JP2006502711A - ポリヌクレオチド分子の融解温度(Tm)を推定するための方法および系 - Google Patents
ポリヌクレオチド分子の融解温度(Tm)を推定するための方法および系 Download PDFInfo
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Abstract
Description
米国特許法119(e)のもと、2002年9月12日に出願した米国仮特許出願第60/410,663号の優先権を主張し、その全内容はすべて参照として本明細書に組み入れられる。
本発明は、核酸分子、特にオリゴヌクレオチド核酸(「オリゴマー」とも称される)の設計、解析、および/または評価に関する。本発明はまた、特定の使用または用途のための、核酸の設計、解析、および/または評価に関する。例えば、特定の態様において、本発明は、例えばPCRまたはマイクロアレイで使用するためのオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを設計する方法に関する。本発明はさらに、本発明の特定の方法を行うため、および/またはそのような方法を実施するためのコンピュータをプログラムするために使用し得るコンピュータシステムおよびコンピュータプログラム製品を含む系にも関する。
相補的な核酸間のハイブリダイゼーションは、DNA構造のワトソン-クリックモデルにおける絶対的特性であり、生物学的および生物医学的技術の多くの用途に利用されている。例えば、核酸分子を複製および/または増幅するための方法は実質的にすべて、相補的なオリゴヌクレオチド(典型的に「プライマー」と称される)が「標的」核酸分子のある部分にハイブリダイズする段階によって開始される。次いでポリメラーゼが、標的核酸を「鋳型」として使用し、プライマーから相補的核酸を合成する。Kleppeら、J. Mol. Biol. 1971, 56:341-361を参照されたい。
式中、Tm 0は1 MナトリウムイオンにおけるDNA二本鎖の融解温度である。上記の式1.1は、0.01〜0.2 M Na+の緩衝液中での大腸菌ゲノムDNAの特定の研究による実験データに基づいている。それにもかかわらず、この式の使用は、任意のDNA二本鎖オリゴマー対を設計するために当たり前のように一般化されている。例えば、Rychlikら、Nucleic Acids Res. 1990, 18:6409-6412、IvanovおよびAbouHaidar、Analytical Biochemistry 1995, 232:249-251;Wetmur, Critical Review in Biochemistry and Molecular Biology 1991, 26:227-259を参照されたい。
他の研究者らも(Frank-Kamenetskii, Biopolymers 1971, 10:2623-2624)同じ実験データを再解析し、その称するところによればlog[Na+]への融解温度の一次従属を反映する、簡略化した式を提案した:
本出願者らは、特定の塩濃度におけるポリヌクレオチドとその相補的配列の融解温度を推定する方法を発見した。本方法は、基準塩濃度における基準融解温度を得る段階、および次に基準温度からポリヌクレオチドのG-C含量に依存する方法で、新たな塩濃度依存的「補正」融解温度を算出する段階に関する。本発明により、所望の塩濃度におけるポリヌクレオチドの融解温度を確実に推定する新規な方法が提供される。本方法は容易であり、コンピュータで扱いやすい。
定義:
「融解特性」という用語は、二本鎖核酸から一本鎖核酸への(またはその逆)オリゴヌクレオチド分子の移行を示す、オリゴヌクレオチドとその相補鎖の測定値の収集物を指す。核酸の二本鎖から一本鎖への移行は、当技術分野において、その核酸分子の「融解」として示される場合が多い。移行は、核酸の「変性」または「解離」として示される場合もある。したがって、本発明の融解特性は、「解離特性」、「変性特性」、「融解曲線」、「解離曲線」等とも称し得る。
本発明に従って、当技術分野の技術の範囲内の従来の分子生物学、微生物学、および組換えDNA技法を使用し得る。そのような技法は、文献で十分に説明されている。例えば、Sambrook、Fitsch、およびManiatis、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、ニューヨーク(本明細書では「Sambrookら、1989」と称する);DNA Cloning: A Practical Approach、第I巻および第II巻(D.N. Glover編、1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait編、1984);Nucleic Acid Hybridization(B.D. HamesおよびS.J. Higgins編、1984);Animal Cell Culture(R.I. Freshney編、1986);Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press、1986);B.E. Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning (1984);F.M. Ausubelら(編)、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, Inc. (1994)を参照されたい。
本発明に従って、ポリヌクレオチド、またはより詳細にはポリヌクレオチドおよびその相補的配列の融解温度(Tm)を予測する方法をここに提供する。そのような方法は、例えばPCRおよび核酸ハイブリダイゼーションアッセイ等の生物学的アッセイで使用するためのオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーの設計に特に適している。本発明の方法は着実かつ簡便であり、本方法により、典型的にそのようなアッセイ法で使用される条件下での、ポリヌクレオチドの融解温度の信頼性のある予測または推測が提供される。詳細には、本発明の方法を用いて、当業者は特定の塩条件下におけるポリヌクレオチドの融解温度を容易に決定または推定することができ、および/またはそれに応じてアッセイの塩条件を調節することができる。または、本発明の方法を用いて、所望の塩条件下での様々なポリヌクレオチドプローブおよび/またはプライマーの融解温度を決定または推定することができ、次いでアッセイのために最適な融解温度を有するプローブおよび/またはプライマーの融解温度を選択することができる。
典型的に本明細書で記号Tm 0によって示される基準融解温度は、特定の核酸に関して、融解温度を得るまたは決定する当技術分野で周知の任意の技法を用いて容易に得ることができる。例えば、ある標準的または基準の塩濃度における1つまたは複数のポリヌクレオチドの融解温度を実験により決定することができ(後の実施例で記載されているように)、次いで本発明に従って、これらの実験的に決定した融解温度を基準融解温度として使用することができる。しかし、基準融解温度はまた、ある塩濃度において、理論的、実験的、または半実験的モデルを用いて得られ得るまたは提供され得る。特に好ましい態様において、ポリヌクレオチドの基準融解温度は、当技術分野で周知の「最近傍モデル」を用いて得られる(例えば、Breslauerら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1986, 83:3746-3750;およびSantaLuciaら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998, 95:1460を参照のこと)。しかし、当技術分野においては様々な他のモデルも周知であり、本発明に従ってそれらのモデルを使用することも可能である。
本発明の方法に従い、使用者にとって関心対象の特定の塩濃度([X+]で示される)に関して、ポリヌクレオチドの融解温度を容易に決定することができる。一般に、関心対象の塩濃度は、使用者にとって特に関心対象の生物学的アッセイ(例えば、PCRまたはハイブリダイゼーションアッセイ)のための塩濃度に相当することになる。本発明の好ましい態様において、関心対象の塩濃度はナトリウムイオン濃度である。しかし、ナトリウムの代わりに他の一価の陽イオン(例えば、カリウム、リチウム、ルビジウム、セシウム、およびフランシウム)を代用し得る。多くのハイブリダイゼーションアッセイでは、一価の陽イオンのみが存在する。しかし、マグネシウム等の二価の陽イオンが存在する場合もある。二価の陽イオンが存在する場合には、一価の陽イオンに関する以下に記載の方法を用いて融解温度を決定し、その後、例えば当技術分野で既に周知の技法を用いて、二価イオンの濃度に対して調整することができる。例えば、Ahsenら、Clinical Chemistry 2001, 47:1956-1961を参照されたい。また、Peyrot N. (2000) 「Prediction of Nucleic Acid Hybridization: Parameters and Algorithm」、ミシガン州、デトロイト、ウェイン州立大学、Ph.D.論文も参照されたい。
本発明により、ポリヌクレオチドの融解温度に及ぼす塩の影響をより正確に推定する方法および式が提供される。詳細には、これらの方法は、ポリヌクレオチドの配列内容、特にポリヌクレオチドとその相補鎖との間に形成されるグアニン(G)およびシトシン(C)塩基対の含量に依存する様式で、「基準」融解温度Tm 0を調整する。したがって、本発明の系および方法はまた、本明細書で「G-C含量値」と称し記号f(G-C)で示される値を使用する。G-C含量値f(G-C)により、ポリヌクレオチドとその相補的配列との間に形成されるG-C塩基対の数を示す数値が提供される。好ましい態様において、ポリヌクレオチドのG-C含量は、ポリヌクレオチド二本鎖におけるG-C塩基対のモル比から得られ得るまたは提供され得る;すなわち、f(G-C)=(G-C塩基対数)/(全塩基対数)。
本発明に従い、本出願者らは、ポリヌクレオチドの融解温度(Tm)、ポリヌクレオチドの解離(またはハイブリダイゼーション)が起こる塩濃度[X+]、およびポリヌクレオチドのG-C含量値f(G-C)の間の新規な関連性を見出した。したがって、本発明により、新たな関連性を用いて融解温度を推定する新規な方法が提供される。一般的に言えば、「基準」融解温度Tm 0は、上記のように、「基準」塩濃度[X+]0におけるポリヌクレオチドに関して得られるまたは提供される。次いで、基準融解温度を用いて、ポリヌクレオチドのG-C含量に対して最適化した関連性に従って塩補正Tmを算出する。
を用いて、基準融解温度(Tm 0)から推定し得るまたは得られる。本発明において、係数kは好ましくはポリヌクレオチドのG-C含量値;すなわちf(G-C)の関数である。式5.1等の式、および融解温度の逆数(すなわち1/Tm)に基づく、本明細書にわたる他の式に関して、温度はケルビン単位で挿入すべきである。本明細書において提供されるTmを含む式(例えば式5.2)では、ケルビン単位と摂氏温度は互換的に使用され得る。当業者は、当技術分野において周知であり日常的に用いられる式(例えば、K=℃+273.15)により、ケルビン単位と温度を測定する他の尺度(例えば摂氏温度)を容易に変換し得ると考えられる。
を用いて、基準融解温度(Tm 0)から推定し得るまたは得られ得る。この場合もやはり、係数k'はポリヌクレオチドのG-C含量;すなわちf(G-C)の関数であることが好ましい。
等の式を得ることができる。以前と同様に、係数kは、関心対象の特定の塩濃度における融解温度を評価するために最適化される、ポリヌクレオチドのG-C含量の関数であることが好ましい。前記のように(例えば、式5.1および5.2に関して)、係数kは好ましくは一般的な公式の式:
により得られるまたは提供される。この場合もやはり、mおよびk0は、関心対象の塩濃度または塩濃度の範囲におけるポリヌクレオチドの融解温度を決定するために最適化され得る。先と同様に、これらの係数の正確な値は、どの式を用いて塩補正融解温度を推定するかに依存するはずである;すなわち、それぞれの式に対して独立して係数を最適化することが好ましい。
等の式を得ることができる。他の式と同様に、係数kは、例えば前記の式5.3の係数mおよびk0を最適化することにより、関心対象の特定の塩濃度または塩濃度の範囲における融解温度を評価するために最適化される、ポリヌクレオチドのG-C含量値の関数であることが好ましい。この場合もやはり、本明細書に記載するそれぞれの式に対して係数を最適化することが好ましい。
コンピュータシステム
本明細書に記載する解析法は、1つまたは複数のコンピュータシステムを使用することにより実行することができる。図2は、本発明の解析法の実行に適した例示的なコンピュータシステムを図解したものである。コンピュータシステム201の成分には、メインメモリ203と相互接続したプロセッサ202が含まれる。コンピュータシステムは、大容量記憶装置204、ならびに例えばモニター、キーボード、および/またはマウスもしくは他の図形入力装置のような位置決め装置206を含むユーザー・インターフェース機器205等の他の成分を含み得る。コンピュータシステム201はネットワーク207に連結され得り、ネットワーク207は、イーサネット、ローカル・コンピュータシステム(例えば、ローカルエリア・ネットワークまたはLANの一部として)、および/またはインターネット等の広域通信網(WAN)の一部であってよい。
本発明はまた、例えば本発明の解析法を実行するためのコンピュータシステムをプログラムまたは設定するために使用し得るコンピュータ製品を提供する。本発明のコンピュータプログラム製品には、2〜3例を挙げると1つもしくは複数のコンパクトディスク(例えば、1つまたは複数の「CD」であり、これはCD-ROMまたはRW-CDであってよい)、1つもしくは複数のDVD、1つもしくは複数のフロッピーディスク(例えば、1つまたは複数のZIP(商標)ディスクを含む)、または1つもしくは複数のDAT等のコンピュータ可読媒体を含む。コンピュータ可読媒体はコンピュータ可読形式でコード化された1つまたは複数のソフトウェア成分212を有し、このソフトウェア成分は、それがコンピュータシステム201のメモリ203にロードされた場合に、本発明の解析法をコンピュータに実行させる。コンピュータ可読媒体はまた、コンピュータ可読形式でコードされた他のソフトウェア成分を含んでもよい。そのような他のソフトウェア成分には、例えば、機能的言語211またはオペレーティングシステム210が含まれ得る。
例示的な実行においては、本発明の方法を実施するために、G-C含量および/または陽イオン濃度をコンピュータシステム201にロードし得る。例えばG-C含量値は、モニターおよびキーボード205から数字(例えば、G-C含量値)を示す一続きの記号を直接タイプすることにより、使用者によって直接入力され得る。または、使用者は、例えばモニター上に表示された候補イオン濃度のメニューからイオン濃度を選択することにより、またはデータベース中のイオン濃度のアクセッション番号を入力することにより基準イオン濃度を指定してもよく、コンピュータシステムは、例えばメモリ203内のデータベースにアクセスすることにより、またはネットワーク接続上、例えばインターネット上のデータベースから配列にアクセスすることにより、データベースから選択されたイオン濃度にアクセスし得る。
また、以下の実施例を用いて本発明を説明する。しかし、これらの実施例または本明細書のいずれの箇所にある他の実施例も一例に過ぎず、本発明または任意の例証的な項目の範囲および意味を限定するものではない。同様に、本発明は本明細書に記載する任意の特定の好ましい態様に限定されない。実際に、本明細書を読むことにより、当業者には本発明の多くの修正および変更が明白であると考えられ、その精神および範囲から逸脱することなく、そのような修正および変更がなされ得る。したがって、本発明は、特許請求の範囲の権利が与えられる同等物の全範囲と共に、添付の特許請求の範囲の条件によってのみ限定される。
種々の塩条件で測定した様々なオリゴマーの融解温度
本実施例は、様々な塩濃度において、少なくとも92種類の種々の例示的なオリゴヌクレオチド分子に関して融解特性を測定した実験について記載する。各塩濃度において各オリゴヌクレオチドに関して観察されたそれらの特性から融解温度を抽出し、それらの融解温度を以下の結果に提供する。例示的なオリゴヌクレオチドのそれぞれの配列情報もまた提供する。
オリゴヌクレオチドの合成および精製
日常的な技法に従い(Caruthersら、Methods Enzymol. 1992, 211:3-20)、固相ホスホルアミダイト化学によりDNAオリゴヌクレオチド(配列番号:1〜92)を合成し、脱保護し、NAP-5カラム(Amersham Pharmacia Biotech、ニュージャージー州、ピスカタウェイ)で脱塩した。1x TBE緩衝液(50 mM Tris、50 mMホウ酸、1 mM Na2EDTA)中で20%ポリアクリルアミドゲル電気泳動することにより、オリゴマーを精製した。各オリゴマーの精度は、Beckman PACE 5000(Beckman Coulter, Inc. カリフォルニア州、フラートン)でキャピラリー電気泳動(CE)することにより決定した。CEキャピラリーは100μm内径を有し、ssDNA 100Rゲル(Beckman- Coulter)を含んだ。典型的に、約0.6 nモルのオリゴヌクレオチドをキャピラリーに注入し、444 V/cmの電場で泳動し、260 nmでのUV吸光度により検出した。変性Tris-ホウ酸-7 M尿素泳動緩衝液は、Beckman-Coulterから購入した。
融解実験は、3.87 mM NaH2PO4、6.13 mM Na2HPO4、1 mM Na2EDTA、および50、100、200、600、または1000 mM NaClのいずれかを含む緩衝液中で行った。各溶液をpH 7.0に調整するために、1M NaOHを使用した。全ナトリウム濃度は、68.9、119、220、621、および1020 mMであった。
融解実験は、微量Tm解析付属物、(温度を制御するための)Beckman高性能ペルチェ制御装置、および1 cmまたは1 mm光路長キュベットを備えたシングルビームBeckman DU 650分光光度計(Beckman-Coulter)で実施した。融解データは、分光光度計にインターフェースで接続したPCを用いて記録した。383〜368 K(すなわち、10〜95℃)の温度範囲において、0.1度増加するごとに268 nm波長でのUV吸光度値を測定した。制御した速度の温度変化で(時間当たり24.9±0.3ケルビン)、各試料について加熱(すなわち「変性」)および冷却(すなわち「再生」)の遷移曲線を記録した。ペルチェホルダー内の内部測定用電極から試料温度を収集し、各試料のUV吸光度データとともに記録した。緩衝液のみ(オリゴヌクレオチドなし)の試料についても融解特性を記録し、DNA試料の融解曲線からこれらの「ブランク」特性をコンピュータにより減算した。系統誤差を最小限に抑えるため、別のキュベットでかつペルチェホルダー内の別の位置で、各試料について少なくとも2つの融解曲線を収集した。
各試料の融解温度を決定するため、以前に記載された方法を用いて融解特性を解析した(Doktyczら、Biopolymers 1992, 32:849-864;Owczarzyら、Biopolymers 1997, 44:217-239を参照のこと)。簡潔に説明すると、デジタルフィルターを用いて各試料の実験データを平滑化し、温度の関数として試料のUV吸光度のプロットを得た。次いで、そのプロットから一本鎖オリゴヌクレオチド分子の割合、θを算出した。試料の「融解温度」または「Tm」を、θ=0.5の場合の温度と定義した。
オリゴヌクレオチドの融解温度(Tm)に及ぼす塩濃度変化の影響を検討するため、複数の異なるオリゴヌクレオチド分子(「オリゴマー」とも称する)を合成し、種々の塩条件下で各オリゴマーについて融解特性を取得した。「融解特性」という用語は、オリゴヌクレオチド分子の二本鎖核酸から一本鎖核酸への(またはその逆)移行を示すオリゴヌクレオチドとその相補鎖の測定値の収集物を指す。二本鎖から一本鎖への核酸の移行は、当技術分野において、その核酸分子の「融解」として示される場合が多い。移行は、核酸の「変性」または「解離」として示される場合もある。したがって、本発明の融解特性はまた、「解離特性」、「変性特性」、「融解曲線」、「解離曲線」等と称し得る。
とその相補鎖の2μM溶液についての例示的な「UV融解曲線」を示す。「融解曲線」は、前記の材料および方法の項に記載した通りに取得した。核酸分子が二本鎖構造にある場合よりも一本鎖構造にある場合に、溶液はより多くのUV光(260 nm)を吸収するため、図1AのUV融解曲線は実際に、オリゴヌクレオチドの二本鎖構造から一本鎖構造への移行をモニターする。UV融解曲線の観察から、二本鎖構造から一本鎖構造への移行は単一の温度で完全に起こるのではなく、むしろ温度の範囲にわたって起こることが示される。しかし、この範囲は非常に狭い(例えば、約5〜15℃)。したがって、この移行の中間点よりも高い(例えば、約56.5℃または329.7 Kよりも高い)温度において、この試料中のオリゴヌクレオチドは一般に一本鎖構造で存在すると見なされ得り、一方この「融解温度」よりも低い温度において、試料中のオリゴヌクレオチドは一般に二本鎖構造で(すなわち「二本鎖」オリゴヌクレオチドとして)存在すると見なされる。
T m に及ぼす配列依存的な塩の影響
配列の組成および長さが核酸の融解温度Tmに及ぼし得る影響の最初の評価として、前記表1中の各オリゴヌクレオチドの実験的に決定した融解温度を、最小二乗解析の以下の直線回帰のいずれかに当てはめた:
Rychlikら、Nucl. Acids Res. 1990, 18:6409;IvanovおよびAbouHaidar、Analytical Biochemistry 1995, 232:249-251;およびWetmur, Critical Review in Biochemistry and Molecular Biology 1991, 26:227-259もまた参照されたい。上記の式6.3では、1 Mナトリウム塩中のオリゴマーの融解温度を基準融解温度として使用する(すなわち、Tm 0=Tm(1M))。この基準温度は測定してもよいし(例えば上記のように)、または例えばBreslaulerら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1986, 83:3746-3750の最近傍モデルにより、算出もしくは予測してもよい。SantaLuciaら、Biochemistry 1996, 35:3555-3562;およびSanta Lucia Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998, 95:1460-1465もまた参照されたい。
式中、Nはヌクレオチド二本鎖中のリン酸の総数を2で割ったものであり、ΔS゜(1M)は1 M Na+中での解離のエントロピーであり、これは適切な最近傍モデル(上記)を用いて算出することが好ましい。当技術分野では、融解温度、Tmをオリゴヌクレオチド解離のエンタルピーおよびエントロピー(それぞれΔH゜およびΔS゜)ならびに全オリゴヌクレオチド鎖濃度、CTに関連づける式もまた周知である(例えば、Santa Lucia、前記を参照のこと):
式中、標準転移エンタルピー、ΔH゜は、適切な最近傍モデルを用いて算出することが好ましい。
種々の塩濃度に関してT m をより性能よく予測するための式
異なる塩濃度がオリゴヌクレオチドの融解温度に及ぼす影響を評価するため、前記の表1に記載の実験的に決定した融解温度を、(1)塩濃度(本実施例において、[Na+]、および(2)オリゴヌクレオチド配列内容(例えば、f(G-C))に基づいた、融解温度を予測する様々な異なる式に当てはめた。一般的に言えば、式は以下の形式のうちの1つであった:
「基準」濃度 [Na+](0)における核酸の融解温度を示す。典型的に、基準濃度として1 Mの値が選択される(すなわち、[Na+](0)=1 M)。しかし、基準濃度には任意の値も選択され得り、本発明を実施する当業者は、いつ他の基準濃度値を使用し得るか、およびどのような他の基準濃度値を使用し得るかを容易に理解すると考えられる。
これらの結果から、ポリヌクレオチドの融解温度は、ヌクレオチド内容に依存する上記の式6.7および6.8等の式を用いることにより、より正確にかつ確実に推定し得ることが確認される。
本発明の説明において、特許、特許出願、様々な出版物を含む多くの参考文献を引用し考察する。そのような参考文献の引用および考察は、本発明の説明を単に明白にするために提供するものであり、そのような参考文献が本明細書に記載する本発明の「先行技術」であることを認めるものではない。本明細書で引用および考察する参考文献はすべて、それぞれの参考文献が個々に参照として組み入れられる場合と同程度に、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
とその相補鎖の2μM溶液についてのUV融解曲線を示す。
(図1B)68.9 mM Na+緩衝液中に溶解したオリゴヌクレオチド
とその相補鎖の90μM溶液についての示差走査熱量測定(DSC)曲線を示す。
(図2)本発明の解析法を実行するために使用し得る例示的なコンピュータシステムを示す。
(図3)複数の異なるオリゴマー(配列番号:1〜80)のそれぞれの実験的に決定した融解温度(Tm)をlog[Na+]の一次関数に当てはめ、それらに関して得られた勾配を、各オリゴマーのG-C含量f(G-C)の関数としてプロットしたものを示す。各オリゴマーの融解温度を68.9、220、621、および1020 mMの推定ナトリウム陽イオン濃度中で測定したが、その融解温度を表1に記載する。
(図4)複数の異なるオリゴマー(配列番号:1〜80)のそれぞれについて実験的に決定した融解温度の逆数(すなわち1/Tm)をlog[Na+]の一次関数に当てはめた場合に得られる、G-C含量f(G-C)の関数としての勾配を示す。
Claims (31)
- 既知のG-C含量値、f(G-C)を有するポリヌクレオチドの、所望のイオン濃度[X+]における融解温度(Tm)を推定する方法であって:
(a) 基準イオン濃度[X+]0におけるポリヌクレオチドに対して得られるかまたは提供される融解温度である、ポリヌクレオチドの基準融解温度(Tm 0)を得る段階;および
(b) G-C含量値の関数である係数を掛けた、該基準イオン濃度に対する該所望イオン濃度の比の対数により、基準融解温度を修正する段階
を含み、推定融解温度が基準融解温度を用いて算出される方法。 - 係数kがk(f(G-C))= m・f(G-C)+k0であり;かつ第一係数mおよび第二係数k0が、ポリヌクレオチドの融解温度Tm 0を予測するために最適化される、請求項4記載の方法。
- 係数kがm・f(G-C)+k0であり、かつ第一係数m、第二係数k0、および第三係数bがポリヌクレオチドの融解温度Tm 0を予測するために最適化される、請求項6記載の方法。
- mが-3.22であり、k0が6.39である、請求項5記載の方法。
- mが-4.62であり、k0が4.52であり、かつbが-0.985である、請求項7記載の方法。
- 係数kが関係式kf(G-C))= m・f(G-C)+k0によって決まる値を有し、かつ第一係数mおよび第二係数k0がポリヌクレオチドの融解温度を予測するために最適化される、請求項10記載の方法。
- 係数kがm・f(G-C)+k0であり、かつ第一係数mおよび第二係数k0および第三係数bがポリヌクレオチドの融解温度を予測するために最適化される、請求項10記載の方法。
- k0が-6.18 x 10-5であり;mが3.85 x 10-5である、請求項11記載の方法。
- k0が-3.95 x 10-5であり;mが4.29 x 10-5であり;かつbが9.40 x 10-6である、請求項13記載の方法。
- G-C含量値が、ポリヌクレオチドの、グアニンまたはシトシンのいずれかであるヌクレオチド塩基の割合である、請求項2記載の方法。
- ポリヌクレオチドがDNAである、請求項1記載の方法。
- ポリヌクレオチドの長さが約2〜約500塩基対の範囲である、請求項1記載の方法。
- ポリヌクレオチドの長さが約5〜約200塩基対の範囲である、請求項1記載の方法。
- ポリヌクレオチドの長さが約10〜約30塩基対の範囲である、請求項1記載の方法。
- 基準融解温度が実験的に決定される、請求項1記載の方法。
- 基準融解温度が理論的モデルから算出される、請求項1記載の方法。
- 基準融解温度が最近傍モデルを利用して得られる、請求項1記載の方法。
- 基準イオン濃度が1 Mである、請求項1記載の方法。
- イオンが一価のイオンである、請求項1記載の方法。
- イオンが、ナトリウム、リチウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、およびフランシウムの陽イオンからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 所望のイオン濃度が約1 mM〜約5 Mの範囲である、請求項1記載の方法。
- 所望のイオン濃度が約10 mM〜約2 Mの範囲である、請求項1記載の方法。
- 所望のイオン濃度が約70 mM〜約1021 mMの範囲である、請求項1記載の方法。
- (a) メモリ;および
(b) 1つまたは複数のソフトウェア成分がロードされたメモリと相互接続されたプロセッサ
を含み、1つまたは複数のソフトウェア成分が請求項1記載の方法の段階をプロセッサに実行させる、融解温度を予測するためのコンピュータシステム。 - コンピュータ可読形式でコード化された1つまたは複数のソフトウェア成分を有するコンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラム製品であって、1つまたは複数のソフトウェア成分が、コンピュータシステムのメモリにロードされ、かつ該メモリに相互接続されたプロセッサに請求項1記載の方法の段階を実行させ得る、コンピュータプログラム製品。
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