JP2006501267A

JP2006501267A - 白血病の処置のためのａ）Ｎ−｛５−［４−（４−メチル−ピペラジノ−メチル）−ベンゾイルアミド］−２−メチルフェニル｝−４−（３−ピリジル）−２−ピリミジン−アミンおよびｂ）ヒストンデアセチラーゼインヒビターの組合せ剤

Info

Publication number: JP2006501267A
Application number: JP2004535791A
Authority: JP
Inventors: ポール・デント; スティーブン・グラント; ジェフリー・クリスタル; ユ・チュンロン
Original assignee: MCGUIRE VA MEDICAL CENTER 111K
Current assignee: MCGUIRE VA MEDICAL CENTER 111K
Priority date: 2002-09-13
Filing date: 2003-09-10
Publication date: 2006-01-12
Also published as: ATE521354T1; CA2498210A1; CA2498210C; US20060100140A1; CN1681505A; AU2003259521A1; AU2003259521A8; WO2004024160A1; EP1553948B1; EP1553948A1; US20090264439A1; BR0314112A

Abstract

本発明は、白血病およびとりわけＮ−｛５−［４−（４−メチル−ピペラジノ−メチル）−ベンゾイルアミド］−２−メチルフェニル｝−４−（３−ピリジル）−２−ピリミジン耐性白血病の処置のための、同時的、個別的または逐次的使用のための、ヒストンデアセチラーゼインヒビターおよびＮ−｛５−［４−（４−メチル−ピペラジノ−メチル）−ベンゾイルアミド］−２−メチルフェニル｝−４−（３−ピリジル）−２−ピリミジンまたは医薬上許容されるそれらの塩の組合せ剤に関する。

Description

発明の詳細な説明

本発明は、たとえば白血病の処置における、同時的、個別的または逐次的使用のための、（ａ）少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼインヒビターおよび（ｂ）Ｎ−｛５−［４−（４−メチル−ピペラジノ−メチル）−ベンゾイルアミド］−２−メチルフェニル｝−４−（３−ピリジル）−２−ピリミジン−アミン（以下、本明細書において「化合物Ｉ」という）または医薬上許容されるその塩、および所望により少なくとも１つの医薬上許容される担体を含んでなる組合せ剤（combination）；白血病を有する温血動物、とりわけヒトの処置方法であって、当該動物に、白血病の処置に共同で治療上有効な量の（ａ）少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼインヒビターおよび（ｂ）化合物Ｉを投与することを含んでなる方法；かかる組合せ剤を含んでなる医薬組成物；白血病の処置または進行遅延のための医薬の製造のための（ａ）および（ｂ）の組合せ剤の使用；ならびに同時的、個別的または逐次的使用のための組合せ調製物として（ａ）および（ｂ）のかかる組合せ剤を含んでなる市販パッケージ（commercial package）または製品に関する。

慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は、成熟する能力が低下した前駆細胞の進行性蓄積をもたらす初期造血幹細胞のクローン性障害を意味する。病態生理学的見地から、ＣＭＬの発症は、該疾患を有する患者の９５％の細胞において見いだされる融合タンパク質をコードするＢｃｒ／Ａｂｌオンコジーンの発現結果を表す。Ｂｃｒ／Ａｂｌチロシンキナーゼの構成的活性化は、造血細胞の増殖に有利であり、このことは白血病への転化（leukemic transformation）に寄与する。一定の有害な環境刺激（たとえば、成長因子の欠乏）から造血細胞を保護することに加えて、Ｂｃｒ／Ａｂｌキナーゼの発現は、細胞を、細胞毒性薬物により誘導されるアポトーシスに比較的非感受性にする。最近まで、ＣＭＬ細胞におけるアポトーシス耐性に関係するＢｃｌ／Ａｂｌの下流の経路は正確には知られていない。しかしながら、複数のシグナル伝達／生存経路が、ＮＦｋ−Ｂ、Ｓｔａｔ５、ＭＥＫ／ＭＡＰキナーゼ、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ、およびとりわけＡｋｔの脱調節を含むこの現象に関与している。

近年、ＣＭＬの処置は、化合物Ｉ、すなわちＢｃｒ／Ａｂｌ、ｃ−Ｋｉｔ、ＰＤＧＦおよび他のキナーゼを阻害する経口で活性なチロシンキナーゼインヒビターの導入により激変した。化合物Ｉは、インビトロで、Ｂｃｒ／Ａｂｌ−陽性白血病細胞の増殖を妨げ、そしてＢｃｒ／Ａｂｌ−陽性白血病細胞のアポトーシスを誘導する。有意に、ＣＭＬ患者に対する化合物Ｉの経口投与は９０％を超える患者において臨床応答をもたらす。しかしながら、初期にはこの剤に応答したＣＭＬ患者における化合物Ｉ耐性の出現、ならびに移行期（accelerated phase）のＣＭＬまたは急性転化の患者はあまり化合物Ｉに応答しないという観察は、この疾患の処置に対するさらなるアプローチの探索を刺激した。

化合物Ｉに対する耐性のメカニズムは、とりわけ、薬物の取り込みの減少、Ｂｃｒ／Ａｂｌの増幅、およびＢｃｒ／Ａｂｌキナーゼドメインの変異を含む。この問題に対する１つの可能性のあるアプローチは、抗白血病活性を示す他の剤と化合物Ｉの組合せ剤を含む。これに関して、化合物Ｉを慣用的な細胞毒性薬物、三酸化ヒ素、ゲルダナマイシン（geldanamycin）、または腫瘍ネクローシス因子アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）と組み合わせた場合、Ｂｃｒ／Ａｂｌ^＋白血病細胞に対する活性の増加が記載されている。さらに最近、Ｂｃｒ／Ａｂｌタンパク質の発現の増加による化合物Ｉに対する耐性を含む、Ｂｃｒ／Ａｂｌ^＋細胞における化合物Ｉおよび薬理学的ＭＥＫ１／２インヒビター、たとえばＰＤ１８４３５１、Ｕ０１２６またはサイクリン依存性キナーゼインヒビター、フラボピリドールの間の相乗的相互作用が記載されている。

とりわけトリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、デプシペプチド、ＭＳ−２７５、およびアフィシジンを含むヒストンデアセチラーゼインヒビター（ＨＤＩ）は、ヒストンデアセチル化を促進し、クロマチン構造の弛緩をもたらすことにより作用する新しいクラスの剤を意味する。クロマチンの弛緩およびアンコイリング（uncoiling）は、多様な遺伝子、たとえば分化プロセスに関与する遺伝子、たとえばｐ２１^ＣＩＰ１の発現を可能にする。実際、ＨＤＩ、たとえばＳＡＨＡ、酪酸ナトリウムは、種々のヒト白血病細胞系において変異を誘導することが示されている。ある状況下で、ＨＤＩは、ヒト白血病細胞において変異よりもむしろアポトーシスを誘導するが、いずれの応答が支配的であるかを決定する因子は不明のままである。ＨＤＩは、また、一定のＢｃｒ／Ａｂｌ^＋白血病細胞、たとえばＫ５６２において変異を誘導し、この現象はＭＡＰキナーゼ経路の活性化の減少に関連する。

化合物ＩはＢｃｒ／Ａｂｌ^＋細胞の分化応答を修飾し得、そして、驚くべきことに、化合物ＩとＨＤＩの組合せは変異を促進するか、または白血球細胞の生存率を変え得ることが見いだされた。この問題に対処するため、化合物Ｉおよび臨床上関係のあるＨＤＩ、すなわち酪酸ナトリウムおよびＳＡＨＡの間の相互作用を試験する。いくつかのＣＭＬ細胞株、たとえばＫ５６２、ＬＡＭＡ８４におけるＨＤＩと化合物Ｉの共投与は、複数のシグナル伝達経路の途絶、ミトコンドリア損傷の誘導、およびアポトーシスの劇的な増強作用をもたらす。さらに、この薬物の組合せは、増加したＢｃｒ／Ａｂｌ発現を示す化合物Ｉ−耐性Ｂｃｒ／Ａｂｌ^＋細胞における細胞死を強力に誘導する。同時に、これらの知見は、臨床的に関連するＨＤＩと化合物Ｉの組合せのストラテジーがＣＭＬおよび関連する血液悪性疾患における考察を保証することを示唆している。

ヒストンの可逆的アセチル化は、ＤＮＡの転写因子の接近可能性を変えることにより作用する遺伝子発現の主要なレギュレーターである。正常細胞において、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡ）およびヒストンアセチルトランスフェラーゼは、ともに、均衡を維持するためにヒストンのアセチル化のレベルを制御する。ＨＤＡの阻害は、過剰にアセチル化されたヒストンの蓄積をもたらし、これは多様な細胞応答をもたらす。

ＨＤＡのインヒビターは、癌細胞に対する治療効果について研究されてきた。たとえば、酪酸および誘導体、たとえばフェニル酪酸ブチルは、インビトロでヒト結腸カルシノーマ、白血病および網膜芽腫細胞系においてアポトーシスを誘導することが報告されている。しかしながら、酪酸およびその誘導体は有用な薬理学的剤ではない。なぜなら、それらはインビボで急速に代謝され、そして非常に短い半減期を有する傾向があるからである。抗癌活性について広く研究されたＨＤＡの他のインヒビターは、トリコスタチンＡおよびトラポキシンである。トリコスタチンＡは抗真菌性および抗菌性であり、そして哺乳類ＨＤＡの可逆的インヒビターである。トラポキシンは環状テトラペプチドであり、これは哺乳類ＨＤＡの不可逆的インヒビターである。トリコスタチンおよびトラポキシンは抗癌活性について研究されてきたが、該化合物のインビボでの不安定性のため、これらは抗癌性薬物としてあまり適していない。腫瘍（癌性腫瘍を含む）の処置に適し、非常に有効かつおよび安定である活性化合物の必要性が未だ存在する。

驚くべきことに、今回、白血病の処置における、（ａ）少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼインヒビターおよび（ｂ）化合物Ｉまたは医薬上許容されるその塩を含んでなる組合せ剤の効果が、いずれかのタイプの組合せパートナー単独で得られる効果よりも大きい、すなわち本明細書において定義した組合せパートナー（ａ）および（ｂ）の一方のみを用いる単剤療法の効果よりも大きいことが見いだされた。

本発明は、（ａ）少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼインヒビターおよび（ｂ）化合物Ｉまたは医薬上許容されるその塩の相乗的有効量（ここで、活性成分は、それぞれの場合において、遊離の形態または医薬上許容される塩の形態で存在する。）および所望により少なくとも１つの医薬上許容される担体を含む、同時的、個別的または逐次的使用のための組合せ剤、たとえば組合せ調製物（combined preparation）または固定医薬組合せ剤（pharmaceutical fixed combination）に関する。

第一の実施態様において、本発明は、白血病を有する温血動物の処置方法であって、当該動物に、白血病に対して共同で治療上有効量の（ａ）少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼインヒビターおよび（ｂ）化合物Ｉを投与することを含んでなる方法に関する。

本明細書において使用される「白血病」なる用語は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、とりわけフィラデルフィア染色体陽性急性リンパ球性白血病（Ｐｈ^＋ＡＬＬ）を含むが、これらに限定されるわけではない。好ましくは、本明細書において開示した方法により処置される白血病の種類は、ＣＭＬならびに化合物Ｉ−耐性白血病、化合物Ｉに耐性のＢｃｒ／Ａｂｌ^＋白血病である。

本明細書において使用される「化合物Ｉ耐性白血病」なる用語は、とりわけ化合物Ｉまたは医薬上許容されるその塩がそれらの治療有効性の減少を示す白血病と定義され、これはＢｃｒ／Ａｂｌ遺伝子の増幅、Ｂｃｒ／Ａｂｌタンパク質の発現およびＡｂｌキナーゼドメイン変異の増加による化合物Ｉ処置に対する耐性を示す白血病を含むが、これに限定されるわけではない。

本明細書において使用される「処置」なる用語は、疾患を治癒させるか、または疾患縮退もしくは疾患の進行遅延に対して効果を生じる目的で、処置を必要とする温血動物、好ましくはヒトに組合せパートナーを投与することを含む。

本明細書において使用される「進行遅延」なる用語は、疾患の進行が処置により少なくとも遅くなるかまたは妨げられ、そして患者が、処置されていない患者または単剤療法で処置された患者と比べて改善された生存率を示すことを意味する。

組合せパートナー（ａ）化合物Ｉは、式Ｉ

を有するＮ−｛５−［４−（４−メチル−ピペラジノ−メチル）−ベンゾイルアミド］−２−メチルフェニル｝−４−（３−ピリジル）−２−ピリミジン−アミンであり、化合物Ｉは、好ましくは本発明においてモノメタンスルホン酸塩の形態で使用される。化合物Ｉは、ＷＯ９９／０３８５４において記載されたように製造および投与され、とりわけＮ−｛５−［４−（４−メチル−ピペラジノ−メチル）−ベンゾイルアミド］−２−メチルフェニル｝−４−（３−ピリジル）−２−ピリミジン−アミンのモノメタンスルホン酸塩はＷＯ９９／０３８５４の実施例４および６において記載されたように製剤化され得る。商標名ＧＬＩＶＥＣ^ＴＭまたはＧＬＥＥＶＥＣ^ＴＭで市販されているような化合物Ｉが投与され得る。「化合物Ｉ」なる用語は、そのすべての医薬上許容される塩を含み、そして水和物の形態でも使用され得るか、または結晶形、たとえばアルファおよびベータ結晶形、たとえば２０００年５月１０日に公開された欧州特許出願第９９８４７３号において記載されたものを含む。

本明細書において使用される「ヒストンデアセチラーゼインヒビター」なる用語は、酪酸ナトリウム、ＭＳ−２７５（以前はＭＳ−２７−２７５）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、アファシジン（aphacidin）、デプシペプチド、ＦＫ２２８（以前はＦＲ９０１２２８）、トリコスタチンＡおよびＮＯＶＡＲＴＩＳＡＧの名義の国際特許出願ＷＯ０１／３８３２２（優先日：１９９９年１１月２３日）およびＷＯ０２／２２５７７（優先日：２０００年９月０１日）において開示された化合物を含むが、これらに限定されるわけではない。これらの文献を出典明示により本願の一部とする。特に、遊離の形態または医薬上許容される塩の形態、好ましくは乳酸塩の形態の式ＩＩ

で示される化合物ＩＩ、
および
遊離の形態または医薬上許容される塩の形態の式ＩＩＩ

で示される化合物ＩＩＩ。

化合物ＩＩは、２００２年３月２１日に公開され、そしてＮＯＶＡＲＴＩＳＡＧの名義で出願された国際特許出願ＷＯ０２／２２５７７の実施例Ｐ２において具体的に開示されている。

化合物ＩＩＩは、２００２年３月２１に公開され、そしてＮＯＶＡＲＴＩＳＡＧの名義で出願された国際特許出願ＷＯ０２／２２５７７の実施例２００において具体的に開示されている。化合物ＩＩＩは、遊離の形態または医薬上許容される塩の形態である。

コード番号、一般名または商品名により同定される活性剤の構造は、標準的概説書「ザ・メルク・インデックス（The Merck Index）」の現行版からまたはデータベース、たとえばパテンツ・インターナショナル（Patents International）（たとえばIMS World Publications）から入手され得る。これらの相当する内容を、出典明示により本願の一部とする。

本発明は、同時的、個別的または逐次的使用のための（ａ）化合物Ｉまたは医薬上許容されるその塩、とりわけモノメシル酸塩の形態のもの、および（ｂ）酪酸ナトリウム、ＭＳ−２７５（以前はＭＳ−２７−２７５）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、アファシジン、デプシペプチド、ＦＫ２２８（以前はＦＲ９０１２２８）、トリコスタチンＡ、化合物ＩＩおよび化合物ＩＩＩ（ここで、活性成分は、それぞれの場合において、遊離の形態または医薬上許容される塩の形態で存在する。）から選択される少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼインヒビターおよび所望により少なくとも１つの医薬上許容される担体を含む組合せ剤、たとえば組合せ調製物または医薬組成物に関する。

本発明は、同時的、個別的または逐次的使用のための（ａ）化合物Ｉまたは医薬上許容されるその塩、とりわけモノメシル酸塩の形態のもの、および（ｂ）酪酸ナトリウム、ＭＳ−２７５（以前はＭＳ−２７−２７５）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、アファシジン、デプシペプチド、ＦＫ２２８（以前はＦＲ９０１２２８）、化合物ＩＩおよび化合物ＩＩＩ（ここで、活性成分は、それぞれの場合において、遊離の形態または医薬上許容される塩の形態で存在する。）から選択される少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼインヒビターおよび所望により少なくとも１つの医薬上許容される担体を含む組合せ剤、たとえば組合せ調製物または医薬組成物に関する。

「本発明の組合せ剤」において使用される組合せパートナーが単一薬物として市販されている形態で適用される場合、それらの用量および投与様式は、特記しない限り、本明細書において記載した有利な効果をもたらすために個々の市販薬の添付文書（package insert）に提供された情報にしたがって行われ得る。

最終生成物、医薬調製物および上で挙げた特許権のクレームの発明主題を、出典明示により本願の一部とする。これらの文献において開示されている、対応する立体異性体ならびに対応する結晶変態、たとえば溶媒和物および結晶多形も同様に含まれる。本明細書において開示した組合せ剤中の活性成分として使用される化合物は、特記しない限り、それぞれ、先に挙げた文献に記載されているように製造され、そして投与され得る。

組合せパートナー（ａ）および（ｂ）とは、医薬上許容される塩を含むことを意味すると理解される。これらの組合せパートナー（ａ）および（ｂ）が、たとえば少なくとも１つの塩基中心を有する場合、それらは酸付加塩を形成し得る。所望により追加的に存在する塩基中心を有する、対応する酸付加塩もまた形成され得る。酸性基（たとえばＣＯＯＨ）を有する組合せパートナー（ａ）および（ｂ）は、また、塩基で塩を形成し得る。組合せパートナー（ａ）もしくは（ｂ）または医薬上許容されるそれらの塩は、また、水和物の形態で使用されるか、または結晶化に用いた他の溶媒を含み得る。

本明細書において使用する場合、「組合せ調製物」なる用語は、上記に定義した組合せパートナー（ａ）および（ｂ）が独立に投与し得るか、または組合せパートナー（ａ）および（ｂ）の識別し得る量での異なる一定の組合せで投与し得る、すなわち、同時にまたは異なる時点で投与し得るという意味で、「パーツのキット（kit of parts）」と特に定義される。「パーツのキット」のパーツは、したがって、同時に投与するか、または時間的にずらして、すなわち、異なる時点で、同じまたは異なる時間間隔で、「パーツのキット」のいずれかのパーツを投与する。

非常に好ましくは、時間間隔は、パーツの併用使用により処置する疾患に対する効果が組合せパートナー（ａ）および（ｂ）のいずれか一方のみの使用により得られる効果よりも大きくなるように選定される。組合せ調製物として投与すべき組合せパートナー（ａ）と組合せパートナー（ｂ）の総量比は、処置すべき患者下位集団の必要性に対処するために、または患者個人に必要であって、その異なる必要性がその患者の特定の疾患、年齢、性別、体重などによるものである場合、それに対処するために変更することは可能である。好ましくは、少なくとも一つの有益性があること、たとえば、組合せパートナー（ａ）および（ｂ）の作用を相互に、特に相乗的に強め合うこと、たとえば、相加作用よりも強いこと、さらなる有利な作用があること、副作用が少ないこと、組合せパートナー（ａ）および（ｂ）の一方または双方の非有効用量で併用治療効果のあること、また極めて好適には組合せパートナー（ａ）および（ｂ）の強力な相乗効果のあることである。

本発明の１つの実施態様において、白血病、特に化合物Ｉ−耐性白血病は、組合せパートナーとして（ａ）化合物Ｉならびに（ｂ）酪酸ナトリウム、ＭＳ−２７５（以前はＭＳ−２７−２７５）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、アファシジン、デプシペプチド、ＦＫ２２８（以前はＦＲ９０１２２８）、トリコスタチンＡ、ＳＡＨＡ、化合物ＩＩおよび化合物ＩＩＩからなる群から選択されるヒストンデアセチラーゼインヒビターを含んでなる組合せ剤で処置される。好ましくは、ヒストンデアセチラーゼインヒビターは、酪酸ナトリウム、ＳＡＨＡ、化合物ＩＩ、および化合物ＩＩＩから選択される。

（ａ）化合物Ｉまたは医薬上許容されるその塩、とりわけそのものメタンスルホン酸塩の形態のもの、および（ｂ）酪酸ナトリウム、ＭＳ−２７５（以前はＭＳ−２７−２７５）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、アファシジン、デプシペプチド、ＦＫ２２８（以前はＦＲ９０１２２８）、トリコスタチンＡからなる群から選択される、好ましくはＳＡＨＡ、酪酸ナトリウム、化合物ＩＩおよび化合物ＩＩＩからなる群から選択されるヒストンデアセチラーゼインヒビター（ここで、活性成分は、それぞれの場合において、遊離の形態または医薬上許容される塩の形態で存在する。）および所望により少なくとも１つの医薬上許容される担体を含んでなる組合せ剤を、以下、本明細書において「本発明の組合せ剤」という。

（ａ）化合物Ｉまたは医薬上許容されるその塩、とりわけそのものメタンスルホン酸塩の形態のもの、および（ｂ）酪酸ナトリウム、ＭＳ−２７５（以前はＭＳ−２７−２７５）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、アファシジン、デプシペプチド、ＦＫ２２８（以前はＦＲ９０１２２８）からなる群から選択される、好ましくはＳＡＨＡ、酪酸ナトリウム、化合物ＩＩおよび化合物ＩＩＩからなる群から選択されるヒストンデアセチラーゼインヒビター（ここで、活性成分は、それぞれの場合において、遊離の形態または医薬上許容される塩の形態で存在する。）および所望により少なくとも１つの医薬上許容される担体を含んでなる組合せ剤を、以下、本明細書において「本発明の組合せ剤」という。

「本発明の組合せ剤」は、白血病、たとえばＣＭＬ、化合物Ｉ−耐性白血病の進行を阻害する。本発明の１つの実施態様において、「本発明の組合せ剤」で処置されるべき増殖性疾患は白血病、とりわけＢｃｒ／Ａｂｌ^＋白血病および好ましくは化合物Ｉ−耐性白血病である。

さらに驚くべきことは、「本発明の組合せ剤」において使用された医薬活性成分の一方のみを適用する単剤療法と比べて、「本発明の組合せ剤」のインビボ投与は、たとえば増殖性疾患の進行遅延に関して、または腫瘍容積の変化に関して、より有利な、とりわけ相乗的な、たとえば抗増殖作用をもたらすのみならず、さらに驚くべき有利な効果、たとえばより少ない副作用ならびに死亡率および罹患率の減少ももたらすという実験的知見である。「本発明の組合せ剤」は、特に、抗癌剤として既知の化学療法に対して難治性の疾患ならびに化合物Ｉ処置に対して難治性の増殖性疾患の処置に適している。

さらなる利点は、「本発明の組合せ剤」の活性成分のより少ない用量を使用できること、たとえば、用量がより少なくなるだけでなく、より少ない回数で適用されること、またはたとえば、組合せパートナー単剤の１つで観察される下痢または吐き気のような副作用の発生を減少させるために使用できることである。このことは、処置される患者の要望および要求に合致する。

「本発明の組合せ剤」が本明細書において前記した有利な効果をもたらすことは、確立された試験モデルにより示され得る。当業者であれば、かかる有利な効果を証明するための関連試験モデルを選択することが十分に可能である。「本発明の組合せ剤」の薬理学的作用は、たとえば、臨床試験において、または本明細書において本質的に後記した試験手順により証明され得る。

適当な臨床試験は、特に、末期の疾患を有する癌患者における無作為化、二重盲検、プラセボ制御、並行試験である。かかる試験は、特に、活性成分を用いる単剤療法および「本発明の組合せ剤」を用いる治療を比較し、そして特に「本発明の組合せ剤」の活性成分の相乗効果を証明するのに適当である。かかる試験における一次エンドポイントは、ペインスコア、鎮痛剤の使用、一般状態（performance status）、クオリティ・オブ・ライフ・スコアまたは疾患進行までの時間に対する効果であり得る。規則的な時間間隔、たとえば４、６または８週ごとの腫瘍の評価は、「本発明の組合せ剤」の効果を測定するのに適したアプローチである。

本発明の１つの目的は、「本発明の組合せ剤」を含む増殖性疾患に対して共同で治療上有効量を含む医薬組成物を提供することである。この組成物において、組合せパートナー（ａ）および（ｂ）は、一緒に、一方の後に他方を、または１つの組合せ単位投与形態もしくは２つの個別の単位投与形態で個別的に投与され得る。単位投与形態は、また、固定された組合せ剤であってもよい。

本発明の医薬組成物は、自体公知の方法で製造され得、そしてヒトを含む哺乳類（温血動物）への経腸、たとえば経口または経直腸および非経腸投与に適したものであり、そして単独または１もしくはそれ以上の医薬上許容される担体（とりわけ経腸または非経腸投与に適したもの）と組み合わせた少なくとも１つの薬理学的活性組合せパートナーの治療上有効量を含んでなる。本発明の１つの実施態様において、１またはそれ以上の活性成分が経静脈的に投与される。

新規医薬組成物は、たとえば、約１０％〜約１００％、好ましくは約２０％〜約６０％の活性成分を含有する。経腸または非経腸投与のための組合せ治療のための医薬調製物は、たとえば単位投与形態のもの、たとえば糖衣錠、錠剤、カプセル剤または坐剤、およびさらにアンプル剤である。特記しない限り、これらは自体公知の方法、たとえば慣用的混合、造粒、シュガーコーティング、溶解または凍結乾燥プロセスにより製造される。個々の投与形態の個々の用量に含まれる組合せパートナーの単位含量はそれ自体で有効量を構成する必要がないものと考えられる。というのは、必要な有効量が複数の投与単位の投与により達成され得るからである。

特に、「本発明の組合せ剤」の各組合せパートナーの治療上有効量は、同時的または任意の順番で逐次的に投与され得、そしてその構成成分は個別的または固定された組合せとして投与され得る。たとえば、本発明の増殖疾患の進行遅延または処置方法は、同時的または任意の順序で逐次的に、共同で治療上有効な量で、好ましくは相乗的有効量で、たとえば本明細書に記載した量に対応する１日用量で、（ｉ）遊離または医薬上許容される塩の形態の第一の組合せパートナーの投与および（ｉｉ）遊離または医薬上許容される塩の形態の第二の組合せパートナーの投与を含み得る。「本発明の組合せ剤」の個々の組合せパートナーは、分割または単一組合せ形態で、治療過程の異なる時点で個別的に、または同時一体的（concurrently）に投与され得る。さらに、「投与」なる用語は、また、組合せパートナー自体にインビボで変換される組合せパートナーのプロドラッグの使用を包含する。したがって、本発明は、同時的または代替的処置のすべてのかかるレジメンを包含するものとして理解されるべきであり、そして「投与」なる用語は、それにしたがって解釈されるべきである。

「本発明の組合せ剤」において使用される各組合せパートナーの有効用量は、使用される特定の化合物または医薬組成物、投与様式、処置される病状、処置される病状の重度に依存して変動し得る。したがって、「本発明の組合せ剤」の投与レジメンは、投与経路ならびに患者の腎および肝機能を含む種々の因子にしたがって選択される。通常の知識を有する医師、臨床医および獣医であれば、容易に、病状の進行を予防、対抗または阻止するのに必要な単一の活性成分の有効用量を決定し、そして処方することができる。毒性なしに効果を生じる範囲内の有効成分の濃度を達成する最適精度は、標的部位への活性成分の利用能の動力学に基づくレジメンを必要とする。これは、活性成分の分布、平衡および排泄の考察を含む。

１１９.５ｍｇの化合物Ｉモノメタンスルホン酸塩は、活性物質として１００ｍｇの化合物Ｉ（遊離塩基）に相当する。種、年齢、個々の状態、投与様式および問題の臨床像に依存して、化合物Ｉの有効用量、たとえば約５０〜１０００ｍｇ、たとえば５０〜８００ｍｇ、好ましくは５０〜６００ｍｇ、たとえば５０〜４００ｍｇの活性物質に相当する１日用量が、体重約７０ｋｇの温血動物に投与される。白血病を有する成体患者について、１日４００ｍｇの開始用量が推奨され得る。１日４００ｍｇでの治療に対する応答の評価後に不十分な応答を示す患者について、用量漸増を安全に考慮することが可能であり、そして患者は、患者が処置から利益を受け、そして制限的な毒性が不存在である限り、処置され得る。

本発明は、また、白血病を患うヒト対象に「本発明の組合せ剤」を投与することを含んでなる方法であって、化合物Ｉまたは医薬上許容されるその塩の医薬上有効量が当該ヒト対象に３ヶ月を超える期間にわたって毎日投与される方法に関する。本発明は、とりわけ、５０〜８００ｍｇ、とりわけ５０〜６００ｍｇ、たとえば５０〜４００ｍｇの１日用量の活性物質が投与される方法に関する。

「本発明の組合せ剤」において使用される組合せパートナーが単一薬物として市販されている形態で適用される場合、それらの用量および投与様式は、特記しない限り、本明細書において記載した有利な効果をもたらすために個々の市販薬の中入れ書（packet leaflet）で提供された情報にしたがって行われ得る。

「本発明の組合せ剤」は、組合せ調製物または医薬組成物であり得る。

さらに、本発明は、白血病を有する温血動物の処置方法であって、当該動物に増殖性疾患に対して共同で治療上有効量の「本発明の組合せ剤」を投与することを含み、そして組合せパートナーは、また、それらの医薬上許容される塩の形態で存在し得る方法に関する。本発明の１つの実施態様において、「本発明の組合せ剤」は抗下痢剤と共投与される。

さらに、処置は、外科的治療、放射線治療、凍結療法および免疫療法を含み得る。

本発明は、また、白血病を有する温血動物における変異の形成を阻害する方法であって、当該患者に、白血病に対して共同で治療上有効量の「本発明の組合せ剤」の医薬上有効量を投与することを含み、そして化合物は、また、それらの医薬上許容される塩の形態で存在し得る方法に関する。

本発明は、白血病、たとえば化合物Ｉ−耐性白血病の処置のための、および白血病の処置用医薬の製造のための「本発明の組合せ剤」の使用に関する。

さらに、本発明は、白血病の処置用医薬の製造のための、他剤と組み合わせた化合物Ｉまたは医薬上許容されるその塩の使用に関する。

さらに、本発明は、白血病、たとえばＣＭＬ、化合物Ｉ耐性白血病の処置における同時的、個別的または逐次的使用のための指示書とともに、活性成分として「本発明の組合せ剤」を含んでなる市販パッケージを提供する。

本発明は、好ましくは、増殖性疾患、好ましくはＢＣＲ／ＡＢＬ^＋ヒト骨髄性白血病を有する温血動物の処置方法であって、当該増殖性疾患に対して共同で治療上有効な量の（ａ）化合物Ｉ、とりわけそのものメタンスルホン酸塩の形態のもの、および（ｂ）ＳＡＨＡ、酪酸ナトリウム、化合物ＩＩおよび化合物ＩＩＩから選択されるヒストンデアセチラーゼインヒビターを含んでなる組合せ剤を投与することを含んでなる方法（ここで、化合物は、また、それらの医薬上許容される塩の形態で存在し得る。）に関する。

本発明は、好ましくは、増殖性疾患、好ましくはＢＣＲ／ＡＢＬ^＋ヒト骨髄性白血病、最も好ましくは化合物Ｉ−耐性ＢＣＲ／ＡＢＬ^＋ヒト骨髄性白血病の処置用医薬の製造のための、本明細書において記載した（ａ）化合物Ｉまたは医薬上許容されるその塩、とりわけそのモノメタンスルホン酸塩の形態のもの、および（ｂ）ＳＡＨＡ、酪酸ナトリウム、化合物ＩＩおよび化合物ＩＩＩからなる群から選択されるヒストンデアセチラーゼインヒビターを含んでなる組合せ剤の使用に関する。

実施例１：
材料および方法
細胞：Ｋ５６２、ＨＬ６０、ＪｕｒｋａｔおよびＵ９３７ヒト白血病細胞を、American Type Culture Collection, Rockville, MDから購入する。ＬＡＭＡ８４細胞を、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures （Braunschweig, Germany）から購入する。すべての細胞を、ピルビン酸ナトリウム、ＭＥＭ必須ビタミン、Ｌ−グルタミン酸塩、ペニシリン、ストレプトマイシン、および１０％熱不活性化ＦＣＳ（Hyclone, Logan, UT）を補ったＲＰＭＩ１６４０中で培養する。それらを３７℃、５％ＣＯ_２、十分に加湿したインキュベーターで維持し、週に２回植え継ぎ、そして対数増殖期（細胞密度≦４×１０^５細胞／ｍｌ）に達したときに実験手順のために調製する。

多剤耐性Ｋ５６２Ｒ細胞を、過去に記載された漸増濃度のドキソルビシン中での継代培養により、親株から得る（Yanovich et al., Cancer Res 1989, 49:4499-4503）。それらを、すべての実験手順の前にドキソルビシンの不存在下で培養する。さらに、化合物Ｉ−耐性ＬＡＭＡ８４細胞（ＬＡＭＡ８４−Ｒと称する）を、漸増濃度の化合物Ｉ中でのＬＡＭ８４細胞を継代培養することにより作成する。これらの細胞を、０.５μＭの化合物Ｉを含む培地中で選択圧下にて維持する。ＬＡＭＡ−Ｓ−５７１およびＬＡＭＡ−Ｒ−５７１についての化合物ＩのＩＣ_５０値は、それぞれ、０.３、１.８μＭである。ＬＡＭＡ８４−Ｒ株を含む研究のために、細胞を薬物なしで洗浄し、そして実験の４８時間前に薬物なしの培地中に再懸濁させる。

試薬：化合物Ｉを、滅菌ＤＭＳＯ（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）中の１０ｍＭストック溶液として調製する。酪酸ナトリウムおよびＳＡＨＡは、Calbiochem, San Diego, CA; BOC-fmkから供給され、そしてＩＥＴＤ−ｆｍｋをEnzyme Products, Ltd., Livermore, CAから購入し、そして使用前に滅菌ＤＭＳＯで作成する。

実験形式：対数的に増殖している細胞を、滅菌プラスチックＴ−フラスコ（Corning, Corning, NY）に入れ、これに指定医薬品を添加し、そしてフラスコをインターバルの間、インキュベーターに入れる。インキュベーション期間の終わりに、細胞を滅菌遠心管に移し、４００×ｇにて室温で１０分間遠心分離することによりペレット化させ、そして下記の分析のために調製する。

アポトーシスの評価：薬物曝露の後、細胞遠心調製物をライト−ギムザ（Wright-Giemsa）で染色し、そして光学顕微鏡で観察し、過去に記載された（Yu et al., Nat. Rev. Cancer 1:294-202）ようにアポトーシスの程度を評価する（すなわち、細胞縮小（cell shrinkage）、核凝縮（nuclear condensation）、アポトーシス小体の形成など）。これらの試験のために、アポトーシス細胞のパーセンテージは、トリプリケートで≧５００細胞／病状を評価することにより決定される。形態学的分析の結果を確認するために、アネキシンＶ／ＰＩ染色が使用される。細胞死のアネキシンＶ／ＰＩ（BD PharMingen, San Diego, CA）分析は、製造社の指示通りに行われる。ＴＮＦおよびＴＮＦ可溶性レセプターを含む試験において、使用２０分前に両化合物を合わせ、そして室温で維持する。これらの実験のために、病状あたり１〜２×１０^５細胞を回収する。分析を、ベクトン−ディッキンソン（Becton-Dickinson）ＦＡＣＳｃａｎｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Mansfield, MA）を用いて行う。形態学的結果をさらに確認するために、ＴＵＮＥＬ染色を用いる。ＴＵＮＥＬ染色のために、細胞遠心調製物を得、そして４％ホルムアルデヒドで固定する。スライドを酢酸／エタノール（１：２）で処理し、１×末端基転移酵素（terminal transferase）反応バッファー（０.２５ユニット／μｌ末端基転移酵素、２.５ｍＭＣｏＣｌ_２、および２ｐｍｏｌフルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）を含む末端基転移酵素反応混合物で染色し、そして蛍光顕微鏡を用いて観察する。

ＭＭＰ（ΔΨ_ｍ）の測定：ＭＭＰを、ＤｉＯＣ６［３６］を用いて監視する。個々の病状について、４×１０^５細胞を、１ｍｌの４０ｎＭＤｉＯＣ６（Calbiochem）中で３７℃にて１５分間インキュベートし、そしてその後、それぞれ４８８および５２５ｎｍの励起および発光設定でベクトン−ディッキンソン（Becton-Dickinson）ＦＡＣＳｃａｎｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを用いて分析する。ΔΨ_ｍの減少を実証する対照実験を、細胞を５μＭのカルバモイルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（Sigma Chemical Co.; １５分、３７℃）（ＭＭＰを無効化する脱共役剤）に曝露させることにより行う。

Ｓ−１００フラクションの調製およびチトクロームＣ放出の評価：Ｕ９３７細胞を、６００×ｇにて４℃で１０分間遠心分離することにより過去に記載された（Yu et al., 2001, BBRC 286:1011-18）ように薬物処置後に回収し、そしてＰＢＳ中で洗浄する。細胞（４×１０^６）を、７５ｍＭＮａＣｌ、８ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、１ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、１ｍＭＥＤＴＡ、および３５０μｇ／ｍｌジギトトニンを含む溶解バッファー（１００μｌ）中で３分間インキュベートすることにより溶解させる。溶解物を１２,０００×ｇにて５分間遠心分離し、そして上清を集め、そして等容積の２×ＬＡＥＭＭＬＩバッファーを添加する。タンパク質試料を定量し、そして１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離する。

イムノブロット分析：イムノブロッティングを、過去に記載された（Yu et al., Nat. Rev. Cancer 1:294-202）ように行う。簡単に言うと、薬物処理後に、遠心分離により細胞をペレット化させ、そしてＬａｅｍｍｌｉバッファー［１Ｘ＝３０ｍＭトリス塩基（ｐＨ６.８）、２％ＳＤＳ、２.８８ｍＭ β−メルカプトエタノール、および１０％グリセロール］に直ちに溶解させ、そして手早く超音波処理する。ホモジネートをＣｏｏｍａｓｓｉｅタンパク質アッセイ試薬（Pierce, Rockford, IL）を用いて定量化する。等量のタンパク質（２０μｇ）を１０分間沸騰させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５％濃縮用ゲルおよび１０％分離ゲル）による分離し、そしてニトロセルロース膜に電気的ブロッティングする。ＴＢＳ−Ｔ（０.０５％）および５％ミルク中で２２℃にて１時間ブロッキングした後、ブロットを適当な希釈度の一次抗体とともに新たなブロッキング溶液中で２２℃にて４時間インキュベートする。抗体の供給源は以下のとおりである：Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ、ウサギポリクローナル、Santa Cruz Biotechnology; ＸＩＡＰ、ウサギポリクローナル、R&D Systems, Minneapolis, MN; Ｍｃｌ−１、マウスモノクローナル Pharmingen, San Diego, CA; サイクリンＤ１、マウスモノクローナル; ｐ２１、マウスモノクローナル、Pharmingen; ＥＲＫ１／２、ウサギポリクローナル、Cell Signaling Technology, Beverly, MA; ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２（ｔｈｒ２０２／ｔｙｒ２０４）、ウサギポリクローナル、Cell Signaling Technology; ＪＮＫ、ウサギポリクローナル、Santa Cruz Biotechnology; ｐｈｏｓｐｈｏ−ＪＮＫ、マウスモノクローナル、Santa Cruz Biotechnology; ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８ＭＡＰＫ、ウサギポリクローナル、Cell Signaling Technology; ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ７０Ｓ６Ｋ（４２１／４２４）、ウサギポリクローナル、Cell Signaling Technology; ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ＳＴＡＴ５、Cell Signaling Technology; ｐＲＢ、マウスモノクローナル、Pharmingen; ｕｎｄｅｒ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＲＢ、マウスモノクローナル、PharMingen; キャスパーゼ３、マウスモノクローナル、Transduction Laboratories, Lexington, KY; ＰＡＲＰ（Ｃ−２−１０）、マウスモノクローナル、BioMol Research Laboratories, Plymouth, MA; チトクロームｃ、マウスモノクローナル、Santa Cruz Biotechnology; ＡＩＦ、マウスモノクローナル、Santa Cruz Biotechnology; Ｓｍａｃ、ウサギポリクローナル、Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY; キャスパーゼ８、ウサギポリクローナル、Pharmingen; およびα−チュブリン、Calbiochem。ブロットをＴＢＳ−Ｔ中で３×１５分間洗浄し、次いで１：２０００希釈のホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ−共役二次抗体（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）で２２℃にて１時間インキュベートする。ブロットをＴＢＳ−Ｔ中で再び３×１５分間洗浄し、次いで、高感度ケミルミネッセンス（Pierce, Rockford, IL）により現像する。

分化の試験
Ｋ５６２細胞の赤血球変異の分析を、過去に記載された（Yang et al., J. Biol.Chem. 2001, 276:25742-52）ようにヘモグロビンの産生を監視することにより行う。

クローン的生存（Clonogenic Survival）：白血病細胞のクローン的生存に対する薬物処置の効果を、過去に記載されたクローン的アッセイ（Yu et al., Mol. Pharmacol. 2001, 60: 143-54）を用いて測定する。

一過性トランスフェクション：ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期（immediate-early）プロモーター（ｐＥＧＦＰ−Ｃ２）の転写制御下の高感度緑色フルオレセインタンパク質をコードしているプラスミド、およびＨＡ−タグ化活性化ＭＥＫ１（ｐＵＳＥＥａｍｐ中のＳ２１８Ｄ／Ｓ２２２Ｄ）は、それぞれ、クローンテック・ラボラトリーズ（Clontech Laboratories）（Palo Alto, CA）およびアップステート・バイオテクノロジー（Upstate Biotechnology）（Lake Placid, NY）から得られる。ＭＥＫ１ｃＤＮＡを含む１２８５ｂｐのフラグメントを、ＡｐａＩおよび部分ＥｃｏＲＩ消化により得、そしてｐＥＧＦＰ−Ｃ２の（Ｃ末端）多重クローニング部位にインフレームにて挿入する。融合構成物中の全ＭＥＫ１ｃＤＮＡを配列決定し、そしてリーディングフレームを確認する。対数増殖期のＫ５６２細胞を、ＢＴＸエレクトロマニュピレーター６００を用いるエレクトロポレーションバッファー（Eppendorf）にトランスフェクトする。２０μｇのＤＮＡおよび２.０×１０^７細胞をそれぞれの条件について使用する。インキュベーションの１２時間後、２０％〜３０％の細胞が緑色の蛍光を示した。最も明るい１０％〜２０％の総細胞集団を、ＣｙｔｏｍａｔｉｏｎＭｏＦＬＯセルソーターを用いる蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）により単離する。次いで、細胞を上で示した薬物に曝露させ、そして上記したようにアポトーシスの形態学的エビデンスについて試験する。

統計的分析：実験条件間の相違の有意差を、両側Ｓｔｕｄｅｎｔ−ｔ検定を用いて測定する。相乗作用および拮抗作用の分析を、Yu et al., 2002, Cancer Res. 62:188-189により過去に記載されたように、商品として入手可能なソフトウエアプログラム（Calcysyn; Biosoft; Ferguson, MO）と組み合わせてメジアン用量作用分析（Median Dose Effect analysis）（Chou and Talalay, 1984, Adv.Enz. Regul. 22:27-55）を用いて行う。

結果
Ｋ５６２細胞中の化合物ＩおよびＳＡＨＡ間の相互作用を特徴づけるために、用量応答試験を行う。細胞を３００ｎＭの濃度の化合物Ｉへの２４時間曝露すると、無視できる程度のアポトーシスが誘導されるが、単独で投与された２.０μＭＳＡＨＡも最小毒性である。しかしながら、細胞を１００ｎＭの化合物Ｉと組み合わせたＳＡＨＡに曝露させた場合、アポトーシスの明らかな増加が観察され（すなわち、約２０％）、そして２５０ｎＭの化合物Ｉの濃度に関して、大部分の細胞（すなわち、約７５％）がアポトーシスを起こす（表１Ａ）。

表１Ａ：Ｋ５６２細胞を、上で示した濃度の化合物Ｉと組み合わせた２.０μＭＳＡＨＡに曝露させた後に、アポトーシスが「方法」で記載したライト−ギムザ染色試料の形態分析により監視される。

同様に、細胞を漸増濃度のＳＡＨＡと組み合わせた２５０ｎＭの化合物Ｉに２４時間曝露させた場合、アポトーシスの急激な増加が１.０μＭＳＡＨＡにて示され、そして１.５μＭのＳＡＨＡ濃度にて、大部分の細胞がアポトーシスを起こす（表１Ｂ）。

表１Ｂ：細胞を、上で示した濃度のＳＡＨＡと組み合わせた２５０ｎＭ化合物Ｉに２４時間曝露させた後に、アポトーシスを上のとおりに評価する。ＡおよびＢについて、数値は、３つの個別の実験の平均±Ｓ.Ｄ.を表す。

一連のＳＡＨＡ濃度でのアポトーシス誘導のメジアン用量作用分析により、１.０未満の組合せインデックス（ＣＩ）値が得られ、これは相乗的相互作用に対応する（表１Ｃ）。

表１Ｃ：Ｋ５６２細胞を、固定比率（１０：１）で種々の濃度のＳＡＨＡおよび化合物Ｉに２４時間曝露させた後に、アポトーシスについての組合せインデックス（ＣＩ）値を、メジアン用量作用分析を用いて影響を受けたフラクション（ＦＡ）に関して決定する。１.０未満のＣＩ値は相乗的相互作用に対応する。２つの追加的試験により、同様の結果が得られる。

薬物なしの培地に曝露させたＫ５６２細胞と比べて、２５０ｎＭ化合物Ｉ＋２.０μＭＳＡＨＡに２４時間曝露させたＫ５６２細胞におけるポトーシスは顕著に増加する；ＳＡＨＡ２.０μＭ（２４時間）；化合物Ｉ２５０ｎＭ（２４時間）をＴＵＮＥＬ−染色細胞の顕微鏡写真（示していない）により証明される。

２５０ｎＭ化合物Ｉ±２.０μＭＳＡＨＡに曝露させたＫ５６２細胞の経時試験を行う。４８時間にわたって個々に投与されたこれらの剤の各々は、最小のアポトーシスを誘導するが、組合せ処置は１２時間で最初に観察されるアポトーシスの増加をもたらし、そしてこれは２４時間までに最大付近のレベルに達する。組合せ処置の４８時間後、９０％を超える細胞がアポトーシスを起こす（表２Ａ）。

表２Ａ：Ｋ５６２細胞を、上で示した間隔で２.０μＭＳＡＨＡ±２５０ｎＭ化合物Ｉに曝露させた後に、アポトーシス細胞のパーセンテージを「方法」で記載したように決定する。

ミトコンドリア膜電位の減少（ΔΨΘ_ｍ）を監視した場合に、同様の結果が得られるが、化合物Ｉ自体は曝露の４８時間後にこれに関して幾分さらに毒性である（表２Ｂ）。

表２Ｂ：Ｋ５６２細胞を、上で示した間隔で２.０μＭＳＡＨＡ±２５０ｎＭ化合物Ｉに曝露させた後に、ミトコンドリア膜電位の減少（ΔΨ_ｍ）を示す細胞のパーセンテージを、「方法」で記載したように決定する。
同時に、これらの知見は、化合物ＩおよびＨＤＩＳＡＨＡでの組合せ処置がＢｃｒ／Ａｂｌ^＋Ｋ５６２細胞においてミトコンドリア損傷およびアポトーシスの初期誘導をもたらすことを示している。

ＨＤＩと組み合わせた化合物Ｉで処置されたＫ５６２細胞におけるアポトーシスの増強作用が白血球細胞の自己再生能力の喪失と関連があるか否かを調べるために、クローン的分析を行った。それぞれ２５０ｎＭ化合物Ｉまたは２.０μＭＳＡＨＡへの２４時間の曝露は実質的に細胞増殖性（clonogenicity）を減少させたが（すなわち、対照値の約２５％まで）、組合せ処置はコロニー形成において２−ｌｏｇ減少より大であった（表２Ｃ）。

表２Ｃ：細胞を、２.０μＭＳＡＨＡ±２５０ｎＭ化合物Ｉで２４時間処置し、薬物なしで洗浄し、「方法」で記載したように軟寒天にプレーティングする。１２日のインキュベーション期間後、コロニーを評点し、そして生存を、非処置対照に対するパーセンテージとして表す。

化合物ＩおよびＨＤＩ（たとえばブチレート）の両方がＢｃｒ／Ａｂｌ^＋細胞の成熟を誘導することが示されたので、かかる剤の組合せ曝露がＫ５６２細胞の分化の増加をもたらすかどうかを調べることを試みる。この目的で、ヘモグロビン（Ｈｇｂ）産生を、ＳＡＨＡ±化合物Ｉで処置されたＫ５６２細胞において監視する。Ｋ５６２細胞を、上で示した間隔で２.０μＭＳＡＨＡ±２５０ｎＭ化合物Ｉに曝露させた後に、分化を、「方法」で記載したようにＨｇｂの細胞内レベルを定量することにより監視した。それぞれの場合において、値は３つの個別の実験の平均±Ｓ.Ｄ.を表す。２４時間の曝露後、ＳＡＨＡ−処置細胞はＨｇｂ産生の顕著な（すなわち約５０％）増加を示したが、化合物Ｉはこれに関して比較的有効ではない。しかしながら、両方の剤で処置した細胞は、Ｈｇｂレベルの上昇を示さない。４８時間後、ＳＡＨＡ−および化合物Ｉ−処置細胞は、Ｈｇｂ産生の実質的な増加を示す。しかしながら、細胞（この時点で多くはアポトーシスを起こしている）のＨｇｂレベルは、対照よりも低い（データは示していない）。これらの知見は、化合物ＩおよびＳＡＨＡでのＢｃｒ／Ａｂｌ^＋Ｋ５６２細胞の共処置は分化を促進しないことを示しているが、これらの条件下で起こる過度のアポトーシスがこのプロセスを妨げることを示唆している。

次いで、ＳＡＨＡおよび化合物ＩへのＫ５６２細胞の２４時間の組合せ曝露の効果を、ミトコンドリア損傷、キャスパーゼ活性、およびアポトーシス調節タンパク質の発現に関して調べる。Ｋ５６２細胞を２.０μＭＳＡＨＡ±２５０ｎＭ化合物Ｉに２４時間曝露させた後に、ウエスタン分析を用いて、Ｓ−１００細胞質内フラクションへのＡＩＦ、Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ、およびチトクロームＣの放出を評価し、そして総細胞抽出物を開裂型キャスパーゼ９、キャスパーゼ−３、キャスパーゼ−８、ＰＡＲＰ、およびＢｃｒ／Ａｂｌの発現について監視する。各レーンは２５μｇのタンパク質を含む；ブロットをはぎ取り、そして等価の負荷および転移を保証するためにチュブリンについて再びプローブ化する。２つの追加的試験により、同等の結果を得た。化合物Ｉ（２５０ｎＭ）またはＳＡＨＡ（２.０μＭ）の効果はそれぞれ極めて小さいが、これらの剤への細胞の組合せ曝露は細胞質性Ｓ−１００細胞フラクションへのチトクロームｃ、ＡＩＦ、およびＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯの放出の顕著な増加をもたらした。これらの事象には、キャスパーゼ−９の開裂、ならびにキャスパーゼ−３、キャスパーゼ−８およびＰＡＲＰの分解が伴う。興味深いことに、個々の処置はほとんど効果がないが、化合物ＩおよびＳＡＨＡへの組合せ曝露は、Ｂｃｒ／Ａｂｌタンパク質のレベルの顕著な減少をもたらした（データは示していない）。したがって、ＨＤＩＳＡＨＡと組み合わせた毒性以下の濃度の化合物ＩでのＢｃｒ／Ａｂｌ^＋細胞の処置は、プロ−アポトーシス性ミトコンドリアタンパク質の放出の顕著な増加、キャスパーゼカスケードの活性化、およびＢｃｒ／Ａｂｌの発現の減少をもたらした。

次いで、ＳＡＨＡおよび化合物Ｉの間の相互作用を、Ｋ５６２細胞における種々のシグナル伝達、細胞周期およびアポトーシス調節タンパク質に対する効果に関して調べる。興味深いことに、ＳＡＨＡ単独への曝露（１６時間）は、Ｒａｆの発現の明確な減少をもたらすが、化合物Ｉはほとんど効果がない。Ｋ５６２細胞を２.０μＭＳＡＨＡ±２５０ｎＭ化合物Ｉに１６時間曝露させた後に、ウエスタン分析を用いて、Ｒａｆ、ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ＭＥＫ１／２および−ＥＲＫ１／２、総ＥＲＫ１／２、ｐｈｏｓｐｈｏｒ−７０^Ｓ６Ｋ（ＥＲＫ−リン酸化部位；４２１／４２４）；ｐｈｏｓｐｈｏ−ＪＮＫ、ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ＳＴＡＴ５、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（４２３）、および総Ａｋｔの発現を評価する。Ｋ５６２細胞を上記のとおり処置し、そしてＢｃｌ−ｘ_Ｌ、Ｍｃｌ−１、およびＸＩＡＰの発現について監視する。上記の化合物Ｉ±ＳＡＨＡでの処置後に、ｐ２１ＣＩＰ１、低リン酸化型（under-phosphorylated）ｐＲｂ、総ｐＲｂ、およびサイクリンＤ_１の発現をウエスタン分析により試験する。ＣＦ＝開裂フラグメント。２５μｇのタンパク質を含む各レーン；ブロットをはぎ取り、そして等価の負荷および転移を保証するためのチュブリンについて再プローブ化する。２つの追加的試験により、同等の結果が得られる（データは示していない）。化合物ＩおよびＳＡＨＡの共投与は、Ｒａｆ発現のさらなる減少をもたらした。ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＥＫ１／２およびｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ１／２のレベルのほぼ平行な変化が観察される。化合物ＩおよびＳＡＨＡでの組合せ処置は、また、ＥＲＫ−関連部位（４２１／４２４）でのｐ７０^Ｓ６Ｋのリン酸化の顕著な減少、ならびにｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ５（これはＢｃｒ／Ａｂｌの標的である）の発現の顕著な減少をもたらした。総Ａｋｔの発現に変化は見られないが、リン酸化（活性化）Ａｋｔの緩やかな減少がＳＡＨＡおよび化合物Ｉの両方に曝露された細胞において観察される。さらに、化合物ＩおよびＳＡＨＡは、それぞれ、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＪＮＫの発現を調節することができないが、組合せ処置は、ＪＮＫの活性化の非常に劇的な増加をもたらした。ｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化の僅かな増加がＳＡＨＡ−処置細胞において観察されるが、これは化合物Ｉの添加で変化しない。化合物ＩおよびＳＡＨＡでの組合せ処置は、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−ｘ_ＬまたはＸＩＡＰの発現を改変しない。しかしながら、化合物Ｉ単独での処置は、過去に報告されたように、抗アポトーシスタンパク質Ｍｃｌ−１の発現の僅かな減少を誘導するが、ＳＡＨＡ（これ自体は非常に小さい作用を発揮する。）の添加は、Ｍｃｌ−１発現のさらなる減少をもたらした（データは示していない）。

次いで、ＳＡＨＡおよび化合物Ｉの間の相互作用を、いくつかの細胞周期調節タンパク質の発現に関して調べる。ＳＡＨＡでの処置は、Ｂｃｒ／Ａｂｌ⁻白血病細胞において見られる効果と同様に、ｐ２１^ＣＩＰ１の強い誘導をもたらす。予期せぬことに、化合物Ｉへの共曝露は、ＳＡＨＡによるｐ２１^ＣＩＰ１の誘導を実質的に減少させる。この作用にもかかわらず、ＳＡＨＡおよび化合物Ｉへの細胞の組合せ曝露は、総および低リン酸化型タンパク質の両方の開裂に伴う低リン酸化型ｐＲｂの発現の緩やかな増加をもたらした。最後に、化合物ＩおよびＳＡＨＡの両方で処置されたＫ５６２細胞は、サイクリンＤ_１のレベルの明らかな減少を示した。この減少は、以前はアポトーシスの誘導と関連付けられていた。これらをまとまると、これらの知見は、化合物ＩおよびＳＡＨＡへのＫ５６２細胞の共曝露は複数のシグナル伝達、細胞周期、およびアポトーシス調節タンパク質の発現の改変、Ｒａｆの下方調節、ＭＥＫ１／２、ＥＲＫ１／２、およびｐ７０^Ｓ６Ｋの活性化の減少、ＪＮＫの顕著な活性化、Ｂｃｒ／Ａｂｌ、Ｍｃｌ−１、ｐ２１^ＣＩＰ１、およびサイクリンＤ_１の発現の減少、ならびにｐＲｂの脱リン酸化／開裂をもたらすことを示している（データは示していない）。

これらの事象におけるキャスパーゼの役割を評価するために、Ｋ５６２細胞を、パン−キャスパーゼインヒビターＢＯＣ−ｆｍｋまたはキャスパーゼ８インヒビターＩＥＴＤ−ｆｍｋ（表３）の存在下または不存在下で、化合物Ｉ＋ＳＡＨＡで２０時間処置する。

表３：Ｋ５６２細胞を、２５μＭＢＯＣ−ｆｍｋまたはＩＥＴＤ−ｆｍｋの存在下または不存在下で、２.０μＭＳＡＨＡ＋２５０ｎＭ化合物Ｉに２４時間曝露させた後に、アポトーシスを上記のように監視する。値を、３つの個別の実験についての平均±Ｓ.Ｄ.で表す。

細胞をＳＡＨＡ＋化合物Ｉ±ＢＯＣ−ｆｍｋで処置した後に、Ｓ−１００細胞質フラクションへのチトクロームｃまたはＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯの放出を上記のように評価する（示していない）。細胞をＳＡＨＡ＋化合物Ｉ±ＢＯＣ−ｆｍｋで処置した後に、ウエスタン分析を用いて、プロキャスパーゼ−３、Ｂｃｒ／Ａｂｌ、ｐＲｂ、低リン酸化型ｐＲｂ、Ｒａｆ−１、Ｍｃｌ−１、ｐ２１^ＣＩＰ１、およびサイクリンＤ_１の発現を評価する。各レーンは２５μｇのタンパク質を含んでいた；ブロットをはぎ取り、そして等価の負荷および転移を保証するためにチュブリンについて再プローブ化する。２つの追加的試験により、等価の結果が得られた（データは示していない）。ＢＯＣ−ｆｍｋは顕著にアポトーシスを阻害するが、ＩＥＴＤ−ｆｍｋの効果は極めて小さく、このことは、これらの経路において、化合物Ｉ／ＳＡＨＡ−介在性の致死性における外因性経路に関して比較的役割が小さいことを示唆している。しかしながら、ＢＯＣ−ｆｍｋは、化合物Ｉ＋ＳＡＨＡに曝露された細胞における細胞質へのチトクロームｃの放出のブロックにおいて有効でなく、それはＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯの放出を大きくブロックし、このことは後者が二次的、キャスパーゼ−依存性事象を表すことを示している。予想通り、ＢＯＣ−ｆｍｋは、プロキャスパーゼ−３ならびに総および低リン酸化型ｐＲｂの両方の開裂を低減化する。これは、また、化合物Ｉ／ＳＡＨＡ−処置細胞においてＢｃｒ／Ａｂｌの発現の下方調節を部分的に反転させ、このことは、この現象のキャスパーゼ−依存性成分を示唆している。対照的に、ＢＯＣ−ｆｍｋは、Ｒａｆ、Ｍｃｌ−１、ｐ２１^ＣＩＰ１、またはサイクリンＤ_１の下方調節に対してほとんど効果が無く、このことは、これらの事象がキャスパーゼ活性化からほとんど独立していることを示している。別の試験において、ＢＯＣ−ｆｍｋの共投与は、ＳＡＨＡの単独投与の作用にほとんど影響しなかった（データは示していない）。

化合物ＩおよびＳＡＨＡの間の相乗効果が他のＢｃｒ／Ａｂｌ^＋細胞を含むよう拡張可能か否かを調べるために、ＬＡＭＡ８４細胞において並行試験を行う（表４）。

表４：ＬＡＭＡ８４細胞を２００ｎＭ化合物Ｉ±１.０μＭＳＡＨＡに２４時間曝露させた後に、アネキシンＶ／ＰＩ^＋細胞のパーセンテージ（ゲート付き数字として示す）を、「方法」において記載したフローサイトメトリーにより決定する。２つの追加的試験により、同等の結果が得られた。

１.０μＭＳＡＨＡまたは２００ｎＭ化合物Ｉのいずれかへの２４時間のＬＡＭＡ８４細胞の曝露は細胞死に対して極めて小さい効果を発揮した。しかしながら、これらの剤を組み合わせた場合、大部分の細胞（すなわち、７０％）がアポトーシスを起こし、このことはアネキシン陽性により示される。対照的に、いくつかのＢｃｒ／Ａｂｌ⁻白血病細胞株（Ｕ９３７、ＨＬ−６０、ＮＢ４、およびＪｕｒｋａｔを含む）と組み合わせた場合、相乗効果の証拠は観察されない（表５）。

表５：Ｂｃｒ／Ａｂｌ^＋Ｋ５６２細胞、およびいくつかのＢｃｒ／Ａｂｌ−白血病細胞株、たとえばＵ９３７単球性白血病、Ｊｕｒｋａｔリンパ芽球性白血病、ならびにＮＢ４およびＨＬ−６０前骨髄球性白血病細胞をＳＡＨＡ±化合物Ｉに２４時間曝露させた後に、アポトーシス細胞のパーセンテージを、「方法」に記載したライト−ギムザ染色サイトスピンスライド（cytospin slide）を調べることにより決定する。それぞれの細胞株の濃度は以下のとおりである：Ｋ５６２：ＳＡＨＡ２.５μＭ；化合物Ｉ２５０ｎＭ；Ｕ９３７：ＳＡＨＡ１.５μＭ；化合物Ｉ２５０ｎＭ；Ｊｕｒｋａｔ：ＳＡＨＡ０.７５μＭ；化合物Ｉ２５０ｎＭ；ＮＢ４：ＳＡＨＡ１.５μＭ；化合物Ｉ２５０ｎＭ；ＨＬ−６０：ＳＡＨＡ１.０μＭ；化合物Ｉ２５０ｎＭ。それぞれの場合において、値は３つの個別の実験についての平均±Ｓ.Ｄ.を表す。

これらの知見は、ＳＡＨＡおよび化合物Ｉの間の相乗的相互作用がＢｃｒ／Ａｂｌタンパク質を発現しているヒト白血球細胞に限られることを示している。

ウエスタン分析により、化合物Ｉ＋ＳＡＨＡへのＬＡＭＡ８４細胞の組合せ曝露がチトクロームｃの細胞質放出、ならびにキャスパーゼ−９、−３、および−８の対応する活性化の顕著な増加をもたらすことが分かる（データは示していない）。Ｋ５６２細胞において得られた結果と矛盾することなく、化合物ＩおよびＳＡＨＡの組合せでのＬＡＭＡ８４細胞の処置は、Ｒａｆ、ｐ２１^ＣＩＰ１、サイクリンＤ_１、Ｍｃｌ−１、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ５、ｐＲｂの高感度低リン酸化および開裂の下方調節、ならびにＪＮＫリン酸化の劇的な増加をもたらす（データは示していない）。

次いで、かかる相互作用がＳＡＨＡ以外のＨＤＩに拡張可能か否かを証明することを試みる。ＬＡＭＡ８４細胞を、２００ｎＭ化合物Ｉ±１.０μＭＳＡＨＡに２４時間曝露させた後に、ウエスタン分析を行い、細胞質Ｓ−１００フラクションへのチトクロームｃ放出、または総細胞抽出物中の開裂型プロキャスパーゼ−９、開裂型プロキャスパーゼ−３、もしくはプロキャスパーゼ−８の発現を監視する（データは示していない）。ＣＦ＝開裂フラグメント。ＬＡＭＡ細胞を上記のように処置した後に、総細胞抽出物をＲａｆ１、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＪＮＫ、ｐ２１^ＣＩＰ１、サイクリンＤ_１、Ｍｃｌ−１、およびｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ５の発現について監視する。各レーンは２５μｇのタンパク質を含む；ブロットをはぎ取り、そして等価の負荷および転移を保証するためにチュブリンについて再プローブ化する。２つの追加的試験により、同等の結果が得られた（データは示していない）。

この目的で、Ｋ５６２およびＬＡＭＡ８４細胞を、酪酸ナトリウム（ＳＢ；１または２ｍＭ）の存在下または不存在下にて上で示した濃度の化合物Ｉに２４時間曝露させた後に、アポトーシスの程度を評価し、そしてアポトーシス細胞のパーセンテージを、「方法」において記載したようにサイトスピンスライドを調べることにより決定する。値は３つの個別の実験についての平均±Ｓ.Ｄ.を表し（表６）、化合物ＩとＳＢの共投与は両方の細胞株においてアポトーシスの顕著な増加をもたらした。

ＳＡＨＡで得られた結果と同様に、致死性の増大は、細胞質へのチトクロームｃの放出の増加、およびプロキャスパーゼ−３および−９の活性化、Ｒａｆ、ｐ２１^ＣＩＰ１、Ｍｃｌ−１、サイクリンＤ_１の下方調節、およびＪＮＫの顕著な活性化を伴う（データは示していない）。

化合物Ｉと、ＭＥＫ１／２インヒビターまたはサイクリン依存性キナーゼインヒビターフラボピリドールの共投与は、Ｂｃｒ／Ａｂｌの発現の増加を示す化合物Ｉ−耐性Ｋ５６２細胞の致死性の増大をもたらす。したがって、化合物Ｉ／ＨＤＩレジメンを含む並行試験を、多剤耐性細胞株に由来するＫ５６２Ｒ細胞において、ならびに化合物Ｉ−耐性ＬＡＭＡ８４細胞（ＬＡＭＡ８４−Ｒ）において行う。これらは、漸増濃度の化合物Ｉ中での細胞培養により作成される（表７）。

表７：化合物Ｉ−耐性Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２Ｒ）および化合物Ｉ−耐性ＬＡＭＡ８４細胞（ＬＡＭＡ８４Ｒ）を上で示した濃度の化合物ＩおよびＳＡＨＡに２４時間曝露させた後に、アポトーシス細胞のパーセンテージを、「方法」において記載したように、ライト−ギムザ染色サイトスピンスライドを試験することにより決定する。インセット（inset）は、耐性および感受性細胞において（チュブリン対照とともに）Ｂｃｒ／Ａｂｌタンパク質レベルをアッセイするウエスタンブロットを含む。各レーンは２５μｇのタンパク質を含む。値は、３つの個別の実験についての平均±Ｓ.Ｄ.を表す。

ＬＡＭＡ８４−Ｒ細胞は、それらの感受性対応物よりも約１０倍高い化合物ＩのＩＣ_５０値を示す（たとえば、２.１ vs ０.２２μＭ；データは示していない）。個々の細胞株についてのＢｃｒ／Ａｂｌタンパク質レベルの増加を示すウエスタンブロットを、挿入物中に示す。細胞株において僅かな致死性のみをもたらす化合物Ｉ（１.０または１.２５μＭ）と、ごく僅かな毒性濃度のＳＡＨＡ（すなわち、１.０または２.０μＭ）の４８時間の共投与は、大部分の（たとえば約６６％）のＫ５６２ＲおよびＬＡＭＡ８４−Ｒ細胞において細胞死を誘導することが分かる。これらの化合物Ｉ濃度への４８時間の感受性Ｋ５６２およびＬＡＭＡ８４細胞の曝露は、事実上１００％の細胞において細胞死を誘導する（データは示していない）。細胞をＳＢと組み合わせた化合物Ｉに曝露した場合、本質的に同一の結果が得られる（データは示していない）。かかる結果は、化合物ＩとＨＤＩの共投与が化合物Ｉ−耐性Ｂｃｒ／Ａｂｌ^＋細胞において、少なくともＢｃｒ／Ａｂｌタンパク質の発現の増加を示しているものにおいて、細胞死を効果的に増加させることを示している。

最後に、Ｂｃｒ／Ａｂｌ＋細胞における化合物ＩおよびＨＤＩの間の相乗的相互作用に対するＲａｆ／ＭＥＫ／ＭＡＰキナーゼ軸の脱調節の機能的貢献を評価するために、Ｋ５６２細胞をＧＦＰ単独または構成的に活性なＭＥＫ１／２／ＧＦＰ融合タンパク質のいずれかを発現しているベクターを一過性にトランスフェクトする（表８）。

表８：ＧＦＰを発現している精製集団（たとえば、＞９５％）を、「方法」において記載したＣｙｔｏｍａｔｉｏｎＭｏＦＬＯセルソーターを用いて単離する。非トランスフェクトＫ５６２細胞は９１％の生存および０.０１％のＧＦＰ発現を示した；ＧＦＰのみをトランスフェクトされたＫ５６２細胞；ソートされた細胞は９５％の生存および９５％のＧＦＰ発現を示した；ＧＦＰ／構成的に活性なＭＥＫ１／２融合ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＫ５６２細胞；ソートした細胞は、９５％の生存および９６％のＧＦＰ発現を示した。ＧＦＰ単独またはＧＦＰ／構成的に活性なＭＥＫ１／２融合ｃＤＮＡをトランスフェクトしたソート細胞を、薬物なしの培地中で５時間培養し、次いで２.０μＭＳＡＨＡ±２５０ｎＭ化合物Ｉに曝露した後に、アポトーシスを、上記のようにライト−ギムザ染色サイトスピン調製物を試験することにより監視する。値は２つの個別の測定についての平均±Ｓ.Ｄ.を表す。＊＝ＧＦＰのみをトランスフェクトした細胞について値より有意に小さい；Ｐ＜０.０５；＊＊＝Ｐ＜０.０１。この期間の終わりに、アポトーシスの程度を上記のように監視する。構成的に活性なＭＥＫ１／２をトランスフェクトした細胞は、ＧＦＰ単独対照よりも、僅かではあるが、有意に化合物Ｉ−介在性致死性に対して耐性であり（Ｐ＜０.０５）、このことは、薬理学的ＭＥＫ１／２インヒビターによる化合物Ｉ−誘導アポトーシスの増強を示す以前の報告と矛盾しない。さらに、変異型ＭＥＫ１／２での一過性トランスフェクションは、ＳＡＨＡ／化合物Ｉレジメンの致死性から細胞を極めて有意に保護する（Ｐ＜０.０１）。これらの知見は、ＨＤＩと組み合わせた化合物Ｉに曝露させたＫ５６２細胞におけるＲａｆ／ＭＥＫ／ＭＡＰキナーゼカスケードの脱調節が致死性の増加に重要な機能的役割を果たすことを示唆している。

当該試験の結果は、Ｂｃｒ／Ａｂｌキナーゼインヒビター化合物Ｉおよび臨床的に関係のあるＨＤＩの共投与は、Ｂｃｒ／Ａｂｌ＋ヒト白血病細胞におけるミトコンドリア損傷およびアポトーシスの劇的な増加をもたらす。ヒト白血病細胞において、ＨＤＩは、おそらくクロマチンの弛緩を促進することにより、分化プロセスに関与する遺伝子の転写の転写活性化を可能にすることが従来から知られている。この点に関して、ＳＢのようなＨＤＩはＫ５６２のようなＢｃｒ／Ａｂｌ^＋細胞株における赤血球の変異を誘導することが示された。さらに近年、ヒト白血病細胞において変異プログラムよりもむしろアポトーシスを引き起こすＨＤＩ、特に比較的新しい世代の化合物の能力が注目されている。ＨＤＩがかかる細胞において細胞死と分化のいずれを誘導するかを決定する因子は十分には解明されていないが、活性酸素種の発生がこのプロセスにおいて役割を果たす可能性が示唆されている。いずれにしても、Ｋ５６２細胞は、おそらく、Ｂｃｒ／Ａｂｌキナーゼおよびその下流の細胞保護標的の構成的活性化により与えられるアポトーシスに対する一般的耐性により、ＨＤＩ−介在性細胞死に比較的非感受性である。ＨＤＩおよび化合物Ｉの共投与がＢｃｒ／Ａｂｌ＋細胞におけるアポトーシスの閾値の顕著な低下をもたらす知見について、いくつかの可能性のある説明が存在する。たとえば、化合物Ｉは、細胞保護標的の下流の１またはそれ以上のＢｃｒ／Ａｂｌの抗アポトーシス作用を干渉することにより、細胞死を引き起こすＨＤＩの能力を増強し得る。逆に、ＨＤＩにより誘導される種々のシグナル伝達および細胞周期調節経路における変化は、化合物Ｉにより引き起こされるものと組み合わせて、ミトコンドリア損傷およびアポトーシスの増幅をもたらす。さらなる可能性は、Ｂｃｒ／Ａｂｌ＋細胞における変異を誘導することが報告されている化合物Ｉが、ＨＤＩと組み合わせた場合に、分化よりもむしろアポトーシスをもたらす矛盾シグナルを起こし得ることである。これに関して、白血病細胞の脱調節が強力なアポトーシス性刺激を表すという知見が十分に証明されている。これらのメカニズムは互いに排他的ではないので、これらのうちの１以上が細胞死の顕著な増加に貢献している可能性を排除することはできない。

いくつもの証拠により、ＨＤＩによるＢｃｒ／Ａｂｌ＋細胞におけるＲａｆ／ＭＥＫ／ＭＡＰキナーゼカスケードの遮断が化合物Ｉ／ＨＤＩレジメンによるアポトーシスの顕著な誘導に貢献するという概念が支持される。過去の試験では、Ｂｃｒ／Ａｂｌ^＋細胞のＨＤＩ−介在性分化誘導におけるＭＥＫ／ＭＡＰキナーゼの変化を示唆されていたが、かかる変化の性質の相違が報告された。たとえば、リベロ（Rivero）は、酪酸ナトリウムに曝露したＫ５６２細胞におけるＥＲＫの初期活性化を報告したが、ウィットら（Witt et al）は、Ｋ５６２細胞における酪酸塩誘導性分化とＥＲＫの阻害との間の相関を記載している。このような本質的に異なる結果は亜系統特異的な相違を反映するか、あるいはＥＲＫ活性化／下方調節後の酪酸塩曝露の二相性時間的パターンを反映し得る。これに関して、少なくとも初期においてＥＲＫ活性化に対抗する化合物Ｉは、また、Ｋ５６２細胞の成熟を促進することが示された。これらの知見にしたがって、我々は、また、化合物Ｉ−処置Ｋ５６２細胞においてＥＲＫ活性化の初期阻害を観察したが、この後、活性の基底レベルまたはそれ以上のレベルへの後期リバウンドを観察した。有意に、化合物Ｉ−処置Ｋ５６２細胞におけるＭＥＫ／ＥＲＫ活性化の阻害（すなわち、薬理学的ＭＥＫ１／２インヒビターによる）は、ミトコンドリア損傷およびアポトーシスに関する非常に強力な刺激を表す［２５］。しかしながら現在では、Ｂｃｒ／Ａｂｌ^＋細胞の上流部位（たとえば、Ｒａｆのレベルで）でＭＥＫ／ＭＡＰキナーゼ経路の遮断効果に関して、ほとんど情報を入手することができない。我々の知る限り、Ｂｃｒ／Ａｂｌ^＋細胞におけるＨＤＩによるＲａｆの下方調節は、過去に記載されたことはなかった。総合すると、これらの知見は、（ａ）Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ軸の下方調節がＨＤＩ−処置細胞の成熟プログラムを修飾し、それによりアポトーシスが促進される；または（ｂ）Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ細胞保護経路の途絶がＨＤＩ−介在性細胞死の閾値を低下させるという概念と適合する。後者の可能性を支持して、我々は、最近、薬理学的ＭＥＫ１／２／ＥＲＫ遮断（たとえば、Ｕ０１２６のような剤による）がＨＤＩに曝露したＫ５６２細胞におけるアポトーシスの顕著な増強をもたらすことを観察した（C. Yu and S. Grant、未公表データ）。

化合物ＩおよびＨＤＩでの組合せ処置は、また、ストレス関連キナーゼＪＮＫの活性化における顕著な増加をもたらす。例外が存在するが、ＪＮＫおよびｐ３８ＭＡＰＫのようなストレス関連キナーゼの活性化は、一般に細胞死に有利に働くが、ＭＥＫ／ＭＡＰキナーゼの活性化は細胞保護効果を発揮する。実際、ＪＮＫおよびＭＡＰキナーゼカスケードの純アウトプット比が生存／細胞死の決定において重要な役割を果たすことが示された。したがって、化合物ＩおよびＨＤＩの組合せに曝露したＢｃｒ／Ａｂｌ＋細胞におけるＭＥＫ／ＭＡＰキナーゼからＪＮＫシグナル伝達への劇的な移行がアポトーシスの顕著な増強に寄与すると推測される。

ＭＥＫ１／２／ＥＲＫ経路の遮断に加えて、ＣＤＫＩｐ２１^ＣＩＰ１の脱調節は、Ｂｃｒ／Ａｂｌ＋細胞における化合物ＩおよびＨＤＩの間の相乗的相互作用において重要な役割を果たし得る。たとえば、ｐ２１^ＣＩＰ１誘導（たとえば、アンチセンス構築物を発現している細胞またはＣＤＫインヒビターフラボピリドールに曝露した細胞において）での干渉は、いくつかの分化誘導剤、たとえばＰＭＡ、ブリオスタチン１、および最近、酢酸塩およびＳＡＨＡを含むＨＤＩでの処置後の白血病細胞アポトーシスを促進することが示された。この現象の根拠ははっきりとは分からないが、キャスパーゼ−３と結合し、そして阻害するｐ２１^ＣＩＰ１の能力と関係しているかもしれない。ＨＤＩによるヒストンの脱アセチル化がｐ２１^ＣＩＰ１プロモーターを特異的に活性化し、そしてｐ２１^ＣＩＰ１が特に成熟中の細胞白血病細胞における、ＨＤＩにより規則的に誘導されるという観察は、このＣＤＫＩの発現の増加がＨＤＩ−介在性成熟において重要な役割を果たすことを示唆している。化合物ＩがＨＤＩ−処置細胞においてｐ２１^ＣＩＰ１誘導をブロックするメカニズムは明らかではないが、ｐ２１^ＣＩＰ１の上流で機能することが知られているＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ軸の途絶から派生し得る。あるいは、特にＨＤＩと組み合わせた化合物Ｉの投与は、Ａｋｔ経路に干渉し得るが、これは、ｐ２１^ＣＩＰ１の調節にも関係するＢｃｒ／Ａｂｌの下流標的である。Ｂｃｒ／Ａｂｌ^＋細胞におけるＨＤＩおよび化合物Ｉの間の相乗的相互作用のｐ２１^ＣＩＰ１誘導でのＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ対化合物Ｉ−介在性相互作用のＨＤＩ−関連下方調節の相対的貢献は、もし存在するとしても、依然として明らかではない。

化合物Ｉ−耐性Ｋ５６２およびＬＡＭＡ８４細胞におけるＨＤＩによる化合物Ｉ致死性の増強は、薬理学的ＭＥＫ１／２インヒビター、または最近、ＣＤＫインヒビターフラボピリドールを含む組合せレジメンの場合において過去に観察されたものよりも大きくない場合には、同様である。化合物Ｉに対する耐性は、細胞内取り込みの減少、ｂｃｒ／ａｂｌの増幅およびＢｃｒ／Ａｂｌタンパク質発現の増加、薬物動態学的因子、およびＢｃｒ／Ａｂｌキナーゼドメインにおける変異を含む複数の因子に潜在的に由来し得る。不明確な理由に関して、Ｂｃｒ／Ａｂｌの発現の増加は、我々の研究室で単離したものを含む培養細胞株における耐性の最もありふれたメカニズムである［２５,２６］。しかしながら、化合物Ｉに対するインビボ耐性を発症したＣＭＬ患者から得られた細胞において、Ｂｃｒ／Ａｂｌの発現の増加は、Ｂｃｒ／Ａｂｌキナーゼドメインの変異ほど頻繁に観察されるわけではない。これらのうち、Ｂｃｒ／Ａｂｌキナーゼ接触部位（たとえば、Ｔ３１５およびＹ２５３）の変異が最も広範に報告されている。さらに、コービンら（Corbin et al）は、近年、部位特異的突然変異誘発法を用いて、化合物Ｉの阻害効果を減少させるＢｃｒ／Ａｂｌキナーゼドメインにおける他の変異を同定し、そしてこれは、潜在的に、臨床上関係があり得る。耐性Ｋ５６２またはＬＡＭＡ８４細胞においてアポトーシスを誘導する化合物Ｉ／ＨＤＩレジメンの能力は、Ｂｃｒ／Ａｂｌ発現の増加の効果を回避するか、あるいはＢｃｒ／Ａｂｌの下流または独立して機能する経路を介して作用するこのストラテジーを示唆している。かかるストラテジーはＢｃｒ／Ａｂｌの上方調節を示す細胞において有効であり得るが、化合物Ｉに対する耐性を与えるＢｃｒ／Ａｂｌ変異を発現している細胞における活性を証明するか否かは未決定のままである。これに関して、キナーゼドメインにおける一アミノ酸置換がかかるプロセスを妨げそうにないので、Ｂｃｒ／Ａｂｌの下方調節を引き起こす化合物Ｉ／ＨＤＩレジメンの能力が関係し得る。

ヒストンのアセチル化およびアンコイリングを誘導することにより、ＨＤＩは成熟プロセスに関与する遺伝子の発現を促進する。結果的に、特に白血病における、他の剤の分化誘導能を促進するためのＨＤＩの使用について関心がある。たとえば、オール−トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）に耐性の白血病細胞を克服する酪酸塩のようなＨＤＩの能力が近年報告された。化合物Ｉは、限られた程度ではあるが、Ｂｃｒ／Ａｂｌ^＋細胞において分化を誘導できるので、ＨＤＩの共投与がこのプロセスを増強する可能性が存在する。しかしながら、本明細書において提示したデータは、化合物ＩおよびＨＤＩの間の相乗効果は、主に、成熟よりもむしろアポトーシスの誘導を反映することを示唆している。ヒトデの臨床試験への数種の新規ＨＤＩの近年の導入の観点から、ＣＭＬおよび関連障害を有する患者の処置のためにかかる剤を化合物Ｉと組み合わせるコンセプトは、実施可能であり得る。したがって、このストラテジーを開発するさらなる試みが進行中である。

実施例２：実施例３：４−［（４−メチル−１−ピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−［［４−（３−ピリジニル）−２−ピリミジニル］アミノ］フェニル］ベンズアミドメタンスルホン酸塩、β−結晶形を有するカプセル剤
活性物質として１００ｍｇの化合物Ｉ（遊離塩基）に相当する１１９.５ｍｇの標題で命名した化合物（化合物Ｉモノメタンスルホン酸塩）を含むカプセルを以下の組成で製造する：

該カプセルを、成分を混合し、当該混合物をサイズ１の硬ゼラチンカプセルに充填することにより製造する。

Claims

（ａ）式Ｉ

で示されるＮ−｛５−［４−（４−メチル−ピペラジノ−メチル）−ベンゾイルアミド］−２−メチルフェニル｝−４−（３−ピリジル）−２−ピリミジンまたは医薬上許容されるその塩および（ｂ）遊離の形態またはその医薬上許容される塩の形態の少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼインヒビターおよび所望により少なくとも１つの医薬上許容される担体を含んでなる、同時的、個別的または逐次的使用のための組合せ剤。
（ｂ）が酪酸ナトリウム、ＭＳ−２７５、ＳＡＨＡ、アファシジン、デプシペプチド、ＦＫ２２８、トリコスタチンＡ、式ＩＩ

で示される化合物もしくは医薬上許容されるその塩および式ＩＩＩ

で示される化合物もしくは医薬上許容されるその塩および少なくとも１つの医薬上許容される担体からなる群から選択される、請求項１に記載の組合せ剤。
酪酸ナトリウム、ＳＡＨＡ、式ＩＩの化合物および式ＩＩＩの化合物からなる群から選択される、請求項２に記載の組合せ剤。
白血病の処置における請求項１〜３のいずれか１項に記載の組合せ剤の使用。
白血病の処置における医薬の製造のための請求項１〜３のいずれか１項に記載の組合せ剤の使用。
白血病が化合物Ｉ−耐性白血病である、請求項４または５のいずれか１項に記載の組合せ剤の使用。
白血病を有する温血動物の処置方法であって、当該動物に、白血病に対して共同で治療上有効量の請求項１〜３のいずれか１項に記載の組合せ剤を投与することを含んでなり、そして該化合物は、また、それらの医薬上許容される塩の形態で存在していてもよい方法。
白血病に対して共同で治療上有効量の請求項１〜３に記載の医薬組合せ剤および少なくとも１つの医薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物。
白血病の処置におけるそれらの同時的、個別的または逐次的使用のための指示書とともに請求項１〜３のいずれか１項に記載の組合せ剤を含んでなる市販パッケージ。
白血病が化合物Ｉ−耐性白血病である、請求項７に記載の方法、請求項８に記載の医薬組成物および請求項１０に記載の市販パッケージ。