイトカインアンタゴニストが併用投与される場合を除き、サイトカインアンタゴニストの溶解性形態投与後に、生存率が改良されたことを示す研究報告はこれまでにない。

結果として、本発明者らは、in vitro全血モデルを用いて、内毒素で誘発されるＴＮＦ−α及びＩＬ−１−β放出の抑制において、マイクロカプセル化ＣＮＩ−１４９３が非常に効果的であることを示した。この改良された効果により、内毒素血症及び敗血症性ショックのＥ．Ｃｏｌｉ腹膜炎モデルの両方において、有意に高い生存率が得られた。

−化学薬剤−クロドロネート
−適用−糸球体腎炎
−アルブミンマイクロカプセル化されたクロドロネートによるマクロファージ破壊：マクロファージ依存性の糸球体腎炎におけるサイトカイン放出の減衰

Ａ）導入
マクロファージは、サイトカイン、ケモカイン及び他の物質の放出を介する炎症プロセスにおいて、重要な役割を果たす。種々の炎症性疾患におけるマクロファージの役割を、水溶性化合物であるクロドロネートを用いてマクロファージを破壊することにより評価することができる。クロドロネートのビスホスホネートは、砕骨細胞で媒介される骨の再吸収の強力な阻害剤であり、代謝性骨疾患の治療に臨床で使用されている。遊離（溶液）形態におけるクロドロネートは、全身性投与によってはマクロファージ機能にほとんど影響を与えない。しかし、クロドロネートを含有するリポソームは、マクロファージによって容易に貪食され、体循環において、肝臓内、すい臓内、リンパ節内及び腹腔内、及び単核細胞内でマクロファージを破壊する。本発明者らは、アルブミンを用いてクロドロネートをマイクロカプセル化する方法を開発した。この方法は、リポソームを用いる方法に比べて、いくつかの利点を有する。アルブミンは、生体適合性ポリマーマトリックスとして使用され、リポソームと比較した場合に、より安定性が高く、調製が容易であり、種々のサイズのミクロスフィア（ＭＳ）を形成することができる。アルブミンは、生分解性であり、高いカプセル化能を持つ毒性の低い物質である。本研究の目的は、クロドロネートを含有するアルブミンＭＳが、（１）全身性マクロファージ崩壊を起こすか否か、（２）in vitroで内毒素によって誘発されるＴＮＦ−α及びＩＬ−１−β放出に対して効果があるか否か、（３）ラットにおける実験的糸球体腎炎（ＧＮ）において、マクロファージ浸潤に効果があるか否かを検討することである。この結果により、クロドロネートＭＳは効果的にマクロファージを崩壊し、内毒素で誘発されるＴＮＦ−α及びＩＬ−１−β放出を弱め、糸球体内へのマクロファージ浸潤を誘発する実験的ＧＮを阻害することを示す。

（Ｂ）ミクロスフィアの調製
マイクロカプセル化クロドロネートを実施例１に従って作製した。

（Ｃ）実験方法
（ａ）ラット全血モデルにおける、クロドロネートの遊離形態及びミクロスフィア形態のin vitro効力の比較：６〜７匹のＦｉｓｈｅｒラット（Ｆ−３４４）（体重２００〜２５０グラム（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙより入手）からの血液を心臓に穿刺して集め、それぞれ「ｎ」づつ保存した。血液１ｍＬに対して１５％ＥＤＴＡ溶液１０μＬをそれぞれ添加し、凝固を防止した。この血液をアリコートに分け、１ｍＬにつき、生理食塩水に溶解した遊離クロドロネート２５、５０及び１００μｇ、又はクロドロネートＭＳ５０、１００及び２００μｇ（マイクロカプセル化クロドロネート処方物中のアルブミン：クロドロネート比が１：１であるため、それぞれ２５、５０及び１００μｇの遊離クロドロネートと当量）を添加した。さらに、各ラット由来の血液のアリコートを、生理食塩水５０μｌ又はブランクＭＳ４００μｇで処理した。２時間後、内毒素１００ｎｇ／ｍｌを添加し、血液サンプルを２４時間培養した（３７℃、５％ＣＯ_２ａｔｍｏｓｐｈｅｒ）。ベースライン、２、４、６及び２４時間経過時の血漿サンプルを、１０００×ｇで１０分間遠心分離し、本発明者の実験室で開発された改変アルカリ性ホスファターゼＥＬＩＳＡ法を用いて、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１−βを測定した。

（ｂ）健康なラット及び抗ＧＢＭ ＧＮをもつラットにおけるクロドロネートによるマクロファージ破壊：Ｆｒｅｕｄの完全アジュバント（ＦＣＡ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、セントルイス、ミズーリ、米国）とラット腎臓の膜フラクションを用いて繰り返し免疫化することによって、ヒツジに抗ＧＢＭグロブリンを生じさせた。ヒツジの血清中の補体を熱により除去し、ラットの赤血球に対して２回吸収させた（１０容積％）。最終的な濃度５０％で、硫酸アンモニウムを用いて沈殿させることによって、グロブリンフラクションを調製し、リン酸緩衝生理食塩液に対して広範囲に透析した。雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（体重１００〜１５０ｇ、Ｃｅｎｔｒａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（モナッシュ大学、クレイトン、ビクトリア、オーストラリアから入手）に対して１００μｇ／ｇｍ体重の用量で、ヒツジの抗ラットＧＢＭグロブリンを静脈内に注射することによりＧＮを開始させた。抗ＧＢＭ ＧＮの開始の４８時間前に、ラットの１群に、クロドロネートＭＳ５ｍｇ（５０重量％を超えない量のクロドロネートを含有すると推定される）を与え、他の群にはクロドロネート処置をしなかった。抗ＧＢＭ ＧＮを受けなかった健康で正常なラット群を、コントロールとして使用した。抗ＧＢＭ注射の７２時間後に、全てのラット（健康なコントロールラットを含む）を屠殺し、脾臓、肝臓及び腎臓の組織サンプルを得た。次いで、この組織サンプルを、過ヨウ素酸−リシン−パラホルムアルデヒド中で４時間固定し、７％スクロース溶液で洗浄し、次いで、液体窒素で冷却したイソペンタン中で凍結させた。凍結させた組織をクライオスタット中で４ｍｍ片にスライスした。組織片を３層のイムノペルオキシダーゼ技術を用いて染色した。ラットＥＤ１に対するマウスモノクローナル抗体、細胞質抗原と反応するｐａｎ−マクロファージマーカーを一次抗体として添加した。その後、ウサギの抗マウスＩｇＧグロブリンの第２の層（Ｄａｋｏ、グロストラップ、デンマーク）によって、１００において１の濃度で染色した。この後、マウス免疫グロブリン（Ｄａｋｏ、グロストラップ、デンマーク）に結合したペルオキシダーゼによって１：１００の濃度で染色した。次いで、サンプル片をジアミノベンズアジン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、セントルイス、ミズーリ）とともにインキュベートし、計測のためにＨａｒｒｉｓヘマトキシリンで染色した。脾臓におけるマクロファージの数を、１０×１ｍｍ^２の赤色脾髄領域で、ＥＤ１陽性の細胞を計測することによって測定し、細胞／ｍｍ^２として平均した。肝臓中のＫｕｐｆｆｅｒ細胞の数を、１０×１ｍｍ^２の肝臓のひも状（ｌｉｖｅｒ ｃｏｒｄ）領域で、ＥＤ１に陽性の細胞を計測することによって測定し、細胞／ｍｍ^２として平均した。循環中のマクロファージを、循環する白血球に対する割合として計算した。

（Ｄ）結果及び考察
本発明者らの研究は、アルブミン中にカプセル化された少ない用量のクロドロネートが、ラットの肝臓、脾臓、腎臓及び末梢血由来のＥＤ１陽性のマクロファージを破壊するのに有効であることを示した。さらに、クロドロネートＭＳが、内毒素で刺激されるＴＮＦ−α及びＩＬ−１−β放出をすばやく減少させた。これは、遊離（溶液）形態におけるクロドロネートよりも有意に大きく、ラットにおける実験的な抗ＧＢＭ ＧＮの間に累積する糸球体の内部へのマクロファージ浸潤を防いだ。

マクロファージ破壊は、病理状態の進行に対するマクロファージの貢献を評価することにおいて価値の高いツールであることがわかった。クロドロネートのビスホスホネートは、遊離形態におけるマクロファージの生存度に対してほとんど効果がないが、リポソーム又はＭＳ内にカプセル化されたもの（本研究におけるような）は、２４〜４８時間以内にマクロファージ集団を一時的に破壊した。クロドロネートリポソームによるマクロファージの破壊は、アポトーシスで誘発される細胞死によって引き起こされることが示された。本発明者らは、クロドロネートＭＳについて同様の作用機構を考えている。

さらに、本研究において見られるような、クロドロネートＭＳを用いた前処理の後、内毒素で誘発されるＴＮＦ−α及びＩＬ−１−β放出の減少は、クロドロネートリポソームを用いた他の試験でも示された。さらに、クロドロネートリポソームは、マウスにおけるサイトカイン遺伝子発現を弱め得ることも示された。全血モデルにおいて、本発明者らはさらに、クロドロネートの遊離形態と比較した場合、クロドロネートＭＳを用いて、内毒素で誘発されるサイトカイン放出を大きく減少させることを示した。クロドロネートＭＳの最高用量群で、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１−β放出の両方をほとんど完全に阻害したが、。クロドロネートＭＳの作用機構は、クロドロネートリポソームと同様に、クロドロネートを含有するアルブミンＭＳのマクロファージによる貪食、クロドロネートのマクロファージ内での放出、それに続くマクロファージの死によるサイトカイン放出の阻害に起因していると考えられる。クロドロネートによるサイトカイン放出の阻害は、炎症誘発性のサイトカイン放出によって特徴付けられる疾患状態の治療において有益であり得る。

以前の研究では、マクロファージが、ＧＮにおける腎臓障害の誘発及び進行において重要な役割を果たすことが示された。ＧＮの特徴の１つは、タンパク尿及びマクロファージ浸潤である。実験的ＧＮにおけるクロドロネートＭＳによるマクロファージ浸潤の減少は、本発明者らのグループにより以前に示された。本発明者らは、本研究で示されるのと同様に、抗ＧＢＭで誘発されるＧＮが、マクロファージ浸潤を引き起こし（８．２細胞／糸球体の断面）、クロドロネートＭＳを用いた処理がマクロファージ浸潤を防止する（２．２細胞／糸球体の断面）ことを示した。それに加えて、さらに、本発明者らは、抗ＧＢＭ ＧＮで誘発されるタンパク尿（４３ｍｇ／２４時間）がクロドロネートＭＳ（８．４ｍｇ／２４時間）投与で正常で健康なラットにおいて見いだされるレベル（５．３ｍｇ／２４時間）と同じ程度まで有意に抑制可能であることも示した。クロドロネートＭＳは、ＧＮにおけるマクロファージを破壊することによって、治療に有益であり得る。

内毒素で誘発されるＴＮＦ−α及びＩＬ−１−β放出に対するクロドロネートの影響を、それぞれ図１３及び１４に示す。ブランクＭＳの存在は、内毒素で誘発されるＴＮＦ−α及びＩＬ−１−β放出に有意な影響を与えなかった。低用量（２５μｇ／ｍＬ）及び中用量（５０μｇ／ｍＬ）の遊離クロドロネートは、内毒素で誘発されるＴＮＦ−α及びＩＬ−１−β放出に影響しないが、さらに高用量（１００μｇ／ｍＬ）の遊離クロドロネートは、内毒素で誘発されるＴＮＦ−α及びＩＬ−１−β放出を弱める傾向が示された。一方、全ての用量のクロドロネートＭＳ（遊離クロドロネートの２５、５０、及び１００μｇと当量／ｍＬ）は、内毒素で誘発されるＴＮＦ−α及びＩＬ−１−β放出を有意に減少させた（ｐ<０．０５）。

ＥＤ１陽性マクロファージについて染色された組織片は、未処理のコントロールラットと比較して、クロドロネートＭＳを受けたラットにおける肝臓及び脾臓由来のＥＤ１陽性マクロファージを有意に減少させた（ｐ<０．００１）ことを示す（表３を参照）。

末梢血における単核細胞の循環において有意な減少が見られた（表３、ｐ<０．００１）。同様に、ＥＤ１陽性マクロファージについて染色された腎臓片は、正常で健康な腎臓の糸球体内へのマクロファージ浸潤はなく、抗ＧＢＭ ＧＮの誘発がＥＤ１陽性マクロファージ浸潤を引き起こすことを示す。クロドロネートＭＳを用いた前処理は、抗ＧＢＭ ＧＮにおけるマクロファージ浸潤を有意に減少させた。

結論として、これらの研究は、クロドロネートを含有するアルブミンＭＳが、ラットにおけるマクロファージの全身での破壊のために効果的なツールであることを示す。クロドロネートＭＳによるマクロファージの破壊が、炎症誘発性のサイトカインの生成を弱め、マクロファージ依存性であることが示されている実験的な抗糸球体ベース膜ＧＮを改善した。マクロファージの一時的な破壊は、マクロファージ依存性の疾患状態のための治療法であり得る。

図１３は、ラット全血モデルにおける、内毒素で誘発されるＴＮＦ−αレベルに対するクロドロネート（ＣＬＯＮ）の遊離形態及びＣＬＯＮのミクロスフィア（ＭＳ）の効果を示す。

血液１ｍＬにつき、生理食塩水に溶解した遊離クロドロネート２５、５０及び１００μｇ又はクロドロネートＭＳ５０、１００及び２００μｇ（それぞれ遊離クロドロネート２５、５０及び１００μｇと当量）を添加した。生理食塩水群には血液1mＬあたり生理食塩水５０μＬを添加し、ブランクＭＳ群には血液1ｍＬあたりブランクＭＳ４００μｇを添加した。２時間後、内毒素１００ｎｇ／ｍｌを添加し、血液を２４時間培養した（３７℃、５％ＣＯ_２ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ）。内毒素チャレンジ後の血漿レベルを図１３に示す。ＣＬＯＮのＭＳ形態は、ＣＬＯＮの遊離形態と比較して内毒素で誘発されたＴＮＦ−αレベルを有意に低下させた（ｐ<０．０５）。

図１４は、ラット全血モデルにおいて、内毒素で誘発されるＩＬ−１−βレベルに対するクロドロネート（ＣＬＯＮ）の遊離形態及びＣＬＯＮのミクロスフィア（ＭＳ）の影響を示す。血液１ｍＬにつき、生理食塩水に溶解した遊離クロドロネート２５、５０及び１００μｇ又はクロドロネートＭＳ５０、１００及び２００μｇ（それぞれ遊離クロドロネート２５、５０及び１００μｇと当量）を添加した。生理食塩水群には血液1mＬあたり生理食塩水５０μＬを添加し、ブランクＭＳ群には血液1mＬあたりブランクＭＳ４００μｇを添加した。２時間後、内毒素１００ｎｇ／ｍｌを添加し、血液を２４時間培養した（３７℃、５％ＣＯ_２ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ）。内毒素チャレンジ後の血漿レベルを図１４に示す。ＣＬＯＮのＭＳ形態は、ＣＬＯＮの遊離形態と比較して、内毒素で誘発されたＩＬ−１−βレベルを有意に低下させた（ｐ<０．０５）。

−生体活性タンパク質薬剤ＮＦ−ＫＢ
−適用−敗血症性ショック
−調製方法−乳化方法
−サイトカインアンタゴニスト（すなわち、ＮＦ−ＫＢに対するアンチセンスオリゴマー（生体活性タンパク質薬剤））を含有するミクロスフィアの調製
−全血モデル、内毒素ショックモデル及び腹膜炎モデルにおける評価
−ＮＦ−Ｋｂに対するマイクロカプセル化アンチセンスオリゴマー；炎症誘発性のサイトカイン阻害に対する新規なアプローチ

（Ａ）導入
個々のタンパク質合成の阻害は、特定のｍＲＮＡと結合した後、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって可能である。しかし、アンチセンス化合物の細胞内浸透が不十分なため、それらの効果が限定される。マイクロカプセル化アルブミン内に含有されるアンチセンス化合物は、核及びサイトゾルｍＲＮＡに対するオリゴマーの接触を高めるために、マクロファージの通常の食細胞機能を活用して、アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞内に送達する。マクロファージ内に微量注射されたフルオレセイン標識されたオリゴヌクレオチドは、数分以内に核中に現れ、合成されたｍＲＮＡとすぐに相互作用する。

本発明者らの実験室において行われた研究は、アルブミンマイクロカプセルを、（１）in vitro及びin vivoでマクロファージがすばやく貪食し、（２）肝臓、脾臓、腎臓及び血液中の単核細胞／マクロファージの９０％以上に分布し、（３）感染領域に移動することを示した。以前の研究において、本発明者らは、in vitroでのサイトカイン抑制及びin vivoでの感染の致死性内毒素ショックモデル及び腹膜炎モデルを用いた動物生存率の両方で、ＴＮＦ及びＩＬ１に対するマイクロカプセル化された中和抗体の効力が向上していることを示した。従って、マイクロカプセル化薬剤は、直接的にマクロファージ（炎症誘発性のサイトカインの大部分を分泌する）を標的として送達され、これらの化合物の効力を高め得る。

ＮＦ−ｋＢは、近年、炎症誘発性のサイトカイン（例えば、ＴＮＦ及びＩＬ１）の合成の原因となる核転写因子であると考えられている。さらに、炎症性プロセスに関与する他の物質は、ＮＦ−ｋＢによって調節される。ＮＦ−ｋＢの活性の増加は、敗血症及び他の炎症性状態、例えば、糸球体腎炎、急性呼吸困難症候群、及び炎症性腸疾患において認められる。従って、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、炎症誘発性のサイトカインの合成を抑制することによって、炎症性応答を変え得る。これらの化合物のマイクロカプセル化は、直接的にマクロファージを標的化することによってさらに効力が高められる場合がある。

本研究の目的を以下に示す：
（ａ）in vitro全血モデルにおいて、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴマーのアルブミンマイクロカプセル化により、内毒素刺激に対するＴＮＦ、ＩＬ１、ＩＬ６及びＩＬ８の抑制の程度が向上するか否かを決定すること、及び
（ｂ）ＮＦ−ｋＢに対するマイクロカプセル化オリゴマーが炎症誘発性のサイトカインを抑制し、in vivo内毒素ショックモデル及び腹膜炎モデルを用いて生存率を向上させるか否かを決定すること。

（Ｂ）ミクロスフィアの調製
ＮＦ−ｋＢに対するマイクロカプセル化アンチセンスオリゴヌクレオチドを実施例１に従って作製した。

（Ｃ）実験方法
（ａ）in vitro全血モデル：
血液サンプルを、正常なヒト志願者から抜き取り、複数の１ｍＬアリコートに分けた。Ｅ．Ｃｏｌｉ内毒素１００ｕｇを各標本に添加した。培養（ＴＮＦ−４時間、ＩＬ１−２４時間）後、各群のサイトカインレベルを２連のＥＬＩＳＡ法によって測定した。

以下の各群を試験した：
１．コントロール：内毒素＋生理食塩水
２．内毒素の添加１時間前に、溶液中のＮＦ−ｋＢアンチセンス、２００及び３００ｕｇ／ｍｌを添加
３．ＮＦ−ｋＢ非センス（スクランブルされた）２００及び３００ｕｇ／ｍｌ
４．ＮＦ−ｋＢに対するマイクロカプセル化アンチセンスオリゴマー２００及び３００ｕｇ／ｍｌ
５．マイクロカプセル化非センス（スクランブルされた）オリゴマー２００及び３００ｕｇ／ｍｌ
（ｂ）in vivo内毒素ショックモデル
体重約１５０ｇのＦｉｓｃｈｅｒラットに、Ｅ．Ｃｏｌｉ内毒素１５ｍｇ／ｋｇを静脈内注射して、内毒素ショックを起こさせた。投与０時間、４時間、８時間、２４時間及び４８時間後のＴＮＦ値をＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。生存を５日間（１２０時間）観察した。

用量反応試験を行った後、ＮＦ−ｋＢに対するマイクロカプセル化アンチセンスオリゴマー３００ｕｇを１０匹のラットに注射し、溶液中のオリゴマー３００ｕｇを１０匹のラットに静脈内に投与した。

（ｃ）in vivo腹膜炎モデル
Ｅ．Ｃｏｌｉ１０^１０有機体を腹腔内に注射して、ラットに腹膜炎を誘発させた。ゲンタマイシン１５ｍｇ／ｋｇを、３日連続して、腹腔内投与した。投与０時間、４時間、８時間、２４時間、及び４８時間後のＴＮＦを測定した。生存を５日間（１２０時間）観察した。

１．同時投与：Ｅ．Ｃｏｌｉの腹腔内注射と以下の投与を同時に行い、さらに２日間毎日投与した。
ａ．コントロール
ｂ．マイクロカプセル化ＮＦ−ｋＢ（静脈内） ４００ｕｇ／ラット ｎ＝１０
ｃ．マイクロカプセル化ＮＦ−ｋＢ（静脈内） ２００ｕｇ／ラット ｎ＝１０
ｄ．溶液ＮＦ−ｋＢ（静脈内） ４００ｕｇ／ラット ｎ＝１０
ｅ．溶液ＮＦ−ｋＢ（静脈内） ２００ｕｇ／ラット ｎ＝１０

２．遅延投与：Ｅ．Ｃｏｌｉの腹腔内投与の４時間後（ＴＮＦレベルピーク時）に上述の用量のオリゴマーを投与し、さらに２日間投与した。

（Ｄ）結果及び考察：
ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴマーのマイクロカプセル化は、マクロファージ内への細胞内浸透を増大させるため、炎症誘発性のサイトカイン阻害を向上させる。ＮＦ−ｋＢに対するマイクロカプセル化アンチセンスオリゴマーは、in vitro全血モデルを用いて、溶液中の当量のオリゴマーよりもかなりの程度ＴＮＦ>ＩＬ１>ＩＬ６>ＩＬ８を抑制する（ｐ<０．０５）。マイクロカプセル化ＮＦ−ｋＢオリゴマーは、ラットにおける内毒素ショックモデルにおいて、用量依存的にＴＮＦレベルを抑制した。ラットあたり３００ｕｇの用量で、溶液中の当量の用量を用いた内毒素ショックモデルの２０％と比較して、８０％の生存率が観察された（ｐ<０．０５）。マイクロカプセル化オリゴマーは、腹膜炎モデルで８０％の生存率を与え（溶液群では３０％）、遅延投与群で７０％の生存率を与えた（溶液群では２０％）。ＴＮＦ及びＩＬ１は、マイクロカプセル化群においてかなりの程度まで阻害された。マイクロカプセル化オリゴマーを用いた遅延投与群では、ＴＮＦピーク後に投与した場合でさえ、生存が認められた。

要約すると、ＮＦ−ｋＢに対するマイクロカプセル化オリゴマーは、in vitro及びin vivoの両方において、炎症誘発性のサイトカイン阻害を高めるとともに、内毒性ショック及び腹膜炎の致死モデルにおける死亡率を改善する。ＮＦ−ｋＢに対するマイクロカプセル化オリゴマーは、炎症誘発性のサイトカイン活性化によって特徴付けられる病理状態の治療に価値を有し得る。

（Ｅ）結果：
図１５は、ミクロスフィア（ＭＳ）及び溶液（Ｓｏｌｎ．）処方物における、ＴＮＦ−α阻害に対する、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンス（ＡＳ）オリゴマーの効果を示す。

図１６は、ヒト全血試験において、ミクロスフィア（ＭＳ）及び溶液（Ｓｏｌｎ．）処方物におけるＩＬ−１−βレベルに対する、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンス（ＡＳ）オリゴマーの効果を示す。

図１７は、内毒性ショックラットモデルにおいて、アンチセンスＮＦ−ｋＢのミクロスフィアの用量反応試験を示す。

図１８は、内毒素ショックラットモデルにおけるＴＮＦ−αレベルに対する、ＮＦ−ｋＢ（ミクロスフィア及び溶液）の効果を示す。

図１９は、内毒素ショックラットモデルの生存率における、アンチセンスＮＦ−ｋＢのミクロスフィアの用量反応試験（同時投与した場合）を示す。

図２０は、内毒素ショックラットモデルの生存率における、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴマーのミクロスフィア形態及び溶液形態の同時投与（Ｓ）の効果を示す。

図２１は、腹膜炎ラットモデルのＴＮＦ−αレベルにおける、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴマー（ミクロスフィア形態及び溶液形態）の同時投与の効果を示す。

図２２は、腹膜炎ラットモデルの生存率における、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴマー（ミクロスフィア形態及び溶液形態）の同時投与（Ｓ）の効果を示す。

図２３は、腹膜炎ラットモデルのＴＮＦ−αレベルにおける、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴマー（ミクロスフィア形態及び溶液形態）の遅延投与（Ｄ）の効果を示す。

図２４は、腹膜炎ラットモデルのＩＬ−１−βレベルにおける、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴマー（ミクロスフィア形態及び溶液形態）の遅延投与（Ｄ）の効果を示す。

図２５は、腹膜炎ラットモデルの生存率における、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴマー（ミクロスフィア形態及び溶液形態）の遅延（Ｄ）投与の効果を示す。
〔実施例（パート２）〕

薬剤の異なる例、異なる溶媒、異なる温度及び種々の方法論を用いた噴霧方法によって調製したミクロスフィアの評価

（Ａ）導入
本発明者らは、異なるカテゴリーの薬剤（生体活性タンパク質、オリゴヌクレオチド、化学物質、ワクチン）を噴霧する方法により調製したミクロスフィアの評価、さらにミクロスフィアの調製について、油、温度及び方法論のバリエーションの影響を試験することについて関心を持った。本発明者らは、生分解性非抗原性アルブミンマトリックスを、サイトカインアンタゴニスト［例えば、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴマー］をマイクロカプセル化するために使用した。

（Ｂ）実験の方法論
ミクロスフィア調製：
噴霧方法：
一般的な方法論：
本発明の一般的な基本方法は、以下の工程を包含する：
マイクロカプセル化されるべき薬剤（生体活性タンパク質、薬剤又は合成薬剤であってもよい）の水溶液を、カプセル化するポリマー（例えば、限定されないが、アルブミン、キトサン、グロブリン又はいくつかの他の生分解性天然ポリマー又は合成ポリマー）とともに調製する。次いで、このポリマー−薬剤溶液をエアロゾル化し（いくつかのスプレー形成デバイス、例えば限定されないが、超音波噴霧器を用いて）、微細なミスト様のスプレーを形成する。次いで、このポリマー−薬剤（又は他の物質）溶液を含有するミスト又はスプレーを、溶媒系、例えばブタノール又は他の低級炭素アルコール、例えば、限定されないが、メタノール、エタノール、プロパノールなど（図２６を参照）又はいくつかの不活性油（例えば、限定されないが、オリーブ油、キャノーラ油、綿実油、重鉱物油又は軽鉱物油、上述のもの又は上述のサブコンポーネントの混合物など）に直接入れる。溶媒系を攪拌状態に保つ。水性の液滴は溶媒系と混和しないため、小さなポリマー−薬剤ミクロスフィアを溶媒中で混合し、それらを互いに分離した状態に維持する。エアロゾル化されるポリマー−薬剤溶液の濃度、スプレーヘッドの構造、及び／又は可能な他のパラメーター（例えば、溶液に適用される圧力、溶液の上を通る空気又はガスの速度など）に基づいて、ミクロスフィアのサイズは、直径約０．０５〜５０マイクロメートル、さらに好ましくは直径約０．５〜５マイクロメートルの範囲であってもよい。乳化剤、例えばＳｐａｎ８５は、溶媒系中に存在しても存在していなくてもよい。溶媒系は、カプセル化される溶液の性質に依存して、５℃〜６０℃の範囲の温度であってもよい。全ての溶液がエアロゾル化された後、攪拌をさらに１／２〜２時間続ける。ミクロスフィアを、（ａ）デシケーター中でグルタルアルデヒド蒸気を用いて、又は（ｂ）ブタノール又はいくつかの同様な溶媒系中の０．５〜２０％ｗ／ｖの範囲の種々のグルタルアルデヒド比率からなる溶媒系中に乾燥したミクロスフィアを浸すことによって、表面架橋によって硬化させる。次いで、ミクロスフィアを、カプセル化される薬剤の性質に依存して、溶媒、例えば、限定されないが、エタノール、メタノール又はブタノール又はヘキサンで数回洗浄する。硬い表面を得るための球からの水の除去は、（ａ）ミクロスフィアを凍結乾燥させることによって、（ｂ）デシケーター中で炭酸カルシウムのような脱水剤を用いて水を除去することによって、又は（ｃ）薬剤の性質に依存して、約２５〜１００℃の範囲の温度で、減圧オーブン中で乾燥することによってのいずれかで達成される。使用される噴霧器（エアロゾル生成器）は、超音波型（Ｏｍｒｏｎ ＭｉｃｒｏＡｉｒ，ＮＥ−Ｕ０３Ｖ）、又は微細なミスト様のスプレーを生じる任意のデバイスであり得、例えば、（ａ）香水噴射器のような単純なデバイスでさえ使用可能であり、又は空気加圧ノズル型デバイスを使用することも可能である。他のスプレーを生成するデバイス及び機構は、当業者に公知であり、本明細書中では詳細には議論しない。

本方法の利点のいくつかを以下に示す：
（ａ）粒子サイズが約０．０５〜５０マイクロメートルの粒子が製造可能である。
（ｂ）各バッチの粒子サイズ分布が、非常に狭い範囲内にある。
（ｃ）本方法が非常に再現可能である。
（ｄ）大きなバッチサイズが短時間で製造可能であり、この手順は大きなスケールの製造に非常に好ましい。本プロセスは、連続フロープロセスに類似している。

−生体活性タンパク質薬剤ＮＦ−ＫＢ
−適用−敗血症性ショック
調製方法−噴霧
−噴霧方法による、サイトカインアンタゴニスト、すなわちＮＦ−ＫＢに対するアンチセンスオリゴマー（生体活性タンパク質薬剤）を含有するミクロスフィアの調製

（Ａ）導入
サイトカインアンタゴニストを含有するミクロスフィア［（ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴマー（生体活性タンパク質薬剤）］を本試験において評価した。

（Ｂ）噴霧方法を用いた、アルブミンによるＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの調製
サイトカインアンタゴニストを含有するミクロスフィア［（ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴマー（生体活性タンパク質薬剤）］を、アルブミンミクロスフィアマトリックスに架橋した。
（１）ヒトアルブミン５０ｍｇを、発熱性物質を含まない水２ｃｃに溶解した。
（２）ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴマー）を、２５ｍｇ／ｃｃの濃度で、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に別個に溶解した。
（３）上記の２つの溶液を、約３０分間、混合した。
（４）得られた混合物を５℃に冷却した。
（５）以下に「油及び溶媒の違いによる影響」として概略を説明するような溶媒２０ｃｃを、５０ｃｃビーカーに入れ、５℃まで冷却し、氷浴中でこの温度に維持した。
（６）アルブミン及びオリゴヌクレオチドの混合物を溶媒中に噴霧し、この溶媒系を３０分攪拌状態に保つ。
（７）マイクロカプセル化アルブミン−薬剤ミクロスフィアを含有する溶媒系を、ミクロスフィアが直径約１ミクロンになるまで、レーザー粒子サイズ測定器を用いて、そのサイズを評価した。
（８）氷浴によって温度を約５℃に維持しながら、組織ホモジナイザーを高（ｈｉｇｈ）に設定してコンスタントに攪拌しつつ、１時間かけてグルタルアルデヒドの２５％ｗ／ｖ溶液０．５ｃｃでミクロスフィアを架橋した。
（９）ミクロスフィアをブタノール又はエタノール又はメタノール又はヘキサン２０ｃｃで３回洗浄し、連続型ＨＰＬＣフィルター（５０、２０、１０、５、及び１ミクロンサイズ）を用いて、最後の溶媒洗浄液中に懸濁させつつ、最終的なサイズを測定した。
（１０）ミクロスフィアを凍結乾燥させ、使用するまで冷蔵庫で保存した。

全ての場合において、使用前に、ミクロスフィアを発熱性物質を含まない水又は生理食塩水に懸濁させた。噴霧工程において、スプレーヘッドで作成された粒子を、上述の工程（５）において、溶媒を含有する容器へ管を介して移動させ、管の先端を溶媒の表面より下になるように維持する。その結果、噴霧された粒子は、空気中への損失が最小限になるように、空気界面より下の溶媒溶液中に導入される。

乳化媒体として異なる種類の油及び溶媒系を使用して評価するために、上記手順を繰り返し、上述の５℃に加えて、製造時の温度も変えて評価した。最後に、水に加えて、異なる溶媒もまた薬剤を溶解するための媒体として評価した。以下のバリエーションを評価した：

（ａ）油及び溶媒の違いによる影響：
異なる油／溶媒、例えば、オリーブ油、綿実油、キャノーラ油、鉱物油及びブタノールを本試験のために使用した。

（ｂ）温度の違いによる影響：
広範囲に温度条件を変化させて、ミクロスフィアを調製した。

（ｃ）薬剤を溶解させるために使用される水相の違いによる影響：
ＰＢＳに加えて、生理食塩水、蒸留水／脱イオン水及びＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を含む水を使用してアルブミン及び薬剤を溶解させた。

（ｄ）架橋のバリエーションの違いによる影響：
全てのミクロスフィアを溶媒中に噴霧した後、架橋剤を添加して、架橋による影響を評価した。

（Ｃ）実験的方法論：
（ａ）薬剤含量分析：
本発明者らの実験室で開発したＨＰＬＣ方法によって、薬剤含量分析を行った。

（ｂ）効力試験−in vitro全血モデル試験：
調製物を、全血モデルを用いて薬剤の効力について評価した。以下に概略を説明する：
血液をＥＤＴＡを含有するラベンダートップ管に入れておいた。この血液を５ｍｌのアリコート３個にわけ、ミクロスフィアの以下のバッチの１個を用いて１時間かけて前処理し、内毒素（１００ｍｃｇ／ｍｌ）を用いてチャレンジ試験した。内毒素チャレンジ後０時間及び４時間のサンプルを得て、これらのＴＮＦ−αレベルを決定した。

（Ｄ）結果：
図１〜６は、薬剤含量、及び噴霧方法及び乳化の方法論によって調製したミクロスフィアのＴＮＦ−α抑制効果を比較するデータを示す。

−化学薬剤ピロリジンジチオカルバメート
−適用−敗血症性ショック
−調製方法−乳化
−マイクロカプセル化ピロリジンジチオカルバメートの調製及び評価

（Ａ）導入：ピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）は、水溶性の、低分子量の、酸化防止物質であり、これは、ＮＦ−ｋＢ活性化を阻害する。ＮＦ−ｋＢは核転写因子であり、これは、炎症性サイトカインの活性化の原因となる。いくつかの研究により、サイトカイン阻害におけるin vitroでのＰＤＴＣの効果及びラットの内毒素ショックモデルにおける死亡率の改善が示された。本発明者らは、in vitro及びin vivoの両方でサイトカイン阻害において、中和抗体及びＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴマーのような化合物の効果の向上を示した。化合物のマイクロカプセル化によりマクロファージを標的化し、サイトカイン阻害の効力を高める。

（Ｂ）実験的な方法論：
全血モデルを使用して、マイクロカプセル化ＰＤＴＣの効力を評価する。３つの用量［１５μＭ、３０μＭ、及び６０μＭ］を試験する。これらの用量を、カプセル化形態及び溶液形態の両方で、１ｍＬアリコートに添加する。ＴＮＦαを、標準的なＥＬＩＳＡ手順によって測定する。

（Ｃ）結果：
図２７は、in vitroでのサイトカインレベルに対するＰＤＴＣの効果を示す。ＰＤＴＣのミクロスフィアは、評価した３つの用量で、対応する溶液用量とは有意に異なっていた。

本発明のいくつかの例示的な実施形態のみが上に詳細に示されたけれども、本発明の新規な教示及び利点から実質的に逸脱することなく、これらの例示的な実施形態において多くの改変が可能であることを当業者は容易に認識する。それ故に、全てのこのような改変は、特許請求の範囲に規定されるような本発明の範囲内に含まれることが意図される。本明細書中で参照される任意の特許、明細書及び刊行物は、その全体が参考として本明細書中に組み込まれることをさらに注記すべきである。

図１は、乳化法及び噴霧法による、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンス（ＡＳ）オリゴマーのパーセント含量分析における、油（５℃で調製）の違いによる影響を示す（薬剤を溶解させるために水相として水を使用）。 図２は、異なる温度設定で調製したバッチの、乳化法及び噴霧法によるＮＦ−ｋＢに対するアンチセンス（ＡＳ）オリゴマーのパーセント含量分析を示す（オリーブ油、薬剤を溶解させるための水相として水を使用）。 図３は、オリーブ油と、１０℃で調製した異なる水相を用いた場合の、乳化法及び噴霧法によるＮＦ−ｋＢに対するアンチセンス（ＡＳ）オリゴマーのパーセント含量分析を示す。 図４は、乳化法及び噴霧法によってＮＦ−ｋＢに対するアンチセンス（ＡＳ）オリゴマーのミクロスフィアを製造するために異なる油を用いた場合の、ＴＮＦ−αレベルを示す。 図５は、乳化法及び噴霧法によるＮＦ−ｋＢに対するアンチセンス（ＡＳ）オリゴマーの製造プロセスにおいて異なる温度を用いた場合の、ＴＮＦ−αレベルを示す。 図６は、乳化法及び噴霧法によるＮＦ−ｋＢに対するアンチセンス（ＡＳ）オリゴマーの製造プロセスにおいて異なる水相を用いて試験した場合の、ＴＮＦ−αレベルを示す。 図７は、ＭＥＣＡ（８０μｇのＭＥＣＡ中に２０μｇのＥＣＡを含有）群での腫瘍発現率を示す。 図８は、内毒素で誘発されたＴＮＦ−α放出に対する、ＣＮＩ−１４９３の効果を示す。 図９は、内毒素で誘発されたＩＬ−１−β放出に対する、ＣＮＩ−１４９３の効果を示す。 図１０は、内毒素で誘発されたＴＮＦ−αレベルに対する溶解性（ＳＯＬ）及びマイクロカプセル化（ＭＣ）ＣＮＩ−１４９３の異なる用量での影響を示す。 図１１は、内毒素で誘発されたＩＬ−１−βレベルに対する溶解性（ＳＯＬ）及びマイクロカプセル化（ＭＣ）ＣＮＩ−１４９３の異なる用量での影響を示す。 図１２は意図的に削除した。 図１３は、内毒素で誘発されるＴＮＦ−α放出に対するクロドロネートの効果を示す。 図１４は、内毒素で誘発されるＩＬ−１−β放出に対するクロドロネートの効果を示す。 図１５は、ミクロスフィア（ＭＳ）及び溶液（Ｓｏｌｎ．）処方物におけるＴＮＦ−α阻害に対する、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンス（ＡＳ）オリゴマーの効果を示す。 図１６は、ミクロスフィア（ＭＳ）及び溶液（Ｓｏｌｎ．）処方物におけるＩＬ−１−βレベルに対する、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンス（ＡＳ）オリゴマーの効果を示す。 図１７は、内毒性ショックラットモデルにおける、アンチセンスＮＦ−ｋＢのミクロスフィアの用量反応試験の効果を示す。 図１８は、内毒素ショックラットモデルにおけるＴＮＦ−αレベルに対する、ＮＦ−ｋＢ（ミクロスフィア及び溶液）の効果を示す。 図１９は、内毒素ショックラットモデルの生存率における、アンチセンスＮＦ−ｋＢのミクロスフィアの用量反応試験（同時投与した場合）を示す。 図２０は、内毒素ショックラットモデルの生存率における、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴマーのミクロスフィア形態及び溶液形態を用いた同時投与（Ｓ）の効果を示す。 図２１は、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴマー（ミクロスフィア形態及び溶液形態）の同時投与（Ｓ）のＴＮＦ−αレベルに対する効果を示す。 図２２は、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴマー（ミクロスフィア形態及び溶液形態）の同時投与（Ｓ）の生存率に対する効果を示す。 図２３は、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴマー（ミクロスフィア形態及び溶液形態）の遅延投与（Ｄ）のＴＮＦ−αレベルに対する効果を示す。 図２４は、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴマー（ミクロスフィア形態及び溶液形態）の遅延投与（Ｄ）のＩＬ−１−βレベルに対する効果を示す。 図２５は、ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴマー（ミクロスフィア形態及び溶液形態）の遅延投与（Ｄ）の生存率に対する効果を示す。 図２６は、全血モデルにおいて、異なる溶媒系を用いて調製したＮＦ−ｋＢに対するアンチセンス（ＡＳ）オリゴマーのミクロスフィアによる、ＴＮＦ−αの抑制に対する製造条件による影響を示す。 図２７は、in vitroでのサイトカインレベルに対するＰＤＴＣの効果を示す。

Claims (1)

1. 生体活性物質をカプセル化する方法であって、当該方法は、以下：
   ａ．水中にアルブミンを溶解する工程；
   ｂ．ＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴマー）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解する工程；
   ｃ．前記溶解させたアルブミン及び前記可溶化させたＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴマー）を混合する工程；
   ｄ．工程ｃで形成された混合物を冷却する工程；
   ｅ．溶媒を準備する工程；
   ｆ．工程ｅの前記溶媒を冷却する工程；
   ｇ．工程ｆの前記溶媒を冷却した温度に維持して溶媒系を形成する工程；
   ｈ．工程ｇの前記溶媒を攪拌しながら、前記溶解させたアルブミン及び前記溶解させたＮＦ−ｋＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴマー）を前記溶媒中に噴霧する工程；
   ｉ．工程ｈのマイクロカプセル化したアルブミン−薬剤ミクロスフィアを含有する前記溶媒中のミクロスフィアのサイズを評価して、ミクロスフィアを得る工程；
   ｊ．前記溶媒系を冷却した温度に維持しながら、攪拌しつつ、前記ミクロスフィアとグルタルアルデヒドとを架橋させる工程；
   ｋ．工程ｊの前記ミクロスフィアを溶媒を用いて洗浄する工程；
   ｌ．工程ｋの前記ミクロスフィアのサイズを測定する工程；ならびに
   ｍ．工程ｌの前記ミクロスフィアを凍結乾燥させる工程
   を包含する、方法。