JP2006325600A - 磁性細胞およびその使用方法 - Google Patents
磁性細胞およびその使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006325600A JP2006325600A JP2006196830A JP2006196830A JP2006325600A JP 2006325600 A JP2006325600 A JP 2006325600A JP 2006196830 A JP2006196830 A JP 2006196830A JP 2006196830 A JP2006196830 A JP 2006196830A JP 2006325600 A JP2006325600 A JP 2006325600A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- magnetic
- cells
- present
- cell
- acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
【解決手段】本発明によれば、間葉系細胞や軟骨培養細胞の表面と磁性粒子を結合させた磁性細胞を提供し、それを体内に投与し、外部から磁場を与えることにより、長期間病巣部位に該細胞を存置させることが可能となる。さらに、本発明に係る磁性細胞に薬物を包含させて、ドラックデリバリーシステムを構築することもできる。
【選択図】図1
Description
日本口腔外科学会誌1997年2月号 p55−61 バイオマテリアル2003年2月号 p113−119
を含む、磁性細胞の滞留方法を提供する。
(第一の実施態様)
本発明に係る磁性細胞は、細胞表面に存在する接着成分の利用に基づくものである。図1は、本発明の第一の実施態様における磁性細胞10の概略図を示す。この磁性細胞10は、核30を有する細胞20の表面に発現している糖蛋白質40を、リンカー50を介して結合させた磁性粒子60を含む。本発明で利用する糖蛋白質40としては、以下のものに限定されるわけではないが、CD44やHLAが好ましい。
(第二の実施態様)
図2は、本発明の第二の実施態様における磁性細胞の概略図を示す。本発明の第二の実施態様では、細胞表面に存在するインテグリン110と、そのインテグリンに対して接着活性を有するペプチド120を利用する。前記ペプチドとしては、以下のものに限定されるわけではないが、RGDS(アルギニン-グリシン-アスパラギン酸-セリンの四つのアミノ酸から構成されるペプチド、分子量433.42)を挙げることができる。
(磁性細胞の調製その1)
1.磁気ビーズの活性化
磁気ビーズであるフェリスフェア100C原液(50mg/ml)(日本ペイント製)から3mg相当(60μl)をとり、0.01NNaOHを加え、ミキサーで10分間、室温で攪拌して洗浄した。この洗浄操作をもう一度繰り返して、脱イオン水を加え、ミキサーで5分間、室温で攪拌して洗浄した。この洗浄操作を3回繰り返した。磁気ビーズを活性化させるため、余分な水分を除去後、予め25mM 2−[N−モルフォリノ]エタンスルホン酸(以下「MES」という)(SIGMA社製)、pH5.0で50mg/mlに調製していた1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(以下、「EDC」という。)(SIGMA社製)とN−ヒドロキシスクシンイミド(以下、「NHS」という。)(SIGMA社製)を50μlずつ、及び磁気ビーズをチューブ内でよく混合し、30分間、室温でゆっくりと転倒攪拌した。反応後のチューブをネオジム磁石の上に2分間置き、上清を除去した。最後に、25mM MES、pH5.0で2回洗浄し、最終的な溶液体積を40μlにした。
60μlの25mM MESでラットのCD44抗体(20μg)(CHEMICON社製)を溶解し、上記活性化ビーズに添加し、3時間、室温でゆっくりと転倒攪拌させ、活性化ビーズへ抗体を固定化した。反応後のチューブをネオジム磁石の上に2分間置き、上清を除去した。ビーズと反応していない抗体を除くため、リン酸緩衝液中の0.05Mエタノールアミンを添加し、1時間室温でゆっくり転倒攪拌した。固定化されたビーズを0.5%BSA(SIGMA社製)のリン酸緩衝液で4℃、5分間洗浄した。この洗浄操作を4回繰り返した。1mlの0.5%BSAのリン酸緩衝液で懸濁して4℃で保存した。
培養したラット骨髄間葉系幹細胞をdishからはがしてチューブに移し、4℃に10分間保存しておく。細胞懸濁液(1x106 cells)に調製した上記ビーズを60μl添加した後、4℃で1時間ゆっくりと転倒攪拌して、抗原抗体反応させた。反応後のチューブをネオジム磁石の上に2分間置き、上清を除去した。0.5%BSAのリン酸緩衝液で再懸濁させた。この洗浄操作を4回行った。リン酸緩衝液などに懸濁して実験に使用した。
1.N−[3−(2−ピリジルジチオ)プロピオニル]フォスファチジルエタノールアミン(以下「PDP-PE」という)の合成
無水エタノール3mlに25mgのN-スクシンイミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオン酸エステルと50μmolのトリエチルアミンを溶解し、さらに50μmolのフォスファチジルエタノールアミンを溶解し攪拌した。5時間後、メタノールを減圧除去し、残留物をクロロホルムにて溶解した。150℃で一晩活性化したシリカゲルカラム(10ml)をクロロホルムで洗浄した。洗浄後反応物をカラムに流し、さらに20mlのクロロホルムで洗浄した。40:1、30:1、25:1、20:1および15:1のクロロホルム:メタノール混合溶液をそれぞれ20ml流して、最後に10:1の混合溶液を60ml流した。15:1および10:1の流出物を合わせて減圧濃縮した。
卵黄フォスファチジルコリン(Egg phosphatidylcholin)10μmol、コレステロール10μmolおよびPDP-PE 1μmol、を3mlのジエチルエーテルに溶解し、ジエチルエーテルを減圧気化した。磁性体鉄(Fe2O3)5mgおよび封入薬物(TGF-β、bFGF)を含んだ0.9%生理食塩水1mlおよびホウ酸/クエン酸バッファー(pH6.0)を加え、ボアテックスミキサーを用い振とう、フラスコ内に付着した薄層被膜を完全に剥離した。Bath sonicator(同上)にて50分超音波処理した。0.45Tの永久磁石(同上)を用い、作成した磁性体リポソームおよび封入されていない磁性体を溶液から分離した。1000xg(ppm)にて15分間遠心分離し、上澄みである磁性体リポソームと沈殿物の封入されていない磁性体を分離した。
60μlの25mM MESでヒトCD44抗体(20μg)を溶解し、作成したリポソームを添加し、3時間室温にてゆっくりと転倒攪拌させ、リポソームへ抗体を固定化した。反応後ネオジム磁石の上に2分間置き、上清を除去した。未反応の抗体を除去するため、0.05Mエタノールアミンのリン酸緩衝液を添加し、1時間、室温でゆっくりと転倒攪拌した。0.5%BSAのリン酸緩衝液で4℃、5分間洗浄した。この洗浄操作を4回繰り返した。1mlの0.5%BSAのリン酸緩衝液で懸濁安定化して4℃保存した。
培養したヒト骨髄間葉系幹細胞をdishから剥がしてチューブに移し、4℃で10分間保存した。細胞懸濁液(1x106cells)辺りに調製したリポソームを添加した後、4℃で1時間、ゆっくりと転倒攪拌して、抗原抗体反応させた。反応後のチューブをネオジム磁石の上に2分間置き、上清を除去した。0.5%BSAリン酸緩衝液で再懸濁した。この洗浄操作を4回行った。リン酸緩衝液などに懸濁したままで実験に使用した。
(In vitro試験)
前述の方法により調製した磁性粒子と結合した骨髄間葉系幹細胞4x106cellsをシャーレに播いた。本実施例においては、シャーレの下部中央に4300Gの円形(直径5mm)のネオジム磁石を設置した。一方、比較例においては、磁石を設置しなかった。シャーレにTGF-βとデキサメタゾンを加えた。21日間培養後、トルイジンブルー染色により評価した。実施例においては軟骨様組織が磁石に相当する位置を中心に局在的に形成されていた。一方、比較例においては、軟骨様組織は局在的に形成されてはいなかった。
(ラビットの膝間部における骨欠損修復)
ラビットの膝関節部にバイオインダストリー2002.Vol.19.No.6 p47-53記載の方法に準じ、幅5mmの骨欠損を2箇所作成した。当該欠損部に実施例で得られた磁性細胞を3.0μg注射投与した。その後、700Gの磁場をもつ磁石を欠損部にあたる表面に9週間留置した。一方、比較例として外部磁場与えずに磁性細胞を投与した。その結果、実施例では軟骨細胞が骨欠損部で局在し、新生骨の架橋形成による骨欠損の修復が見られたが、一方外部磁場を与えなかった比較例では骨欠損の修復が見られなかった。
1.EDCとNHSを用いた磁気ビーズの活性化
フェリスフェア100C原液(50mg/ml)[日本ペイント社]から3mg相当(60μl)をとり、0.01NNaOHを加え、ミキサーで10分間、室温で撹拌して洗浄した。この洗浄操作をもう一度繰り返して、脱イオン水を加え、ミキサーで5分間、室温で撹拌して洗浄した。この洗浄操作を3回繰り返した。磁気ビーズを活性化させるため、余分な水分を除去後、予め25mM MES、pH5.0で50mg/mlに調製しておいたEDCとNHSを50μlずつ、磁気ビーズによく混合し、30分間、室温でゆっくりと転倒撹拌した。反応後のチューブをネオジム磁石の上に2分間置き、上清を除去した。最後に、25mM MES、pH5.0で2回洗浄した(最後の溶液体積を40μlにした)。
60μlの25mM MES、pH5.0でrat CD44抗体[CHEMICON社]またはRGDS peptides[ペプチド研究所](20μg)を溶解し、活性化ビーズ(40μlの25mM MES pH5.0で懸濁)に添加し、3時間、室温でゆっくりと転倒撹拌させ、活性化ビーズへ抗体を固定化した。反応後のチューブをネオジム磁石の上に2分間置き、上清を除去した。ビーズと反応していない抗体を除くため、0.05M ethanolamine in PBS(-)pH8.0を添加し、1時間、室温でゆっくり転倒撹拌させた。固定化されたビーズを0.5%BSA in PBS(-)で4℃、5分間洗浄した。この洗浄操作を4回繰り返した。1mlの0.5%BSA in PBS(-)で懸濁して4℃保存した。
培養したラット骨髄間葉系幹細胞をdishから剥がしてチューブに移した。500μlの細胞懸濁液(2x105cells)辺りに調製したビーズを15μl添加した後、4℃で1時間、ときどき転倒撹拌して、抗原抗体反応させた。この時の反応緩衝液は0.5%BSA in PBS(-)を用いた。反応後のチューブをネオジム磁石の上に2分間置き、上清を除去した。0.5%BSA in PBS(-)で再懸濁した。この洗浄操作を3-4回行った。PBS(-)などに懸濁して実験に使用した。
1.EDCとNHSを用いた磁気ビーズの活性化
フェリスフェア100C原液(50mg/ml)[日本ペイント社]から3mg相当(60μl)をとり、0.01NNaOHを加え、ミキサーで10分間、室温で撹拌して洗浄した。この洗浄操作をもう一度繰り返して、脱イオン水を加え、ミキサーで5分間、室温で撹拌して洗浄した。この洗浄操作を3回繰り返した。磁気ビーズを活性化させるため、余分な水分を除去後、予め25mM MES、pH5.0で50mg/mlに調製しておいたEDCとNHSを50μlずつ、磁気ビーズによく混合し、30分間、室温でゆっくりと転倒撹拌した。反応後のチューブをネオジム磁石の上に2分間置き、上清を除去した。最後に、25mM MES、pH5.0で2回洗浄した。(最後の溶液体積を40μlにした)。
60μlの25mM MES、pH5.0でrat CD44抗体[CHEMICON社]またはRGDS peptides[ペプチド研究所](10ng)を溶解し、活性化ビーズ(40μlの25mM MESpH5.0で懸濁)に添加し、3時間、室温でゆっくりと転倒撹拌させ、活性化ビーズへ抗体を固定化した。反応後のチューブをネオジム磁石の上に2分間置き、上清を除去した。ビーズと反応していない抗体を除くため、0.05M ethanolamine in PBS(-) pH8.0を添加し、1時間、室温でゆっくり転倒撹拌した。固定化されたビーズを0.5%BSA in PBS(-)で4℃、5分間洗浄した。この洗浄操作を4回繰り返した。1mlの0.5%BSA in PBS(-)で懸濁して4℃保存した。
培養したラット骨髄間葉系幹細胞をdishから剥がしてチューブに移す。500μlの細胞懸濁液(2x105cells)辺りに調製したビーズを1μl添加した後、CD44抗体の場合、冷蔵庫(4-10℃)で1時間、ときどき転倒撹拌して、抗原抗体反応させた。RGDS peptidesの場合、37℃で1時間、ときどき転倒撹拌して、細胞と反応させた。この時の反応緩衝液は0.5%BSA 4.4μM EDTA in PBS(-)を用いた。反応後のチューブをネオジム磁石の上に2分間置き、上清を除去した。0.5%BSA in PBS(-)で再懸濁させた。この洗浄操作を3-4回行った。PBS(-)などに懸濁して実験に使用した。
Claims (5)
- 細胞と、
前記細胞の表面が接着する特定のアミノ酸配列からなるペプチドを有し、少なくとも磁性体を包含する磁性粒子と、
を含む磁性細胞。 - 前記細胞が、軟骨培養細胞、間葉系細胞、神経幹細胞、リンパ球細胞及びインテグリンを発現する細胞からなる群から選択される、請求項1に記載の磁性細胞。
- 前記ペプチドの前記磁性粒子へのコーティング量が、前記磁性粒子1mgに対して、3ng〜6μgである、請求項1又は2に記載の磁性細胞。
- 前記磁性粒子は、さらに薬物を包含する、請求項1ないし3のうち何れか一項に記載の磁性細胞。
- 請求項1ないし4のうち何れか一項に記載の磁性細胞を用意する工程と、
前記磁性細胞を培養する工程と、
を含む磁性細胞の培養方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006196830A JP4195478B2 (ja) | 2003-06-30 | 2006-07-19 | 磁性細胞およびその使用方法 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2003188626 | 2003-06-30 | ||
JP2006196830A JP4195478B2 (ja) | 2003-06-30 | 2006-07-19 | 磁性細胞およびその使用方法 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005511040A Division JP3889026B2 (ja) | 2003-06-30 | 2004-06-25 | 磁性細胞およびその使用方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006325600A true JP2006325600A (ja) | 2006-12-07 |
JP4195478B2 JP4195478B2 (ja) | 2008-12-10 |
Family
ID=37547953
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006196830A Active JP4195478B2 (ja) | 2003-06-30 | 2006-07-19 | 磁性細胞およびその使用方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4195478B2 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101028875B1 (ko) * | 2010-02-12 | 2011-04-12 | 메디스커브 주식회사 | 세포 내에서 세포내 물질의 생리활성 기능을 조절하는 조절물질을 검출하는 방법 |
WO2011049236A1 (ja) * | 2009-10-23 | 2011-04-28 | 学校法人芝浦工業大学 | 磁気誘導システムとその動作方法 |
WO2015146153A1 (ja) * | 2014-03-24 | 2015-10-01 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 細胞内へ物体を導入する方法 |
-
2006
- 2006-07-19 JP JP2006196830A patent/JP4195478B2/ja active Active
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011049236A1 (ja) * | 2009-10-23 | 2011-04-28 | 学校法人芝浦工業大学 | 磁気誘導システムとその動作方法 |
JP5688661B2 (ja) * | 2009-10-23 | 2015-03-25 | 学校法人 芝浦工業大学 | 磁気誘導システムとその動作方法 |
US9242117B2 (en) | 2009-10-23 | 2016-01-26 | Shibaura Institute Of Technology | Magnetic induction system and operating method for same incorporation by reference |
KR101028875B1 (ko) * | 2010-02-12 | 2011-04-12 | 메디스커브 주식회사 | 세포 내에서 세포내 물질의 생리활성 기능을 조절하는 조절물질을 검출하는 방법 |
WO2011099730A3 (ko) * | 2010-02-12 | 2012-01-12 | 메디스커브 주식회사 | 세포 내에서 세포내 물질의 생리활성 기능을 조절하는 조절물질을 검출하는 방법 |
WO2015146153A1 (ja) * | 2014-03-24 | 2015-10-01 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 細胞内へ物体を導入する方法 |
JPWO2015146153A1 (ja) * | 2014-03-24 | 2017-04-13 | 国立研究開発法人科学技術振興機構 | 細胞内へ物体を導入する方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP4195478B2 (ja) | 2008-12-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3889026B2 (ja) | 磁性細胞およびその使用方法 | |
JP5147699B2 (ja) | タンパク質ナノ粒子およびその使用 | |
EP2748299B1 (en) | Targeting microbubbles | |
JP5526156B2 (ja) | 磁性粒子、及びその製造方法、並びに磁性粒子含有製剤 | |
JP2006516539A (ja) | 物質を血液−脳関門を渡って輸送するための人工低密度リポタンパク質キャリア | |
US20110262415A1 (en) | Erythrocyte-based delivery system, method of preparation and uses thereof | |
JP4965570B2 (ja) | 膜に囲まれた細胞または細胞小器官の内外へ生体分子をデリバリーするのに適したナノ粒子 | |
Burnouf et al. | Circulatory-cell-mediated nanotherapeutic approaches in disease targeting | |
US9211346B2 (en) | Carrier-linked magnetic nanoparticle drug delivery composition and method of use | |
JP4195478B2 (ja) | 磁性細胞およびその使用方法 | |
WO2014058179A2 (ko) | 저밀도 지단백질 유사 나노입자 및 이를 포함하는 간 표적 진단 및 치료용 조성물 | |
WO2005092389A1 (ja) | 複合粒子および被覆複合粒子 | |
US20210206879A1 (en) | Enhanced targeting platform | |
Ruiz-Cánovas et al. | Tolerability to non-endosomal, micron-scale cell penetration probed with magnetic particles | |
KR20230064570A (ko) | 마이크로 버블-세포외 소포 복합체 | |
Bhatt et al. | Challenges and Emerging Problems in Nanomedicine Mediated Gene Therapy | |
Ma et al. | Engineered Cell Membrane‐Coated Nanoparticles: New Strategies in Glioma Targeted Therapy and Immune Modulation | |
RU2336901C1 (ru) | Противоопухолевое средство на основе иммунолипосомальной биологической конструкции, способ его получения и векторной доставки в центральную нервную систему при опухолевом процессе | |
JP2014114267A (ja) | 脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および/または増強するペプチド、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体、ならびに脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および/または増強する剤 | |
CN118001395A (zh) | 超声空化促进活体阳离子脂质-核酸复合体转染的载体及其制备方法和应用 | |
JP2011111417A (ja) | 磁性微粒子含有剤形、及びその製造方法、並びに磁性微粒子含有製剤 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20060829 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061003 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061023 |
|
AA91 | Notification that invitation to amend document was cancelled |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971091 Effective date: 20061114 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070206 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080620 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080819 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080910 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080925 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4195478 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111003 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111003 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121003 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131003 Year of fee payment: 5 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
R371 | Transfer withdrawn |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |