MXPA05003743A - Metodo para mejorar la funcion inmunologica en mamiferos utilizando cepas de lactobacillus reuteri. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere al uso de cepas de Lactobacillus reuteri en la forma de agentes de mejoria inmune, a metodos para mejorar la funcion inmune en mamiferos utilizando las cepas de Lactobacillus reuteri en productos que contienen celulas de dichas cepas y en los productos como tal. Estas cepas exhiben buen enlace y efecto de neutralizacion de toxinas, y exhiben buen reclutamiento de las celulas CD4+.

Description

MÉTODO PARA MEJORAR LA FUNCIÓN INMUNOLOGICA EN MAMÍFEROS UTILIZANDO CEPAS DE LACTOBACILLUS REUTERI Campo del Invento La presente invención se refiere al uso de cepas Lactobacillus reuteri en la forma de agentes de mejoría inmunológica y a métodos mejorados para seleccionar las cepas que son las más benéficas para este propósito. Antecedentes del Invento Se han formulado probióticos que contienen una amplia variedad de diferentes microorganismos gastrointestinales, debido principalmente al incremento en patógenos resistentes a los antibióticos. Las cepas de una amplia variedad de especies Lactobacillus, incluyendo L. reuteri, se han utilizado en formaciones probióticas. El Lactobacillus reuteri es uno de los habitantes que surgen en forma natural en el tracto gastrointestinal de los animales, y se encuentra en forma rutinaria en los intestinos de animales saludables. Es conocido por tener actividad anti-bacteriana. Ver por ejemplo las Patentes Norteamericanas Nos. 5,439,678, 5,458,875, 5,534,253, 5,837,238, y 5,849,289. Cuando las células L. reuteri se crecen bajo condiciones anaeróbicas en la presencia de glicerol, producen la sustancia antimicrobiana conocida como reuterin (ß-hidroxi-propionaldehído).

La actividad ¡nmunomoduladora también ha estado asociada con L. reuteri. Ver por ejemplo la publicación de "Biotherapeutic effects of probiotic bacteria on candidiasis ¡n ¡mmunodeficient mice" de Wagner RD, y asociados, Infect Immune 1997 Oct 65:4165-4172; sin embargo, las diferencias en eficacia que existen entre las cepas y los métodos son necesarias para seleccionar las cepas más efectivas, por ejemplo, en la presente invención se proporciona el método para seleccionar las cepas que recluían las células CD4+. Además, aunque se sabe que L. reuteri se utilizará como un probiótico generalmente benéfico, los trabajos anteriores solo han considerado hasta cierto punto la importancia de utilizar las mejores cepas de Lactobacillus, que neutralizan las toxinas producidas por estos patógenos, que ya se encuentran en el tracto gastrointestinal. Ver por ejemplo la publicación de "Renoval of common Fusariun toxins in vitro by strains of Lactobacillus and Propionibacterium" de El-Nezami HS, y asociados, Food Addit Contam 2002 Jul 19:680-6. De acuerdo con la presente invención dicha neutralización de toxinas, incluyendo el enlace, no es importante únicamente para aminorar los efectos directos causados por estos patógenos que producen toxinas, tal como se reporta, sino que también es importante para la reducción de la carga general en el sistema inmune. Existen muchas causas diferentes de problemas gastrointestinales originados por microorganismos patógenos. Por ejemplo, la especie Helicobacteri pylori origina úlceras gástricas y duodenales, cáncer gástrico y linfoma de tejido linfoide asociado con mucosa gástrica. Ciertas cepas Escherichia coli patógenas producen toxinas, tales como la vero toxina (VT) producida por E. coli 0157:H7, contra la cual los antibióticos son cada vez menos efectivos. Por consiguiente es un objeto de la presente invención, proporcionar un método para mejorar la función inmunológica en mamíferos utilizando cepas Lactobaclllus reuterl detectadas como efectivas tanto en el reclutamiento de células CD4+ como en la neutralización de toxinas, y proporcionar métodos para seleccionar dichas cepas L. reuteri de mejoría inmunológica, y proporcionar productos que contengan dichas cepas. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método para utilizar los sobrenadantes del cultivo de las cepas de L. reuteri efectivos para reducir la carga inmune de estas toxinas. Se podrán apreciar otros objetos y ventajas a partir de la descripción que se encuentra a continuación y de las reivindicaciones adjuntas. Sumario del Invento La presente invención se refiere al uso de cepas Lactobacillus reuteri como agentes de mejoría inmunológica, a métodos para mejorar la función inmune en mamíferos utilizando cepas Lactobacillus reuteri en producto que contienen células de dichas cepas y a los productos como tal. Estas cepas se seleccionan para exhibir buen enlace y neutralización de toxinas; y para exhibir buen reclutamiento de células CD4+. Se podrán apreciar otros objetos y características de la presente invención, a partir de la descripción que se encuentra a continuación y de las reivindicaciones adjuntas. Breve Descripción de los Dibujos Figura 1. Confirmación de capacidad inhibidora contra el enlace de vero citotoxina (VT) y receptor Gb3, en un sobre nadante de cultivo de L. reuteri a través de ensayo ELISA competitivo. Cada uno reaccionó como se indica a continuación, sobre placas recubiertas con Gb3, seguido de la realización de ensayo ELISA utilizando mAb contra VT. Control: VT+ caldo de soya tríptico (TSB) VT+ G: VT + 250 mM de solución de glicerol VT + LRS: VT + un sobre nadante de cultivo de L. reuteri incubado en 250 mM de solución de glicerol. Descripción Detallada del Invento La presente invención se refiere al uso de cepas L. reuteri que exhiben buen enlace y efecto de neutralización de toxinas; y exhiben un buen reclutamiento de células CD4 + para la producción de una composición para mejorar la función inmune en mamíferos. También se refiere a productos que comprende dichas cepas Lactobacillus reuteri y a un método para mejorar la función inmune en mamíferos utilizando dichas cepas Lactobacillus reuteri. Además, se proporcionan métodos para seleccionar dichas cepas L. reuteri de mejoría inmunológíca. Las citocinas son proteínas del sistema inmunológico que son modificadores de respuesta biológica. Coordinan anti-cuerpos e interacciones del sistema inmune de células T, y amplifican la reactividad inmunológíca (10). Las citocinas incluyen monocinas sintetizadas mediante macrófagos y linfocinas producidas mediante linfocitos T activados y células asesinas naturales (NK). El sub-grupo CD4+ tanto en humanos como en ratones, se basa en la producción de citocina y en funciones efectoras. Las células Th1 sintetizan interferón-gama (INF-?) IL-2 y factor de necrosis de tumor (TNF). Son las principales responsables de la inmunidad celular contra micro-organismos intracelulares y de las reacciones de hipersensibilidad tipo retrasada. Afectan la síntesis de inmunoglobulina G 2a (lgG2a) y la citotoxicidad transmitida por células que dependen de anti-cuerpos. El INF-? que producen, activan los macrófagos y en consecuencia la fagocitosis. Las células Th2 sintetizan interleucina-4 (1L-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-6 (1L-6), interleucina-9 (I L-9), interleucina-10 (IL-10), e interleucina-13 (IL-13). Inducen las respuestas de anti- cuerpos IgE e Ig G1, y la inmunidad de mucosas mediante la síntesis de células mástil y crecimiento de eosinófilos y factores de diferenciación, y facilitan la síntesis de IgA. Incluidos en la presente invención, se encuentran métodos con diversos pasos de ejemplo que confirman: la administración de la cepa L. reuteri, el análisis de la cepa y la eficacia de la cepa utilizada tanto en el reclutamiento de células CD4+ como en la neutralización de toxinas. Los datos indican que por ejemplo, una formulación de tableta que contienen L. reuteri, proporciona niveles de colonización gastro-intestinal similares a los de la administración directa de cultivos celulares. La colonización de L. reuteri está relacionada con la ingestión de L. reuteri, y el período de lavado (el tiempo que toma que los niveles de L. reuteri caigan a los niveles previos a la Ingestión) es de al menos 28 días después de la administración de la tableta, lo que muestra que la presente invención es aplicable para cultivos celulares de L. reuteri así como para productos formulados para contener dichos contenidos L. reuteri. La presente invención se refiere preferentemente al uso de productos que comprenden cepas de L. reuteri como un probioticum para la mejoría profiláctica de la función inmune en mamíferos. Dichos productos pueden ser diversos productos alimenticios, tales como suplementos dietéticos, dulces o tabletas que contienen cepa seleccionada.

Las cepas L. reuteri de acuerdo con la presente invención, también se pueden utilizar para la preparación de un fármaco para el tratamiento de diversos microorganismos que producen toxinas, tales como Escherichia coli. También se pueden tratar de este modo Enterohemorrhagic E. coli y toxinas VT. De acuerdo con la presente invención, tanto las células de las cepas L. reuteri como de un sobre nadante de cultivo de las mismas, se puede utilizar para la producción de una composición farmacéutica tipo probiótico y profiláctica. De acuerdo con la presente invención, se puede utilizar cualquier cepa L. reuteri que exhiba un buen reclutamiento de células CD4+ y/o un buen enlace de toxinas. Debido a que están presentes las células CD4 + , se pueden probar utilizando anti-cuerpos CD4, por ejemplo, con métodos inmunohistoquímicos (tal como en el ejemplo 5) o inmunofluorescentes. El enlace de toxinas puede confirmarse poniendo en contacto células L. reuteri o el sobre nadante con la toxina y probar la diferencia en la toxina disponible, por ejemplo tal como se realiza en el ejemplo 1. Los productos probióticos, profilácticos y farmacéuticas de acuerdo con la presente invención, pueden comprender aditivos y excipientes aceptables para uso en nutrición o farmacéutico. Se podrán apreciar de manera más clara las características de la presente invención, a través de la referencia a los siguientes ejemplos, los cuales no están construidos como limitantes de la presente invención. Ejemplo 1, estudio de Vero Toxina En este experimento se emplearon cepas de tres bacterias de ácido láctico, L. reuteri ATCC 55730, L. bulgaricus, cepa LB12, (CHR, Horsholm, Denmark) , y cepa L. casei 01, (CHR, Horsholm, Denmark). Se incubó L. reuteri en una condición de fijación aerotrópica a una temperatura de 37°C durante de 24 a 48 horas después de la inoculación en un caldo MRS (más 20 mM de glucosa). En algunos casos, esta incubación inicial estuvo seguida por centrifugación a 2,5000 rpm durante 30 minutos, lavado dos veces con solución salina regulada por fosfato (PBS) para eliminar los componentes del medio, suspensión en 250 mM de solución de glicerol, seguido de la incubación en una condición de fijación aerotrópica a una temperatura de 37°C durante 6 horas. Se incubaron L. bulgaricus y L. casei en MRS más 20 mM de glucosa (sin glicerol) en una condición de fijación aerotrópica a una temperatura de 37°C durante de 24 a 48 horas. Cada bacteria de ácido láctico para pruebas fue empleada siguiendo el ajuste de 2g/30 mi (peso seco) centrifugando a 2,500 rpm durante 30 minutos después de la incubación, recuperando el sobrenadante, ajusfando el pH a 7.0 con NaOH para inocular las vero células (ver más adelante) y filtrando a través de un filtro de 2.0 µ. La solución de gliceroi y el caldo MRS ajustados a un pH de 7.0, sirvieron como un control, después de filtrar a través de un filtro de 2.0 µ?t?. Se incubaron vero células (células de riñon de Mono Verde Africano ATCDC-CCL81) en un medio esencial mínimo (MEM, Sigma) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS, Sigma) en 25 mg/ml de gentamicina (Sigma) a una temperatura de 37°C en un incubador de Co2 al 10% durante 48 horas, y se utilizaron después de confirmar la formación de la monocapa. Se empleó Escherichia coli 0157:H7 (ATCC 43894), la cual segrega tanto VT1 como VT2, seguido de la inoculación al caldo de soya tríptico (TSB), la incubación durante 24 horas al mismo tiempo de la agitación en un incubador de agitación a una temperatura de 37°C, la centrifugación a 2,500 rpm durante 30 minutos y la filtración del sobrenadante del cultivo. Se inocularon 500 Vero células (2 x 105 células/ml) en una placa de 96 depósitos y se incubaron a una temperatura de 37°C en un incubador de C02 al 10% durante 48 horas hasta confirmar la formación de una monocapa, seguido de la realización del experimento utilizando los siguientes tratamientos: A: únicamente VT (control positivo); B: TSB (medio de cultivo Escherichia coli 0157:1-17); C: caldo MRS (bacteria de ácido láctico de prueba); D: solución de glicerol (medio de cultivo L. reuteri); E: VT + caldo MRS; F: VT+ solución de glicerol; G: VT + sobre nadante de la solución del cultivo de la solución de reacción L. reuteri] H: VT + sobre nadante del cultivo del caldo MRS de L. bulgaricus; I: VT + sobre nadante de L. casei. Los tratamientos B, C y D son para determinar si cada fluido del cultivo origina por si mismo la citotoxicidad para las Vero células; y E y F son para determinar si el medio de cultivo de la bacteria de ácido láctico de prueba tiene capacidad de neutralización contra VT. Cada sobrenadante del cultivo de la bacteria de ácido láctico de prueba en G, H, I y J se sometió a una dilución en serie 2x, después de que cada uno de los sobrenadantes del cultivo diluido de la bacteria de ácido láctico de prueba y VT se combinaron mediante 400 mi + 100 mi; 300 mi + 200 mi; 200 mi + 300 mi; y 100 mi + 400 mi, respectivamente, y posteriormente se incubaron a un temperatura de 37°C en un incubador de C02 al 10% durante 18 horas para determinar si apareció un efecto citopático (CPE). Se agregaron 300 m de clorhidrato de semicarbazida neutralizado (Sigma), el cual inhibe la producción de reuterina a un fluido de cultivo de L. reuteri en 250 mM de solución de glicerol para restringir la producción de reuterina, y el sobrenadante se recolectó como se indicó anteriormente. Se inocularon 100 µ? de Vero células en una placa de 96 depósitos y se incubaron a una temperatura de 37°C en un incubador CO2 al 10% durante 24 horas, para examinar si se formaron las monocapas, seguido de la realización de los siguientes tratamientos: A: VT solo; B: VT + 25 mM de solución de glicerol; C: VT + sobrenadante del cultivo de solución de glicerol de L. reuteri; y D: VT + sobre nadante del cultivo de solución de glicerol de L. reuteri incubado después del tratamiento con un inhibidor de reuterina (ver lo anterior). Cada fluido de cultivo de L. reuteri tratado con o sin solución de glicerol e inhibidor de reuterina en B, C y D, se combinó con VT en 20 + 80; 30 + 70; 40 + 60; 50 + 50; 60 + 40; 70 + 30; y 80 + 20 µ? respectivamente, y posteriormente se incubó a una temperatura de 37°C en un incubador de C02 al 10% durante 18 horas para examinar si apareció un efecto citopático. Después de la observación citopática, los fluidos del cultivo fueron entintados con violeta cristal y sus valores O. D. (densidad óptica) se leyeron a 490 nm. Se recubrieron placas de 96 depósitos con Gb3 (globotriaosilceramida) (Sigma) bloqueado con 5% de albúmina de suero bovino (BSA) y se hizo reaccionar con el sobrenadante del cultivo L. reuteri que se incubó ya sea en VT o VT + 250 mM de solución de glicerol. Posteriormente, se utilizó un anticuerpo monoclonal (mAb) contra VT como un anticuerpo primario, al cual se le agregó IgG anti-ratón de carga conjugado mediante peroxidasa de rábano (HRP), y después del desarrollo de dlamina O-fenileno, se leyó su densidad óptica (0:D) a 490 nm a través de un lector ELISA. Este experimento confirmó la presencia de cualquier material que inhibe la interacción entre L. reuteri y el receptor Gb3. A partir de los resultados de la interacción entre VT y 250 mM de solución de glicerol y entre VT y un sobrenadante del cultivo de L. reuteri incubado en solución de glicerol después del recubrimiento con Gb3, se determinó que una combinación de VT y un sobrenadante del cultivo de L. reuteri produjo un valor o punto de punto bajo en niveles significativos, en comparación con VT solo, tal como en la figura 1. Esto significa que la presencia de un material que inhibe el enlace de VT y el receptor Gb3 en un sobrenadante del cultivo L. reuteri, podría ser detectado en forma indirecta. Se recubrieron placas de 96 depósitos con sobrenadante de cultivo L. reuteri el cual fue inoculado en VT/VT + 250 mM de solución de glicerol, bloqueado con 3% de BSA y reactivado con VT. Posteriormente, se utilizó un anticuerpo monoclonal contra VT en la forma de un anticuerpo primario, al cual se le agregó IgG anti-ratón de cabra (H + L) conjugado mediante peroxidasa de rábano (HRP), y después del desarrollo de la diamina O-fenileno, se leyó su densidad óptica (O.D) a 490 nm a través un lector ELISA. Este experimento confirmó la presencia de un material interactivo con VT en el sobrenadante de L. reuteri.

Ejemplo 2. Investigación del Efecto de neutralización de la bacteria de ácido láctico en Vero citotoxina (VT) I y II segregada mediante E. coli 0157:1-17 Cuando se agregaron el caldo TSB, MRS y la solución de glicerol a las Vero células, no se observó un efecto citopático. Además, cuando se agregaron tanto VT como el caldo MRS solución de glicerol a las Vero células, se observó CPE en las Vero células, lo cual prueba que los propios fluidos del cultivo carecen de una capacidad neutralizante contra VT. Cuando cada sobrenadante del cultivo de la bacteria de ácido láctico de prueba se sometió a un ajuste de pH de 7.0, se filtró y combinó con VT, se descubrieron los resultados que se muestran en la tabla 1. Para L. bulgaricus y L. casei, apareció CPE en todo el rango de concentraciones, en tanto que para L. reuteri, CPE no apareció en muchos de los sobrenadantes de glicerol excepto con la proporción de la bacteria de ácido láctico de prueba a VT de 4:1, en donde hubo mucho menos CPE. Por lo tanto, hubo una capacidad de neutralización discernible contra VT del sobrenadante del cultivo incubado en 250 mM de solución de glicerol. Para la incubación en caldo MRS ( + 20 mM glucosa), CPE apareció en toda clase de concentraciones. Tabla 1. Comparación de capacidad inhibidora contra efecto citopático (CPE) de Vero células mediante vero citotoxina (VT) en sobrenadante de cultivo de L. reuteri, L. buígaricus y L. casei.

El sobrenadante del cultivo se obtuvo después de la incubación de L. reuteri en 250 mM de solución de glicerol. **: El sobrenadante del cultivo se obtuvo después de la incubación de L. reuteri en caldo MRS (adición de 20 mM de glucosa) -: Sin CPE (efectos citopáticos) + : CPE a: CPE Leve Los resultados de la prueba ELISA competitiva y el ensayo de enlace entre VT y el sobrenadante del cultivo L. reuteri se sometieron a la prueba de estudiante utilizando el programa Microcal Origin 6.1 (Microcal Software, Inc, Boston, MA). Ejemplo 3: Administración a sujetos de L., reuteri En este ejemplo se administró a los sujetos dos tabletas masticables dos veces por día, conteniendo cada tableta 1 x 108 CFE (unidades de formación de colonias) de L. reuteri (SD2112: ATCC 55730) para administrar una dosis diaria total 4 x 108 CFE de L. reuteri. Todos los demás excipientes utilizados en las tabletas eran bien conocidos y cumplieron con las farmacopoeas internacionales. El estudio se llevó a cabo en dos partes: una sesión de gastroscopía con investigación del tracto gastro-intestinal superior, y una sesión de ileoscopía con investigación del intestino delgado distante (los detalles se encuentran más adelante). Los criterios de exclusión fueron: antibióticos tomados dos semanas antes y durante el estudio; probióticos tomados tres semanas antes y durante el estudio, tratamiento en curso con fármacos relacionados con el sistema gastro intestinal, y enfermedad orgánica severa con la necesidad de tratamiento regular (por ejemplo, cáncer). El protocolo del tratamiento para pacientes fue aprobado por el Danish Ethical Comité y estuvo de acuerdo con la declaración de Helsinki. El estudio se realizó en Dinamarca. Se utilizó la prueba de clasificación firmada por Wilcoxon para comparar los síntomas valores de pruebas de sangre, contenido de deposición de L. reuteri y diferencias histológicas antes y después de la ingesta de L. reuteri. P<0.05 se consideró como significativo.

Todos los sujetos terminaron el estudio. En la sesión de gastroscopía, se estudiaron diez voluntarios sanos, con edades mayores a 18 años, con hábitos de alimentación normales. Se llevó a cabo una gastroduodenoescopía seguido de un ayuno durante la noche en el día 0, antes de la ingesta de L. reuteri, y en el día 28, al final del estudio. Se tomaron biopsias del corpus y el antrum del estómago y de la tercera parte del duodeno, ambos para el cultivo de L. reuteri y para examinación histológica. El tamaño promedio de la biopsia fue de 33 mg . Las biopsias se colocaron inmediatamente en PBS (2:1 vol/peso de la muestra), se almacenaron en hielo y se transportaron a Biogaia AB Laboratorios en Lund, Suecia para el análisis de conteos de Lactobacillus reuteri. El tiempo a partir del aislamiento del tejido hasta el análisis fue de 36 horas. En la sesión de ileoscopía, se estudiaron nueve sujetos con ileostomía seguido de colectomía para colitis ulcerativa (3 sujetos) o enfermedad de Cronh (6 sujetos). El intestino delgado estuvo sin signos de inflamación en todos los sujetos. Se llevó a cabo una ileoscopía en el día 0 y el día 28. Se tomaron biopsias tal como se indicó anteriormente dentro de 20 cm del intestino delgado distante para el cultivo de L. reuteri, así como otros lactobacilos y para examinación histológica. Ejemplo 4. Análisis de Microorganismos Se recolectaron muestras de deposición de cada sujeto antes de la ingestión de L. reuteri (día 0) y al final del estudio (día 28). Se tomaron del estómago las heces en los sujetos de ileoscopia (se explicará más adelante). Se recolectaron muestras de deposición en el día 42 (14 días después del término de la ingesta de L. reuteri) de siete voluntarios de la sesión de gastroscopía y cuatro voluntarios de la sesión de ileoscopia. La muestra fue homogeneizada y se suministraron en alícuotas dentro de criófrascos antes de la congelación inmediata a una temperatura de -70°C. La muestras fueron enviadas, congeladas en un baño de hielo a Biogaia AB Laboratory para el análisis de Lactobacillus y L. reuteri totales. Las muestras fueron descongeladas, diluidas y plaqueadas sobre agar MRS-3 que contiene vancomicina (50 mg/l) para L. reuteri y placas de agar LBS (KEBOLAB AB, Lund)) para el conteo de Lactobacillus total. MRS-3 es un agar MRS modificado (KEBOLAB AB, Lund, Suecia) que contiene 2% de acetato de sodio (peso/volumen). El agar LBS se prepara tal como lo recomendó el fabricante, agregando 1.32 mi de ácido acético glacial por litro. Se incubaron placas de agar en forma anaeróbica utilizando paquetes BBL Gas en jarras anaeróbicas) a una temperatura de 37°C durante 48 horas. Se analizó el ADN de aislados seleccionados procedentes del estudio (ver más adelante) mediante PCR utilizando un equipo Bacterial Barcotes repPROTM ADN Fingerprinting (Bacterial barcotes, Inc, Houston, TX), y se analizaron las huellas digitales utilizando el software Bionumerics (Applied Maths BVBA, Sint Martens-Latem, Bélgica). Al inicio del estudio y antes de la administración del Producto del Estudio, ninguno de los sujetos de la sesión de gastroscopia tuvo L.reuteri detectable en las heces (Tabla 2). Después de 28 días de la ingesta de L. reuteri, todos tuvieron L. reuteri en las heces en cantidades que fluctúan de 1.0 x 102 a 3.5 x 105 CFU/g (unidades de formación de colonias por gramo de material fecal), con un promedio de 4.0 x 104 CFU/g, lo que indica un incremento significativo en el nivel de L. reuteri en las heces debido a la administración del Producto del Estudio. Se eligieron cinco sujetos para proporcionar muestras fecales en los días 42 y 56 (por ejemplo, hasta 28 días después de la administración del Producto del Estudio). En estos sujetos, el L. reuteri persistió en las heces cuatro semanas después de la ingesta (tabla 2).

Tabla 2. Recuperación de L. reuteri en heces Sujetos de gastroscopía Sujeto 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Mean SD Tabletas consumidas 100 104 104 86 93 92 81 104 102 98 96 8 % de cumplimiento 89 93 93 77 83 82 72 93 91 88 86 7 CFU L. reuterüg heces Día 0 nd Nd nd Nd nd nd nd nd nd nd nd Día 28 5.0?+0? 1.0E+03 3.8E+04 3.SE+05 1.0E+02 1.0E+02 4.1E+03 2.0E+02 1.0E+02 1.9E-K» 4.0E+04 1.1E+ 5 , Día 42 * 1.4E+03 1.5E+03 * * 1.2E+03 1.6E+03 6.0E+02 3.0E+02 5.0E+02 1.0E+03 5.3E-H12 Día 56 * * 1.3E+03 * * 2.2E+03 1.0E+03 6.0E402 t 1.0E+03 I.2E-HJ3 6.0E+02 Sujetos de ileoscopfa Sujetos 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Mean SD Tabletas consumidas 92 110 112 110 98 110 112 112 112 108 ' 7 % de cumplimiento 82 98 100 98 88 98 100 100 100 96 7 CFU L. reuteri g producción de ileostomía Dia 0 nd Nd nd Nd nd nd nd 5.00E+04 1.00E+02 nd Día 28 nd Nd nd 6.8E+03 1.0E+02 3.0E+02 5.0E+02 4.0E+04 1.0E+02 8.0E+03 1.6E+04 Día 42 * 1.0E+03 * 6.0E+02 1.9E+03 6.0E+02 * * * ?.0?+?3 6.1JS+02 Día 56 * 1.0E+03 * 8.0E+02 * 2.0E+02 * « * 6.7E-HI2 4.2E+02 nd = no detectado (<1.0x102 CFU/g materia fecal); * ¡ndica que no fue proporcionada la muestra por parte del sujeto Las muestras fecales (producción de ileostomía) fueron tomadas en el reclutamiento (Día 0) antes del suplemento con £.. reuteri durante 28 días. Los resultados se expresan en la forma de unidades de formación de colonia (CFU)/g materia fecal con peso húmedo.

Ejemplo 5, Histología Para evaluar cualquier respuesta inmunológica local, se determinaron los cambios en la cantidad de B-linfocitos, T-linfocitos y macrófagos. Las biopsias de la línea de base y las biopsias del día 28 fueron fijadas en formalina e incrustadas en parafina. En forma subsecuente, se cortaron secciones de 4 µ? y se tiñeron en forma histoquímica utilizando técnicas estándar y en forma inmunohistoquímica. Los anticuerpos primarios obtenidos de DAKO, Glostrup, Dinamarca; fueron para: CD20 (B-linfocitos); CD3, CD4 + , CD8 (T-linfocitos), CD68 (histociocitos), Helicobacter, y Ki-67 (marcador de proliferación). La tinción Inmunohistoquímica, se llevó a cabo en el inmunoentintador DAKO Tech ate™ 500 para obtener una tinción uniforme. Las biopsias fueron evaluadas por un patólogo. Sobre las bases de la tinción histoquímica se clasificó el daño al tejido (1-10) de acuerdo con la publicación de Madsen y asociados (Gastroenterol. 1999; 116:1107-11 4). Esta clasificación representa la suma numérica de cuatro criterios: ulceración de hiperplasia epitelial, la cantidad de células mononucleares y los granulocitos de neutrófilos en la propia laminar. Sobre la base de la tinción inmunohistoquímica se evaluaron en forma semi-cuantitativa los números de células positivas CD20, CD3, CD4+, CD8 y CD68 en la propia laminar. Tres meses después, se cegaron las biopsias de la línea de base y del día 28 y fueron evaluadas nuevamente por el mismo patólogo. Se calculó y se comparó en cada evaluación, la correlación general entre las células teñidas en forma positiva de la línea de base y las biopsias del día 28. Se descubrieron en forma predominante células B-linfocito solas en el estómago (corpus y antrum) de dos sujetos en el día 0 y dos sujetos en el día 28. Un sujeto tuvo células dispersas en el estómago (antrum) en el día 28. Cuatro sujetos tuvieron células simples en el duodeno en el día 0, y 8 sujetos tuvieron predominantemente células simples en el duodeno en el día 28. 8 sujetos tuvieron predominantemente células simples de CD3, CD4+ y CD8 (T-linfocitos) en el estómago (corpus y antrum) en el día 0 y nueve sujetos tuvieron predominantemente células simples en el ventrículo (corpus y antrum) en el día 28 (tabla 3). Se encontraron células dispersas en el duodeno en 8 sujetos en el día 0, y se encontraron predominantemente T-linfocitos dispersos en el duodeno de 7 sujetos en el día 28. Se encontraron predominantemente células de histiocitos simples en el estómago (corpus y antrum) en nueve sujetos en el día 0 y en 5 sujetos en el día 28. Se encontraron predominantemente células dispersas en el duodeno de 6 sujetos en el día 0 y en el día 28 (no los mismos 6 sujetos). Hubo una caída estadísticamente significativa en el número de histociocitos (CD68) en las biopsias procedentes del corpus (p = 0.025) y antrum (p = 0.046), y un número significativamente incrementado de células-B (CD20) en el duodeno, después de que los sujetos recibieron L. reuteri (p = 0.046); tabla 3). No se encontraron cambios significativos en la cantidad de T-linfoc¡tos debido a la ingestión de L. reuteri. La concordancia entre las dos investigaciones (primero, no ciego, y segundo, análisis ciego de muestras histológicas) fue del 76% (tabla 3). Para las células de histiocitos (CD68) del corpus y antrum, la concordancia fue únicamente del 40% y 65%, respectivamente. La concordancia de las células-B duodenales (CD20) fue del 60%. Por lo tanto, existió cierta incertidumbre en estos descubrimientos. La concordancia de CD3, CD4 + , y CD8 fue mucho mayor (hasta el 90%; tabla 3). En la sesión de ¡leoscopia, todas las biopsias fueron histológicamente normales y Helicobacter negativas. Las células Ki-positivas fueron normales en todas las biopsias. Se encontraron predominantemente células B-linfocitos simples en 6 sujetos y células dispersas en 2 sujetos en el día 0. Se observaron células simples en todos los sujetos en el día 28. Se encontraron predominantemente células CD3 dispersas (B-linfocitos) en 7 sujetos tanto en el día 0 como en el día 28. Se encontraron predominantemente células CD4 + dispersas en 7 sujetos en el día 0 y predominantemente grupos de unión de células en 7 sujetos en el día 28. Se encontraron predominantemente células CD8 dispersas en 7 sujetos en el día 0 y en 9 sujetos en el día 28 (tabla 3). Se encontraron predominantemente células de histiocitos dispersas en 7 sujetos tanto en el día 0 como en el día 28.

Existió una cantidad significativamente mayor de linfocitos CD4+ después del suplemento con L. reuteri durante 28 días (p = 0.046; tabla 3). No se encontraron cambios significativos en la cantidad de B-linfocitos o histiocitos debido a la administración de L. reuteri. La concordancia entre las dos investigaciones fue generalmente superior para todos los tipos de células examinadas y para CD4+, los descubrimientos fueron del 78%, lo que indica una buena confiabilidad en estos datos (tabla 3). Todas las tinciones Helicobacter fueron negativas.

O Las biopsias fueron tomadas en los 20cm distantes del intestino delgado y se fijaron y seccionaron para el Examen histológico utilizando tinción inmunohistoquimica de tipos ? celulares específicos (ver texto). o "-" = células no detectadas; "X" = células simples; "XX" = células dispersas o agregación de células; *< "XXX" = algunos grupos de unión de células. Calificación de histología (1 a 10) clasificando el grado de daño al tejido. 3 Análisis estadístico: Prueba de Clasificación de Wilcoxon. A las muestras se les — proporcionó una calificación nominal -, X, XX y XXX se ajustaron a 1 , 2, 3 y 4 respectivamente para el análisis estadístico. CÚ 28, y fueron analizadas con respecto a hemoglobina, hematocritos, trombocitos y leucitos, proteína reactiva-C, potasio, sodio, creatinina, b-urea, p-glucosa, colesterol, HDL (Iipoproteínas de alta densidad), LDL (lipoproteínas de baja densidad), VLDL (lipoproteínas de muy baja densidad), triglicéridos, bilirrubina total, urato, ALAT, fosfatasa alcalina y lactato. La mayor parte de las pruebas sanguíneas fueron normales, tanto antes como después de la ingesta de L. reuteri. Existieron pocos de los valores anteriores aparte en las variables sanguíneas, pero no se encontraron anormalidades clínicamente significativas y no se observaron cambios sistemáticos después del tratamiento. Ejemplo 7. Huella de ADN Se llevó a cabo un análisis de huella de ADN en los aislados L. reuteri seleccionados del estudio. Por lo tanto, se tomaron aislados fecales de tres sujetos que habían consumido L. reuteri durante 28 días, así como un aislado de una biopsia duodenal y un aislado de una biopsia ileal, tomadas ambas en el día 0 antes de la administración de L. reuteri. Se descubrió que todos los aislados tienen un 98% de similitud genética entre sí. Todos de estos aislados mostraron una similitud del 97% con SD2112, la cepa incorporada en las tabletas. Ejemplo 8: Formulación del producto para mejorar la función inmune en humanos En este ejemplo se selecciona L. reuteri SD2112, ATCD 55730, utilizando los métodos anteriores para la neutralización de toxinas y el reclutamiento de células CD4+, con el objeto de agregarse a un yogurt estándar. Se creció y liofilizó la cepa L. reuteri, utilizando métodos estándar para el crecimiento de Lactobacillus en la industria de productos lácteos. Posteriormente se agregó este cultivo a leche fermentada previamente, utilizando cultivos de yogurt tradicionales, en un nivel de 10E + 7 CFU/gram de yogurt, y el yogurt fue consumido por humanos como una manera para mejorar su función inmune. Aunque la presente invención ha sido descrita con referencia a modalidades específicas, se podrá apreciar que son posibles diversas modificaciones, variaciones y modalidades, y por consiguiente, todas de dichas variaciones, modificaciones y modalidades estarán consideradas como dentro del espíritu y alcance de la presente invención.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES 1.- El uso de cepas de Lactobacillus reuteri, las cuales: a. exhiben buen enlace y efecto de neutralización de toxinas; lo cual se puede confirmar poniendo células o sobrenadantes de L. reuteri en contacto con la toxina y elaborando una prueba con respecto a la diferencia en la toxina disponible, por ejemplo, mediante una prueba de anticuerpos, y b. exhiben buen reclutamiento de células CD4 + , lo cual se puede probar utilizando anticuerpos contra CD4, por ejemplo, con métodos de inmunofluorescencia inmunohistoquímica para producir una composición para mejorar la función inmune en mamíferos.
2. 2.- Un producto que comprende una cepa con al menos las características de conformidad con la reivindicación 1.
3. 3.- El producto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el producto está formulado en la forma de un alimento que contiene células de la cepa seleccionada.
4. 4.- El producto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el producto está formulado en la forma de una tableta que contiene células de la cepa seleccionada.
5. 5.- El producto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el producto está formulado en la forma de un suplemento dietético que contiene células de la cepa seleccionada.
6. 6.- El producto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el producto está formulado en la forma de dulces que contienen células de la cepa seleccionada.
7. 7.- El producto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el producto está formulado en la forma de un fármaco que contiene células de la cepa seleccionada.
8. 8.- El uso del sobrenadante del cultivo de L. reuteri ATCC 55730 para neutralizar las toxinas bacterianas.
9. 9.- Un método para mejorar la función inmune en mamíferos utilizando cepas Lactobacillus reuteri en productos que contienen células de dichas cepas, en donde el método comprende: utilizar las cepas que: a. exhiben un buen enlace y efecto de neutralización de toxinas; lo cual se puede confirmar poniendo en contacto las células o sobrenadante de L. reuteri con la toxina y probando la diferencia en toxina disponible, por ejemplo, mediante anticuerpos. b. exhiben buen reclutamiento de células CD4+, lo cual se puede probar utilizando anticuerpos con CD4, por ejemplo, con métodos de inmunofluorescencia, inmunohistoquímica.