JP2006288302A - 昆虫gaba受容体遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヒメトビウンカよりγ−アミノ酪酸受容体サブユニットの遺伝子をクローニングし、昆虫細胞内で発現させることによりGABA受容体様のイオンチャンネルが形成される。
【選択図】なし
Description
[1] 配列表の配列番号1および2に記載の塩基配列を有する遺伝子。
[2] 配列表の配列番号3および4に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。
[3] 上記[1]に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
[4] 上記[3]に記載の組換えベクターで細胞を形質転換して得られる組換え細胞。[5] 上記[4]に記載の組換え細胞を用いたヒメトビウンカGABA受容体に作用する合成化合物をスクリーニングする方法。
本発明の遺伝子は、配列番号1および2に記載のDNA塩基配列のものであるが数塩基の置換を含む配列も本特許の範疇である。本発明の遺伝子は、実施例に記載のようにヒメトビウンカの受精卵から、容易に調製可能である。
ヒメトビウンカからのtotal RNA画分の調製は以下の手順で行った。まずヒメトビウンカ成虫10頭を氷上にて眠らせた後、ハサミで頭部を切断し、RNAlater RNA Stabilization Reagent(QIAGEN社)中に4℃で1晩浸漬した。その後、ガラス製ホモジナイザーで頭部をすり潰し、RNeasy Midikit(QIAGEN社)を用いてプロトコールに従ってtotal RNA画分を抽出した。抽出したtotal RNA画分は使用直前まで−20℃で保存した。
ヒメトビウンカGABA受容体遺伝子の全長を取得するための第一段階として、上の実験で解析したcDNA配列をもとにヒメトビウンカGABA受容体遺伝子特異的なプライマーを作製し、totalRNA画分を鋳型としたRACE PCR(SMART RACEcDNA Amplification Kit;Clontech社)を行った。3’RACE PCRについては、Clontech社SMART RACE cDNA Amplificationキットのプロトコールに従った。まず、キット添付の3’RACE CDSプライマーAを用いて一本鎖cDNAを合成後、ユニバーサルプライマーミックスA(UPM)と配列番号:8に示すヒメトビウンカ特異的プライマー(LSRD−1140F)を用いてPCRを行った。得られたPCR産物を鋳型とし、ネステッドユニバーサルプライマーA(NUP)及び配列番号:9のヒメトビウンカ特異的プライマー(LSRD−1230F)を用いてネステッドPCRを行った。これにより得られたDNA断片について、常法に従いTAクローニングを行い、DNAシーケンシングにより3’側配列を取得した。上記と同様にClontech社SMART RACE cDNA Amplificationキットを使用し、5’RACE PCRを実施した。まずキットに添付されているSMART IIAオリゴヌクレオチドとPowerScript Reverse Transcriptaseを用いて末端にSMART配列が付加した一本鎖cDNAを合成した。この際、プライマーとして配列番号:10に示すヒメトビウンカ特異的プライマー(LSRD−RT1P)を用いた。得られたcDNAを鋳型とし、NUP及び配列番号:11に示すヒメトビウンカ特異的プライマー(LSRD−550R)を用いてPCRを行った。
トータルRNAを鋳型とし、GeneRacer kit (INVITROGEN社)を用いて一本鎖cDNAを合成した。一本鎖cDNAを鋳型として、配列番号:14のプライマー(LSRD−5’F1)と配列番号:15のプライマー(LSRD−3’R1)を用いて1回目のPCRを行い、次に配列番号:16のプライマー(SalI−LSRD−5’)と配列番号:17のプライマー(LSRD3’−2−BamHI)を用いて2回目のPCRを行った。PCR産物は、上述の通りTAクローニングを行い、遺伝子配列を解析し、ヒメトビウンカGABA受容体遺伝子全長配列LS47−3(配列番号:1)を得た。同様に、一本鎖cDNAを鋳型として、配列番号:14のプライマー(LSRD−5’F1)と配列番号:18のプライマー(LSRD−3’R2)を用いて1回目のPCRを行い、次に配列番号:16のプライマー(SalI−LSRD−5’)と配列番号:19のプライマー(LSRD3’−BamHI)を用いて2回目のPCRを行った。PCR産物は、上述の通りTAクローニングを行い、遺伝子配列を解析し、ヒメトビウンカGABA受容体遺伝子全長配列LS50−2(配列番号:2)を得た。
5Tag)を得た。
LR recombinase(INVITROGEN社)を用いてEntry Clone(pENTR1A―ヒメ+V5Tag)とDestination vector、pDEST8(INVITROGEN社)間で部位特異的組換えを行い、pDEST8にヒメトビウンカGABA受容体+V5Tag遺伝子を組み込んだプラスミド(pDEST8―ヒメTag)を作製した。次に、INVITROGEN社のBac−to−Bac Baculovirus Expression Systemを用いて、ヒメトビウンカGABA受容体+V5Tag遺伝子をウイルスDNAに組み込んだバキュロウイルスを作製した。
上記のように構築したヒメトビウンカGABA受容体発現細胞のイオンチャンネル機能を電位センサープローブ法(INVITROGEN社)により確認した。
LR recombinase(INVITROGEN社)を用いてEntry Clone(pENTR1A―ヒメ+V5Tag)とDestination vector、pXINSECT−DEST38(INVITROGEN社)間で部位特異的組換えを行い、pXINSECT−DEST38にヒメトビウンカGABA受容体+V5Tag遺伝子を組み込んだプラスミド(pXINSECT−DEST38―ヒメTag)を作製した。
LR recombinase(INVITROGEN社)を用いてEntry Clone(pENTR1A―ヒメ+V5Tag)とDestination vector、pMT−DEST48(INVITROGEN社)間で部位特異的組換えを行い、pMT−DEST48にヒメトビウンカGABA受容体+V5Tag遺伝子を組み込んだプラスミド(pMT−DEST48―ヒメTag)を作製した。
pAc5.1/V5−HisA(INVITROGEN社)のSalI部位にpCoHygroのハイグロマイシン耐性遺伝子を挿入しpAc5.1−Hygroを作製した。次に、attR1−Lacプロモーター−LacZα−attR2をコードするXbaI−MluI断片をpAc5.1−HygroのXbaI−MluI部位に挿入して、Destination vector、pAc−lac−Hygroを得た。LR recombinaseを用いてEntry Clone(pENTR1A―ヒメ+V5Tag)とDestination vector、pAc−lac−Hygro間で部位特異的組換えを行い、大腸菌DH5αを形質転換し、アンピシリン及びX−Galを含むLBプレート上で37℃、16時間培養後、白いコロニーを選択して、pAc−lac−HygroのLacZα遺伝子がヒメトビウンカGABA受容体+V5Tag遺伝子と入れ替わったプラスミド、pAc−Hygro−ヒメTagを取得した。
Claims (5)
- 配列表の配列番号1および2に記載の塩基配列を有する遺伝子。
- 配列表の配列番号3および4に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。
- 請求項1に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項3に記載の組換えベクターで細胞を形質転換して得られる組換え細胞。
- 請求項4に記載の組換え細胞を用いたヒメトビウンカGABA受容体に作用する合成化合物をスクリーニングする方法。
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JP2005114969A JP2006288302A (ja) | 2005-04-12 | 2005-04-12 | 昆虫gaba受容体遺伝子 |
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO1998049185A1 (en) * | 1997-04-28 | 1998-11-05 | Fmc Corporation | Lepidopteran gaba-gated chloride channels |
JP2004536559A (ja) * | 2000-12-01 | 2004-12-09 | ヘスカ コーポレイション | ノミgabaレセプターサブユニットの核酸分子、タンパク質およびその使用 |
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2005
- 2005-04-12 JP JP2005114969A patent/JP2006288302A/ja active Pending
Patent Citations (2)
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