JP2006506371A

JP2006506371A - ラクトバチルス・リューテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒｉ）株を用いる哺乳類における免疫機能の改善方法

Info

Publication number: JP2006506371A
Application number: JP2004545114A
Authority: JP
Inventors: カング，ホ−ジン; クワン，イク−ボー; コノリー，イーモン; モルスタム，ボ; リー，ドング−セオグ
Original assignee: Biogaia AB
Current assignee: Biogaia AB
Priority date: 2002-10-18
Filing date: 2002-10-18
Publication date: 2006-02-23
Also published as: WO2004034808A1; AU2002347697A1; DE60232827D1; ES2329020T3; CN1668211A; AU2002347697B2; DK1567018T3; CN100348119C; HK1079661A1; BR0215884A; US20060002907A1; EP1567018A1; MXPA05003743A; ATE434940T1; EP1567018B1

Abstract

本明細書における発明は、免疫増進剤としてのラクトバチルス・リューテリ株の使用、そのような菌株の細胞を含有する製品においてラクトバチルス・リューテリ株を用いる哺乳類における免疫機能を改善する方法、および製品それ自体に関する。これらの菌株は、良好な毒素の結合と中和効果を発揮し、そして良好なＣＤ４＋細胞の動員を発揮する。

Description

本発明は、免疫増進剤としてのラクトバチルス・リューテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒｉ）株の使用、およびこの目的のためにもっとも有益である菌株を選択する改善方法に関する。

主に、抗生物質耐性病原菌における増加のために、広範な種々の胃腸内微生物を含む共生生物（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）が製剤化されている。Ｌ．リューテリを含む広範なラクトバチルス種の菌株が、共生生物調合物において使用されてきた。ラクトバチルス・リューテリは、動物の胃腸管の自然に存在する棲息生物の１つであり、そして日常的に健康な動物の腸内に見いだされる。それは抗菌活性を有することで知られている。参照、例えば、特許文献１、同２、同３、同４および同５。Ｌ．リューテリ細胞はグリセロールの存在下の嫌気的条件下で増殖する場合、それらはリューテリン（ｒｅｕｔｅｒｉｎ）（β−ヒドロキシ−プロピオンアルデヒド）として既知の抗微生物物質を生産する。

免疫調節活性もまたＬ．リューテリに関連していた。参照、例えば、非特許文献１；しかしながら、効力における差異が菌株間に存在し、そしてもっとも有効な菌株を選択する方法、例えば、本発明で提供されるＣＤ４＋細胞を動員する（ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ）菌株を選択する方法が必要とされる。

さらにまた、Ｌ．リューテリは一般に有益な共生生物として使用されることが知られているけれども、従来の研究は、胃腸管内に既に存在するこれらの病原菌によって生産される毒素を中和する最良のラクトバチルス菌株を利用するという重要性をある程度実現したに過ぎなかった。参照、例えば、非特許文献２。結合を含むそのような毒素の中和は、報告されたように、これらの毒素生産性病原菌によって惹起される直接効果を改善するために重要であるだけでなく、また本発明による免疫系への全般的負荷を減少されることにおいて重要である。

病原性微生物によって惹起される胃腸問題について多くの異なる原因が存在する。例えば、ヘリコバクテリ・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｐｙｌｏｒｉ）は、胃と十二指腸の潰瘍、および胃粘膜に関するリンパ系組織のリンパ腫を惹起する。ある種の病原性エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）菌株は、Ｅ．コリＯ１５７：Ｈ７によって生産されるベロ毒素（ＶＴ）のような毒素を生産し、この菌株に対する抗生物質は少くかつ低い効力である。

したがって、本発明の目的は、ＣＤ４＋細胞の動員（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）と毒素の中和の両方に有効であることが検出されたラクトバチルス・リューテリ株を用いて哺乳類における免疫機能を改善する方法を提供すること、およびそのような免疫改善性Ｌ．リューテリ菌株を選択する方法を提供すること、ならびにそのような菌株を含有する製品を提供することである。本発明のさらなる目的は、これらの毒素の免疫負荷を低下することにおいて有効なＬ．リューテリの菌株の培養上澄液を利用する方法を提供することである。

他の目的および利点は、より完全に、次に示す開示および添付される請求項から明らかになるであろう。
米国特許第５，４３９，６７８号米国特許第５，４５８，８７５号米国特許第５，５３４，２５３号米国特許第５，８３７，２３８号米国特許第５，８４９，２８９号 "ＢｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｅｆｆｅｃｔｓｏｆＰｒｏｂｉｏｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａｏｎｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓｉｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔｍｉｃｅ" ｂｙＷａｇｎｅｒＲＤ，ｅｔａｌ，ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎｅ１９９７Ｏｃｔ６５：４１６５−７２ "ＲｅｍｏｖａｌｏｆｃｏｍｍｏｎＦｕｓａｒｉｕｍｔｏｘｉｎｓｉｎｖｉｔｒｏｂｙｓｔｒａｉｎｓｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｎｄＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ" ｂｙＥｌ−ＮｅｚａｍｉＨＳ，ｅｔａｌ，ＦｏｏｄＡｄｄｉｔＣｏｎｔａｍ２００２Ｊｕｌ１９：６８０−６

本明細書における発明は、免疫増進剤としてのラクトバチルス・リューテリ株の使用、そのような菌株の細胞を含有する製品においてラクトバチルス・リューテリ株を用いる哺乳類における免疫機能を改善する方法、および製品それ自体に関する。これらの菌株は、良好な毒素結合性と中和性を発揮し、そして良好なＣＤ４＋細胞の動員を発揮するように選択される。本発明の他の目的および特徴は、より完全に次に示す開示および添付される請求項から明らかになるであろう。

本発明は、哺乳類における免疫機能を改善する組成物の製造のための、良好な毒素結合性と中和性効果を発揮し；そして良好なＣＤ４＋細胞の動員を発揮するラクトバチルス・リューテリ株の使用に関する。それはまた、そのようなラクトバチルス・リューテリ株を含有する製品およびそのようなラクトバチルス・リューテリ株を用いて哺乳類における免疫機能を改善する方法に関する。さらにそれは、そのような免疫改善性Ｌ．リューテリ株を選択する方法を提供する。

サイトカインは生物学的応答の修飾因子である免疫系タンパク質である。それらは抗体とＴ細胞免疫系の相互作用を調整し、そして免疫反応性を増幅する（１０）。サイトカインは、マクロファージによって合成されるモノカインおよび活性化したＴリンパ球とナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって産生されるリンホカインを含む。両ヒトおよびマウスにおけるＣＤ４＋サブセットはサイトカイン産生およびエフェクター機能に基づいている。Ｔｈ１細胞は、インターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）、ＩＬ−２および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を合成する。それらは主として、細胞内の微生物に対する細胞性免疫および遅延型過敏症反応に関与している。それらは免疫グロブリンＧ２ａ（ＩｇＧ２ａ）合成および抗体依存性細胞媒介の細胞障害に影響する。それらが産生するＩＮＦ−γはマクロファージと、その結果として食作用を活性化する。Ｔｈ２細胞はインターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）およびインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）を合成する。それらは、ＩｇＥとＩｇＧ１抗体応答、ならびにマスト細胞の合成および好酸球増殖と分化因子による粘膜性免疫、およびＩｇＡ合成の促進を誘導する。

本発明には、Ｌ．リューテリ株の投与、その菌株の解析およびＣＤ４＋細胞動員と毒素中和の両方における使用菌株の効力を確認する種々の例証段階を有する方法が含まれる。データは、例えば、Ｌ．リューテリを含有する錠剤調合物が細胞培養物の直接投与によるのと同様な胃腸のコロニー形成レベルを与えることを示している。Ｌ．リューテリのコロニー形成はＬ．リューテリの経口摂取に関係し、そして流出期間（Ｌ．リューテリのレベルが摂取前のレベルまで低下するのにかかる時間）は錠剤の投与後少なくとも２８日であり、このことは、本明細書の発明がＬ．リューテリ細胞培養物ならびにそのようなＬ．リューテリ培養物を含有するよう製剤化された製品のために応用できることを示している。

本発明は、好ましくは、哺乳類における免疫機能の予防的改善のための、共生生物としてのＬ．リューテリ株を含有する製品の使用に関する。そのような製品は選ばれた菌株の細胞を含有する種々の食料、例えば食物サプリメント、菓子類または錠剤であってもよい。

また、本発明によるＬ．リューテリ株は、毒素を生産する種々の微生物、例えばエシェリヒア・コリの処置のための薬物の製造のために使用されてもよい。かくして、腸出血性Ｅ．コリおよびＶＴ毒素が処置されてもよい。

本発明によれば、Ｌ．リューテリ株の細胞およびその培養上澄液の両方が、予防的、共生型および製薬学的組成物の製造のために使用されてもよい。

本発明によれば、良好なＣＤ４＋細胞動員および／または良好な毒素結合を発揮するいかなるＬ．リューテリ株が使用されてもよい。ＣＤ４＋細胞が存在していることは、例えば免疫組織化学的（実施例５におけるように）または免疫蛍光的方法により、ＣＤ４に対する抗体を用いて試験することができる。毒素結合は、例えば実施例１において実施されたように、Ｌ．リューテリ細胞または上澄液を毒素と接触させ、そして利用できる毒素における差異について試験することによって確認されてもよい。

本発明による共生性、予防的および製薬学的製品は、栄養的または製薬学的使用のために許容しうる添加物および賦形剤を含有してもよい。

本発明の特徴は、次に示す実施例を参照してより明瞭に理解できるが、これは本発明を限定するものと考えてはならない。

ベロ毒素の研究
３種の乳酸菌、Ｌ．リューテリＡＴＣＣ５５７３０、Ｌ．ブルガリクス（Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、菌株ＬＢ１２（ＣＨＲ，Ｈｏｒｓｈｏｌｍ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、およびＬ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、菌株０１（ＣＨＲ，Ｈｏｒｓｈｏｌｍ，Ｄｅｎｍａｒｋ）がこの実験において用いられた。Ｌ．リューテリは、ＭＲＳブロス（２０ｍＭグルコースを補足）に接種した後、３７℃で２４〜４８時間屈気性（ａｅｒｏｔｒｏｐｉｃ）固定（ｆｉｘｉｎｇ）条件下でインキュベートされた。ある場合には、この初期インキュベーションの後、２，５００ｒｐｍで３０分間の遠心、リン酸緩衝化生理食塩水で２回の洗浄による培地成分の除去、２５０ｍＭグリセロール溶液への懸濁、続いて屈気性固定条件下３７℃で６時間のインキュベーションを実施した。Ｌ．ブルガリクスおよびＬ．カゼイは屈気的固定条件下３７℃で２４〜４８時間ＭＲＳプラス２０ｍＭグルコース（グリセロール不含）においてインキュベートされた。各供試乳酸菌は、２ｇ／３０ｍｌ（乾燥重量）に調節し、インキュベーション後２，５００ｒｐｍで３０分間遠心し、上澄液を回収し、ベロ（ｖｅｒｏ）細胞（下記参照）を接種するためにＮａＯＨによりｐＨ７．０に調節し、そして２．０μｍフィルターを通して濾過した後使用された。グリセロール溶液およびｐＨ７．０に調節したＭＲＳブロスは、２．０μｍフィルターを通して濾過後、対照として使用された。

ベロ細胞（ＡｆｒｉｃａｎＧｒｅｅｎＭｏｎｋｅｙ腎細胞、ＡＴＣＣ−ＣＣＬ８１）は、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ，Ｓｉｇｍａ）を補足した最小必須培地（ＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）において２５ｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）の存在下で、１０％ＣＯ_２インキュベーター中３７℃４８時間インキュベートされ、そしてモノレアー形成を確認後使用された。

両ＶＴ１およびＶＴ２を分泌するエシェリヒア・コリＯ１５７：Ｈ７（ＡＴＣＣ４３８９４）は、トリプシン処理大豆培地（ＴＳＢ）に接種し、３７℃の振盪インキュベーターにおいて撹拌しつつ２４時間インキュベートし、２，５００ｒｐｍで３０分間遠心し、そして培養上澄液を濾過した後使用された。

５００ベロ細胞（２ｘ１０^５細胞／ｍｌ）が９６穴プレートに接種され、そして１０％ＣＯ_２インキュベーター中３７℃で４８時間インキュベートして、モノレアーの形成を確認し、続いて次の処理を用いて実験を実施した：Ａ：ＶＴ単独（ポジティブ対照）；Ｂ：ＴＳＢ（エシェリヒア・コリＯ１５７：Ｈ７培地）；Ｃ：ＭＲＳブロス（試験乳酸菌）；Ｄ：グリセロール溶液（Ｌ．リューテリ培地）；Ｅ：ＶＴ＋ＭＲＳブロス；Ｆ：ＶＴ＋グリセロール溶液；Ｇ：ＶＴ＋Ｌ．リューテリのグリセロール溶液培養上澄液；Ｈ：ＶＴ＋Ｌ．ブルガリクスのＭＲＳブロス培養上澄液；Ｉ：ＶＴ＋Ｌ．ブルガリクスの培養上澄液；およびＪ：ＶＴ＋Ｌ．カゼイの培養上澄液。処理Ｂ、ＣおよびＤは、各培養液それ自体がベロ細胞に対して細胞障害を惹起するか否かを決定するためであり、そしてＥおよびＦは、供試乳酸菌の培地がそれ自体においてＶＴに対する中和能力を有するか否かを決定するためである。Ｇ，Ｈ，ＩおよびＪにおける供試乳酸菌の各培養上澄液は２ｘ連続希釈にかけられ、供試乳酸菌の希釈した培養上澄液の各々とＶＴが、４００ｍｌ＋１００ｍｌ；３００ｍｌ＋２００ｍｌ；２００ｍｌ＋３００ｍｌ；および１００ｍｌ＋４００ｍｌでそれぞれ合体された後、次いで、１０％ＣＯ_２インキュベーター中３７℃で１８時間インキュベートされて、細胞変性効果（ＣＰＥ）が現れるか否かが決定された。

リューテリン生産を抑制する３００ｍＭ中和塩酸セミカルバジド（Ｓｉｇｍａ）が、２５０ｍＭグリセロール溶液におけるＬ．リューテリの培養液に添加されて、リューテリン生産を抑制し、そして上澄液が前記のように回収された。１００μｌベロ細胞が９６穴プレートに接種され、そして１０％ＣＯ_２インキュベーター中３７℃で２４時間インキュベートされて、モノレアが形成されるか否かが試験され、続いて次の処理を実施した：Ａ：ＶＴ単独；Ｂ：ＶＴ＋２５ｍＭグリセロール溶液；Ｃ：ＶＴ＋Ｌ．リューテリのグリセロール溶液培養上澄液；およびＤ：ＶＴ＋リューテリンインヒビターで処理（上記参照）後にインキュベートされたＬ．リューテリのグリセロール溶液培養上澄液。Ｂ，ＣおよびＤにおいてグリセロール溶液およびリューテリンの有無によって処理されたＬ．リューテリの各培養液が、ＶＴと２０＋８０；３０＋７０；４０＋６０；５０＋５０；６０＋４０；７０＋３０；および８０＋２０μｌでそれぞれ合体され、次いで、１０％ＣＯ_２インキュベーター中３７℃で１８時間インキュベートされて、細胞変性効果が現れるか否かが試験された。顕微鏡観察後、培養液はクリスタルヴァイオレットで染色され、そしてそれらのＯ．Ｄ．（光学濃度）値が４９０ｎｍにおいて測られた。

９６穴プレートはＧｂ３（グロボトリアオシルセラミド（ｇｌｏｂｏｔｒｉａｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ））（Ｓｉｇｍａ）でコーティングされ、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックされ、そしてＶＴまたはＶＴ＋２５０ｍＭグリセロール溶液のいずれかにおいてインキュベートされたＬ．リューテリ培養上澄液と反応させた。その後、ＶＴに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が一次抗体として使用され、これに対して、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ・抗マウスＩｇＧが添加され、そしてＯ−フェニレンジアミンの発色後、その光学濃度（Ｏ．Ｄ．）がＥＬＩＳＡリーダーにより４９０ｎｍで読まれた。この試験はＬ．リューテリとＧｂ_３レセプター間の相互作用を抑制するいずれかの物質の存在を確認した。

Ｇｂ_３によるコーティング後、ＶＴと２５０ｍＭグリセロール溶液との間およびＶＴとグリセロール溶液中でインキュベートされたＬ．リューテリの培養上澄液との間の相互作用の結果から、図１におけるように、ＶＴとＬ．リューテリの培養上澄液の組み合わせが、ＶＴのみと比較して有意なレベルで低いＯ．Ｄ．値を示すことが確認された。このことは、Ｌ．リューテリの培養上澄液中にＶＴとＧｂ_３レセプターとの結合を抑制する物質の存在が間接的に決定できたことを意味する。

９６穴プレートはＶＴ／ＶＴ＋２５０ｍＭグリセロール溶液においてインキュベートされたＬ．リューテリ培養上澄液によりコーティングされ、３％ＢＳＡでブロックされ、そしてＶＴと反応させた。その後、ＶＴに対するモノクローナル抗体が一次抗体として使用され、これに、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ・抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）が添加され、そしてＯ−フェニレンジアミンの発色後、その光学濃度（Ｏ．Ｄ．）がＥＬＩＳＡリーダーにより４９０ｎｍで読まれた。この試験はＬ．リューテリ上澄液中のＶＴと相互作用する物質の存在を確認した。

Ｅ．コリＯ１５７：Ｈ７によって分泌されるベロ毒素（ＶＴ）ＩおよびＩＩに及ぼす乳酸菌の中和効果の探究
ＴＳＢ、ＭＲＳブロスおよびグリセロール溶液がベロ細胞に添加された場合、細胞変性効果は見られなかった。さらに、両ＶＴおよびＭＲＳブロス／グリセロール溶液がベロ細胞に添加された場合、ＣＰＥがベロ細胞において観察され、このことは、培養液それ自体はＶＴに対する中和能力を欠くことを証明している。

供試乳酸菌の各培養上澄液がｐＨ７．０に調節され、濾過され、そしてＶＴと合体された場合、表１に示された結果が見い出された。Ｌ．ブルガリクスおよびＬ．カゼイでは、ＣＰＥは全濃度範囲において現れたが、Ｌ．リューテリでは、ＶＴに対する供試乳酸菌の比が４：１（この場合、はるかに少ないＣＰＥが見られた）以外は、ＣＰＥは多くのグリセロール上澄液において現れなかった。かくして、２５０ｍＭグリセロール溶液においてインキュベートされた培養上澄液のＶＴに対する明瞭な中和能力が存在した。ＭＲＳブロス（＋２０ｍＭグルコース）におけるインキュベーションでは、ＣＰＥは全濃度において現れた。

競合ＥＬＩＳＡおよびＶＴとＬ．リューテリ培養上澄液間の結合アッセイの結果は、ＭｉｃｒｏｃａｌＯｒｉｇｉｎ６．１（ＭｉｃｒｏｃａｌＳｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）プログラムを用いてＳｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ検定にかけられた。

被験者に対するＬ．リューテリの投与
この試験では、被験者は２個の咀しゃく錠剤を１日当たり２回与えられたが、各錠剤はＬ．リューテリ（ＳＤ２１１２：ＡＴＣＣ５５７３０）の１ｘ１０^８ＣＦＵ（コロニー形成単位）を含有し、４ｘ１０^８ＣＦＵＬ．リューテリの総１日用量になる。錠剤に使用されたすべての他の添加物は周知のものであり、そして国際薬局方に従った。研究は２部：上部胃腸管の探索を含む胃鏡検査セッション、および末端小腸の探索を含む回腸鏡検査セッションにおいて実施された（以下に詳述）。除外基準は、研究２週前および研究中に摂取される抗生物質；研究３週前および研究中に摂取される共生生物、胃腸関連の薬物による進行中の処置および規則的な処置を必要とする重い臓器疾患（例えば、がん）であった。患者の処置に関するプロトコールは、デンマーク医療委員会（ＤａｎｉｓｈＥｔｈｉｃａｌＣｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認され、そしてヘルシンキの布告（ｄｅｃｌａｒａｔｉｏｎｏｆＨｅｌｓｉｎｋｉ）にしたがった。研究はデンマークにおいて実施された。

Ｗｉｌｃｏｘｏｎｓｉｇｎｅｄ−ｒａｎｋｔｅｓｔは、Ｌ．リューテリの摂取前後の症候、血液試験値、便のＬ．リューテリ含量、および組織学的差異を比較するために使用された。Ｐ＜０．０５は有意と考えられた。

すべての被験者が研究を終了した。胃鏡検査セッションでは、正常な食習慣を有する１８歳を超える年齢の１０人の健康なボランティアが研究された。胃十二指腸鏡検査は、Ｌ．リューテリの摂取前０日目、および研究終了時点、２８日目に一夜絶食後に実施された。生検材料は、Ｌ．リューテリの培養と組織学的検査の両方のために、胃の体（ｃｏｒｐｕｓ）および洞（ａｎｔｒｕｍ）から、および十二指腸の第３部分から採取された。生検材料の平均サイズは３３ｍｇであった。生検材料はＰＢＳ中に直接入れられ（２：１ｖｏｌ／サンプルｗｔ）、氷上に保存され、そしてラクトバチルス・リューテリの菌数分析のためにスウェーデンのルンドにあるＢｉｏｇａｉａＡＢ研究所に送られた。組織の分離から分析までの時間は３６時間以内であった。

回腸鏡検査では、潰瘍性大腸炎（３被験者）またはクローン病（６被験者）のために結腸切除後の回腸造瘻を有する９人の被験者が研究された。小腸は全被験者において炎症の症候はなかった。回腸鏡検査は０日および２８日目に実施された、生検材料はＬ．リューテリならびに他の乳酸桿菌の培養のため、および組織学的検査のために小腸の末端２０ｃｍ内で前記のように採取された。

微生物に関する分析
便サンプルはＬ．リューテリの摂取前（０日目）および研究の終了時（２８日目）に各被験者から収集された。回腸鏡検査の被験者の便（以下に説明する）は小口から採取された。胃鏡検査セッションからの７ボランティアおよび回腸鏡検査セッションからの４ボランティアは４２日目（Ｌ．リューテリ摂取の停止１４日後）に便サンプルを収集した。サンプル（少なくとも５ｇ）が無菌容器中に収集され、そして直ちに冷蔵庫に入れた。２４時間内に、０．１％ペプトン水２０ｍｌ（１：５，ｗｔ／ｖｏｌ）が添加された。サンプルはホモジナイズされ、そして一定分量が寒冷容器中に分配された後直ちに−７０℃で凍結された。そのサンプルが総ラクトバチルス菌とＬ．リューテリの分析のためにＢｉｏｇａｉａＡＢ研究所に向けてドライアイスで凍結されて発送された。そこで、サンプルは解凍され、希釈され、そしてＬ．リューテリについてはバンコマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を含有するＭＲＳ−３寒天、そして総ラクトバチルス菌数についてはＬＢＳ寒天プレート（ＫＥＢＯＬＡＢＡＢ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）上に塗布された。ＭＲＳ−３は２％酢酸ナトリウム（ｗｔ／ｖｏｌ）を含有する改変ＭＲＳ−３寒天（ＫＥＢＯＬＡＢＡＢ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）である。ＬＢＳ寒天は１Ｌ当たり１．３２ｍｌの氷酢酸を添加することによって販売者により推奨されたように調製された。寒天プレートは３７℃で４８時間嫌気ジャーにおいてＢＢＬＧａｓパックを用いて嫌気的にインキュベートされた。研究において選ばれた分離株からのＤＮＡはＢａｃｔｅｒｉａｌＢａｒｃｏｄｅｓｒｅｐＰＲＯＴＭＤＮＡＦｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇキット（ＢａｃｔｅｒｉａｌＢａｒＣｏｄｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を用いてＰＣＲによって分析され、そしてフィンガープリントはＢｉｏｎｕｍｅｒｉｃｓソフトウェア（ＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈｓＢＶＢＡ，Ｓｉｎｔ−Ｍａｒｔｅｎｓ−Ｌａｔｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて解析された。

研究の開始時および研究用製品（ＳｔｕｄｙＰｒｏｄｕｃｔ）の投与前には、胃鏡検査セッションの被験者の誰も便中に検出可能なＬ．リューテリを有しなかった（表２）。Ｌ．リューテリ摂取の２８日後、彼らのすべては４．０ｘ１０^４ＣＦＵ／ｇの平均値をもつ１．０ｘ１０^２〜３．５ｘ１０^５ＣＦＵ／ｇ（便材料１ｇ当たりのコロニー形成単位）の範囲の量で便中にＬ．リューテリを有し、これは研究用製品の投与による便中の生存Ｌ．リューテリにおける有意な増加を示している。５人の被験者が選ばれて、４２日目と５６日目（すなわち、研究用製品の投与後２８日目まで）における便サンプルを送達した。これらの被験者では、Ｌ．リューテリは摂取後４週の便中に維持された（表２）。

組織学
いずれかの局部的免疫応答を評価するために、Ｂ−リンパ球、Ｔ−リンパ球およびマクロファージの量における変化が測定された。基礎の生検材料および２８日目の生検材料がホルマリン固定され、そしてパラフィン中に包埋された。続いて、４μｍの切片が切り取られ、そして標準的技術（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ，ｖａｎＧｉｅｓｏｎ，ＰｅｒｉｏｄｉｃＡｃｉｄＳｃｉｆｆ−ＡｌｃａｉｎおよびＰｅｒｉｏｄｉｃＡｃｉｄＳｃｉｆｆ−ｄｉａｓｔａｓｅ）を用いて組織化学的および免疫組織化学的に染色された。ＣＤ２０（Ｂ−リンパ球）、ＣＤ３，ＣＤ４＋，ＣＤ８（Ｔ−リンパ球）、ＣＤ６８（組織球）、ヘリコバクターおよびＫｉ−６７（増殖マーカー）に対する１次抗体は、ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋから得られた。免疫組織化学的染色は、均一な染色を得るためにＤＡＫＯＴｅｃｈＭａｔｅ^ＴＭ５００イムノステイナーにおいて実施された。

病理学者が生検材料を評価した。組織化学的染色に基づいて、組織の損傷がＭａｄｓｅｎら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１９９９；１１６：１１０７−１１１４）にしたがって等級付け（１〜１０）された。この等級は４つの基準：潰瘍形成、上皮増生、単核細胞量および固有層中の好中球顆粒細胞、の数値の合計を表す。免疫組織化学的染色に基づいて、固有層中のＣＤ２０、ＣＤ３，ＣＤ４＋，ＣＤ８およびＣＤ６８ポジティブ細胞の数が半定量的に評価された。３カ月後、基礎および２８日目の生検材料がブラインドされ、そして同じ病理学者によって評価された。基礎の生検材料と２８日目の生検材料のポジティブ染色細胞の間の全般的相関関係が各評価において算出され、そして比較された。

主として単独の（ｓｉｎｇｌｅ）Ｂ−リンパ球細胞が、０日目の２被験者と２８日目の２被験者の胃（体および洞）において見い出された。１人の被験者は２８日目の胃（洞）に分散した細胞を有した。４被験者は０日目の十二指腸中に単独の細胞を有し、そして８被験者は２８日目の十二指腸中に主として単独の細胞を有した。８被験者は０日目の胃（体および洞）にＣＤ３、ＣＤ４＋およびＣＤ８（Ｔ−リンパ球）の主として単独の細胞を有し、そして９被験者は２８日目の小室（ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）（体および洞）中に主として単独の細胞を有した（表３）。分散した細胞は０日目の８被験者における十二指腸中に見い出され、そして主として分散したＴ−リンパ球が２８日目の７被験者の十二指腸中に見い出された。

主として単独の組織球細胞が０日目の９被験者および２８日目の５被験者における胃（体および洞）に見い出された。主として分散した細胞は０日目と２８日目の６被験者（同じ６被験者ではない）の十二指腸において見い出された。

体（ｐ＝０．０２５）および洞（ｐ＝０．０４６）からの生検材料における組織球（ＣＤ６８）の数では統計学的に有意な減少があり、そして被験者がＬ．リューテリを受けた後の十二指腸ではＢ細胞（ＣＤ２０）数の有意な増加があった（ｐ＝０．０４６）（表３）。Ｌ．リューテリの摂取によるＴ−リンパ球の量には有意な変化が見いだせなかった。２つの検討（組織学的サンプルの第１回の非ブラインド、および第２回のブラインド分析）間の一致は７６％であった（表３）。体および洞の組織球（ＣＤ６８）細胞では、一致はそれぞれわずか４０％と６５％であった。十二指腸のＢ細胞（ＣＤ２０）の一致は６０％であった。したがって、これらの知見には若干不確かな点があった。ＣＤ３、ＣＤ４＋およびＣＤ８の分析における一致ははるかに高かった（９０％まで、表３）。

回腸鏡検査セッションでは、すべての生検材料は組織学的に正常であり、そしてヘリコバクターはネガティブであった。Ｋｉ−ポジティブ細胞はすべての生検材料において正常であった。主として単独のＢ−リンパ球細胞が６被験者において見い出され、そして０日目の２被験者では、分散した細胞が見い出された。単独の細胞は２８日目の全被験者において観察された。主として分散したＣＤ３細胞（Ｂ−リンパ球）は両０日目および２８日目の７被験者において見い出された。主として分散したＣＤ４＋細胞は０日目の７被験者において、そして２８日目の７被験者では主として隣接する細胞群が見い出された。主として分散したＣＤ８細胞が０日目の７被験者において、そして２８日目の９被験者において見い出された（表３）。主として分散した組織球細胞が両０日目および２８日目の７被験者において見い出された。

２８日間Ｌ．リューテリを補充した後には、有意に高い量のＣＤ４＋リンパ球が存在した（ｐ＝０．０４６；表３）。Ｌ．リューテリの投与によるＢ−リンパ球または組織球の量には有意な変化が見いだせなかった。２つの検討間の一致は、検査したすべての細胞型について一般に高く、そしてＣＤ４＋の知見では、それはこれらのデータにおいて７８％を示す良好な信頼度であった（表３）。すべてのヘリコバクター染色はネガティブであった。

血液の生化学
血液サンプルは０日目および２８日目に採取され、そしてヘモグロビン、ヘマトクリット、血小板、白血球、Ｃ−反応性タンパク質、カリウム、ナトリウム、クレアチン、ｂ−尿素、ｐ−グルコース、コレステロール、ＨＤＬ（高密度リポタンパク質）、ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）、ＶＬＤＬ（超低密度リポタンパク質）、トリグリセリド、総ビリルビン、尿酸塩、ＡＬＡＴ、アルカリ性ホスファターゼおよび乳酸塩について分析された。

ほとんどの血液試験はＬ．リューテリの摂取前後でともに正常であった。血液変数において少しの外れたものがあったが、臨床的に有意な異常は見いだされず、そして全身的変化は処置後に観察されなかった。

ＤＮＡフィンガープリント
ＤＮＡのフィンガープリント分析が本研究から選択されたＬ．リューテリ分離株において実施された。かくして、２８日間Ｌ．リューテリを消費した３人の被験者からの便分離株が採取され、そして十二指腸生検材料からの１分離株および回腸生検材料からの１分離株がともに、Ｌ．リューテリ投与前０日目に採取された。全分離株は互いに９８％の遺伝的類似性を有することが見い出された。これらの分離株のすべては、錠剤に組み入れられた菌株、ＳＤ２１１２に対する９７％の類似性を示した。

ヒトにおいて免疫機能を改善するための製品の製剤化
この実施例では、標準ヨーグルトに添加するために、毒素の中和およびＣＤ４＋細胞の動員について前記方法を用いてＬ．リューテリＳＤ２１１２，ＡＴＣＣ５５７３０が選ばれた。Ｌ．リューテリ菌株は、酪農産業においてラクトバチルスを増殖させるための標準的方法を用いて増殖され、そして凍結乾燥された。次いで、この培養物が１０Ｅ＋７ＣＦＵ／ｇヨーグルトのレベルで慣用のヨーグルト培養物を用いて予め発酵させた牛乳に添加され、そしてヨーグルトはヒトの免疫機能を改善する手段としてヒトによって使用される。

本発明は特定の実施態様に関して記述されたので、種々の改変物、修飾物および実施態様が可能であることが評価でき、したがって、すべてのそのような改変物、修飾物および実施態様が本発明の精神および範囲内にあると見なさねばならない。

Ｌ．リューテリの培養上澄液におけるベロ細胞毒（ＶＴ）とＧｂ_３レセプターの結合に対する抑制能力の競合ＥＬＩＳＡによる確認。各々は、Ｇｂ_３でコーティングしたプレート上で次のように反応させ、続いてＶＴに対するｍＡｂを用いてＥＬＩＳＡを実施した。

対照：ＶＴ＋トリプシン処理大豆ブロス（ＴＳＢ）
ＶＴ＋Ｇ：ＶＴ＋２５０ｍＭグリセロール溶液
ＶＴ＋ＬＲＳ：ＶＴ＋２５０ｍＭグリセロール溶液においてインキュベートしたＬ．リューテリの培養上澄液

Claims

哺乳類における免疫機能を改善する組成物の製造のための、
ａ．良好な毒素の結合と中和効果を示し；そして
ｂ．良好なＣＤ４＋細胞の動員を示す
ラクトバチルス・リューテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｈｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒｉ）株の使用。
少なくとも請求項１に記載する特徴を有する菌株を含んでなる製品。
選ばれた菌株の細胞を含有する食料として調製される、請求項２の製品。
選ばれた菌株の細胞を含有する錠剤として製剤化される、請求項２の製品。
選ばれた菌株の細胞を含有する食物サプリメントとして製剤化される、請求項２の製品。
選ばれた菌株の細胞を含有する菓子として調製される、請求項２の製品。
選ばれた菌株の細胞を含有する薬物として製剤化される、請求項２の製品。
細菌毒素を中和するための、Ｌ．リューテリＡＴＣＣ５５７３０の培養上澄液の使用。
ａ．良好な毒素の結合と中和効果を示し；そして
ｂ．良好なＣＤ４＋細胞の動員を示す
菌株を使用することを含む、そのような菌株の細胞を含有する製品においてラクトバチルス・リューテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒｉ）株を用いる哺乳類における免疫機能を改善する方法。