JP2006345811A - 超低増殖性細胞株 - Google Patents
超低増殖性細胞株 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006345811A JP2006345811A JP2005178385A JP2005178385A JP2006345811A JP 2006345811 A JP2006345811 A JP 2006345811A JP 2005178385 A JP2005178385 A JP 2005178385A JP 2005178385 A JP2005178385 A JP 2005178385A JP 2006345811 A JP2006345811 A JP 2006345811A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell line
- hemangiosarcoma
- mouse
- scid
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【解決手段】SCID(重症複合型免疫不全症)マウス皮下可植性ヒト血管肉腫より得た腫瘍細胞をマウス血管肉腫細胞株ISOS−1培養上清含有培地で培養し、トリプシン−EDTA処理によって剥離しない細胞株を選択し、得られた細胞株を剥離継代培養することを特徴とする(超)低増殖性細胞株の樹立方法、これによる細胞株及びこれを用いたライ菌の培養方法。
【選択図】なし
Description
ライ菌は試験管内で培養することはできず、抗ライ薬の効果を調べるためにはマウス足底部でのライ菌培養が用いられている。また、ライ菌はアルマジロに感染することが発見されており、ライ腫型ライ(LL型:ライ菌が最も増殖する臨床病型)の疾患モデルとしてライ研究に利用され、これを用いてライワクチンをつくることが試みられている。
染細胞として用いることも検討されてきたが、培養には成功していない。このように、in vitro培養が不可能であるという事情がハンセン病研究の遅れの大きな原因となっている。また、上述の通り、ハンセン病は現在でも多数の患者を有する感染症である。ハンセン病治療薬としてはサルファ剤や各種抗生物質が用いられており、耐性菌に対しては2〜3剤併用の多剤療法が行なわれているが、これらに対しては耐性菌が発生しており、有用な抗ライ薬のスクリーニング系が望まれている。
本発明者はこれらの点に着目し、生体内においてライ球形成(ライ腫型ライの良好な増殖形態とされる)が認められる血管内皮細胞から、増殖速度が低く、ライ菌の感染増殖に適した細胞株を樹立することを試みた。その結果、特定の方法を採ることにより低増殖性細胞株、特に超低増殖性細胞株が樹立され得ること、及び、この方法により得られた細胞株がライ菌の感染増殖に適していることを見出し、本発明を完成するに至った。
1.SCID(重症複合型免疫不全症)マウス皮下可植性ヒト血管肉腫より得た腫瘍細胞をマウス血管肉腫細胞株ISOS−1培養上清含有培地で培養し、トリプシン−EDTA処理によって剥離しない細胞株を選択し、得られた細胞株を剥離継代培養することを特徴とする低増殖性細胞株の樹立方法。
2.前記1に記載の方法において、マウス血管肉腫細胞株ISOS−1培養上清含有培地におけるマウス血管肉腫細胞株ISOS−1培養上清含有濃度を50%以下とする前記1に記載の低増殖性細胞株の樹立方法。
3.マウス血管肉腫細胞株ISOS−1培養上清含有濃度を20%以下とする前記2に記載の超低増殖性細胞株の樹立方法。
4.SCIDマウス皮下可植性ヒト血管肉腫に由来し、前記3に記載の方法により樹立された超低増殖性細胞株。
5.倍化時間が1000時間以上である前記4に記載の超低増殖性細胞株。
6.SCIDマウス皮下可植性ヒト血管肉腫WB−SCIDに由来する超低増殖性細胞株SLG/WB−SCID(平成17年6月8日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領番号FERM−ABP−10349号として寄託)。
7.前記4〜6のいずれかに記載の超低増殖性細胞株を宿主とすることを特徴とするライ
菌の培養方法。
はじめに、本発明による低増殖性細胞株の樹立方法について説明する。
本発明による低増殖性細胞株の樹立方法は、SCID(重症複合型免疫不全症)マウス皮下可植性ヒト血管肉腫より得た腫瘍細胞をマウス血管肉腫細胞株ISOS−1培養上清含有培地で培養し、トリプシン−EDTA処理によって剥離しない細胞株を選択し、得られた細胞株を剥離継代培養することを特徴とする。
SCID(severe combined immunodeficiency disease;重症複合型免疫不全症)マウスは、遺伝子再構成能に異常があるために成熟したBおよびT細胞が先天的に欠損したマウスであり、ヒト新生児でみられる遺伝性の重症複合型免疫不全症のモデル動物である。レシピエントとしてのSCIDマウスは、種々の系統が知られているが、本発明ではいずれも用いることができる。一方、ヒト血管肉腫は稀ではあるが致死性の高い腫瘍である。
SCIDマウス皮下可植性ヒト血管肉腫は、ヒト血管肉腫をSCIDマウスに移値して細胞樹立したものである。このようなSCIDマウス皮下可植性ヒト血管肉腫は、本発明者らにより樹立されており(Masuzawa M. et al.,摘valuation of recombinant interleukin-2 immunotherapy for human hemangiosarcoma in a SCID mice model(WB-SCID) J. Dermatol. Sci. 27(2):88-94,2001)、本発明でもこの腫瘍(WB−SCID)またはこれに準じて作製したSCIDマウス皮下可植性ヒト血管肉腫を用いることができる。以下の説明では、便宜上、このようにして得られるSCIDマウス皮下可植性ヒト血管肉腫をWB−SCID腫瘍細胞と呼ぶ。
もっとも、このようにして得られたWB−SCID腫瘍細胞は、それ自体低増殖性で、本発明では、かくして得られたWB−SCID腫瘍細胞についてトリプシン−EDTA処理を行なった後、これを機械的に剥離して培養する手法を繰り返して継代培養を行なう(本願において「剥離継代培養」と呼ぶ。)。これにより、より低増殖性の細胞株を得ることができる。剥離継代培養における機械的剥離操作としては接着細胞を穏やかかつ効果的に剥離するために慣用される剥離方法が利用できるが、典型的にはピペッティング操作が用いられる。剥離継代培養は通常10代以上、好ましくは100代以上行なう。
得られた細胞は密度依存性であり、密度が高いほど増殖が活発化する。
本発明による超低増殖性細胞株の樹立方法は、基本的には上記の低増殖性細胞株の樹立方法と同様であるが、初代培養時のマウス血管肉腫細胞株ISOS−1培養上清の添加濃度は好ましくは5〜20%程度とする。5%以下では成育せず死滅する。20%が最適である。また、インキュベータの設定温度を低くすることでより増殖性の低い細胞株が得られる。通常は37℃以下、好ましくは34℃以下とする。
このようにして得られる(超)低増殖性細胞株は、マウスCD31、GSA−1陽性であり、マウス内皮系細胞である。また、染色体はすべてマウス型で、最頻数は77である。しかし、ヒト/マウス両クラスI抗原を同時発現している。
また、低増殖性細胞株で倍化時間が50〜100時間程度、超低増殖性細胞株では、500時間を超え、1000時間以上、さらに1500時間以上の細胞株が得られる。このような細胞株としてSLG/WB−SCIDが得られ、平成17年6月8日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領番号FERM−ABP−10349号として寄託した。
上述のように、本発明による、低増殖性細胞株、特に超低増殖性細胞株は培養時間が1500時間以上であり、しかも、至適温度が34℃である。このため、倍化時間が約2週間(330時間)、至適温度が31〜34℃であるライ菌の培養に適している。
本発明による超低増殖性細胞株を用いてライ菌の培養を行なうには、SLG/WB−SCIDを34℃インキュベータでISOS−1培養上清20%添加の培地にて、75cm2培養フラスコでコンフルエントになるまで培養した時点で、ライ菌2〜5×107を添加して培養を続ける。
(1)マウス血管肉腫細胞株ISOS−1培養上清の作成
培地としてDMEM+10%FBS+2mM L−グルタミン+10mM Hepes+50μg/mlゲンタマイシンを用い、ISOS−1(Masuzawa M. et al., 忍stablishment of a new murine-phenotypic angiosarcoma cell line (ISOS-1) J. Dermatol. Sci., 16(2): 91-98, 1998)を1×106を175cm2フラスコで上記培地50ml中1週間培養した。フラスコがコンフルエントになり細胞数約1×108となった状態で培地を回収し、遠心(3000rpmで10分間)後、上清を−20℃凍結保存した。これを使用時37℃で解凍後、0.45μmフィルターで濾過して用いる。
SCIDマウス皮下可植性ヒト血管肉腫WB−SCID(Masuzawa M, et al., 摘valuation of recombinant interleukin-2 immunotherapy for human hemangiosarcoma in a SCID mice model(WB-SCID) J. Dermatol. Sci. 27(2):88-94,2001)の腫瘍を摘出した。
摘出腫瘍をシャーレに移し、生理食塩水内にて半割し、腫瘍中心半壊死組織より円刃を用いて擦過するようにして非酵素処理にて細胞遊出させた。遊出した細胞を遠心チューブに移し、遠心器にて4℃、1000rpmで遠心し、細胞を沈下させ上清を除去し、沈下した細胞層を分離した。
以後週に2回培地を交換し、培養開始1週間後、培地を除去し、生理食塩水で1回培養皿底を洗い、0.25%トリプシン−EDTA(GIBCO製)(以後、トリプシン−EDTAと略す)を適量加え10分間放置した。放置後、剥離した細胞を除去し、培養皿底に残存した細胞のみを生理食塩水で1回洗い、新たに新鮮な培地を加え継続培養した。上記の操作を週2回、計10回繰り返し、トリプシン−EDTA処理にて剥離する細胞がないことを確認し、トリプシン−EDTAで剥離しなかった細胞のみ培養を続けた。
1カ月後、培養皿底に観察される細胞コロニーをトリプシン−EDTAで1時間処理し、その後トランスファーピペットで約10分間ピペッティングして機械的に細胞を剥離した。剥離細胞を新たな培養皿に移し、培養を継続した。
培養皿内で増殖した細胞について上記の同様にピペッティングして機械的に細胞を剥離、剥離継代培養を繰り返した。
2ケ月後、紐状に長い細胞群が単層敷石状に安定して培養された。この細胞は密度依存性(細胞密度が高いほど増殖は活発化)に増殖した。
径35mm培養皿(9.6cm2)で培地2ml、培地交換週2回の培養条件で、105個の細胞を培養すると最も増殖する7日目から10日目でも、倍化時間は約70時間であり、低増殖性であった。
上記の培養条件で10日目以降に細胞は培養皿をほぼ覆い、唐草模様状に単層に増殖した。コンフルエントの状態に近づくと、細胞の剥離が起こった。
細胞数を減らして培養を繰り返すことで細胞は性状を変化せず、ゆっくり増殖を続けた。
得られた細胞は紐状で長い形態(長さ:約100〜250μm)である。また、得られた細胞を自動細胞分析装置(FACScan:Becton Dickinson社製)を用いCELLQuest解析ソフトでFACS解析したところ、マウスCD31、GSA−1陽性でマウス内皮系細胞であることが確認された。染色体はすべてマウス型で、71〜79に及び、最頻数は77であった。また、ヒト/マウス両クラスI抗原を同時発現しており、電顕的には高密度顆粒が多く、きわめて細胞小器官に富んでいた。この細胞はDMSO10%添加培地で凍結保存が可絶であった。
実施例1と同様にしてWB−SCID細胞を得た。(1)培地に添加するISOS−1培養上清の添加比率を50%から20%に低下させ、(2)CO2インキュベーターの温度設定を37℃から34℃に低下させた他は実施例1と同様の培養条件でこれを培養した。
この結果、変更前の条件でコンフルエントに達した細胞密度の約50%まで増殖した時点で細胞は超低増殖性となり、この時点での倍化時間は1500時間以上であった。
細胞の形状等は実施例1と同様であった。単一株をSLG/WB−SCIDとして、平成17年6月8日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した(受領番号FERM−ABP−10349号)。
上記のSLG/WB−SCID細胞株を75cm2培養フラスコを用いて34℃インキュベータでISOS−1培養上清20%添加の培地にて培養し、コンフルエントになった時点(細胞数約1.5×106)で、Thai53株ライ菌(国立感染症研究所ハンセン病研究センター)2〜5×107個を培地に混入させ、上記と同様の培養条件で培養を継続した。
チール・ネルセン染色、ヒトライ菌DNA特異的プライマーによるPCRで得られた細胞中のライ菌を確認し、さらにATP測定とヌードマウスの足蹠接種での腫瘤形成で生菌の確認を行なった。培養フラスコあたりの回収細胞を0.5%Triton−X100処理し、Shepard法により菌数を算定した。これによりライ菌の長期培養が可能であることが確認された。
Claims (7)
- SCID(重症複合型免疫不全症)マウス皮下可植性ヒト血管肉腫より得た腫瘍細胞をマウス血管肉腫細胞株ISOS−1培養上清含有培地で培養し、トリプシン−EDTA処理によって剥離しない細胞株を選択し、得られた細胞株を剥離継代培養することを特徴とする低増殖性細胞株の樹立方法。
- 請求項1に記載の方法において、マウス血管肉腫細胞株ISOS−1培養上清含有培地におけるマウス血管肉腫細胞株ISOS−1培養上清含有濃度を50%以下とする請求項1に記載の低増殖性細胞株の樹立方法。
- マウス血管肉腫細胞株ISOS−1培養上清含有濃度を20%以下とする請求項2に記載の超低増殖性細胞株の樹立方法。
- SCIDマウス皮下可植性ヒト血管肉腫に由来し、請求項3に記載の方法により樹立された超低増殖性細胞株。
- 倍化時間が1000時間以上である請求項4に記載の超低増殖性細胞株。
- SCIDマウス皮下可植性ヒト血管肉腫WB−SCIDに由来する超低増殖性細胞株SLG/WB−SCID(平成17年6月8日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領番号FERM−ABP−10349号として寄託)。
- 請求項4〜6のいずれかに記載の超低増殖性細胞株を宿主とすることを特徴とするライ菌の培養方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005178385A JP4652139B2 (ja) | 2005-06-17 | 2005-06-17 | 超低増殖性細胞株 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005178385A JP4652139B2 (ja) | 2005-06-17 | 2005-06-17 | 超低増殖性細胞株 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006345811A true JP2006345811A (ja) | 2006-12-28 |
JP4652139B2 JP4652139B2 (ja) | 2011-03-16 |
Family
ID=37642304
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005178385A Expired - Fee Related JP4652139B2 (ja) | 2005-06-17 | 2005-06-17 | 超低増殖性細胞株 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4652139B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009028705A1 (ja) * | 2007-08-31 | 2009-03-05 | School Juridical Person Kitasato Institute | ライ菌の体外培養法 |
CN113025558A (zh) * | 2021-02-23 | 2021-06-25 | 王姗 | 一种用于口腔黏膜癌前病变脱落细胞检测的辅助试剂 |
-
2005
- 2005-06-17 JP JP2005178385A patent/JP4652139B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6010067003, Journal of Dermatol. Sci., 1998, Vol.16, p.91−98 * |
JPN6010067004, 日本癌学会総会記事, 2004, Vol.63, p.522 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009028705A1 (ja) * | 2007-08-31 | 2009-03-05 | School Juridical Person Kitasato Institute | ライ菌の体外培養法 |
CN113025558A (zh) * | 2021-02-23 | 2021-06-25 | 王姗 | 一种用于口腔黏膜癌前病变脱落细胞检测的辅助试剂 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP4652139B2 (ja) | 2011-03-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101378874B1 (ko) | 태반 줄기세포를 이용한 면역 조절 | |
JP2017513477A5 (ja) | ||
CN103403150A (zh) | 利用羊膜来源贴壁细胞治疗与免疫相关的疾病和紊乱 | |
CN107949641A (zh) | 用于基因组编辑的crispr/cas9复合物 | |
CN1860222A (zh) | 用于临床和商业用途的干细胞 | |
JP6648259B2 (ja) | 向上された臍帯由来付着型幹細胞、その製造方法及びその用途 | |
CN106636210B (zh) | 转录因子组合诱导成纤维细胞转分化为类睾丸间质细胞的方法 | |
JP2021522860A (ja) | キメラ抗原受容体で修飾されたγδ T細胞を生産する方法 | |
CN110106201A (zh) | 一种可控永生化的逆转录病毒载体和人脐带间充质干细胞及其构建方法 | |
JP2017060422A (ja) | 成熟した心筋細胞を分化誘導させる方法 | |
CN111500578A (zh) | 调控ADSCs成骨分化及组织再生Circ RNA-FTO及其应用 | |
US9017657B2 (en) | Islet cell cluster produced from human umbilical cord mesenchymal stem cells | |
MX2011000993A (es) | Metodo para separar celulas madre activas de celulas madre humanas y celulas madre altamente activas separadas por el mismo. | |
KR101389851B1 (ko) | 신경능선줄기세포의 배양방법 및 그 용도 | |
CN114209814A (zh) | Tnfsf15蛋白在促进骨髓干细胞分化为巨噬细胞并扩增中的用途 | |
JP4652139B2 (ja) | 超低増殖性細胞株 | |
CN112138162B (zh) | 降低kat7含量或活性的物质在预防衰老和治疗肝纤维化中的应用 | |
CN108220243A (zh) | 一种多能干细胞及其分化的t细胞和应用 | |
JP2010046019A (ja) | ヒト羊膜由来間葉系細胞及びこれを用いた糖尿病治療薬 | |
WO2012026687A2 (ko) | 세포응집을 이용한 인간 혈액 유래 혈구 세포괴의 유도와 이를 이용한 혈중 성체줄기세포 및 전구세포의 증폭방법 및 상기의 방법에 의해 제조된 줄기세포 | |
CN107858322B (zh) | 一种海马原代细胞培养体系的建立方法 | |
RU2645255C1 (ru) | Способ получения биобезопасной культуры мезенхимальных стволовых клеток из ворсин хориона человека | |
CN111876383B (zh) | 一种类器官肺癌pdxo模型以及egfr工程化修饰及其在肿瘤药物药效学研究中的应用 | |
WO2018155952A9 (ko) | 인간 뇌 조직 유래 신경줄기세포의 고효율 분리 방법 | |
CN112941106A (zh) | 一种通过foxp1基因编辑和突变延缓间充质干细胞衰老的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20070705 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080328 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20101119 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20101214 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20101215 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131224 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |