JP2006500422A - 酵素活性を阻害するためのキレート化剤の親油性ジエステル - Google Patents

Abstract

本発明は、特定のメタロプロテイナーゼ及びカルパインのタンパク質分解活性を阻害するための、キレート化剤１，２−ビス（２アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）の親油性ジエステルの使用に関する。本発明はさらに、キレート化剤ＢＡＰＴＡの前記親油性ジエステルを治療上有効量含む薬剤組成物を、それを必要としている哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物においてＭＭＰ及びカルパインに関連する疾患又は障害を予防、治療又は管理する方法に関する。

Description

本発明は、特定のメタロプロテイナーゼ及びカルパインのタンパク質分解活性を阻害するための、キレート化剤１，２−ビス（２アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）の親油性ジエステルの使用に関する。

マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）とは、潜在形（ｌａｔｅｎｔ ｆｏｒｍ）で産生され、触媒活性のために活性化を必要とする、細胞外の亜鉛及びカルシウム依存性プロテアーゼである。活性化は細胞表面で起こり、ＭＭＰが膜の周囲の特異的部分で細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の構成成分を分解することを可能にする。最も研究されているＭＭＰは、ゼラチン、ＩＶ型コラーゲン及びフィブロネクチンを好ましい基質として使用するＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９を含めたゼラチナーゼである。ＭＭＰ−９遺伝子の転写は、サイトカイン及び成長因子によってトランス活性化され、ＭＭＰ−２は構成的に発現され、且つホルボールエステル及びほとんどのサイトカインに非応答性である。ＭＭＰ−２の活性化は、膜結合ＭＭＰ（ａ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ＭＭＰ）であるＭＴ１−ＭＭＰによって調節される。ＭＭＰ−９の活性化は、プラスミン及びストロメライシン−１（ＭＭＰ−３）が関与するプロテアーゼカスケードによって調節される。

マトリックスメタロプロテイナーゼは、マトリックス構成成分の代謝回転の大部分を担っており、したがって正常プロセスにも病的プロセスにも関与している。ＭＭＰは、膜及びＥＣＭの維持及び再生、例えば発生及び損傷からの回復の間、細胞外マトリックスを分解して細胞の成長及び組織の再生を可能にする点において重要な役割を果たす。これらはまた、排卵、毛細血管透過性の調節及び細胞の炎症部位への遊走を可能にするなどのプロセスにおいて役割を果たす。

ＭＭＰは多くの病的状態に関与している。例えば、これらは、浸潤、転移及び血管形成などの癌における発病機構に関連している［Ｆｏｄａ及びＺｕｃｋｅｒ（２００１）、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ、６：４７８〜４８２に総説］。ＭＭＰは、脳卒中、出血、リウマチ性疾患（例えば関節炎）、クローン病、喘息、並びに脳血管及び心血管の障害などにおける、細胞外マトリックスの分解を伴う炎症性の症状及び疾患の進行に一役を担っている［Ｍｕｎ−Ｂｒｙｃｅ及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９８）、Ｊ．Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、１８：１１６３〜７２；Ｙｏｎｇ他（１９９８）、ＴＩＮＳ、２１：７５−８０；Ｌｕｋｅｓ他（１９９９）、Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１９：２６７〜２８４］。ＭＭＰファミリーのメンバーはまた、脱髄及び神経炎症性プロセスに関与するとして、神経疾患及び状態にも関連付けられている。例えば、ＭＭＰは、脳損傷及び虚血、ギラン−バレー、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症並びにアルツハイマー病と関連付けられている。現在の見解によれば、炎症により、ＭＭＰの産生を調節する、サイトカイン、ケモカイン、成長因子及びホルモンが産生されると考えられている。ＭＭＰ及びプラスミノーゲン活性化因子（ＰＡ）の活性化は、炎症性応答における重要な調節ステップである。

「Ａディスインテグリン及びメタロプロテアーゼ」（ＡＤＡＭ）と同定された別のメタロプロテイナーゼのメンバーは、ＭＭＰファミリーのメンバーと同様、亜鉛依存性の触媒ドメイン及び酵素を不活性状態に保つことを担っているＮ末端プロドメインを含めた複数のドメインを有する［Ｍｏｓｓ他（２００１）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ、６：４１７〜４２６］。ＡＤＡＭファミリーのメンバーが、基質の細胞膜表面からの切断（「シェディング」と呼ばれる現象）を含めたいくつかの異なるプロセッシング現象に関与していることが示された。ＡＤＡＭファミリーのメンバーの１つは、ＴＮＦα−変換酵素（ＴＡＣＥ）である。ＴＡＣＥは、これが膜結合ＴＮＦα、すなわち炎症誘発性サイトカインを、その成熟した可溶性形態へとプロセッシングする細胞表面上で見られる。炎症状態において放出される可溶性ＴＮＦαは、アポトーシスを誘発させることができる。例えば、ＴＮＦは、マクロファージ及びグリア細胞中でＭＭＰ−Ｐの分泌及び活性化を誘発させ、神経炎症性の疾患及び続く脳損傷において神経細胞死を引き起こす。ＴＮＦはまた、関節リウマチなどの病的状態において役割を果たすことが示されている。

潜在的に毒性の高いタンパク質分解性酵素として、マトリックスメタロプロテイナーゼは以下のような複数の段階で厳重に調節されている。
ｉ）遺伝子転写−ほとんどのＭＭＰは構成的に発現されないが、その転写は様々なサイトカイン（例えばＩＬ−１、ＴＮＦ）及び成長因子（例えばＴＧＦ−β、レチノイン酸、ＦＧＦ）によって制御されている。
ｉｉ）プロ酵素の活性化−ＭＭＰは通常、酵素を活性化させるために通常除去しなければならないプロペプチドセグメントを含む潜在形（ｐｒｏ−ＭＭＰ）で産生される。
ｉｉｉ）酵素活性の阻害−酵素に結合してその活性を遮断する、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）として知られる内在性ＭＭＰ阻害剤が少なくとも４つ存在する。ＭＭＰの別の知られている天然阻害剤は、血清プロテイナーゼ阻害剤α−マクログロブリンである。

ＭＭＰのいくつかの合成阻害剤が、科学論文及び特許文献の様々な出版物中に記載されている。現在知られている阻害剤は、主に合成ペプチド及びキレート化剤を含んでいる［Ｗｏｅｓｓｎｅｒ ＪＦ Ｊｒ．、Ａｎｎ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、（１９９９）３０：３８８〜４０３に総説］。

ＭＭＰ活性部位の合成阻害剤のいくつかは、コラーゲン中で切断されるペプチドの配列に基づいたペプチド模倣体である［Ｍａｓｕｉ他（１９７７）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｅｄ．、１７：２１５〜２１）。ヒトコラゲナーゼＩＶのプロセグメント由来の保存されているペプチド配列に基づいたペプチド体は、Ｓｔｅｌｔｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ他［Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ．、（１９９１）３０２：１６３〜７０］及びＬｉｏｔｔａ他の米国特許第５，２７０，４４７号に開示されている。ファージディスプレイペプチドライブラリから単離した合成ペプチド及びＭＭＰ阻害活性を有する環状ペプチドは、Ｋｏｉｖｕｎｅｎ他［Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌ、（１９９９）１７：７６８〜７４］に記載されている。

ＴＡＣＥ及びＭＭＰ阻害剤として有用なＮ−ヒドロキシホルムアミドペプチド模倣体は、Ｍｕｓｓｏ他［Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ、（２００１）１１：２１４７〜５１］に開示されている。

メタロプロテイナーゼ阻害剤として有用な他のポリペプチド及びペプトイド化合物は、Ｓｕｎｄｅｅｎ他の米国特許第４，２６３，２９３号及び第４，２９７，２７５号、すべてＭｃＧｒｅｇｏｒに発行された米国特許第４，３７１，４６５号、第４，３７１，４６６号及び第４，３７４，７６５号並びにＬａｎｇｌｅｙ他の米国特許公開第２００２／００９０６５４号に開示されている。

非ペプチド性ＭＭＰ阻害化合物は、Ｗｉｔｉａｋ他の米国特許第４，９５０，７５５号及びＬｉａｎｇ他の米国特許第５，８６６，５７０号に開示されている。

標的化部分及びキレート化剤を含むＭＭＰ阻害剤は、Ｄｕｐｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｍｐａｎｙの国際公開公報ＷＯ０１／６０８２０号及びＫｉｍｂｅｒｌｙ−Ｃｌａｒｋ Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ，Ｉｎｃ．の国際公開公報ＷＯ０２／０５３１７３号に開示されている。

マトリックスメタロプロテイナーゼ及びＡＤＡＭファミリーの他のメンバーは、キレート化剤によって阻害される。これらのキレート化剤のほとんどが天然及び合成ヒドロキサメート化合物並びにスクシニルヒドロキサメート、スルホンアミドヒドロキサメートなどのその誘導体である［Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｆ．Ｊｒ．（１９９９）、Ａｎｎｕａｌｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、３０：３８８〜４０３に総説］。例えば、合成ヒドロキサメートのバチマスタット（ｂａｔｉｍａｓｔａｔ、ＢＢ−９４；Ｉｎｖｅｓｔ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ（１９９６）、１４：１９３〜２０２）及び経口による生体利用が可能なその類似体であるマリマスタット（ｍａｒｉｍａｓｔａｔ）は、動物において悪性腫瘍の拡大及び成長を阻害することが示されている。これらの化合物は、現在後期臨床試験で試験中である。

ＭＭＰ阻害剤として示された化合物には、テトラサイクリン及びその化学修飾した類似体などの抗生物質も含まれる（Ｇｏｌｕｂ他（１９８３）、Ｊ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｒｅｓ．、１８：５１６〜２６；ＭｃＮａｍａｒａ他の米国特許第４，７０４，３８３；Ｇｏｌｕｂ他の米国特許第５，８３７，６９６］。

上述の薬剤のほとんどは、メタロプロテイナーゼ及び他の金属イオン依存性プロテアーゼの非特異的な阻害剤である。

カルパインとは、別のプロテアーゼファミリーのメンバーである。これらは、カルシウム依存性のシステインプロテアーゼである、細胞基質酵素である。カルパインは細胞内に不活性なプロ酵素として大部分存在し、細胞内のカルシウムレベルが上昇するとその活性形態へと変換される。カルシウムが結合すると、酵素前駆体は、自己消化プロセスを行い、これにより活性化されたカルパインが放出される。

細胞骨格タンパク質、膜タンパク質及び調節タンパク質を含めた広範囲のタンパク質がカルパインの基質として役割を果たす。カルパインは、いくつかの正常な細胞シグナル伝達系並びに病的状態に関与する。例えば、カルパインの活性化は、虚血並びに脳卒中や外傷性の脳及び脊髄損傷などによって引き起こされる神経細胞死に関連付けられている［Ｂａｒｔｕｓ他（１９９５）、Ｎｅｕｒｏｌ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７：２４９〜２５８］。カルパインのタンパク質分解活性はまた、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病及びピック病を含めたいくつかの神経変性の疾患及び状態にも関連付けられている。

ペプチド分子及び非ペプチド分子のどちらも含む現在知られている天然及び合成カルパイン阻害剤は、Ｗａｎｇ及びＹｕｅｎ［「カルパイン阻害：その治療上の潜在性の概要（Ｃａｌｐａｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｉｔｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）」、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、（１９９４）１５；４１２〜４１９］並びにＤｏｎｋｏｒ［「カルパイン阻害剤の調査（Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｃａｌｐａｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）」、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、（２０００）７：１１７１〜８８］に総説されている。既知のカルパイン阻害剤には、天然阻害剤カルパスタチン及びキニノーゲンのペプチド配列を模倣するポリペプチドが含まれる［総説には、Ｗａｎｇ及びＹｕｅｎ（１９９４）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、（１９９４）１５、４１２〜４１９参照］。

システインプロテアーゼに対して阻害活性を有するスルホンアミド誘導体及びケトン誘導体である化合物はそれぞれ、いずれもＡｎｄｏ他の米国特許第５，５０６，２４３号及び第５，６３９，７８３号に開示されている。ジペプチドα−ケトエステル、αケトアミド及びαケト酸であるカルパイン阻害剤は、Ｌｉ他［Ｊ．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ、（１９９３）３６：３４７２〜８０］に記載されている。カルパイン阻害剤のいくつかの他のクラスは、Ｂａｒｔｕｓ他の国際公開公報ＷＯ９２／１１８５０号に開示されている。

市販されているカルパイン阻害剤のほとんどは、酵素の基質結合部位と相互作用するペプチド構造に基づいた化合物である。これらの化合物の多くは非特異的であり、カルパインだけでなく様々なプロテアーゼを阻害する。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性であった既知の阻害剤のほとんどが、膜透過性が乏しいことからｉｎ−ｖｉｖｏで、特にＣＮＳ内でカルパインを阻害するのに効果がないことが見出された。さらに、病的炎症状態又は癌の治療について試験したほとんどすべてのＭＭＰ阻害剤が、ｉｎ−ｖｉｖｏの臨床研究で役に立たなかった。

したがって、ＭＭＰ及びカルパインなどの重要なプロテアーゼの特異的な阻害剤である、有効で無毒性の薬剤に対する長い間の切実な必要性が依然として存在する。

ＢＡＰＴＡ−ジエステル
二価金属イオンのキレート化剤１，２−ビス（２アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）の安定な親油性ジエステルが、本出願人の国際公開公報ＷＯ９９／１６７４１号に開示されている。また、この公報には、過剰の二価金属イオンに関連する疾患及び障害の治療に有用な薬剤組成物中におけるこれらの化合物の使用も開示されている。これらの疾患及び障害には、虚血、脳卒中、癲癇並びにアルツハイマー病及びパーキンソン病などの神経変性疾患が含まれる。

しかし、その時点では、これらのキレート化剤がその神経保護効果を発揮する機構が解明も開示もされていなかった。ＷＯ９９／１６７４１号若しくは他のどの出版物にも、これらのキレート化剤によって影響を受ける細胞標的について何ら暗示も示唆もなされていない。

今回本発明により、キレート化剤１，２−ビス（２アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（本明細書中で以降「ＤＰ−ＢＡＰＴＡ」と示す）の特定のジエステルが、プロテアーゼであるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、カルパイン及びＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）の酵素活性を阻害できることが見出された。

従って、本発明は一態様で、プロテアーゼ活性を阻害する方法であって、前記プロテアーゼがメタロプロテイナーゼ及びカルパインから選択され、前記方法が細胞を阻害に有効な量の一般式（Ｉ）の化合物に曝露させることを含む方法を提供する：

［式中、
Ｒは、１〜６個の酸素及び／又は窒素原子の任意の組合せによって中断されていてもよい（ただし、２つの酸素原子同士、又は酸素原子と窒素原子とは互いに直接連結されていない）１〜２８個の炭素原子を有する飽和若しくは不飽和アルキル、シクロアルキル、アリールアルキル又はシクロアルキル−アルキル基であり、Ｍは水素又は生理的に許容される陽イオンを表す］。

さらに、本明細書に開示した特定の化合物は新規であり、それ自体で本発明の一態様を構成する。これらの化合物には、Ｒが２−ベンジルオキシエチルである一般式（Ｉ）の化合物が含まれる。したがって、本発明の別の態様によれば、１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン，Ｎ，Ｎ’−ジ（酢酸２−ベンジルオキシエチル），Ｎ，Ｎ’−酢酸である一般式（Ｉ）の化合物及びその塩である一般式（Ｉ）の化合物が提供される。また、治療上有効な量の前記化合物及び製薬上許容される担体又は賦形剤を含む薬剤組成物も本発明によって提供される。

本発明における現在の好ましい実施形態によれば、ＭＭＰ−９活性の阻害に有用な化合物は、以下の化合物：
１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン，Ｎ，Ｎ’−ジ（酢酸２−オクトキシエチル），Ｎ，Ｎ’−二酢酸（本明細書中ではＤＰ−ｂ９９と示す）、
１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン，Ｎ，Ｎ’−ジ（酢酸２−オクトデシルオキシエチル），Ｎ，Ｎ’−二酢酸（本明細書中ではＤＰ−ｂ１０９と示す）、
１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン，Ｎ，Ｎ’−ジ（酢酸２−ベンジルオキシエチル），Ｎ，Ｎ’−酢酸（本明細書中ではＤＰ−ｂ４４０と示す）、
１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン，Ｎ，Ｎ’−ジ（酢酸２−ドデシルオキシエチル），Ｎ，Ｎ’−二酢酸（本明細書中ではＤＰ−ｂ４６０と示す）、
１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン，Ｎ，Ｎ’−ジ［酢酸２−（２−ドデシルオキシエトキシ）−エチル］，Ｎ，Ｎ’−二酢酸（本明細書中ではＤＰ−ｂ４５８と示す）、及び生理的に許容されるその塩であり、
カルパイン活性を阻害するために現在最も好ましい化合物は、１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン，Ｎ，Ｎ’−ジ（酢酸２−オクトキシエチル），Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＤＰ−ｂ９９）及び１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン，Ｎ，Ｎ’−ジ（２−酢酸オクトデシルオキシエチル），Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＤＰ−ｂ１０９）及び生理的に許容されるその塩である。

本発明の別の態様では、傷害を与えるＭＭＰ及び／又はカルパイン活性に関連する疾患及び病的状態を予防、治療又は管理する方法を提供する。この方法は、治療上有効な量の上述の一般式（Ｉ）の化合物を活性成分として含む薬剤組成物を、それを必要としている哺乳動物に投与することを含む。

本発明のさらに別の態様では、メタロプロテイナーゼ、カルパイン及びＴＡＣＥから選択されるプロテアーゼの活性を阻害する医薬品を調製するための、一般式（Ｉ）の化合物の使用を提供する。

本発明はさらに、癌（転移癌を含む）、血管形成依存性の疾患（例えば癌性腫瘍、関節炎、乾癬、黄斑変性症、慢性炎症、糖尿病性網膜症）、虚血性又は低酸素性の組織損傷、酸化的傷害、脳卒中、外傷、炎症性の状態及び疾患（例えば関節炎疹、関節リウマチ、骨関節炎、再狭窄、喘息、乾癬、全身性エリテマトーデス、炎症性腸症候群、クローン病、歯肉炎、歯周病、髄膜炎、熱帯性痙性不全対麻痺、敗血症、水疱性皮膚障害、ざ瘡、感染症による炎症）、アテローム性動脈硬化症、血栓性障害、関節炎、骨粗鬆症、糖尿病、出血、自己免疫疾患、リウマチ性疾患、眼病及び網膜症（例えば糖尿病性網膜症、緑内障、黄斑変性症、白内障、網膜剥離、網膜裂傷）、火傷、慢性創傷（例えば潰瘍）、神経性及び神経変性の疾患及び障害（例えば多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ギラン−バレー、パーキンソン病、ハンチントン病、ピック病、痴呆症候群、血管性痴呆、多発硬塞性痴呆、ＨＩＶ誘発性神経障害、脳虚血（全体及び局所虚血のどちらも）、神経組織の外傷）、偏頭痛、脳血管及び心血管の疾患からなる群から選択され得るＭＭＰ又はカルパインに関連する疾患、障害又は状態を治療するための方法並びに一般式（Ｉ）の化合物の使用を提供する。

本発明による治療方法はさらに、一般式（Ｉ）の化合物を含む薬剤組成物の投与と同時に、その前に又はその後実施し得る、追加の治療的処置で患者をさらに治療することを含むことができる。

すべてのキレート化剤が試験したプロテアーゼの活性を阻害できるわけではないことが重要である。ＤＰ−ＢＡＰＴＡ化合物の効果とは対照的に、密接に関連している既知のキレート化剤であるＢＡＰＴＡ及びＢＡＰＴＡ−ＡＭは、ＤＰ−ＢＡＰＴＡと類似の用量ではＭＭＰ−９活性を阻害しなかった。むしろ、ＢＡＰＴＡ−ＡＭはＭＭＰ−９活性をわずかに増大させた。

強調すべき別の点は、用いた実験条件下では、試験したＤＰ−ＢＡＰＴＡはカルパイン及びＭＭＰ−９のタンパク質分解活性を阻害したが、このような効果は試験した他のゼラチナーゼであるＭＭＰ−２では実証されなかった。

本発明のさらなる目的は、本発明の特定の実施形態の詳細な説明を含めた以下の開示をさらに参照することによって当業者に明らかとなるであろう。

ＢＡＰＴＡ（ＤＰ−ＢＡＰＴＡ）の安定な親油性ジエステル合成及びいくつかの利用性は、本出願人の国際公開公報ＷＯ９９／１６７４１号に開示されており、その教示及び開示の全体を本明細書中に参照により特別に組み込む。国際公開公報ＷＯ９９／１６７４１号では、ｉｎ−ｖｉｔｒｏでの神経細胞培養物において及びｉｎ−ｖｉｖｏでの虚血モデル系において、ＤＰ−ＢＡＰＴＡの神経保護効果が実証されている。しかし、特定の酵素の活性に対するＤＰ−ＢＡＰＴＡ分子の効果は、この刊行物にも他のどの刊行物にも、教示も示唆もされていない。したがって、本発明中に開示するように、これらの化合物をＭＭＰ及びカルパインに関連する疾患及び障害の治療に有効に使用し得ることは、教示も認識も疑われてもいない。

今回初めて、キレート化剤ＢＡＰＴＡの特定のジエステルがカルパインの活性及びＡＤＡＭファミリーの特定のプロテアーゼの活性を阻害する能力を有すること、特にマトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）の活性を阻害する能力を有することが、開示された。

本発明に従う有用な化合物は、上述の一般式（Ｉ）のものである。本発明の範囲内には、有機及び無機陽イオンを含めた一般式（Ｉ）の化合物の製薬上許容される塩、水和物を含めた様々な溶媒和物、並びに一般式（Ｉ）の化合物の他の活性型も含まれることが理解されるべきである。

本発明において現在好ましいＭＭＰ又はカルパインの活性を阻害するための化合物は、約８〜２０個の炭素原子を含むアルキル鎖を有するＢＡＰＴＡのジエステルである。アルキル鎖は１つ又は複数の二重結合及び／又は三重結合を含む飽和若しくは不飽和アルキルであり得る。本発明の好ましい実施形態によれば、アルキル鎖は１〜３個の酸素原子によって中断されている。本発明の最も好ましい実施形態によれば、一般式（Ｉ）の化合物のＲ部分はエチレングリコールのモノアルキルエーテル、好ましくはモノ−、ジ−又はトリ−エチレングリコールを含む。

一般式（Ｉ）の化合物のＲ位のアルキル残基は、芳香環若しくは非芳香環構造であり得る環状要素からなる又はそれを含み得る。好ましくは、環状要素は５個又は６個の炭素原子を有する。

本発明において好ましい環状のＲ基は、フェニル残基である芳香環を含む。Ｒ位に含まれる他の現在好ましい環状要素は、飽和若しくは不飽和のシクロペンチル、シクロヘキシル又はシクロヘプチルである。環状要素は一般式（Ｉ）の化合物のカルボキシ部分に直接結合されているか、又は１つ若しくは複数の酸素及び／又は窒素原子を含み得る飽和若しくは不飽和アルキル鎖を介して結合されていてよい。

好ましくは、一般式（Ｉ）の化合物はＭ位で一価の陽イオンを含む。適切な製薬上許容される陽イオンには、それだけには限定されないが、Ｈ^＋、Ｎａ^＋、Ｌｉ^＋、Ｋ^＋、ＮＨ_４ ^＋及びモノ−アルキルアンモニウムが含まれ得る。また、二価の陽イオンもＭ位に含まれ得る。一般式（Ｉ）のＭ位の好ましい陽イオンの選択は、化合物の意図する治療上の使用、並びに利用する特定の配合及び投与経路に依存する。当業者は、それぞれの特定の治療事例で選択される最適な薬剤組成物及び投与方法で求められる、適切な陽イオンを選択できるであろう。

最も好ましいＤＰ−ＢＡＰＴＡ化合物のうちの１つは、１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン，Ｎ，Ｎ’−ジ（酢酸２−ベンジルオキシエチル），Ｎ，Ｎ’−酢酸（ＤＰ−ｂ４４０）［一般式（Ｉ）の化合物のＲ部分がアルキルアリール部分を含む］である。この化合物は国際公開公報ＷＯ９９／１６７４１号に一般的に開示されているが、具体的に特許請求されておらず、個別に試験されていない。

今回本発明の発明者によって、ＤＰ−ＢＡＰＴＡが基底のＭＭＰ−９活性及びＴＮＦα又はＰＭＡ誘発性のＭＭＰ−９の活性化をどちらも減衰又は遮断することができることが示された。ＤＰ−ＢＡＰＴＡはまた、カルパイン活性も阻害することができる。したがって、ＤＰ−ＢＡＰＴＡは、例えば虚血及び炎症性応答が原因の病的状態における有害なプロテアーゼ活性を軽減させるのに有用であり得る。したがって、ＤＰ−ＢＡＰＴＡ化合物は、マトリックスメタロプロテイナーゼ又はカルパインの有害な活性に関連する疾患及び病的状態の予防、治療又は管理に有用であり得る。

ＭＭＰ−９活性はＤＰ−ＢＡＰＴＡ化合物によって顕著に阻害されたが、このような阻害活性は試験した関連のキレート化剤すなわち１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’四酢酸（ＢＡＰＴＡ）又は１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸アセトキシメチルエステル（ＢＡＰＴＡ−ＡＭ）では実証されなかったことに注目することが重要である。

本発明によるＤＰ−ＢＡＰＴＡ化合物は、ＭＭＰ、ＴＡＣＥ又はカルパインによって行われる又は媒介される分解プロセスを伴う全範囲の適応症の治療に有用であり得る。このような適応症には、それだけには限定されないが、神経虚血が原因の疾患や状態（例えば全脳虚血及び局所脳虚血）、心虚血、外傷、神経炎症性の疾患や障害を含めた脳卒中及び炎症状態、リウマチ病及び自己免疫疾患、神経性、脳血管及び心血管の疾患や障害が含まれる。ＤＰ−ＢＡＰＴＡ化合物はまた、例えば火傷及び慢性創傷（例えば潰瘍）などにおける創傷治癒を亢進させるための組成物及び方法で有用であり得る。

炎症性プロセスが関連付けられている疾患及び状態の進行におけるＭＭＰ及び／又はカルパインの関与を示す大量のデータが蓄積されている。このような病的状態には、それだけには限定されないが、リウマチ病（例えば関節リウマチ及び骨関節炎）、喘息、乾癬、全身性エリテマトーデス、炎症性腸症候群、クローン病、歯肉炎、歯周病、髄膜炎、熱帯性痙性不全対麻痺、敗血症、水疱性皮膚障害、ざ瘡並びに感染症による炎症が含まれる。

感染症には、それだけには限定されないが、細菌、真菌（例えばカンジダ症、アスペルギルス症）及びウイルス（例えばヘルペスウイルスに関連する障害、ＨＩＶに関連する疾患）などの任意の種類の微生物、寄生虫（例えばマラリア、アメーバ症）又はプリオン（例えばクロイツフェルト−ヤコブ病）によって引き起こされる感染症が含まれ得る。

ＭＭＰ又はカルパインの阻害剤は、炎症性プロセスの間に生じたものなどの組織に与えられたタンパク質分解性の損傷を軽減させることができる。例えば、これらは脳血液関門（ＢＢＢ）崩壊の制限、神経性炎症（例えば髄膜炎におけるもの）の阻害、脳又は心虚血性の損傷に関連する損傷の軽減、物理的理由（例えば外傷）が原因の酸化的ストレス、火傷、感染症、中枢神経系（ＣＮＳ）及び末梢神経系系（ＰＮＳ）損傷などの傷害によって引き起こされるタンパク質分解効果の減少を行い得る。

ＭＭＰ又はカルパイン活性の上昇は、それだけには限定されないが、多発性硬化症（ＭＳ）、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、ギラン−バレー症候群、パーキンソン病、ハンチントン病、ピック病、痴呆症候群、血管性痴呆、多発硬塞性痴呆、ＨＩＶ誘発性神経障害、脳虚血（全体及び局所虚血のどちらも）並びに神経組織の外傷を含めたいくつかの神経変性疾患及び状態に関連付けられている。

ＭＭＰはまた、虚血性又は低酸素組織損傷、酸化的損傷、骨粗鬆症、出血、動脈再狭窄、心血管障害（例えば虚血性心筋梗塞）並びに糖尿病性網膜症、緑内障、黄斑変性症、白内障、網膜剥離及び網膜裂傷を含めた様々な眼病及び網膜症などの病的状態に関連付けられている。

癌も、メタロプロテイナーゼのタンパク質分解活性が疾患の進行に寄与することが示されている主要な疾患の１つである。ＭＭＰは癌の拡大、特に疾患の転移状態の促進に関与している。ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９は基底膜の主要な構成成分であるＩＶ型コラーゲンの分解に関与しており、したがって、膜分解を含むプロセス、例えば、血管形成並びに腫瘍の浸潤及び転移における主要な要素であり得る。実際、腫瘍の進行とＭＭＰファミリーのメンバーの発現との間に正の相関が見られている。例えば、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９遺伝子の発現の増加がグリオーマの悪性度に関連付けられている。

いくつかの要素が悪性疾患の進行に重要である。重大な要素の１つは、原発腫瘍の成長、腫瘍の進行及び転移に必須であると考えられている血管形成である。血管形成機構の最初のステップは、新しい毛細血管の発生を容易にするための基底膜の分解を含む。したがって、ＥＣＭの分解及び再生は血管形成機構に不可欠なプロセスであり、これらのプロセスを阻害する方法は血管形成を遮断し、したがって悪性疾患を減少させるために有益であると思われる。

血管形成はまた、関節炎、乾癬、糖尿病性網膜症、慢性炎症、強皮症、血管腫、水晶体後線維増殖症及び血友病患者の関節における異常な毛細血管の増殖、長期出血などを含めたいくつかの他の病的プロセスにおいても重要である。ＭＭＰ阻害剤は、このような血管形成に関連する疾患の治療に有用であることが期待されている。

転移は癌に罹患している患者の主な死亡原因であるので、転移を制御できないことは大きな問題である。現在までに、転移の成長を予防又は制限するための満足できる治療は存在しない。したがって、ＭＭＰを阻害するため、具体的にはＭＭＰ−９プロテアーゼ活性を阻害するための本発明によるＤＰ−ＢＡＰＴＡ化合物の使用は、この点で有益であり得る。

ＤＰ−ＢＡＰＴＡで治療する癌（ｃａｎｃｅｒ）には、原発腫瘍（ｐｒｉｍａｒｙ ｔｕｍｏｒｓ）だけでなく続発腫瘍（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｔｕｍｏｒｓ）を含む良性若しくは悪性の腫瘍（ｂｅｎｉｇｎ ｏｒ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ）のあらゆる種類の腫瘍及び腫瘍性増殖（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｇｒｏｗｔｈｓ）が含まれ得る。用語「癌」及び「腫瘍性増殖」は、本発明の明細書及び特許請求の範囲で互換性があるように使用され、浸潤性及び非浸潤性腫瘍（ｎｅｏｐｌａｓｍｓ）、固形及び固形でない腫瘍（ｔｕｍｏｒ）、並びに遠隔転移を含めたすべての種類の病的な制御されていない細胞成長を含むことを意味する。

本明細書中で使用する用語「治療」とは、病的状態の発症及び／若しくは発生及び／若しくは進行を予防、寛解、緩和、阻害若しくは遅延させること、又はその徴候を改善させることを目的とする治療的手順を含むことを意味する。

本明細書中に開示且つ特許請求した一般式（Ｉ）の化合物の治療的活性は、これらの化合物の正確な機構を問わず、これらの分子がその有益な効果を発揮する特定の作用機構に制限されることを意図しないことを理解されるべきである。

本発明の方法によれば、治療上有効な量の一般式（Ｉ）の化合物を含む薬剤組成物を、それを必要としている患者に投与する。

投与する薬剤組成物は、一般式（Ｉ）の化合物を唯一の活性成分として含んでもよく、或いは前記化合物を特定の疾患又は障害の治療に有効であることが知られている１つ又は複数の追加の薬剤と組み合わせて含んでもよい。一般式（Ｉ）の化合物及び追加の治療上活性な薬剤は、同じ薬剤組成物中に含んでもよく、又は別の組成物中で投与してもよい。さらに、別の治療上活性な薬剤と組み合わせたＤＰ−ＢＡＰＴＡの使用は、同時であっても同時でなくてもよい。本発明の方法は、追加の治療剤又は手順に曝すのと同時に、その前に、又はその後にＤＰ−ＢＡＰＴＡ化合物を投与することを含む。

ＤＰ−ＢＡＰＴＡ化合物と組み合わせて使用し得る追加の薬剤は、治療的及び予防的な薬物、ホルモン、免疫修飾剤などがあり、他のキレート化剤、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質分子、ＤＮＡ及びＲＮＡ配列などを含むことができる。

このような薬剤は、それだけには限定されないが、抗腫瘍剤、抗増殖剤、抗炎症剤、抗生物質、抗ウイルス剤、抗微生物剤、抗真菌剤、抗アレルギー剤、心血管剤、抗痙攣剤、抗鬱剤、抗精神病剤、鎮痛剤、神経疾患用剤、神経保護剤、並びに神経伝達物質、免疫変調剤、成長因子、ホルモン、抗体などの生物活性ペプチド及びタンパク質から選択され得る。

例えば、癌を治療する場合は、ＤＰ−ＢＡＰＴＡ化合物（又は複数の化合物）は、単独で又は組み合わせて、追加の抗癌治療と同時に若しくは個別に使用し得る。追加の抗癌治療には、それだけには限定されないが、化学療法、照射療法、免疫療法、遺伝子治療、手術又は当分野で知られている任意の他の抗癌治療が含まれ得る。追加の処置は、一般式（Ｉ）の化合物の投与と同時に又は連続的に、すなわち、追加の処置は一般式（Ｉ）の化合物の投与と同時に又はその前に若しくはその後連続して適用し得る。２つの治療の時間間隔及び全体的なレジメンは、治療する具体的な疾患並びに個体の治療に対する具体的な状態応答に応じて、当業者によって決定し得る。

化学療法手順での使用に適した任意の抗癌薬を一般式（Ｉ）の化合物と組み合わせて適用し得る。適切な抗癌薬には、それだけには限定されないが、アルカロイド（例えばタキソール、ビンブラスチン、ビンデシン及びビンクリスチン）、スルホン酸アルキルなどのアルキル化剤、アジリジン、エチレンイミン、メチルメラミン、窒素マスタード（例えばシクロホスファミド）及びニトロソ尿素、抗生物質及び類似体（例えばアクラシノマイシン、アクチノマイシン、アンスラマイシン、ダウノルビシン及びドキソルビシン）、葉酸類似体（例えばＴｏｍｕｄｅｘ（登録商標））などの抗代謝剤、プリン及びピリミジン類似体、並びに白金錯体（例えばカルボプラチン、シスプラチン、ミボプラチン及びオキサリプラチン）が含まれ得る。

追加の治療手順との組合せ治療は、他の疾患及び障害の治療にも有益であり得る。例えば、炎症性、神経性又は心血管状態の治療では、感染性因子又は他の病原性要素を除去又は死滅させるために、ＤＰ−ＢＡＰＴＡ化合物の投与を別の医薬品又は治療剤（例えば抗生物質、抗体など）を用いた手術及び／又は治療と（同時に、その前に又はその後いずれか）組み合わせ得る。

当業者には、多数の他の有益な薬物、試薬、手段又は手順が特定の病的状態の治療に有用でありうる事が容易に理解されよう。このような治療的に有効な薬剤を含む薬剤組成物及びそれらを施用する方法又は他の医療手順も、一般式（Ｉ）の化合物と組み合わせるのに有用な組成物及び方法として本発明の範囲内に含まれる。使用する正確なプロトコル及び追加の医薬品又は治療手順は、治療する具体的な医療状態の詳細、例えば疾患又は障害の段階、その重篤度及び進行、並びに患者の状態を考慮して、当業者によって決定される。

一般式（Ｉ）の化合物を含む薬剤組成物は、液体、エアロゾル又は固体の剤形であり得、それだけには限定されないが、適切な投与経路の必要に応じて、溶液、懸濁液、ミセル、乳剤、マイクロエマルジョン、エアロゾル、軟膏、ゲル、坐剤、カプセル、錠剤などを含む任意の適切な配合物へと処方することができる。

それだけには限定されないが、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、吸入、経鼻、局所、直腸又は他の知られている経路を含めた任意の適切な投与経路が本発明に包含されている。好ましい実施形態では、有用な薬剤組成物を経口又は静脈内によって投与する。用量範囲は、所望のプロテイナーゼ阻害効果を生じるために十分に大きいものである。用量範囲は、使用する具体的なＤＰ−ＢＡＰＴＡ、治療する病的状態及び投与経路に応じて変化し、追加の処置が適用される場合にはその追加の処置手順に依存する。

投与する用量はまた、レシピエントの年齢、性別、健康状態、重量、存在する場合は同時に行う治療、治療の頻度及び所望する効果の性質にも依存する。具体的な用量、レジメン及び投与手段は、担当医師又は他の当業者によって決定される。

以降、本発明を以下の非限定的な例によって例示する。

ＢＡＰＴＡのアルキル又はアルキルアリールジエステル及びその塩の合成
１，２−ビス（２アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＤＰ−ＢＡＰＴＡ）のいくつかのジエステルの二ナトリウム又はカルシウム塩の合成を、以下のような３つのステップで実施した。
ステップ１．ＢＡＰＴＡの酸無水物の調製：

ステップ２．ＢＡＰＴＡジエステルの調製：

ステップ３．ＢＡＰＴＡのジエステルの二ナトリウム又はカルシウム塩の調製：

ステップ１．ＢＡＰＴＡ無水物の調製
ＢＡＰＴＡ（２４ｇｒ．、０．０５ｍｏｌ）、ピリジン（８ｇｒ．、０．１ｍｏｌ）及び無水酢酸（９５ｍｌ、１．０ｍｏｌ）を、逆流冷却器（水冷）及び磁気攪拌機を備えた丸底の一口フラスコ（５００ｍｌ）に入れた。磁気攪拌機によって激しく攪拌しながら反応混合物を９０℃で５時間加熱した。その後、温度を５０℃まで下げ、この温度でさらに１０時間加熱を続けた。１０時間の後、反応混合物を室温まで冷却し、濾過によって沈殿物を抽出した。その後、沈殿物を酢酸エチルで４回（それぞれの洗浄に５０ｍｌ）、エーテルで２回（それぞれの洗浄に６０ｍｌ）洗浄した。沈殿物を真空下、５０℃で６〜８時間乾燥させた。生成物はＢＡＰＴＡ無水物である。収率８０％（１７．６ｇ．）。白色固体。Ｍ．ｐ．１４８〜１４９℃。

解析：ＴＬＣ。化合物は解析中に分解した。

ステップ２．ＢＡＰＴＡのアルキル又はアリールジエステルの調製
ステップ１．のＢＡＰＴＡ無水物（１０ｇ、０．０２３Ｍｏｌ）及び対応する無水アルコール（３００ｍｌ）を、アルゴン雰囲気下で逆流冷却器及び磁気攪拌機を備えた丸底の一口フラスコに入れた。混合物を油浴中、９０℃（メチル及びエチルジエステルは７０℃）で激しく攪拌しながら加熱した。６時間後、約半分のアルコールが反応混合物から蒸留された（高分子アルコールは真空下で蒸留される）。得られた混合物を０℃まで冷却し、この温度で５〜８時間保った。真空下の濾過（ガラスフィルターＮ４）によって沈殿物を溶液から分離し、約４０ｍｌのエタノールで３〜４回洗浄し、次いで酢酸エチルで３回洗浄し（それぞれ１００ｍｌ）、最後にジエチルエーテルで３回洗浄した（それぞれ１５０ｍｌ）。生成物を真空下で８時間乾燥させた。

ＢＡＰＴＡの合成ジエステルの化学的／物理的な明細を以下に示す。

ＢＡＰＴＡのエチルジエステル。収率９０％（１１ｇ．）。白色粉末。Ｍ．ｐ．１６１〜１６２℃。ＴＬＣ解析。アルミニウムシート上のシリカゲル６０。溶出液はクロロホルム、メタノール、水の混合物（８０：２０：１．５ｖ／ｖ）である。表示には、クロマトグラムに指示薬スプレーを噴霧し、その後、３５０〜４００℃で焼いた。指示薬スプレーの組成は、４−メトキシベンズアルデヒド（１０ｍｌ）、エタノール（２００ｍｌ）、９８％のＨ_２ＳＯ_４（１０ｍｌ）及び氷酢酸（２ｍｌ）である。単一スポット。Ｒ_ｆ０．３。

ＢＡＰＴＡのプロピルジエステル。収率９０％（１１．５ｇ．）。白色粉末。Ｍ．ｐ．１８７℃。ＴＬＣ解析。ＢＡＰＴＡのジエチル及びジプロピルエステルの解析条件は類似している。単一スポット。Ｒ_ｆ０．３５。

ＢＡＰＴＡのイソプロピルジエステル。収率８０％（１０．２ｇ．）。白色粉末。Ｍ．ｐ．１８１〜１８２℃。ＴＬＣ解析。アルミニウムシート上のシリカゲル６０Ｆ_２５４。溶出液：クロロホルム：メタノール（６５：３０、ｖ／ｖ）。表示には、クロマトグラムに指示薬スプレーを噴霧し、その後、３５０〜４００℃で焼いた。指示薬スプレーの組成は、４−メトキシベンズアルデヒド（１０ｍｌ）、エタノール（２００ｍｌ）、９８％の硫酸（１０ｍｌ）及び氷酢酸（２ｍｌ）である。単一スポット。Ｒ_ｆ０．７２。

ＢＡＰＴＡのブチルジエステル。収率９０％（１２．１ｇ．）。白色粉末。Ｍ．ｐ．１８３℃。ＴＬＣ解析。ＢＡＰＴＡのジエチル及びジブチルエステルの解析条件は類似している。単一スポット。Ｒ_ｆ０．４２。

ＢＡＰＴＡのヘプチルジエステル。収率７０％（１０．８ｇ．）。白色粉末。Ｍ．ｐ．１４６〜１４７℃。ＴＬＣ解析。ＢＡＰＴＡのエチル及びヘプチルジエステルの解析条件は類似している。単一スポット。Ｒ_ｆ０．５０。

ＢＡＰＴＡのオクチルジエステル。収率７０％（１１．３ｇ．）。白色粉末。Ｍ．ｐ．１５５℃。ＴＬＣ解析。ＢＡＰＴＡのジエチル及びジオクチルエステルの解析条件は類似している。単一スポット。Ｒ_ｆ０．５５。

ＢＡＰＴＡのベンジルジエステル。収率７０％（１０．６ｇ．）。白色粉末。Ｍ．ｐ．１６１〜１６３℃。ＴＬＣ解析。ＢＡＰＴＡのエチル及びベンジルジエステルの解析条件は類似している。単一スポット。Ｒ_ｆ０．６４（ベンジルジエステルは、ジメチルホルムアミド溶液中でＴＬＣプレートにプロットした）。

ＢＡＰＴＡの２−（ジメチルアミノ）エチルジエステル。収率７０％（９．９５ｇ．）。白色粉末。Ｍ．ｐ．１２６〜１２７℃。ＴＬＣ解析。アルミニウムシート上のシリカゲル６０Ｆ_２５４。溶出液：クロロホルム：メタノール：水 ６０：４０：２ｖ／ｖ。単一スポット。Ｒ_ｆ０．２。

ステップ３ａ．ＢＡＰＴＡのジエステルのナトリウム塩の調製
対応するＢＡＰＴＡのアルキルジエステル（０．０１９Ｍｏｌ）を、磁気攪拌機を備えたエルレンマイヤーフラスコ（５００ｍｌ）に入れた。約２５０ｍｌのメタノールと水との混合物（１：１ｖ／ｖ）をエステルに加えた。エステルはこの溶液に溶けないので、この混合物を激しく攪拌した。水中のＮａＨＣＯ_３の濃縮溶液（０．０３８ｍｏｌ、３．１９ｇ．）又はＭｅＯＮａの濃縮溶液（０．０３８ｍｏｌ）を攪拌中の混合物に加え、５〜８時間後、混合物は透明になる。これは、アルキルジエステルが二ナトリウム塩へと変換されたことを示す。メタノール及び水を真空下で蒸発させた。得られた塩を、エタノール及びジエチルエーテルを用いた共沸蒸留によって乾燥させた。最後に、塩を真空下（５〜６ｍｍＨｇ）で８時間乾燥させた。

ＢＡＰＴＡのエチルジエステル、二ナトリウム塩。白色粉末。収率９５％（１０．４ｇ．）。元素分析。Ｃ_２６Ｈ_３０Ｏ_１０Ｎ_２Ｎａ_２。計算値：Ｃ ５４．１６％、Ｈ ５．２１％、Ｎ ４．８６％、Ｎａ ７．９８％。実測値：５４．１０％、Ｈ ５．２７％、Ｎ ４．６５％、Ｎａ ８．１０％。

ＢＡＰＴＡのプロピルジエステル、二ナトリウム塩。白色粉末。収率９５％（１０．９ｇ．）。元素分析。Ｃ_２８Ｈ_３６Ｏ_１０Ｎ_２Ｎａ_２。計算値：５５．６３％、Ｈ ５．６３％、Ｎ ４．６３％、Ｎａ ７．６１％。実測値：５４．７６％、Ｈ ６．１３％、Ｎ ４．４６％、Ｎａ ６．７３％。

ＢＡＰＴＡのブチルジエステル、二ナトリウム塩。白色粉末。収率９５％（１１．２ｇ．）。元素分析。Ｃ_３０Ｈ_３８Ｏ_１０Ｎ_２Ｎａ_２。計算値：Ｃ ５６．９６％、Ｈ ６．０１％、Ｎ ４．４３％、Ｎａ ７．２８％。実測値：Ｃ ５６．５０％、Ｈ ６．００％、Ｎ ４．２０％、Ｎａ ７．３０％。

ＢＡＰＴＡのヘプチルジエステル、二ナトリウム塩。白色粉末。収率９０％（１０．３ｇ．）。元素分析。Ｃ_３６Ｈ_５０Ｏ_１０Ｎ_２Ｎａ_２。計算値：Ｃ ６０．３３％、Ｈ ６．９８％、Ｎ ３．９１％、Ｎａ ６．４２％。実測値：Ｃ ５９．８８％、Ｈ ７．４９％、Ｎ ４．１２％、Ｎａ ６．７６％。

ＢＡＰＴＡのオクチルジエステル、二ナトリウム塩。白色粉末。収率９０％（１５．７ｇ．）。元素分析。Ｃ_３８Ｈ_５４Ｏ_１０Ｎ_２Ｎａ_２。計算値：Ｃ ６１．２９％、Ｈ ７．２６％、Ｎ ３．７６％、Ｎａ ６．１６％。実測値：Ｃ ６０．９０％、Ｈ ７．８１％、Ｎ ３．２６％、Ｎａ ６．５２％。

ステップ３ｂ．ＢＡＰＴＡのジエステルのカルシウム塩の調製
対応するＢＡＰＴＡのジエステル（１ｇ．）を、１Ｌのエタノールと水との混合物（７０：３０ｖ／ｖ）に溶かした。この溶液に等モルのＣａ（ＯＨ）_２を加えた。磁気攪拌機によって、得られた混合物を室温で２４時間攪拌した。その後、ＢＡＰＴＡのエチル、プロピル及びブチルジエステルの塩には、溶液をワットマン紙Ｎ１で濾過し、真空下（２０〜３０ｍｍＨｇ）で蒸発させて乾固させた。沈殿物をジエチルエーテルで３回洗浄し（各回１００ｍｌ）、真空下（２〜３ｍｍＨｇ）、室温で６時間乾燥させた。ＢＡＰＴＡのヘプチル及びオクチルジエステルのカルシウム塩には、エタノール溶液を蒸発させて乾固させた。沈殿物を０．８Ｌのエタノールに溶かした。得られた混合物をワットマン紙Ｎ１で濾過し、その後、真空下（２０〜２５ｍｍＨｇ）でエタノールを蒸発させた。沈殿物ジエチルエーテルで３回洗浄し（各回１００ｍｌ）、真空下（２〜３ｍｍＨｇ）、室温で６〜７時間乾燥させた。

ＢＡＰＴＡのエチルジエステル、カルシウム塩。白色粉末。収率９０％（０．９６ｇ．）。Ｃ_２６Ｈ_３０Ｎ_２Ｏ_１０Ｃａ。計算値：Ｃ ５４．７０％、Ｈ ５．２６％、Ｎ ４．９１％、Ｃａ ７．０１％。実測値：Ｃ ５４．３２％、Ｈ ５．４０％、Ｎ ４．８１％、Ｃａ ６．８１％。

ＢＡＰＴＡのプロピルジエステル、カルシウム塩。白色粉末。収率９０％（０．９８ｇ．）。Ｃ_２８Ｈ_３４Ｎ_２Ｏ_１０Ｃａ。計算値：Ｃ ５６．１９％、Ｈ ５．６８％、Ｎ ４．６８％、Ｃａ ６．６９％。実測値：Ｃ ５６．２２％、Ｈ ５．８８％、Ｎ ４．５１％、Ｃａ ６．５１％。

ＢＡＰＴＡのブチルジエステル、カルシウム塩。白色粉末。収率９０％（０．９０ｇ．）。Ｃ_３０Ｈ_３８Ｎ_２Ｏ_１０Ｃａ。計算値：Ｃ ５７．５０％、Ｈ ６．０７％、Ｎ ４．４７％、Ｃａ ６．３９％。実測値：Ｃ ５７．１８％、Ｈ ６．２４％、Ｎ ４．２８％、Ｃａ ６．１１％。

ＢＡＰＴＡのヘプチルジエステル、カルシウム塩。白色粉末。収率８０％（０．８５ｇ．）。Ｃ_３６Ｈ_５０Ｎ_２Ｏ_１０Ｃａ。計算値：Ｃ ６１．７１％、Ｈ ７．１４％、Ｎ ４．００％、Ｃａ ５．７１％。実測値：Ｃ ６１．４４％、Ｈ ７．２４％、Ｎ ４．１８％、Ｃａ ６．３１％。

ＢＡＰＴＡのオクチルジエステル、カルシウム塩。白色粉末。収率８０％（０．８３ｇ．）。Ｃ_３８Ｈ_５４Ｎ_２Ｏ_１０Ｃａ。計算値：Ｃ ６１．７９％、Ｈ ７．３２％、Ｎ ３．７９％、Ｃａ ５．４２％。実測値：Ｃ ６１．９４％、Ｈ ７．１４％、Ｎ ４．００％、Ｃａ ５．３１％。

モノ−、ジ−及びトリエチレングリコールのアルキル若しくはアルキルアリールエーテルのＢＡＰＴＡジエステル又はその塩の合成
エチレングリコールのアルキル又はアルキルアリールエーテルの塩を合成する手順は、ＢＡＰＴＡのアルキルジエステルの塩を調製する手順に類似の４ステップの方法である。

ステップ１．ＢＡＰＴＡ無水物の調製
ＢＡＰＴＡ無水物を得るための第１ステップは、上記実施例１に記載したＢＡＰＴＡのアルキルジエステルを合成する手順のステップ１と同じである。

ステップ２．モノ−、ジ−及びトリエチレングリコールのモノアルキルエーテルの合成
モノ−、ジ−及びトリエチレングリコールのモノアルキルエーテルの合成は、以下のスキームに従って行う：
Ｈ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｍＯＨ＋Ｎａ→Ｈ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｍＯＮａ＋１／２Ｈ_２
Ｈ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｍＯＮａ＋Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１Ｂｒ→Ｈ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｍＯＣ_ｎＨ_２ｎ＋１＋ＮａＢｒ
例えば、ｍ＝１〜３、ｎ＝５〜１８

約０．８〜０．９ｇ．のナトリウム（それぞれの小片の直径が５〜８ｍｍとなるように切断）をアルゴン雰囲気下で、逆流冷却器及び磁気攪拌機を備えた二口の丸底フラスコ（２５０ｍｌ）に入れた。エチレングリコール（３５ｍｌ、０．６２Ｍｏｌ）を、やはりアルゴン下でナトリウムに加え、フラスコを油浴中、７０℃で激しく攪拌しながら加熱した。ナトリウムのほとんどが溶けたら、残りのナトリウム（ナトリウムの典型的な量は３．９ｇ．、０．１７Ｍｏｌである）を１片ずつ反応混合物に加えた。ナトリウムの溶解は反応混合物の温度の上昇及び反応速度の増加を伴うことに注意されたい。爆発を避けるために、反応が十分に制御されるようにナトリウムをゆっくりと加えることが必要である。すべてのナトリウムが溶けた後、テトラヒドロフラン（６０ｍｌ）中の対応する臭化アルキル（２１．５ｇ．、０．１２Ｍｏｌ）の溶液を含む滴下漏斗を反応フラスコに加えた。滴下漏斗からの溶液を１滴ずつ反応フラスコに入れた。反応混合物の温度は７０℃に保った。ほぼ瞬時に臭化ナトリウムの沈殿物が現れ、反応中に量が増えた。１６時間後に反応混合物を室温まで冷却し、有機溶液に約１５０ｍｌの水を加えた。２回の酢酸エチル（それぞれ４０ｍｌ）によって生成物を抽出した。合わせた酢酸エチル溶液を水で洗浄し、硫酸ナトリウムえ乾燥させた。酢酸エチル中の生成物の黄色溶液は、活性炭素と共に加熱することによって脱色される。濾過によって無色の溶液を炭素から分離し、溶媒を蒸発させた。得られた生成物を真空下で蒸留し、その物理的及び化学的特性について解析した。

エチレングリコールのモノヘプチルエーテル。無色液体。Ｂ．ｐ．９５℃／１ｍｍＨｇ。収率７０％（１３．４ｇ．）。
ＴＬＣ解析。アルミニウムシート上のシリカゲル６０Ｆ_２５４。溶出液：酢酸エチル：ｎ−ヘキサン、２：１ｖ／ｖ。指示薬：４−メトキシベンズアルデヒド（１０ｍｌ）、エタノール（２００ｍｌ）、９８％の硫酸（１０ｍｌ）及び氷酢酸（２ｍｌ）。表示には、クロマトグラムに指示薬スプレーを噴霧し、その後、３５０℃で焼いた。単一スポット。Ｒ_ｆ０．８。

ジエチレングリコールのヘプチルエーテル。無色液体。Ｂ．ｐ．１００℃／１ｍｍＨｇ。収率７０％（１７．１ｇ．）。
ＴＬＣ解析。モノ−及びジエチレングリコールのヘプチルエーテルの解析条件は類似している。単一スポット。Ｒ_ｆ０．４。

トリエチレングリコールのヘプチルエーテル。無色液体。Ｂ．ｐ．１０７℃／１ｍｍＨｇ。収率７０％（２０．８ｇ．）。
ＴＬＣ解析。モノ−及びトリエチレングリコールのモノヘプチルエーテルの解析条件は類似している。単一スポット。Ｒ_ｆ０．３。

オクチルモノエチレングリコール。無色液体。Ｂ．ｐ．６０℃／０．５ｍｍＨｇ。収率８５％。ＴＬＣ解析。エチレングリコールのジオクチルエーテルの解析条件は上記と同じである。単一スポット。Ｒ_ｆ０．７。

２−ベンジルオキシエタノール、２−ドデシルオキシエタノール、２−（２−ドデシルオキシエトキシ）−エタノール及び２−［２−（２−ドデシルオキシエトキシ）−エトキシ］−エタノールは、Ｆｌｕｋａ Ｃｏ．から購入した。

ステップ３．モノ−、ジ−及びトリエチレングリコールのモノアルキルエーテルのＢＡＰＴＡジエステルの合成
ステップ１のＢＡＰＴＡ無水物（１．５ｇ．、０．００３４Ｍｏｌ）及びステップ２のモノ−、ジ−又はトリエチレングリコールの対応するモノアルキルエーテル（１０〜１２ｍｌ）を、アルゴン雰囲気下で逆流冷却器及び磁気攪拌機を備えた丸底の一口フラスコ（５０ｍｌ）に入れた。混合物を油浴中、１１５〜１２０℃で激しく攪拌しながら加熱した。１〜１．５時間後に混合物は透明になる。反応が完了するまで、加熱をさらに１．５時間続けた。その後、フラスコを室温まで冷却し、約１００ｍｌの石油エーテル（Ｂ．ｐ．６０〜８０℃）を加えた。形成した沈殿物を遠心分離によって抽出し、石油エーテルで３回洗浄した（それぞれの洗浄に４０ｍｌ）。固形生成物を真空下で５時間乾燥させ、以下の化合物で例示するように、生成物の特性を検証するために解析した。

メチルエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステル。白色固体。Ｍ．ｐ．１５１〜１５２℃。収率９０％（１．８１ｇ．）。
ＴＬＣ解析。アルミニウムシート上のシリカゲル６０Ｆ_２５４。溶出液はクロロホルム：メタノール（１：１ｖ／ｖ）である。表示には、クロマトグラムに指示薬スプレーを噴霧し、その後、１００〜１５０℃で焼いた。指示薬スプレーの組成は、４−メトキシベンズアルデヒド（１０ｍｌ）、エタノール（２００ｍｌ）、９８％の硫酸（１０ｍｌ）及び氷酢酸（２ｍｌ）である。単一スポット。Ｒ_ｆ０．１４。

ヘプチルエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステル。白色固体。Ｍ．ｐ．１１１〜１１２℃。収率９０％（２．３２ｇ．）。
ＴＬＣ解析。ＢＡＰＴＡジエステルのヘプチルエチレングリコールのメチルエチレングリコール及びＢＡＰＴＡジエステルのＴＬＣ解析の条件は同じである。単一スポット。Ｒ_ｆ０．４。

オクチルエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステル。白色固体。Ｍ．ｐ．１２１〜１２２℃、収率８０％（１．４ｇｒ）。
ＴＬＣ解析。アルミニウムシート上のシリカゲル６０。溶出液はクロロホルム：メタノール（１：１、ｖ／ｖ）である。表示には、クロマトグラムに指示薬スプレーを噴霧し、その後、１００〜１５０℃で焼いた。指示薬スプレーの組成は、４−メトキシベンズアルデヒド（１０ｍｌ）、エタノール（２００ｍｌ）、９８％の硫酸（１０ｍｌ）、及び氷酢酸（２ｍｌ）である。単一スポット。Ｒ_ｆ０．４５。

ヘプチルジエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステル。白色固体。Ｍ．ｐ．９５〜９６℃。収率８５％（２．５ｇ．）。
ＴＬＣ解析。メチルエチレンのＢＡＰＴＡジエステル及びＢＡＰＴＡジエステルヘプチルジエチレングリコールの解析条件は同じである。単一スポット。Ｒ_ｆ０．４０。

ヘプチルトリエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステル。白色固体。Ｍ．ｐ．６３〜６５℃。収率８５％（２．７ｇ．）。
ＴＬＣ解析。ヘプチルトリエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステル及びメチルエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステルの解析条件は同じである。単一スポット。Ｒ_ｆ０．４０。

２−ベンジルオキシエタノールのＢＡＰＴＡジエステル。白色固体。収率８０％（２．０２ｇ．）。ＴＬＣ解析。２−ベンジルオキシエタノールのＢＡＰＴＡジエステル及びヘプチルエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステルのＴＬＣ解析の条件は同じである。単一スポット。Ｒ_ｆ０．５。

２−ドデシルオキシエタノールのＢＡＰＴＡジエステル。白色固体。収率８０％（２．４４ｇ．）。ＴＬＣ解析。２−ドデシルオキシエタノールのＢＡＰＴＡジエステル及びヘプチルエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステルのＴＬＣ解析の条件は同じである。単一スポット。Ｒ_ｆ０．５。

２−（２−ジオデシルオキシエトキシ）−エタノールのＢＡＰＴＡジエステル。白色固体。収率８０％（２．６８ｇ．）。
ＴＬＣ解析。２−（２−ドデシルオキシエトキシ）−エタノールのＢＡＰＴＡジエステル及びヘプチルエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステルのＴＬＣ解析の条件は同じである。単一スポット。Ｒ_ｆ０．５。

２−［２−（２−ドデシルオキシエトキシ）−エトキシ］−エタノールのＢＡＰＴＡジエステル。白色固体。収率７０％（２．３２ｇ．）。
ＴＬＣ解析。２−［２−（２−ドデシルオキシエトキシ）−エトキシ］−エタノールのＢＡＰＴＡジエステル及びヘプチルエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステルのＴＬＣ解析の条件は同じである。単一スポット。Ｒ_ｆ０．５。

ステップ４ａ．モノ−、ジ−又はトリエチレングリコールのモノアルキルエーテルのＢＡＰＴＡジエステルの二ナトリウム塩の調製。
モノ−、ジ−又はトリエチレングリコールのモノアルキルエーテルの対応するＢＡＰＴＡジエステル（０．００２５Ｍｏｌ）をメタノールに溶かし（１．０ｇ．のＢＡＰＴＡジエステルを溶かすためには約１０ｍｌのアルコールが必要である）、得られた溶液を、磁気攪拌機を備えたエルレンマイヤーフラスコ（５０ｍｌ）に入れた。炭酸水素ナトリウム水溶液（２ｍｌ中に０．００５Ｍｏｌ）をＢＡＰＴＡジエステルのメタノール溶液に加え、混合物を２時間、室温で混合した。その後、溶媒を真空下（３０ｍｍＨｇ）で蒸発させた。得られた沈殿物を、エタノールと３回、ジエチルエーテルと２回共沸蒸留させることによって乾燥させた。最後に、得られた生成物をヘキサンで洗浄し、真空下で乾燥させた。

メチルモノエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステル、二ナトリウム塩。白色固体。吸湿性。収率９５％（１．５ｇ．）。元素分析。Ｃ_２８Ｈ_３４Ｏ_１２Ｎ_２Ｎａ_２。計算値：Ｃ ５２．８０％、Ｈ ５．３５％、Ｎ ４．４０％、Ｎａ ７．２３％。実測値：５２．２０％、Ｈ ５．５９％、Ｎ ４．４９％、Ｎａ ７．３０％。

ヘプチルモノエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステル、二ナトリウム塩。白色固体。吸湿性。収率９５％（１．９ｇ．）。
元素分析。Ｃ_４０Ｈ_５８Ｏ_１２Ｎ_２Ｎａ_２。計算値：Ｃ ５９．７０％、Ｈ ７．２１％、Ｎ ３．４８％、Ｎａ ５．７２％。実測値：Ｃ ５９．６０％、Ｎ ７．７５％、Ｎ ３．５１％、Ｎａ ５．５１％。

ヘプチルジエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステル、二ナトリウム塩。白色固体。吸湿性。収率９５％（２．１ｇ．）。
元素分析。Ｃ_４４Ｈ_６６Ｏ_１４Ｎ_２Ｎａ_２。計算値：Ｃ ５９．１９％、Ｈ ７．４０％、Ｎ ３．１４％、Ｎａ ５．１６％。実測値：Ｃ ５８．５５％、Ｈ ７．４３％、Ｎ ３．４６％、Ｎａ ５．４９％。

ヘプチルトリエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステル、二ナトリウム塩。白色ろう。非常に吸湿性。収率９０％（２．２ｇ．）。
元素分析。Ｃ_４８Ｈ_７４Ｏ_１６Ｎ_２Ｎａ_２。計算値：Ｃ ５８．７７％、Ｈ ７．５５％、Ｎ ２．８６％、Ｎａ ４．６９％。実測値：Ｃ ５７．９８％、Ｈ ８．０３％、Ｎ ２．９４％、Ｎａ ４．６４％。

オクチルエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステル、二ナトリウム塩。白色固体。収率８０％。ＴＬＣ解析。アルミニウムシート上のシリカゲル６０。溶出液はクロロホルム：メタノール（１：１、ｖ／ｖ）である。表示には、クロマトグラムに指示薬スプレーを噴霧し、その後、１００〜１５０℃で焼いた。指示薬スプレーの組成は、４−メトキシベンズアルデヒド（１０ｍｌ）、エタノール（２００ｍｌ）、９８％の硫酸（１０ｍｌ）、及び氷酢酸（２ｍｌ）である。単一スポット。Ｒ_ｆ０．４５。

２−ベンジルオキシエタノールのＢＡＰＴＡジエステル、二ナトリウム塩。白色固体。吸湿性。収率９０％（１．９２ｇ．）。含水率は７．０％である。
元素分析。Ｃ_４０Ｈ_４２Ｎ_２Ｏ_１２Ｎａ_２・３Ｈ_２Ｏ。計算値：Ｃ ５７．０１％、Ｈ ５．７０％、Ｎ ３．３３％、Ｎａ ５．４６％。実測値：５６．４４％、Ｈ ５．９０％、Ｎ ３．４９％、Ｎａ ５．５０％。

２−ドデシルオキシエタノールのＢＡＰＴＡジエステル、二ナトリウム塩。白色固体。吸湿性。収率９０％（２．３ｇ．）。含水率は２．８％である。
元素分析。Ｃ_２８Ｈ_３４Ｎ_２Ｏ_１２Ｎａ_２・１．５Ｈ_２Ｏ。計算値：Ｃ ６１．７３％、Ｈ ８．３３％、Ｎ ２．８８％、Ｎａ ４．７３％。実測値：６１．３４％、Ｈ ８．４５％、Ｎ ２．７６％、Ｎａ ４．９９％。

２−（２−ドデシルオキシエトキシ）−エタノールのＢＡＰＴＡジエステル、二ナトリウム塩。白色固体。吸湿性。収率８５％（２．３５ｇ．）。含水率は４．３％である。
元素分析。Ｃ_５４Ｈ_８６Ｎ_２Ｏ_１４Ｎａ_２・２．５Ｈ_２Ｏ。計算値：Ｃ ６０．１５％、Ｈ ８．５１％、Ｎ ２．６０％、Ｎａ ４．２７％。実測値：５９．６８％、Ｈ ８．３３％、Ｎ ２．４６％、Ｎａ ４．７５％。

２［２−（２−ドデシルオキシエトキシ）−エトキシ］−エタノールのＢＡＰＴＡジエステル、二ナトリウム塩。白色固体。吸湿性。収率８５％（１．５ｇ．）。含水率は２．３％である。
元素分析。Ｃ_５８Ｈ_９４Ｎ_２Ｏ_１６Ｎａ_２・１．５Ｈ_２Ｏ。計算値：Ｃ ６０．６６％、Ｈ ８．４５％、Ｎ ２．４４％、Ｎａ ４．００％。実測値：６０．２０％、Ｈ ８．３２％、Ｎ ２．３２％、Ｎａ ４．３０％。

ステップ４ｂ．モノ−、ジ−又はトリエチレングリコールのモノアルキルエーテルのＢＡＰＴＡジエステルのカルシウム塩の調製。
ＢＡＰＴＡのモノ−、ジ−又はトリエチレングリコールジエステルの対応するモノアルキルエーテル（０．００２５Ｍｏｌ）を２５０ｍｌのメタノールに溶かした。この溶液に約３〜５ｍｌの水を加えた。得られた溶液を、磁気攪拌機を備えたエルレンマイヤーフラスコ（３００ｍｌ）に入れた。この溶液を激しく攪拌しながらＣａＨ_２の粉末（０．００２５Ｍｏｌ）を加えた。攪拌を室温で３時間続けた。３時間後、混合物を濾紙（ワットマンＮ１）で濾過し、得られた溶液を真空下（１０〜１５ｍｍＨｇ）で蒸発させた。沈殿物を、エタノールで３回（各回２５〜３０ｍｌ）、ジエチルエーテルで２回共沸蒸留させることによって乾燥させた。最後に、生成物をヘキサンで洗浄し、真空下（５ｍｍＨｇ）、室温で５時間乾燥させた。

ＢＡＰＴＡのメチルモノエチレングリコールジエステル、カルシウム塩。白色粉末。収率９０％（１．４２ｇ．）。Ｃ_２８Ｈ_３４Ｎ_２Ｏ_１２Ｃａ。計算値：Ｃ ５３．３３％、Ｈ ５．４０％、Ｎ ４．４４％、Ｃａ ６．３５％。実測値：Ｃ ５３．７４％、Ｈ ５．７８％、Ｎ ４．４３％、Ｃａ ５．９０％。

ＢＡＰＴＡのヘプチルモノエチレングリコールジエステル、カルシウム塩。白色粉末。収率９０％（１．７９ｇ．）。Ｃ_４０Ｈ_５８Ｎ_２Ｏ_１２Ｃａ。計算値：Ｃ ６０．１５％、Ｈ ７．２７％、Ｎ ３．５１％、Ｃａ ５．０１％。実測値：Ｃ ６０．３２％、Ｈ ７．６３％、Ｎ ３．５４％、Ｃａ ４．５９％。

ＢＡＰＴＡのオクチルモノエチレングリコールジエステル、カルシウム塩。白色粉末。収率９０％（１．８１ｇ．）。Ｃ_４２Ｈ_６２Ｎ_２Ｏ_１２Ｃａ。計算値：Ｃ ６１．０１％、Ｈ ７．５０％、Ｎ ３．３８％、Ｃａ ４．８４％。実測値：Ｃ ６１．００％、Ｈ ７．８２％、Ｎ ３．５４％、Ｃａ ４．８８％。

ＢＡＰＴＡのヘプチルジエチレングリコールジエステル、カルシウム塩。白色固体。収率８０％（１．７７ｇ．）。Ｃ_４４Ｈ_６６Ｎ_２Ｏ_１４Ｃａ。計算値：Ｃ ５９．５９％、Ｈ ７．４４％、Ｎ ３．１６％、Ｃａ ４．５１％。実測値：Ｃ ５９．６１％、Ｈ ７．７９％、Ｎ ３．１５％、Ｃａ ４．０４％。

ＢＡＰＴＡのメチルトリエチレングリコールジエステル、カルシウム塩。白色固体。収率８０％（１．６１ｇ．）。Ｃ_３６Ｈ_５０Ｎ_２Ｏ_１６Ｃａ。計算値：Ｃ ５３．６０％、Ｈ ６．２０％、Ｎ ３．４７％、Ｃａ ４．９６％。実測値：Ｃ ５３．９５％、Ｈ ６．３３％、Ｎ ３．２０％、Ｃａ ４．７３％。

ＤＰ−ＢＡＰＴＡはＣ６−グリオーマ細胞において基底活性及びＴＮＦα誘発性のＭＭＰ−９活性を低下させる
ＭＭＰ−９活性に対するＤＰ−ｂ９９の効果を、治療なし（基底活性）又はゼラチナーゼを誘発させる腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）を用いた治療の後に、培養Ｃ６グリオーマ細胞で試験した。

１００ｍｍのペトリ皿に増殖させたＣ６ラットグリオーマ細胞（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ−２１９９）をトリプシン処理によって剥離し、２４ウェルプレートで、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中で１ウェルあたり１０^５個の細胞の密度まで培養した。プレートに植えた次の日に、ゼラチナーゼを誘発させるために刺激したＴＮＦαで処理した細胞を、２０ｎｇ／ｍｌ又は４０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ、カタログ＃４１０−ＴＲＮＣ）のどちらかの存在下で１８時間、血清を含まないＤＭＥＭ中でインキュベートした。記載のように、０．４８％の脂肪酸を含まないＢＳＡ、０．４％のエタノール中の様々な濃度の試験化合物を細胞に加え、その後、細胞を合計１８〜２４時間、３７℃でインキュベートした。ベヒクルのみで処理した細胞を対照群とした。

その後、条件培地（ＣＭ）を採取し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。ＭＭＰゼラチナーゼ活性は、基質としてゼラチンを含むザイモグラムゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃ＥＣ６１７５）を用いて側定した。試料を６２．５ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ６．８、１０％のグリセロール、２％のＳＤＳ及び少量のブロモフェノールブルー中でゲルに載せた。ゲルをトリス／グリシン−ＳＤＳランニング緩衝液に流し込み、ｒｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３０分間洗浄し、ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｂｕｔｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でさらに３０分間洗浄した。ＭＭＰ活性は、新しいｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｂｕｔｔｅｒで、終夜３７℃で発現させた。その後、ゲルを１時間、４０％のメタノール及び７％の酢酸中のクマシーブルー（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ、Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｂ−８６４７）で染色し、３０％のメタノール／１０％の酢酸で脱染色した。ＭＭＰによって形成される消化ゼラチン領域（透明なバンドとして現れる）を、Ｋｏｄａｋ ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（商標）Ｉｍａｇｅ ｓｔａｔｉｏｎを用いて写真撮影した。バンド解析はＫｏｄａｋ ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（商標）１Ｄ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて側定した。処理は３重に行い、３つの個別のザイモグラムゲルに供した。

ＴＮＦαを用いた処理により、ＭＭＰ−９活性の３〜１０倍の増加が引き起こされることが判明した。加えたＤＰ−ＢＡＰＴＡ（２０μＭ）は、Ｃ６−グリオーマ細胞において基底及びＴＮＦα誘発性のＭＭＰ活性をどちらも阻害した。基底及びＴＮＦα誘発性のＭＭＰ−９活性に対する阻害率は、それぞれ約２５％及び６０％までであった。

ＤＰ−ＢＡＰＴＡはＴＮＦα誘発性ＭＭＰ−９の発現／放出を低下させ、酵素活性を阻害する
ＭＭＰ−９の総量及びその活性に対するＤＰ−ｂ１０９の効果を、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）で処理した後のヒトグリオーマ細胞系で試験した。

上記実施例３に記載した手順に従って、Ａ−１７２ヒトグリオーマ細胞（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ−１６２０）を増殖させ、０、２０又は５０μＭのＤＰ−ｂ１０９の存在下で１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処理した。ＴＮＦα治療なしでベヒクルで処理した細胞を対照群とした。各処理群からのＣＭを採取し、ザイモグラムゲル（実施例３の手順参照）、ＭＭＰ−９免疫アッセイ及びＭＭＰ−９活性アッセイに供した。

ＭＭＰ−９タンパク質の総量は、製造者の指示に従って、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（商標）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国、カタログ＃ＤＭＰ９００）キットを用いた免疫アッセイによって側定した。

ＭＭＰ−９活性は、活性ＭＭＰ−９型の量を定量するＭＭＰ−９活性アッセイ系（ＢｉｏＴｒａｋ（商標）、Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国、カタログ＃ＲＰＮ２６３４）を用いてアッセイした（ＢｉｏＴｒａｋキットの指示を参照）。

図１Ａは免疫アッセイの結果を示し、ＭＭＰ−９の合計量がＴＮＦαの存在下で約１０倍増加したことが実証されている。図１Ａは、ＤＰ−ｂ１０９が、用量に依存して採取した条件培地中で測定されるＭＭＰ−９タンパク質のレベルを低下させることを実証している。この低下は、ＭＭＰ−９の発現の低下、酵素の放出の低下、又は両方の組合せに起因し得る。

図１Ｂに見られるように、ＴＮＦαの存在下では、活性ＭＭＰ−９が３５％〜４０％増加した。加えたＤＰ−ｂ１０９の存在下では、この増加は基底レベル、すなわちＴＮＦαによる誘発が存在しない場合に測定されたＭＭＰ−９活性のレベルまで低下した。

結論：
ＭＭＰ−９活性に対するＤＰ−ＢＡＰＴＡの阻害効果が２つのレベル：ａ）タンパク質の発現／放出の低下、及びｂ）ＭＭＰ−９酵素活性の阻害で行われることが示された。

ＤＰ−ＢＡＰＴＡはＣ６−グリオーマ細胞においてＴＮＦα又はＰＭＡのどちらかによって誘発されるＭＭＰ−９活性を阻害する
ＴＮＦα又は１３−酢酸１２−ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）のどちらかで誘発させたＭＭＰ−９活性に対するＤＰ−ＢＡＰＴＡの効果を、Ｃ６グリオーマ細胞で試験した。細胞を２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ、カタログ＃４１０−ＴＲＮＣ）又は０．１μＭの１２−ミリスチン酸１３−酢酸ホルボール（ＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｐ−８１３９）のどちらかで刺激した以外は実施例３に記載のように、Ｃ６グリオーマ細胞を増殖させて処理した。

ＴＮＦα及びＰＭＡはどちらもＭＭＰ−９の分泌を約１０倍増加させたことが示された。様々な濃度のＤＰ−１０９の効果を試験した実験の結果を図２に示す。

図２に見られるように、ＤＰ−１０９はＴＮＦα又はＰＭＡのどちらかによって誘発されたＭＭＰ−９活性を用量に依存して低下させた。ＩＣ_５０の計算値はどちらの治療でも類似しており、ＩＣ_５０＝〜１０μＭであった。

ＭＭＰ−９の２つの異なる刺激剤、すなわちＭＭＰ−９活性の知られている誘発剤であるＴＮＦα及びタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化因子であるＰＭＡで得られたこれらの結果は、ＭＭＰ−９に対するＤＰ−ＢＡＰＴＡの阻害効果はＴＮＦα受容体との相互作用によるものではなく、それよりも下流で、ＭＭＰ−９の発現を遮断すること、又はＭＭＰ−９酵素活性を直接阻害することのどちらかによるものであることを示唆している。

ＢＡＰＴＡ及びＢＡＰＴＡ−ＡＭと比較したＭＭＰ−９活性に対するＤＰ−ＢＡＰＴＡの効果
いくつかのＤＰ−ＢＡＰＴＡ分子をＭＭＰ−９活性に対するその効果についてスクリーニングし、関連するキレート化化合物である１，２−ビス（２アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）及びその親油性類似体である１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸アセトキシメチルエステル（ＢＡＰＴＡ−ＡＭ）の効果と比較した。

Ｃ６グリオーマ細胞をプレートに植え、記載のように試験化合物を存在させて又は存在させずに、上記実施例３に記載したプロトコルに従って２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処理した。試験したＤＰ−ＢＡＰＴＡ、ＢＡＰＴＡ又はＢＡＰＴＡ−ＡＭのそれぞれを１、５、１０及び２０μＭの最終濃度で加えた。ベヒクルのみで処理した細胞を対照とした。

アッセイは３重に行い、ザイモグラム解析は上記実施例３に記載のように実施した。試験したそれぞれのＤＰ−ＢＡＰＴＡ化合物のＩＣ_５０値を計算した。結果を表１に要約する。

ｎ．ｄ．−検出されず

結論：
試験化合物のうち最も強力な阻害剤は、１，２−ビス（２アミノフェノキシ）エタン，Ｎ，Ｎ’−ジ（酢酸２−ベンジルオキシエチル），Ｎ，Ｎ’−酢酸、二ナトリウム塩［ＤＰ−ｂ４４０］及び１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン，Ｎ，Ｎ’−ジ（酢酸２−オクトデシルオキシエチル），Ｎ，Ｎ’−二酢酸、二ナトリウム塩［ＤＰ−ｂ１０９］であり、ＩＣ_５０の計算値はそれぞれ１２μＭ及び１０〜２０μＭであった。

親キレート化化合物、すなわちＢＡＰＴＡはＭＭＰ−９活性に影響を与えなかったことに注目することが重要である。関連するテトラエステルＢＡＰＴＡ類似体、すなわちＢＡＰＴＡ−ＡＭは、使用した試験モデル系（ＴＮＦαで刺激したＣ６グリオーマ細胞）でＭＭＰ−９活性を低下させるよりもむしろ増加させた。

ＤＰ−ＢＡＰＴＡは一次培養グリア細胞においてＭＭＰ−９活性を阻害する
刺激していないＭＭＰ−９（基底活性）に対するＤＰ−ＢＡＰＴＡ分子の効果及びＴＮＦαによって誘発されるＭＭＰ−９の活性化を阻害するその能力を、一次グリア細胞で試験した。

ラット胚（妊娠１８日目）由来の皮質グリア細胞をポリ−Ｄ−リシンでコーティングした２４ウェルプレートに、５％のＦＣＳ、５％のＨＳ、２ｍＭの１−グルタミン及び０．６％のグルコースを含むＭＥＭ培地と共に、１ウェルあたり５×１０^４個の細胞の密度で播種した。４日間培養した後、培地をＭＥＭ＋１０％のＦＣＳに交換した。グリア細胞が集密に到った後（播種後約１７日）、ＭＭＰ−９を誘発させるためにこれらを１０ｎｇ／ｍｌ又は２０ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦαに２４時間曝した。誘発は、５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（実質的に脂肪酸を含まない）を含む血清を含まない培地中の２５μＭのＤＰ−ｂ９９（クエン酸ナトリウム緩衝液中の５ｍＭストックから培地で１：２００に希釈）を存在させて又は存在させずに行った。条件培地（ＣＭ）を採取し、それぞれの３つ組の１２μｌを、上記実施例３に記載のように個別のザイモグラムゲルに供した。

対照（刺激していない）グリア細胞及びＤＰ−ｂ９９を用いて又は用いずに１０又は２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処理した培養物からの条件培地（ＣＭ）におけるＭＭＰ−９活性の代表的なザイモグラムを図３に示す。

図３Ａに見られるように、ＭＭＰ−９の２つの型をゲルで分離した。上方のバンドはより高い分子量を有するｐｒｏ−ＭＭＰ−９を表し、下方のバンド（より低い分子量）は酵素の生物学的に活性のある型を表す。

酵素のｐｒｏ型及び活性型を表すＭＭＰ−９バンドの定量解析を、３重のザイモグラムで行った。結果を対照値の％（＝１００％）に正規化し、それぞれ酵素の生物学的に活性のある型及びｐｒｏ−ＭＭＰ−９型を表す図３Ｂ及び３Ｃに示す。

結果は明らかに、刺激していない細胞では、ＤＰ−ｂ９９が消滅した活性ＭＭＰ−９のバンドの量に基づきｐｒｏ−ＭＭＰ−９のバンド強度を増大させたことを実証している。ＴＮＦαで処理した細胞では、ＭＭＰ−９のｐｒｏ型及び活性型のどちらもが低下した。

結論：
グリア細胞において基底ＭＭＰ−９活性に対するＤＰ−ｂ９９の阻害効果は、活性ＭＭＰ−９型の量に基づくＰｒｏ−ＭＭＰ−９のバンド強度の増大が示されたことによって実証された。ＴＮＦαで処理した細胞では、ＤＰ−ｂ９９は酵素のｐｒｏ型及び活性型をどちらも低下させた。

グリア細胞からのＴＮＦαの放出に対するＤＰ−ＢＡＰＴＡの効果
一次グリア細胞のリポ多糖（ＬＰＳ）を用いた刺激に応答したＴＮＦαの放出レベルに対する様々なＤＰ−ＢＡＰＴＡ分子の効果を測定した。

皮質ラットグリア細胞を上記実施例７に記載のようにプレートに植えた。グリア細胞が集密に到った後（接種後１７日）、これらを、血清を含まない培地中の２０μＭのＤＰ−ｂ９９、ＤＰ−ｂ１０９、ＤＰ−ｂ４５８、ＤＰ−ｂ４４０、ＤＰ−ｂ４６０又はＤＰ−ｂ４６４（＝１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン，Ｎ，Ｎ’−ジ｛酢酸２−［２−（２−ドデシルオキシエトキシ）エトキシ］−エチル｝，Ｎ，Ｎ’−二酢酸）を存在させて又は存在させずに、０．５μｇ／ｍｌのＬＰＳ（大腸菌０１１１：Ｂ４、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ＃４３７６２７）に１８時間に曝した。ＣＭを採取し、ＥＬＩＳＡアッセイ（ＤｕｏＳｅｔ、Ｒ＆Ｄ、カタログ＃ＤＹ５１０）を使用してＴＮＦαの存在について分析した。

図４に見られるように、ＬＰＳはＴＮＦαの放出を対照のレベルの約１０倍に増加させた。すべてのＤＰ−ＢＡＰＴＡ試験化合物がこの増加を阻害した。

結論：
様々なＤＰ−ＢＡＰＴＡ化合物が、グリア細胞においてＴＮＦαの放出の誘発を低下させるその能力について、様々な程度で有効であった。結果は、グリア細胞においてＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）の活性を遮断することにおけるＤＰ−ＢＡＰＴＡ分子の役割の可能性を示唆しており、したがって、神経炎症性プロセスの阻害又は妨害におけるこれらの分子の潜在的な使用を示している。

マクロファージからのＴＮＦαの放出に対するＤＰ−ＢＡＰＴＡの効果
リポ多糖（ＬＰＳ）を用いた刺激に応答したＴＮＦαの放出レベルに対するＤＰ−ＢＡＰＴＡの効果を、マクロファージ細胞系でも試験した。マウスマクロファージ細胞を１００ｍｍのペトリ皿に増殖させ、掻爬によって剥離し、２４ウェルプレートで、ＤＭＥＭ＋１０％のＦＣＳ中で１ウェルあたり約１０^５個の細胞の密度まで再培養した。４８時間後、細胞を、２０μＭのＤＰ−ＢＡＰＴＡを存在させて又は存在させずに、血清を含まない培地中の０．５μｇ／ｍｌのＬＰＳ（大腸菌０１１１：Ｂ４、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ＃４３７６２７）に１８時間曝した。条件培地をＴＮＦα解析用に採取し、ＥＬＩＳＡアッセイ（ＤｕｏＳｅｔ、Ｒ＆Ｄ、カタログ＃ＤＹ４１０）を用いて分析した。

マクロファージからのＴＮＦαの放出を阻害する様々なＤＰ−ＢＡＰＴＡ分子の能力は、末梢炎症性プロセスに関連する疾患及び状態を治療又は寛解することにおけるこれらの分子の潜在的な使用も示し得る。

ｉｎ−ｖｉｖｏでのＭＭＰ−９活性化に対するＤＰ−ｂ９９の効果
ｉｎ−ｖｉｖｏでのＭＭＰ−９活性に対するＤＰ−ＢＡＰＴＡの効果を試験するために、以下の脳虚血のモデル系及び以下のプロトコルを用いた。

６匹のスプラーグ−ドーリー（ＳＤ）ラットに一側性（右半球）中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）を２時間施した。３匹の動物に、０．０２％のクエン酸ナトリウム中の５μｇ／ｋｇのＤＰ−ｂ９９を生理食塩水中で単一用量でｉ．ｐ．投与し、次いで２時間再灌流を行った。残りの３匹の動物はＤＰ−ｂ９９の代わりにベヒクルで治療した。さらなる治療なしに手術のみを行った１匹のラットを偽対照として使用した。

７匹のラットを２４時間後に屠殺し、それらの脳の各半球を個別に溶解に供し、酵素活性用に抽出した。脳を細かく刻み、最終濃度４００ｍｇ／ｍｌで溶解緩衝液（２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１％のＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０（Ｓｉｇｍａの非イオン性洗剤）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．５Ｕ／ｍｌのアプロチニン、０．０１％のアジ化ナトリウム）に溶かした。調製物を２４時間４℃でインキュベートした後、溶解液を１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を採取した。

タンパク質濃度はブラッドフォードアッセイによって側定し、各溶解液から４０μｇのタンパク質をゼラチンザイモグラムゲルに載せてＭＭＰ−９レベルを決定した。ゲルを４８時間展開させた。ゲルの定量解析は、実施例３に記載のＫｏｄａｋ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｙｓｔｅｍ及びＫｏｄａｋ １Ｄソフトウェアを用いて行った。結果を図５に示す。

偽手術を行ったラットの２つの半球で同レベルのＭＭＰ活性が測定された。ＭＣＡＯを施したラットでは、予想どおり、ＭＭＰ−９活性の誘発が右（Ｒ−損傷）半球で実証され、左（Ｌ−無治療）半球では顕著な増加は観察されなかった。

図５に見られるように、ＤＰ−ｂ９９を用いた治療によりＭＭＰ活性のこの誘発が阻害された。ＤＰ−ｂ９９で治療したラットのＲ／Ｌ比の計算値は３．０であった。これに対し、ベヒクルで治療したラットではＲ／Ｌ＝４．９であった。

ＤＰ−ｂ９９によって阻害されたＭＭＰ−９とは対照的に、試験した他のゼラチナーゼ、すなわちＭＭＰ−２の活性レベルはＤＰ−ｂ９９を用いた治療によって影響を受けなかったことに注目することが重要である。

結論：
ＤＰ−ｂ９９は、ラットにおいて局所脳虚血によって誘発されたＭＭＰ−９活性を低下させた。このｉｎ−ｖｉｖｏ検査の結果は、ＤＰ−ＢＡＰＴＡがＣ６及びＡ−１７２グリオーマ細胞並びに一次グリア細胞で誘発されたＭＭＰ−９活性を低下させることを示したｉｎ ｖｉｔｒｏ実験（実施例３〜７）の結果と相関する。これらの発見は、ＤＰ−ＢＡＰＴＡがｉｎ ｖｉｖｏでＭＭＰ−９活性を阻害することができることを示しており、したがって、傷害を与える神経炎症性プロセスを妨害するのに有用であり得ることを示している。

ＤＰ−ｂ−９９は一次皮質ニューロン中のカルパイン活性を阻害する
Ｈ_２Ｏ_２による酵素の活性化に次いで一次皮質ニューロン中のカルパイン活性を評価した。カルパイン活性は、カルパインの基質α−スペクトリンの、２８０ｋＤａの完全長タンパク質から１５０ｋＤａの分解生成物へのタンパク質分解を監視することによって測定した。

培養物の調製：一次皮質ニューロンは、１６〜１７日目の胚性（Ｅ１６−１７）ラット胎児の脳から調製した。１匹の母親からの胚由来の細胞を、０．５ｍＭのグルタミン、０．４ユニット／ｍｌのペニシリン、０．４μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及びＢ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｌａｓｇｏｗ、スコットランド）、並びに２５μＭのグルタミン酸を含む３００ｍｌの「一次培地」（ＮＢＭ Ｇｉｂｃｏ、Ｇｌａｓｇｏｗ、スコットランド）に再懸濁させた。細胞（〜３×１０^５個／ｍｌ）を、生存度アッセイには１ウェルあたり１ｍｌで２４ウェルプレートに播種し、カルパイン活性の解析には１ウェルあたり４ｍｌで６ウェルプレートに播種した。３〜４日毎に培地の半分を新しい「一次培地」に交換した。５〜７日以降に細胞を実験に用いた。

酸化的ストレスの誘発：使用直前にＰＢＳで調製した１０ｍＭの溶液から、Ｈ_２Ｏ_２を指示した濃度で「一次培地」中の細胞に加えた。１８〜２４時間後に生存度を決定した。酸化的ストレスを誘発させる１〜２時間前にＤＰ−ｂ９９を培地に加えた。

カルパイン活性のアッセイ：６ウェルプレート中の一次皮質ニューロンを１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのトリス ｐＨ ７．５；１５０ｍＭのＮａＣｌ；０．５％のＤＯＣ；１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００；０．１％のＳＤＳ；１ｍＭのＮａｐｐｉ；２ｍＭのＥＤＴＡ）及びプロテアーゼ阻害剤（Ｂｏｈｒｉｎｇｅｒ、Ｍａｎｈｅｉｍ、ドイツ）に溶解した。氷上で１０分間インキュベートした後、２０，０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離することによって溶解液を清澄にした。製造者の指示に従って、１０〜５０μｇのタンパク質を含む試料を４〜１２％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｕ−ＰＡＧＥ、ＮＯＶＥＸ、ＭＥＳ緩衝液を含む）で分離し、ニトロセルロース紙にブロットした。α−スペクトリンの様々な型を検出するために、ブロットを抗スペクトリン抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＦＧ６０９０ １：１０００）と、次いでＨＲＰ二次抗体（米国Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）と反応させ、次いでＥＣＬ反応（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ）を行った。バンドの検出はＩｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ４４０（Ｋｏｄａｋ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて行った。切断されていないスペクトリンは〜２８０ｋＤａであり、カルパインで切断された型は〜１５０ｋＤａであった。バンドの定量はＫｏｄａｋ １Ｄソフトウェアを用いて行った。

上述の実験系では、カルパインで切断した生成物は、Ｈ_２Ｏ_２を加えた２時間後に現れ、４時間後で最大レベルに達することが判明した。

カルパイン活性に対するＤＰ−ｂ９９の効果は、Ｈ_２Ｏ_２に誘発されたスペクトリンの切断を監視することによってＨ_２Ｏ_２を加えた４時間後に検査した。皮質一次細胞は、Ｈ_２Ｏ_２（５０μＭ）を加えた１時間に、ＤＰ−ｂ９９（１５μｇ／ｍｌ）又は市販のカルパイン阻害剤ＭＤＬ２８１７０（２５μＭ）で前処理した。カルパイン活性は、上述の「カルパイン活性」アッセイを用いることによって決定した。

図６に見られるように、ＤＰ−ｂ９９はカルパイン活性を知られているカルパイン阻害剤ＭＤＬ２８１７０と同様の程度に阻害した。ＤＰ−ｂ９９による％阻害は、様々な実験で４０％の〜６０％であった。

結論：
ＤＰ−ｂ９９は、Ｈ_２Ｏ_２に誘発されるカルパイン活性を市販のカルパイン阻害剤ＭＤＬ２８１７０と同様に阻害した。

ＤＰ−ｂ−９９はｉｎ ｖｉｖｏにおいて、誘発されたスペクトリンの切断を阻害する
カルパイン活性に対するＤＰ−ｂ９９の効果を、ラットの過渡的局所脳虚血モデル系でｉｎ ｖｉｖｏで評価した。

４−０シリコーン被覆ナイロン単一繊維を外頚動脈にあてることによって、過渡的中大脳動脈（ＭＣＡ）閉塞を雄のスプラーグドーリー（ＳＤ）ラットに施した。動物を４％のハロタンで麻酔し、気管切開なしで自発的に呼吸させながら、亜酸化窒素及び酸素の１：２混合物中で１．５％のハロタンを維持した。腹側皮膚から、総右外頚動脈及び総右内頚動脈（ＥＣＡ）を曝露させた。結紮した右外頚動脈に、頚動脈の分岐に向かって逆方向に縫合を行った。その後、ＭＣＡの起点を恒久的に閉塞させるために、これを遠位に向かって右内頚動脈まで、頚動脈の分岐から２０ｍｍまで行った。これを絹の結紮糸で固定した。閉塞の２時間後、単一繊維を取り除いて再灌流させ、皮膚の創傷を縫合して洗浄した。すべての手順は約２５分かかり、直腸の温度は常に３７℃に維持された。

ＤＰ−ｂ９９を単一用量（５μｇ／ｋｇ）で再灌流の開始時に腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。ベヒクルのみをｉ．ｐ．注射した、ＭＣＡＯを施した動物を対照群とした。４時間後、動物を屠殺し、脳を２つの半球に切断し、即座に−８０℃で凍結した。

カルパイン活性のアッセイ：ホモジネートによって、各半球を個別に氷上で５ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのトリス ｐＨ ７．５；１５０ｍＭのＮａＣｌ；０．５％のＤＯＣ；１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００；０．１％のＳＤＳ；１ｍＭのＮａｐｐｉ；２ｍＭのＥＤＴＡ）及びプロテアーゼ阻害剤（Ｂｏｈｒｉｎｇｅｒ、Ｍａｎｈｅｉｍ、ドイツ）に溶解した。３，０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、次いで２０，０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離することによって溶解液を清澄にした。製造者の指示に従って、５０μｇのタンパク質を含む試料を４〜１２％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｕ−ＰＡＧＥ、ＮＯＶＥＸ、ＭＥＳ緩衝液を含む）で分離し、ニトロセルロース紙にブロットした。α−スペクトリンの様々な型を検出するために、ブロットを抗スペクトリン抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＦＧ６０９０ １：１０００）と、次いでＨＲＰ二次抗体（米国Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）と反応させ、次いでＥＣＬ反応（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ）を行った。バンドの検出はＩｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ４４０（Ｋｏｄａｋ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて行った。無治療のスペクトリンは〜２８０ｋＤａ、カルパインで切断された型は〜１５０ｋＤａであった。バンドの定量はＫｏｄａｋ １Ｄソフトウェアを用いて行った。

上述の実験系では、ＭＣＡＯを施した動物では、カルパインで切断されたスペクトリン（〜１５０ｋＤａのバンド）が、左（Ｌ、無治療）半球と比較して右（Ｒ、虚血性）半球で増加したことが判明した。偽手術を行った動物では、カルパインで切断されたスペクトリンの量は両半球で同等であった。

それぞれの動物（それぞれの治療でｎ＝２）におけるスペクトリンの切断された型の増加は、右（虚血性）及び左（無治療）半球中の１５０ｋＤａのスペクトリンバンドの比として表した。結果を表２に要約する。

表２に見られるように、一側性ＭＣＡＯを施した動物及びベヒクルのみで治療した動物における、左（Ｒ／Ｌ比）と比較した右半球でのカルパインに切断されたスペクトリンの増加は、偽手術を行った動物での比よりも約３倍高かった。ＤＰ−ｂ９９で治療した動物では、切断されたスペクトリンの増加は極めて低減され、偽手術を行った値の約５０％増でしかなかった。

結論：
ＤＰ−ｂ９９は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて虚血によって誘発されたカルパイン活性の増加を阻害する。ＤＰ−ｂ９９によるカルパイン阻害は、この分子が示す神経保護効果を少なくとも一部分担っているかもしれない。

本発明を具体的に記載したが、当業者は、多くの変形及び改変を行うことができることを理解されよう。したがって、本発明は具体的に記載した実施形態に限定されるものと解釈されるべきでなく、正確には、本発明の範囲、精神及び概念は添付の特許請求の範囲を参照することでより容易に理解できるであろう。

記載のように、２０μＭ又は５０μＭのＤＰ−ｂ１０９を存在させて又は存在させずに、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処理した培養Ａ−１７２−グリオーマ細胞から採取した条件培地中のＭＭＰ−９酵素の合計量を示す図である。 記載のように、２０μＭ又は５０μＭのＤＰ−ｂ１０９を存在させて又は存在させずに、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処理した培養Ａ−１７２−グリオーマ細胞から採取した条件培地中のＭＭＰ−９酵素活性の合計量を示す図である。 記載のように、様々な濃度のＤＰ−ｂ１０９を存在させて又は存在させずに、２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処理した培養Ｃ６−グリオーマ細胞から採取した条件培地中のＭＭＰ−９活性の検出に使用したゼラチン−ザイモグラムゲルを示す図である。透明なバンドとして示されたＭＭＰ−９及びＭＭＰ−２のプロテアーゼ活性の面積を矢印で示す。 記載のように、様々な濃度のＤＰ−ｂ１０９を存在させて又は存在させずに、０．１μＭのＰＭＡで処理した培養Ｃ６−グリオーマ細胞から採取した条件培地中のＭＭＰ−９活性の検出に使用したゼラチン−ザイモグラムゲルを示す図である。透明なバンドとして示されたＭＭＰ−９及びＭＭＰ−２のプロテアーゼ活性の面積を矢印で示す。 酵素の代表的なゼラチン−ザイモグラムゲルを示す図である。記載のように、２５μＭのＤＰ−ｂ９９を存在させずに（白いバー）又は存在させて（黒いバー）、１０又は２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処理したＣ６−グリオーマ細胞培養物から採取した条件培地をザイモグラムゲルに流した。矢印はゲル上のｐｒｏ−及び活性ＭＭＰ−９のバンドを表す。 酵素の生物学的に活性のあるＭＭＰ−９の形の解析を示す図である。記載のように、２５μＭのＤＰ−ｂ９９を存在させずに（白バー）又は存在させて（黒バー）、１０又は２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処理したＣ６−グリオーマ細胞培養物から採取した条件培地をザイモグラムゲルに流した。バンドの解析は、Ｋｏｄａｋ ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（商標）１Ｄ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて行った。 酵素のｐｒｏ−ＭＭＰ−９の形の解析を示す図である。記載のように、２５μＭのＤＰ−ｂ９９を存在させずに（白バー）又は存在させて（黒バー）、１０又は２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処理したＣ６−グリオーマ細胞培養物から採取した条件培地をザイモグラムゲルに流した。バンドの解析は、Ｋｏｄａｋ ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（商標）１Ｄ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて行った。 記載のように、様々なＤＰ−ＢＡＰＴＡ化合物を存在させて又は存在させずに、０．５μｇ／ｍｌのＬＰＳで処理した一次グリア細胞から放出されたＴＮＦαを示す図である。 一側性ＭＣＡＯを施したラットの脳の右（Ｒ−損傷）又は左（Ｌ−無治療）半球の溶解液のゼラチン−ザイモグラムゲルを示す図である。記載のように、再灌流の２時間後、動物を５μｇ／ｋｇのＤＰ−ｂ９９又はベヒクルのみのどちらかで処理した。 一側性ＭＣＡＯを施したラットの脳の右（Ｒ−損傷）又は左（Ｌ−無治療）半球の溶解液のＭＭＰ−９のバンドの解析（Ｂ）を示す図である。記載のように、再灌流の２時間後、動物を５μｇ／ｋｇのＤＰ−ｂ９９又はベヒクルのみのどちらかで処理した。 実施例１１に記載のように抗スペクトリン抗体と反応させた皮質一次細胞の溶解液のウエスタンブロットを示す図である。記載のように、酸化的ストレス（Ｈ_２Ｏ_２、５０μＭ）を導入する前に細胞をＤＰ−ｂ９９（１５μｇ／ｍｌ）又は市販のカルパイン阻害剤ＭＤＬ２８１７０（２５μＭ）のどちらかで１時間前処理した。スペクトリンの切断されていない（２８０ｋＤａ）及びカルパインで切断した（１５０ｋＤａ）形を矢印で示す。

Claims (31)

1. プロテアーゼ活性を阻害する方法であって、前記プロテアーゼがメタロプロテイナーゼ及びカルパインから選択され、細胞を、阻害に有効な量の一般式（Ｉ）の化合物：
   

   

   
   ［式中、
   Ｒは、１〜６個の酸素及び／又は窒素原子の任意の組合せによって中断されていてもよい（ただし、２つの酸素原子同士、又は酸素原子と窒素原子とは互いに直接連結されていない）１〜２８個の炭素原子を有する飽和又は不飽和アルキル、シクロアルキル、アリールアルキル又はシクロアルキル−アルキル基であり、Ｍは水素又は生理的に許容される陽イオンを表す］
   に曝露させることを含む方法。
2. Ｒがフェニルアルキルである、請求項１に記載の方法。
3. Ｒが０〜３個の酸素原子によって中断されているアルキルである、請求項１に記載の方法。
4. Ｒがモノ−、ジ−、又はトリ−エチレングリコールのモノアルキルエーテルである、請求項１に記載の方法。
5. Ｒが、Ｃ_８Ｈ_１７、Ｃ_８Ｈ_１７ＯＣＨ_２ＣＨ_２、Ｃ_１８Ｈ_３７、Ｃ_１８Ｈ_３７ＯＣＨ_２ＣＨ_２、ベンジル−ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２、Ｃ_１２Ｈ_２５ＯＣＨ_２ＣＨ_２、Ｃ_１２Ｈ_２５（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_２及びＣ_１２Ｈ_２５（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_３からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
6. 前記プロテアーゼがマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）である、請求項１に記載の方法。
7. 前記マトリックスメタロプロテイナーゼがＭＭＰ−９である、請求項６に記載の方法。
8. 前記プロテアーゼがカルパインである、請求項１に記載の方法。
9. 治療上有効な量の一般式（Ｉ）の化合物を含む薬剤組成物を、それを必要としている哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物においてＭＭＰに関連する疾患又は障害を予防、治療又は管理する方法。
10. 治療上有効な量の一般式（Ｉ）の化合物を含む薬剤組成物を、それを必要としている哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物においてカルパインに関連する疾患又は障害を予防、治療又は管理する方法。
11. 前記方法が、前記哺乳動物を追加の治療的処置で治療することをさらに含む、請求項９又は１０に記載の方法。
12. 前記哺乳動物がヒトである、請求項９から１１までのいずれか一項に記載の方法。
13. 前記ＭＭＰに関連する又はカルパインに関連する疾患又は障害が、癌、脳卒中、外傷、炎症性の状態及び疾患、アテローム性動脈硬化症、血栓性障害、関節炎、出血、リウマチ性疾患、自己免疫疾患、神経疾患及び障害、偏頭痛、脳血管及び心血管の障害からなる群から選択される、請求項９又は１０に記載の方法。
14. 前記炎症性の状態及び疾患が、関節炎疹、関節リウマチ、骨関節炎、再狭窄、喘息、乾癬、全身性エリテマトーデス、炎症性腸症候群、クローン病、偏頭痛、歯肉炎、歯周病、髄膜炎、熱帯性痙性不全対麻痺、敗血症、水疱性皮膚障害、ざ瘡及び感染症による炎症からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
15. 前記ＭＭＰに関連する又はカルパインに関連する疾患又は障害が虚血性又は低酸素組織損傷、酸化的損傷、骨粗鬆症、糖尿病、出血、眼病及び網膜症、糖尿病性網膜症、緑内障、黄斑変性症、白内障、網膜剥離及び網膜裂傷からなる群から選択される、請求項９又は１０に記載の方法。
16. 前記ＭＭＰに関連する又はカルパインに関連する疾患又は障害が、神経変性の疾患又は障害、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ギラン−バレー、パーキンソン病、ハンチントン病、ピック病、痴呆症候群、血管性痴呆、多発硬塞性痴呆、ＨＩＶ誘発性神経障害、脳虚血（全体及び局所虚血のどちらも）並びに神経組織の外傷からなる群から選択される、請求項９又は１０に記載の方法。
17. 治療上有効な量の一般式（Ｉ）の化合物を含む薬剤組成物を、それを必要としている患者に投与することを含む、メタロプロテイナーゼの活性の上昇に関連する癌を予防、治療又は管理する方法。
18. 前記癌が癌転移を含む請求項１７に記載の方法。
19. 患者に治療上有効な量の一般式（Ｉ）の化合物を投与することを含む、血管形成依存性の疾患に罹患している前記患者を治療する方法。
20. 前記血管形成依存性の疾患が、癌性腫瘍、関節炎、乾癬、黄斑変性症、慢性炎症及び糖尿病性網膜症から選択される、請求項１９に記載の方法。
21. 前記患者を追加の治療的処置で治療することをさらに含む、請求項１７から１９までのいずれか一項に記載の方法。
22. 前記追加の処置が、化学療法、照射療法、免疫療法、遺伝子治療及び手術から選択される、請求項２１に記載の方法。
23. 前記追加の処置を一般式（Ｉ）の化合物を含む薬剤組成物の投与と同時に実施する、請求項２１に記載の方法。
24. 前記追加の処置を一般式（Ｉ）の化合物を含む薬剤組成物の投与の前に行う、請求項２１に記載の方法。
25. 前記追加の処置を一般式（Ｉ）の化合物を含む薬剤組成物の投与の後に行う、請求項２１に記載の方法。
26. 前記一般式Ｉの化合物が、
    １，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン，Ｎ，Ｎ’−ジ（酢酸２−オクトキシエチル），Ｎ，Ｎ’−二酢酸、
    １，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン，Ｎ，Ｎ’−ジ（酢酸２−オクトデシルオキシエチル），Ｎ，Ｎ’−二酢酸、
    １，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン，Ｎ，Ｎ’−ジ（酢酸２−ベンジルオキシエチル），Ｎ，Ｎ’−酢酸、
    １，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン，Ｎ，Ｎ’−ジ（酢酸２−ドデシルオキシエチル），Ｎ，Ｎ’−二酢酸、
    １，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン，Ｎ，Ｎ’−ジ［酢酸２−（２−ドデシルオキシエトキシ）−エチル］，Ｎ，Ｎ’−二酢酸、及び
    １，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン，Ｎ，Ｎ’−ジ｛酢酸２−［２−（２−ドデシルオキシエトキシ）エトキシ］−エチル｝，Ｎ，Ｎ’−二酢酸
    からなる群から選択される、請求項９から２５までのいずれか一項に記載の方法。
27. メタロプロテイナーゼ及びカルパインから選択されるプロテアーゼの活性を阻害する医薬品を調製するための、一般式（Ｉ）の化合物の使用：
    

    

    
    ［式中、
    Ｒは、１〜６個の酸素及び／又は窒素原子の任意の組合せによって中断されていてもよい（ただし、２つの酸素原子同士、又は酸素原子と窒素原子とは互いに直接連結されていない）１〜２８個の炭素原子を有する飽和又は不飽和アルキル、シクロアルキル、アリールアルキル又はシクロアルキル−アルキル基であり、Ｍは水素又は生理的に許容される陽イオンを表す］。
28. 前記一般式（Ｉ）の化合物が、
    １，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン，Ｎ，Ｎ’−ジ（酢酸２−オクトキシエチル），Ｎ，Ｎ’−二酢酸、
    １，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン，Ｎ，Ｎ’−ジ（酢酸２−オクトデシルオキシエチル），Ｎ，Ｎ’−二酢酸、
    １，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン，Ｎ，Ｎ’−ジ（酢酸２−ベンジルオキシエチル），Ｎ，Ｎ’−酢酸、
    １，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン，Ｎ，Ｎ’−ジ（酢酸２−ドデシルオキシエチル），Ｎ，Ｎ’−二酢酸、
    １，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン，Ｎ，Ｎ’−ジ［酢酸２−（２−ドデシルオキシエトキシ）−エチル］，Ｎ，Ｎ’−二酢酸、及び
    １，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン，Ｎ，Ｎ’−ジ｛酢酸２−［２−（２−ドデシルオキシエトキシ）エトキシ］−エチル｝，Ｎ，Ｎ’−二酢酸
    からなる群から選択される、請求項２７に記載の使用。
29. 前記医薬品が、癌（転移癌を含む）、虚血性又は低酸素組織損傷、酸化的損傷、脳卒中、外傷、炎症性の状態及び疾患、出血、リウマチ性疾患、自己免疫疾患、神経疾患及び障害、心血管障害、脳血管並びに神経変性の疾患及び障害からなる群から選択されるＭＭＰに関連する又はカルパインに関連する疾患又は障害を治療するためのものである、請求項２７に記載の使用。
30. １，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン，Ｎ，Ｎ’−ジ（酢酸２−ベンジルオキシエチル），Ｎ，Ｎ’−酢酸である一般式（Ｉ）に記載の化合物。
31. 治療上有効な量の請求項３０に記載の化合物及び製薬上許容される担体又は賦形剤を含む薬剤組成物。

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