JP2006254730A - New aspartic acid dehydrogenase - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新規なアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ測定法、該測定に有用なアーキア（Archaea）に属する微生物が生産する新規なアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ、及びその製造法に関する。 The present invention relates to a novel method for measuring aspartate aminotransferase, a novel aspartate dehydrogenase produced by a microorganism belonging to Archea useful for the measurement, and a method for producing the same.
トランスアミナーゼは広く原核生物から真核生物まで分布している、アミノ化合物とα−ケト酸との間のアミノ基転移反応に関する酵素の総称である。生化学診断分野では体液中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（EC 2.6．6.1、以下ASTと略称する。GOT（グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ）と呼ばれることもある）とアラニンアミノトランスフェラーゼ（EC 2.6．1.21、以下ALTと略称する。GPT（グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ）と呼ばれることもある）が良く測定される。
生体内においてASTは、心筋、肝臓、骨格筋、腎臓等に高濃度に存在し、ALTは肝臓と腎臓に多く含まれている。これらの酵素は、細胞が破壊されると血中に漏れ出て、血中の酵素活性が上昇することから、これらの血中濃度上昇は、特に腎臓疾患では細胞障害の程度と良く相関し、また血中のAST及びALT濃度の差は心筋梗塞や肝臓疾患のみならず他の疾患の鑑別にも広く用いられ重要視されている。
血中AST濃度（AST活性）が高値になる例として、例えばウイルス性肝炎の場合、炎症が進んでいる急性期には100U／L以上になり、200U／Lから300U／L位まで上昇する。また、劇症肝炎、薬物性肝炎、虚血性肝炎の場合も1,000U／L場合によっては数千U／Lという高濃度になる例もある。
Transaminase is a general term for enzymes relating to transamination reaction between amino compounds and α-keto acids, which are widely distributed from prokaryotes to eukaryotes. In the biochemical diagnostic field, aspartate aminotransferase (EC 2.6.6.1, hereinafter abbreviated as AST; sometimes referred to as AST, glutamate oxaloacetate transaminase) and alanine aminotransferase (EC 2.6.1.21, hereinafter referred to as ALT) in body fluids. Abbreviated, GPT (sometimes called glutamate pyruvate transaminase) is well measured.
In vivo, AST is present in high concentrations in the myocardium, liver, skeletal muscle, kidney, etc., and ALT is abundant in the liver and kidney. Since these enzymes leak into the blood when cells are destroyed and the enzyme activity in the blood rises, these elevated blood concentrations correlate well with the degree of cell damage, especially in kidney disease, Differences in blood AST and ALT concentrations are widely used and important not only for the differentiation of myocardial infarction and liver disease, but also for other diseases.
For example, in the case of viral hepatitis, the blood AST concentration (AST activity) increases to 100 U / L or more in the acute phase in which inflammation progresses, and increases from 200 U / L to 300 U / L. In addition, in cases of fulminant hepatitis, drug-induced hepatitis, and ischemic hepatitis, there are cases where the concentration becomes as high as several thousand U / L depending on the case of 1,000 U / L.
現在、酵素を用いた体液中のAST活性の定量方法として、（1）リンゴ酸デヒドロゲナーゼを共役酵素として用いる酵素法と（2）オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼを共役酵素として用いる酵素法がある。
1989年、日本臨床化学会はヒト血清中のAST活性の測定方法について上記（1）のリンゴ酸デヒドロゲナーゼを共役酵素として用いる酵素法を勧告法として公表した（非特許文献３）。この方法はAST活性を検出するために、まず、ASTの基質としてL−アスパラギン酸及び2−オキソグルタル酸を用い、オキサロ酢酸とL-グルタミン酸を生成させる（式1）。
L-アスパラギン酸 ＋ 2−オキソグルタル酸 → オキサロ酢酸 ＋ L-グルタミン酸（式１）
Currently, there are two methods for quantifying AST activity in body fluids using enzymes: (1) an enzyme method using malate dehydrogenase as a conjugate enzyme, and (2) an enzyme method using oxaloacetate decarboxylase, pyruvate oxidase and peroxidase as a conjugate enzyme. There is.
In 1989, the Japanese Society for Clinical Chemistry published an enzyme method using malate dehydrogenase (1) as a conjugate enzyme as a recommended method for measuring AST activity in human serum (Non-patent Document 3). In this method, in order to detect AST activity, first, L-aspartic acid and 2-oxoglutaric acid are used as AST substrates to produce oxaloacetic acid and L-glutamic acid (Formula 1).
L-aspartic acid + 2-oxoglutaric acid → oxaloacetic acid + L-glutamic acid (formula 1)
ここで生成したオキサロ酢酸をリンゴ酸デヒドロゲナーゼの存在の下L-リンゴ酸に変化させる。このとき、補酵素NADHはNAD+となるため、波長340nmにおけるNADHの吸光度は減少する（式2）。この吸光度の減少速度からAST活性を求める方法である。
なお、本明細書中では、ニコチンアミドジヌクレオチドをNAD、ニコチンアミドジクレオチドホスフェイトをNADP、還元型ニコチンアミドジヌクレオチドをNADH、もしくは還元型ニコチンアミドジクレオチドホスフェイトNADPHと略称することがある。
オキサロ酢酸 ＋ NAD(P)H ＋ H+ → L-リンゴ酸 ＋ NAD(P)+（式２）
前記（1）の方法は日本臨床検査標準協議会及び国際医療化学連合に認証され、標準化されているので広く用いられている。本方法は反応過程において減少するNADHの紫外部吸収波長における吸光度を測定する方法であるが、光学測定器の測定可能な吸光度に限界があるため、反応液中に予め存在させることができるNADH濃度に上限があるという問題がある。そのため、測定可能なAST活性の範囲が一定の範囲に限られ、さらに、１０００U/ml以上の高濃度のAST活性を測定する場合、試料の希釈を行わなければ反応速度を一定に保てないという問題もある。
The oxaloacetate produced here is converted to L-malate in the presence of malate dehydrogenase. At this time, since coenzyme NADH becomes NAD + , the absorbance of NADH at a wavelength of 340 nm decreases (Formula 2). This is a method for obtaining AST activity from the rate of decrease in absorbance.
In the present specification, nicotinamide dinucleotide is sometimes abbreviated as NAD, nicotinamide diphosphate phosphate is NADP, reduced nicotinamide dinucleotide is NADH, or reduced nicotinamide diphosphate phosphate NADPH.
Oxaloacetic acid + NAD (P) H + H + → L-malic acid + NAD (P) + (Formula 2)
The method (1) is widely used because it is certified and standardized by the Japan Clinical Laboratory Standards Association and the International Association of Medical Chemistry. This method measures the absorbance at the UV absorption wavelength of NADH, which decreases during the reaction process, but there is a limit to the measurable absorbance of the optical measuring instrument, so the NADH concentration that can exist in the reaction solution in advance. There is a problem that there is an upper limit. Therefore, the range of AST activity that can be measured is limited to a certain range, and when measuring AST activity at a high concentration of 1000 U / ml or more, the reaction rate cannot be kept constant unless the sample is diluted. There is also a problem.
また、前記（2）の方法であるオキサロ酢酸デカルボキシラーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼを共役酵素として用いる酵素法は、式１の反応により生じたオキサロ酢酸をオキサロ酢酸デカルボキシラーゼによりピルビン酸とし（式3）、更にピルビン酸オキシダーゼにより過酸化水素を発生し（式4）、過酸化水素はペルオキシダーゼの作用で、例えばロイコ型色素などを酸化し、酸化によって生成する色素を比色定量する方法である（式5）。
オキサロ酢酸 → ピルビン酸 ＋ CO2 （式３）
ピルビン酸 ＋ O2 ＋ リン酸 → 過酸化水素 ＋ アセチルリン酸 ＋ CO2 （式４）
ロイコ型色素 ＋ 過酸化水素 → 色素 ＋ H2O （式５）
Further, the enzyme method using oxaloacetate decarboxylase, pyruvate oxidase and peroxidase as a conjugate enzyme, which is the method of (2) above, converts oxaloacetate produced by the reaction of Formula 1 into pyruvate by oxaloacetate decarboxylase (Formula 3 Further, hydrogen peroxide is generated by pyruvate oxidase (Formula 4), and the hydrogen peroxide is a method of oxidizing the leuco dye, for example, by the action of peroxidase and colorimetrically determining the dye produced by the oxidation ( Formula 5).
Oxaloacetic acid → pyruvic acid + CO 2 (Formula 3)
Pyruvate + O 2 + Phosphoric acid → Hydrogen peroxide + Acetyl phosphate + CO 2 (Formula 4)
Leuco dye + hydrogen peroxide → dye + H 2 O (Formula 5)
この方法も、１０００U/ml以上のAST活性を測定する場合に問題がある。すなわち、溶存酸素の濃度が全反応を律速するものとなり、正確なAST活性測定が困難になるからである。また、AST反応の生成物を直接測定する方法に比べて使用する酵素が多く、不経済である。
AST反応の生成物を直接測定することによりAST活性を測定する方法として、例えば、NAD(P)Hの増加速度を測定する方法が考えられる。例えば、式１でL-グルタミン酸を、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.4．1.2または1.4．1.3）を使用してNAD(P)の共存下、NAD(P)Hの増加速度を測定することによりAST活性を測定する方法である。しかし、この方法では、血清中に存在する多種類のトランスアミナーゼが、同様に血清中に存在する多種類のアミノ酸と反応液中に存在する2−オキソグルタル酸を基質にしてグルタミン酸を生成するために、無視し難い誤差を与えてしまうという問題がある。
このように、ヒト検体中、例えば血清中のAST活性（０〜１０００U/ml及び１０００U/ml以上）を反応生成物の増加反応により測定する実用的な方法はこれまで報告されていない。
This method also has a problem when measuring AST activity of 1000 U / ml or more. That is, the concentration of dissolved oxygen becomes the rate limiting factor for the entire reaction, and accurate AST activity measurement becomes difficult. Moreover, there are many enzymes used compared with the method of measuring the product of AST reaction directly, and it is uneconomical.
As a method of measuring the AST activity by directly measuring the product of the AST reaction, for example, a method of measuring the increase rate of NAD (P) H can be considered. For example, AST activity is measured by measuring the rate of increase of NAD (P) H in the presence of NAD (P) using L-glutamate in Formula 1 and glutamate dehydrogenase (EC 1.4.1.2 or 1.4.1.3). It is a method of measuring. However, in this method, since various types of transaminases present in serum produce glutamic acid using a variety of amino acids similarly present in serum and 2-oxoglutarate present in the reaction solution as substrates, There is a problem of giving an error that is difficult to ignore.
Thus, a practical method for measuring AST activity (0 to 1000 U / ml and 1000 U / ml or more) in a human sample, for example, in serum by increasing reaction products has not been reported so far.
ところで、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼは、EC番号が付与されていない比較的新しい酵素であり、NAD又はNADPの存在下、基質とする1モルのL−アスパラギン酸を1モルのNAD又はNADPを消費して、イミノアスパラギン酸を経て1モルのオキサロ酢酸及び1モルのNADHもしくはNADPHに変換、及びその逆反応を触媒する作用を有する。
アスパラギン酸デヒドロゲナーゼとしては、これまでにKlebsiella pneumoniae IFO 13541（非特許文献1）、及びThermotoga maritima（非特許文献2）のバクテリア由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼが報告されているが、AST活性の測定に使われているという報告はない。
後述する本発明のアーキオグロブス・フルジダス (Archaeoglobus fulgidus) DSM4304菌株については、全ゲノム解析が終了しており、配列表配列番号2に示した遺伝子の塩基配列及び配列表配列番号1に示したアミノ酸配列は公知である（非特許文献4）。しかし、該タンパク質の機能についての報告は一切ない。
Aspartate dehydrogenase has been reported so far from Klebsiella pneumoniae IFO 13541 (Non-patent Document 1) and Thermotoga maritima (Non-patent Document 2) bacterial aspartate dehydrogenase. There is no report that it is.
For the Archaeoglobus fulgidus DSM4304 strain of the present invention to be described later, the whole genome analysis has been completed, the nucleotide sequence of the gene shown in SEQ ID NO: 2 and the amino acid shown in SEQ ID NO: 1 The sequence is known (Non-Patent Document 4). However, there is no report about the function of the protein.
本発明は、高濃度のASTの定量が可能である実用的なASTの測定方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a practical AST measurement method capable of quantifying a high concentration of AST.
本発明者らは、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼを用いることにより検体中のASTをNAD(P)H濃度の減少速度を測定することにより定量できることを見出した。
すなわち、本発明は以下の構成を有する。
（１）アーキア（Archaea）に属する微生物が生産するアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ。
（２）アーキオグロブス（Archaeoglobus）属に属する微生物由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ。
（３）アーキオグロブス・フルジダス（Archaeoglobus fulgidus）DSM4304菌株由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ。
（４）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ測定方法に用いられるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ。
（４−２）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ測定方法に用いられる前記（１）〜（３）のいずれかに記載のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ。
（５）アスパラギン酸デヒドロゲナーゼが、NADを補酵素としてL−アスパラギン酸を基質とした時のL−アスパラギン酸に対するKm値をKm１、NADHを補酵素としてオキサロ酢酸を基質としたときのオキサロ酢酸に対するKm値をKm２とすると、
Km１＜Km２
の関係を満たす性質を有する前記（１）〜（４）のいずれかに記載のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ。
（６）以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ａ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ。
（ｂ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（７）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼタンパク質。
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（８）以下の（ａ）又は（ｂ）の遺伝子。
（ａ）配列番号２に示される遺伝子配列を含むアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子。
（ｂ）配列番号２に示される遺伝子配列において１もしくは複数個の核酸が欠失、置換もしくは付加された核酸配列からなり、かつアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（９）アスパラギン酸デヒドロゲナーゼを製造するための前記（７）又は（８）に記載の遺伝子の使用方法。
（１０）前記（７）又は（８）に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有する組換えベクター。
（１１）前記（１０）に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（１２）前記（１０）に記載の形質転換体を培地に培養し、その培養物からアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを採取することを特徴とするアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの製造方法。
（１３）アスパラギン酸デヒドロゲナーゼを用いたアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ測定方法。
（１４）前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ又はタンパク質を用いたアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ測定方法。
（１５）反応生成物の増加を測定する前記（１３）又は（１４）に記載のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ測定方法。
（１６）反応生成物の増加が、NADH、NADPH、又はホルマザン色素の増加である前記（１５）に記載のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ測定方法。
（１７）２０００U/ml以下の濃度のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを測定する前記（１３）〜（１６）のいずれかに記載のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ測定方法。
（１７−２）１０００〜２０００U/ml以下の濃度のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを測定する前記（１３）〜（１６）のいずれかに記載のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ測定方法。
（１８）前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ又はタンパク質を含むアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ測定用試薬。
（１９）試薬が液体である前記（１８）に記載のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ測定用試薬。
（２０）前記（１）〜（６）のいずれかに記載のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ又はタンパク質を含むアスパラギン酸アミトランスフェラーゼ測定用試薬キット。
The present inventors have found that AST in a sample can be quantified by measuring the decrease rate of NAD (P) H concentration by using aspartate dehydrogenase.
That is, the present invention has the following configuration.
(1) Aspartate dehydrogenase produced by microorganisms belonging to Archea.
(2) Aspartate dehydrogenase derived from a microorganism belonging to the genus Archaeoglobus.
(3) Aspartate dehydrogenase derived from Archaeoglobus fulgidus DSM4304 strain.
(4) Aspartate dehydrogenase used in the method for measuring aspartate aminotransferase.
(4-2) The aspartate dehydrogenase according to any one of (1) to (3), which is used in a method for measuring aspartate aminotransferase.
(5) The Km value for L-aspartic acid when the aspartate dehydrogenase is NAD as a coenzyme and L-aspartate as a substrate is Km1, and the Km for oxaloacetate when NADH is a coenzyme and oxaloacetate is a substrate If the value is Km2,
Km1 <Km2
The aspartate dehydrogenase according to any one of (1) to (4), wherein the aspartate dehydrogenase has a property satisfying the relationship:
(6) A protein having the following amino acid sequence (a) or (b):
(A) Aspartate dehydrogenase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
(B) a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having aspartate dehydrogenase activity.
(7) A gene encoding the following protein (a) or (b).
(A) Aspartate dehydrogenase protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(B) A protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having aspartate dehydrogenase activity.
(8) The following gene (a) or (b):
(A) An aspartate dehydrogenase gene comprising the gene sequence shown in SEQ ID NO: 2.
(B) A gene encoding a protein comprising a nucleic acid sequence in which one or a plurality of nucleic acids are deleted, substituted or added in the gene sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having aspartate dehydrogenase activity.
(9) A method of using the gene according to (7) or (8) above for producing aspartate dehydrogenase.
(10) A recombinant vector containing a gene encoding a protein having the amino acid sequence according to (7) or (8).
(11) A transformant comprising the recombinant vector according to (10).
(12) A method for producing aspartate dehydrogenase, comprising culturing the transformant according to (10) above in a medium and collecting aspartate dehydrogenase from the culture.
(13) A method for measuring aspartate aminotransferase using aspartate dehydrogenase.
(14) A method for measuring aspartate aminotransferase using the aspartate dehydrogenase or protein according to any one of (1) to (6) above.
(15) The method for measuring aspartate aminotransferase according to (13) or (14), wherein the increase in reaction products is measured.
(16) The aspartate aminotransferase measurement method according to (15), wherein the increase in the reaction product is an increase in NADH, NADPH, or formazan dye.
(17) The aspartate aminotransferase measuring method according to any one of (13) to (16), wherein aspartate aminotransferase having a concentration of 2000 U / ml or less is measured.
(17-2) The aspartate aminotransferase measuring method according to any one of (13) to (16), wherein aspartate aminotransferase is measured at a concentration of 1000 to 2000 U / ml or less.
(18) A reagent for measuring aspartate aminotransferase comprising the aspartate dehydrogenase or protein according to any one of (1) to (6) above.
(19) The reagent for measuring aspartate aminotransferase according to (18), wherein the reagent is a liquid.
(20) A reagent kit for measuring aspartate amyltransferase comprising the aspartate dehydrogenase or protein according to any one of (1) to (6).
本発明により、安定性が良いアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ、その製造方法、それを用いた高濃度のASTの定量が可能なASTの測定方法、及び測定試薬を提供することができる。
本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを用いたAST測定方法によれば、NAD(P)H濃度の増加速度を測定するため、減少速度を測定するよりもAST濃度を広範囲に測定できる。 また、反応速度を一定に保ちやすいので高濃度のASTでも正確に測定できる。さらに、使用する酵素が極力少なくできるため経済的である。
また、本発明のアーキオグロブス・フルジダス が産生するアスパラギン酸デヒドロゲナーゼは、熱処理後も高い活性を有するため、液状での安定性に優れ、本発明を用いた試薬は、液状で保存することも可能となり、特に臨床診断薬として好適に用いられる。
INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to provide an aspartate dehydrogenase having good stability, a production method thereof, an AST measurement method capable of quantifying high-concentration AST using the same, and a measurement reagent.
According to the AST measurement method using the aspartate dehydrogenase of the present invention, since the increase rate of the NAD (P) H concentration is measured, the AST concentration can be measured over a wider range than when the decrease rate is measured. In addition, it is easy to keep the reaction rate constant, so even high concentration AST can be measured accurately. Furthermore, it is economical because the number of enzymes used can be minimized.
In addition, aspartate dehydrogenase produced by Archeoglobus fluidas of the present invention has high activity even after heat treatment, so it is excellent in liquid stability, and the reagent using the present invention can also be stored in liquid form Especially, it is suitably used as a clinical diagnostic agent.
本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼとしては、アーキア（Archaea、古細菌、始原菌）の生産するアスパラギン酸デヒドロゲナーゼであれば、何ら限定されるものではないが、アーキオグロブス・フルジダス DSM4304菌株由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼが好ましく、配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列であるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼが特に好ましい。
別の態様としては、以下の（a）又は（b）のアミノ酸配列を有するタンパク質であることが好ましい。
（a）配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ。
（b）配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
特には、配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼが好ましい。
さらに別の態様としては、本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを構成するアミノ酸配列としては、配列表配列番号1のアミノ酸配列の1から236で表記されるアミノ酸配列のN末端側及びC末端側はアミノ酸残基又はポリペプチド残基を含んでもよく、そのアミノ酸残基としてはシグナルペプチド又はT7タグ、Hisタグ、Ｓタグ、Trxタグ、CBDタグ、DsbAタグ、GSTタグ、NusタグなどのFusion Tag等が挙げられる。
また、別の態様としては、本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを構成するアミノ酸配列は、配列表配列番号1のアミノ酸配列の1から236で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する均等物も含まれる。例えば、配列表配列番号1のアミノ酸配列の1から236のアミノ酸配列の一部から実質的になるアミノ酸配列や酵素活性発現に関与しない一部のアミノ酸の配列を変異、欠損又は付加したものである。
The aspartate dehydrogenase of the present invention is not limited as long as it is an aspartate dehydrogenase produced by archaea (Archaea, archaea, archaeon), but aspartate dehydrogenase derived from Archaerobus fluidas DSM4304 strain Aspartate dehydrogenase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is particularly preferable.
As another aspect, a protein having the following amino acid sequence (a) or (b) is preferable.
(A) Aspartate dehydrogenase comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
(B) A protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having aspartate dehydrogenase activity.
In particular, aspartate dehydrogenase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is preferable.
In yet another embodiment, the amino acid sequence constituting the aspartate dehydrogenase of the present invention includes an amino acid residue on the N-terminal side and C-terminal side of the amino acid sequence represented by 1 to 236 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. The amino acid residue may include a signal peptide or Fusion tag such as T7 tag, His tag, S tag, Trx tag, CBD tag, DsbA tag, GST tag, and Nus tag. It is done.
In another embodiment, the amino acid sequence constituting the aspartate dehydrogenase of the present invention is the same as the enzyme activity expression by the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by 1 to 236 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The equivalent which exhibits an effect is also included. For example, an amino acid sequence substantially consisting of a part of amino acid sequence 1 to 236 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a part of amino acid sequence not involved in expression of enzyme activity is mutated, deleted or added. .
本発明の配列表配列番号１のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ
のアミノ酸配列をコードするDNA配列としては、配列表配列番号２に示されるDNA配列が挙げられるが、それ以外の配列として、例えば、各アミノ酸に対応するコドンが複数種類考えられる場合に、各アミノ酸においてそのうちいずれか１つのコドンを選択することができ、そのようにして得られるDNA配列も好ましい一例として挙げられる。
或いは、本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを構成するアミノ酸配列をコードするDNAは、配列表配列番号1のアミノ酸配列1から236で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する均等物のアミノ酸配列をコードするDNAであっても良い。例えば、酵素活性発現に関与しない一部のアミノ酸の配列を変異、欠損又は付加したものである。
上記DNAの好適な例として配列表配列番号1の1から711で表される塩基配列を有するDNAを挙げる事ができる。該DNAは、5’末端の上流側にアミノ酸をコードするコドンを1個以上有したものでもよく、TAA、TAG及びTGA以外のコドンであれば良い。さらに好ましくはATG、GTG、それら以外の開始コドン又はシグナルペプチドに対応するコドンを有したものを挙げる事ができる。3’末端の711下流側には、アミノ酸をコードするコドンを1個以上有するか、又は翻訳終止コドンを有するかのいずれでもよく、さらに、その3’末端側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上有する場合には、このアミノ酸をコードするコドンの3’末端側に翻訳終止コドンを有する事が望ましい。
Examples of the DNA sequence encoding the amino acid sequence of aspartate dehydrogenase of SEQ ID NO: 1 of the present invention include the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing. Other sequences include, for example, corresponding to each amino acid When a plurality of codons are considered, any one of them can be selected for each amino acid, and a DNA sequence thus obtained is also a preferred example.
Alternatively, the DNA encoding the amino acid sequence constituting the aspartate dehydrogenase of the present invention exhibits the same effect as the enzyme activity expression by the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by amino acid sequence 1 to 236 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing It may be DNA encoding an equivalent amino acid sequence. For example, some amino acid sequences not involved in enzyme activity expression are mutated, deleted or added.
Preferable examples of the DNA include DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 to 711 in Sequence Listing. The DNA may have one or more codons encoding an amino acid upstream of the 5 ′ end, and may be any codon other than TAA, TAG and TGA. More preferably, ATG, GTG, other initiation codons or those having a codon corresponding to the signal peptide can be mentioned. There may be either one or more codons encoding amino acids or a translation termination codon at the 711 downstream side of the 3 ′ end, and one codon encoding amino acids on the 3 ′ end side. In the case of having the above, it is desirable to have a translation termination codon at the 3 ′ end side of the codon encoding this amino acid.
本発明のタンパク質を、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼとして使用することも本発明の範囲内である。 It is also within the scope of the present invention to use the protein of the present invention as aspartate dehydrogenase.
本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子としては、アーキアよりDNAが分離精製され、かつアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば何でも良いが、例えば、以下の（a）又は（b）のタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
（a）配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（b）配列表配列番号1に示されるアミノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の別の態様としては、以下の（a）又は（b）の遺伝子が挙げられる。
（a）配列表配列番号2に示される遺伝子配列を含むアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子。
（b）配列表配列番号2において1もしくは複数個の核酸が欠失、置換もしくは付加された核酸配列からなり、かつアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
The gene encoding the aspartate dehydrogenase of the present invention may be any gene as long as the DNA is isolated and purified from archaea and encodes a protein having aspartate dehydrogenase activity. For example, the following (a) or (b ) And the gene encoding the protein.
(A) A protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
(B) A protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having aspartate dehydrogenase activity.
Another embodiment of the gene encoding the aspartate dehydrogenase of the present invention includes the following gene (a) or (b).
(A) An aspartate dehydrogenase gene comprising the gene sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
(B) A gene encoding a protein having a nucleic acid sequence in which one or more nucleic acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and having aspartate dehydrogenase activity.
上記の本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を、本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを製造するために使用することも本発明の範囲内である。
本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクター及び該組換えベクターを含む形質転換体も本発明の範囲内である。
上記の本発明の形質転換体を培地に培養し、その培養物からアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを採取することを特徴とするアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの製造方法も本発明の範囲内である。
It is also within the scope of the present invention to use the above-described gene encoding the aspartate dehydrogenase of the present invention for producing the aspartate dehydrogenase of the present invention.
A recombinant vector containing a gene encoding the aspartate dehydrogenase of the present invention and a transformant containing the recombinant vector are also within the scope of the present invention.
A method for producing aspartate dehydrogenase, which comprises culturing the above transformant of the present invention in a medium and collecting aspartate dehydrogenase from the culture is also within the scope of the present invention.
次に、本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを産生する遺伝子組換え微生物の製造方法について説明する。
アスパラギン酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードするDNAは、例えば、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の供与体である、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼを生産するアーキアよりDNAを分離精製した後、制限酵素などを用いて切断した該DNAと、同じく切断して直鎖状にした発現ベクターとを、両DNAの末端部をDNAリガーゼなどにより結合閉環させる。このようにして得られた組み換えDNAプラスミドを宿主微生物に導入し、発現ベクターのマーカーと、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼの活性発現若しくはDNAプローブを指標としてスクリーニングを行い、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含有する組み換えDNAプラスミドを保持する微生物を分離する。該遺伝子組み換え微生物を培養し、該培養菌体から該組み換えDNAプラスミドを分離精製し、次いで該組み換えDNAプラスミドからアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子であるDNAを取得することにより得られる。
該DNAの供与体である微生物としては、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼを生産するアーキアであれば、なんら限定されるものではないが、好ましくはアーキオグロブス・フルジダス DSM4304菌株が挙げられる。
Next, a method for producing a genetically modified microorganism that produces the aspartate dehydrogenase of the present invention will be described.
The DNA encoding the aspartate dehydrogenase protein is the same as, for example, the DNA that has been separated and purified from archaea that produces aspartate dehydrogenase, which is the donor of the aspartate dehydrogenase gene, and then cleaved using a restriction enzyme or the like. The expression vector that has been cut and linearized is cyclized by binding the ends of both DNAs with DNA ligase or the like. The recombinant DNA plasmid thus obtained is introduced into a host microorganism, screened using an expression vector marker and aspartate dehydrogenase activity expression or DNA probe as an index, and a recombinant DNA plasmid containing an aspartate dehydrogenase gene is obtained. Isolate microorganisms to be retained. It is obtained by culturing the genetically modified microorganism, separating and purifying the recombinant DNA plasmid from the cultured cells, and then obtaining the DNA that is the aspartate dehydrogenase gene from the recombinant DNA plasmid.
The microorganism that is a donor of the DNA is not particularly limited as long as it is an archaea that produces aspartate dehydrogenase, but preferably an Archaerobus fluidaus DSM4304 strain.
アスパラギン酸デヒドロゲナーゼを生産する微生物に由来するDNA（以下total DNAと略称する）を採取するには、例えばアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを生産するアーキアを培養し、得られる培養物から菌体を集菌し、次いでこれを溶菌させることによってアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含有する溶菌物を調製する。溶菌方法としては、例えばリゾチームなどの細胞壁溶解酵素による処理が施され、必要によりプロテアーゼなどの他の酵素やラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤が併用され、さらに細胞壁の物理的破壊法である凍結融解やフレンチプレス処理を上述の溶菌法と組合せで行っても良い。
この様にして得られた溶菌物からtotal DNAを分離精製するには、常法に従って、例えばフェノール抽出による除タンパク処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
In order to collect DNA derived from a microorganism that produces aspartate dehydrogenase (hereinafter abbreviated as total DNA), for example, an archaea that produces aspartate dehydrogenase is cultured, and then the cells are collected from the resulting culture. By lysing this, a lysate containing the aspartate dehydrogenase gene is prepared. As the lysis method, for example, treatment with a cell wall lytic enzyme such as lysozyme is performed, and if necessary, other enzymes such as protease and a surfactant such as sodium lauryl sulfate are used together, and further freeze-thaw is a physical destruction method of the cell wall. Alternatively, the French press treatment may be performed in combination with the above lysis method.
In order to separate and purify the total DNA from the lysate obtained in this manner, according to a conventional method, for example, by appropriately combining methods such as deproteinization by phenol extraction, protease treatment, ribonuclease treatment, alcohol precipitation, and centrifugation. It can be carried out.
分離精製されたtotal DNAを切断する方法は、常法に従って制限酵素処理により行えばよく、特に得られるtotal DNA断片とベクターとの結合を容易ならしめるため、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配列に作用する、例えば、SalI、BglII、BamHI、XhoI、又はMluIなどのII形制限酵素が適している。 A method for cleaving the separated and purified total DNA may be performed by restriction enzyme treatment according to a conventional method, and in particular, it acts on restriction enzymes, particularly specific nucleotide sequences, in order to facilitate the binding of the total DNA fragment obtained to the vector. For example, type II restriction enzymes such as SalI, BglII, BamHI, XhoI or MluI are suitable.
total DNA断片を組み込むベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージ又はプラスミドから遺伝子組み換え用として構築されたものが適しており、ファージベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）に属する微生物を宿主微生物とする場合にはλgt・λC、λgt・λBなどが使用できる。また、プラスミドベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、プラスミドpET-3a、pET-11a、pET-32aなどのpETベクター（Novagen）又はpBR322、pBR325、pACYC184、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19、pUC118、pIN I、Bluescript KS+、枯草菌を宿主とする場合にはpUB110、pKH300PLK、放線菌を宿主とする場合にはpIJ680、pIJ702、酵母特にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae)を宿主とする場合にはYRp7、pYC1、Yep13などが使用できる。このようなベクターを、total DNAの切断に使用した制限酵素で生成するDNA末端と、同じ末端を生成する制限酵素で切断してベクター断片を作成し、total DNA断片とベクター断片とを、DNAリガーゼ酵素により常法に従って結合させれば良い。 As the vector into which the total DNA fragment is incorporated, those constructed for genetic recombination from phages or plasmids that can autonomously grow in the host microorganism are suitable. For example, Escherichia coli Λgt · λC, λgt · λB, etc. can be used when the microorganism belonging to the above is used as the host microorganism. In addition, as a plasmid vector, for example, when Escherichia coli is used as a host microorganism, pET vectors (Novagen) such as plasmids pET-3a, pET-11a, and pET-32a, or pBR322, pBR325, pACYC184, pUC12, pUC13 PUC18, pUC19, pUC118, pIN I, Bluescript KS +, pUB110, pKH300PLK when using Bacillus subtilis as the host, pIJ680, pIJ702 when using actinomycetes as the host, Saccharomyces cerevisiae (especially Saccharomyces cerevisiae) YRp7, pYC1, Yep13, etc. can be used. A vector fragment is prepared by cleaving such a vector with the restriction endonuclease that is used to cleave the total DNA and the restriction enzyme that produces the same end, and the total DNA fragment and the vector fragment are combined with the DNA ligase. What is necessary is just to couple | bond with an enzyme according to a conventional method.
total DNAの断片を結合したプラスミドを移入する宿主微生物としては、組み換えDNAが安定かつ自律的に増殖可能であればよく、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物の場合、エシェリヒア・コリ BL21、エシェリヒア・コリ BL21（DE3）、エシェリヒア・コリ BL21trxB、エシェリヒア・コリ Rosetta（DE3）、エシェリヒア・コリ Rosetta、エシェリヒア・コリ Rosetta（DE3）pLysS、エシェリヒア・コリ Rosetta（DE3）pLacl、エシェリヒア・コリ RosettaBlue、エシェリヒア・コリ Rosetta-gami、エシェリヒア・コリ Origami、エシェリヒア・コリ Tuner、エシェリヒア・コリ DH1、エシェリヒア・コリ JM109、エシェリヒア・コリ W3110、エシェリヒア・コリC600などが利用できる。また、微生物宿主が枯草菌に属する微生物の場合、バチルス・サチリス ISW1214など、放線菌に属する微生物の場合、ストレプトマイセス・リビダンス TK24など、サッカロマイセス・セルビシエに属する微生物の場合、サッカロマイセス・セルビシエ INVSC1などが使用できる。
宿主微生物に組み換えDNAを移入する方法としては、例えば、宿主微生物がエシェリヒア・コリやサッカロマイセス・セルビシエ、ストレプトマイセス・リビダンスに属する微生物の場合には、常法に従ってコンピテントセル化した宿主菌株に組み換えDNAの移入を行えばよく、菌株によっては電気穿孔法を使用しても良い。
The host microorganism into which the plasmid combined with the total DNA fragment is transferred as long as the recombinant DNA can be stably and autonomously propagated. For example, when the host microorganism is a microorganism belonging to Escherichia coli, Escherichia coli BL21, Escherichia・ Colli BL21 (DE3), Escherichia coli BL21trxB, Escherichia coli Rosetta (DE3), Escherichia coli Rosetta, Escherichia coli Rosetta (DE3) pLysS, Escherichia coli Rosetta (DE3) pLacl, Escherichia coli RosettaBlue, Escherichia Kori Rosetta-gami, Escherichia coli Origami, Escherichia coli Tuner, Escherichia coli DH1, Escherichia coli JM109, Escherichia coli W3110, Escherichia coli C600, etc. can be used. When the microorganism host belongs to Bacillus subtilis, Bacillus subtilis ISW1214, etc., actinomycetes, Streptomyces lividans TK24, etc., Saccharomyces cerevisiae microorganisms, such as Saccharomyces cerevisiae INVSC1 Can be used.
As a method for transferring the recombinant DNA into the host microorganism, for example, when the host microorganism belongs to Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, or Streptomyces lividans, it is recombined into a host cell that has been made into a competent cell according to a conventional method. DNA may be transferred, and depending on the strain, electroporation may be used.
形質転換体からのアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むDNAの分離は、常法に従って行えば良い。上述の方法によって得られたアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のDNAの塩基配列は、デオキシ法で解読すればよく、またアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを構成するポリペプチドの全アミノ酸配列は、塩基配列より予測決定できる。この様にして一度選択された組み換えDNAは、組み換えDNAを保持する形質転換微生物から取り出され、他の宿主微生物に移入することも容易に実施できる。また、さらに、該組み換えDNAから制限酵素などにより切断してアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするDNAを切り出し、前記と同様な方法により切断して得られる他の開環ベクターの末端に結合させて新規な特徴を有する組み換えDNAを作製して、他の宿主微生物に移入することも容易に実施できる。 Separation of DNA containing the aspartate dehydrogenase gene from the transformant may be performed according to a conventional method. The base sequence of the aspartate dehydrogenase gene DNA obtained by the above-described method may be decoded by the deoxy method, and the entire amino acid sequence of the polypeptide constituting the aspartate dehydrogenase can be predicted and determined from the base sequence. The recombinant DNA once selected in this way can be easily taken out from a transformed microorganism holding the recombinant DNA and transferred to another host microorganism. Further, another ring-opening vector obtained by cleaving the recombinant DNA with a restriction enzyme or the like to cleave DNA encoding the amino acid sequence of a polypeptide constituting aspartate dehydrogenase, and cleaving it by the same method as described above. Recombinant DNA having novel characteristics can be prepared by binding to the ends and transferred to other host microorganisms.
このようにして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることによりアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを産生し得るが、宿主微生物によってはアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を移入するだけではアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ生産性を有しない場合がありうる。このような場合、得られたアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むDNA断片を、ゾラーの方法による部位特異的変異法による制限酵素認識部位の作製や、制限酵素による切り出しなどにより適切な形態で分離し、該宿主微生物に適合する遺伝子プロモーター下流にアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を結合したDNAを組み込んだプラスミドにより、新たな形質転換体を作成し、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼを産生させれば良い。 The microorganism, which is the transformant thus obtained, can produce aspartate dehydrogenase by being cultured in a nutrient medium, but aspartate dehydrogenase productivity can be increased only by transferring the aspartate dehydrogenase gene depending on the host microorganism. May not be present. In such a case, the obtained DNA fragment containing the aspartate dehydrogenase gene is separated in an appropriate form by creating a restriction enzyme recognition site by a site-directed mutagenesis method by Zoller's method, excision by a restriction enzyme, etc. What is necessary is just to produce a new transformant and produce aspartate dehydrogenase with the plasmid which integrated the DNA which combined the aspartate dehydrogenase gene downstream of the gene promoter suitable for a host microorganism.
例えば、上記宿主微生物がエシェリヒア・コリに属する微生物の場合、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を接続する遺伝子プロモーターとしては、lacZプロモーター、tacプロモーター、T7プロモーター、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子プロモーターなどが例示され、これらのプロモーターの下流にリボソーム結合部位を介在して、開始コドンATGやGTGを有するアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ構造遺伝子を接続し、大腸菌を宿主とするベクターに組み込み、かくのごとくして作成されたプラスミドで大腸菌を形質転換すれば良い。 For example, when the host microorganism is a microorganism belonging to Escherichia coli, examples of gene promoters that connect the aspartate dehydrogenase gene include lacZ promoter, tac promoter, T7 promoter, pyruvate oxidase gene promoter, etc. Connect an aspartate dehydrogenase structural gene with initiation codons ATG or GTG via a downstream ribosome binding site, incorporate it into a vector hosted in E. coli, and transform E. coli with the plasmid thus prepared. It ’s fine.
上記の遺伝子操作に一般的に使用される量的関係は、供与微生物からのDNA及びプラスミドDNA0.1から10μgに対し、制限酵素約1から10U、リガーゼ約300U、その他の酵素約1から10U、程度が例示される。 Quantitative relationships commonly used in the above genetic manipulation are: about 1 to 10 U of restriction enzyme, about 300 U of ligase, about 1 to 10 U of other enzymes, relative to 0.1 to 10 μg of DNA and plasmid DNA from the donor microorganism, The degree is illustrated.
また、本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼは公知の遺伝子操作手段により、本来の反応を触媒する性質を損なわないペプチドの変異をなしてもよく、このような変異体アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子から遺伝子工学的手法により作製される人工変異遺伝子を意味し、この人工変異遺伝子は前述の部位特異的変異法や、目的遺伝子の特定DNA断片を人工変異DNAで置換するなどの種々なる遺伝子工学的方法を使用して得られる。このようにして取得された人工変異アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をベクターに挿入して宿主微生物に移入させることによって変異体アスパラギン酸デヒドロゲナーゼを発現させることが可能であり、優れた性質を有する変異体アスパラギン酸デヒドロゲナーゼができればそれを製造することも可能である。
アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含み、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼを産生し得る形質転換微生物の具体的な例示としては、図5に示すようなエシェリヒア・コリ BL21 Codon Plus（DE3）を含有するプラスミドpET-11a/AF1838を導入した形質転換微生物が挙げられる。
Further, the aspartate dehydrogenase of the present invention may be mutated by a known gene manipulation means without damaging the property of catalyzing the original reaction, and such a mutant aspartate dehydrogenase gene is used as the aspartate dehydrogenase gene of the present invention. Means an artificially mutated gene made from an acid dehydrogenase gene by genetic engineering techniques. This artificially mutated gene can be used in various ways, such as the above-mentioned site-specific mutation method or replacement of a specific DNA fragment of the target gene with an artificially mutated DNA. Obtained using genetic engineering methods. It is possible to express the mutant aspartate dehydrogenase by inserting the artificial mutant aspartate dehydrogenase gene obtained in this way into a vector and transferring it into a host microorganism, and have a mutant aspartate dehydrogenase having excellent properties. If possible, it can be manufactured.
As a specific example of a transformed microorganism containing an aspartate dehydrogenase gene and capable of producing aspartate dehydrogenase, a plasmid pET-11a / AF1838 containing Escherichia coli BL21 Codon Plus (DE3) as shown in FIG. Examples include transformed microorganisms introduced.
次にアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの生産方法について説明する。
アスパラギン酸デヒドロゲナーゼは主としてその菌体内に含有、蓄積されており、その菌体内から抽出すれば良い。当該デヒドロゲナーゼを産生する菌を培養し、培養物から得ることができる。産生する菌は前記形質転換体でもよいし、天然の微生物であってもよい。
本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ産生菌を培養し、培養終了後、得られた湿潤菌体をリン酸緩衝液やトリス-塩酸緩衝液などの溶液に分散し、濾過又は遠心分離などの手段により菌体を採集し、次いでこの菌体を機械的方法又はリゾチームなどの酵素的方法、超音波処理、フレンチプレス処理、ダイノミル処理などの菌体破砕手段を適宜選択組み合わせて、粗製のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ含有液を得る。
Next, a method for producing aspartate dehydrogenase will be described.
Aspartate dehydrogenase is mainly contained and accumulated in the microbial cells, and may be extracted from the microbial cells. Bacteria that produce the dehydrogenase can be cultured and obtained from the culture. The bacterium to be produced may be the aforementioned transformant or a natural microorganism.
The aspartate dehydrogenase-producing bacterium according to the present invention is cultured, and after completion of the culture, the obtained wet microbial cells are dispersed in a solution such as a phosphate buffer or Tris-HCl buffer, and the microbial cells are obtained by means of filtration or centrifugation. Then, the bacterial cells are subjected to a mechanical method or enzymatic method such as lysozyme, ultrasonic cell treatment, French press treatment, dynomill treatment, etc. obtain.
粗製のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ含有液から公知のタンパク質や酵素などの単離、精製手段を用いて精製アスパラギン酸デヒドロゲナーゼを得る。例えば、粗製のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ含有液にアセトン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒による分別沈殿法、硫酸アンモニウム、食塩などによる塩析法などを適用してアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを沈殿させ、回収する。さらに、この沈殿物を必要に応じて透析、等電点沈殿を行った後、電気泳動法などで単一の帯を示すまで、イオン交換体、ゲル濾過剤、吸着体などを用いるカラムクロマトグラフィーなどにより精製する。また、これらの方法を適当に組み合わせることによりアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの精製度が上がる場合は適宜組み合わせて行うことができる。
例えば、本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの製造方法として、本発明の形質転換体を培地に培養し、以下の工程により製造する方法等が挙げられる。
（a）本発明の組換えベクターを含む形質転換体を液体培養する工程。
（b）工程（a）で得られる形質転換体を集菌し可溶化する工程。
（c）工程（b）で得られる可溶化液を熱処理する工程。
（d）工程（c）に続いてアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製する工程。
（e）必要に応じて工程（c）から（d）を繰り返す工程。
A purified aspartate dehydrogenase is obtained from the crude aspartate dehydrogenase-containing solution using isolation and purification means such as known proteins and enzymes. For example, aspartate dehydrogenase is precipitated and recovered by applying a fractional precipitation method using an organic solvent such as acetone, methanol, ethanol, or a salting-out method using ammonium sulfate, sodium chloride, or the like to a crude aspartate dehydrogenase-containing solution. In addition, after performing dialysis and isoelectric precipitation of this precipitate as necessary, column chromatography using an ion exchanger, gel filter agent, adsorbent, etc. until a single band is shown by electrophoresis or the like Purify by etc. Further, when the purification degree of aspartate dehydrogenase is increased by appropriately combining these methods, the methods can be appropriately combined.
For example, as a method for producing the aspartate dehydrogenase of the present invention, a method of culturing the transformant of the present invention in a medium and producing it by the following steps may be mentioned.
(A) A step of subjecting the transformant containing the recombinant vector of the present invention to liquid culture.
(B) A step of collecting and solubilizing the transformant obtained in step (a).
(C) A step of heat-treating the solubilized liquid obtained in step (b).
(D) A step of purification using affinity chromatography following step (c).
(E) A step of repeating steps (c) to (d) as necessary.
形質転換微生物の培養条件は、その栄養生理的性質を考慮して選択すれば良く、通常多くの場合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用されうる。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であれば良く、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。 The culture conditions for the transformed microorganisms may be selected in consideration of the nutritional physiological properties, and in many cases, the culture conditions are usually liquid culture, but industrially, it is advantageous to perform deep aeration and agitation culture. As a nutrient source for the medium, those commonly used for culturing microorganisms can be widely used. The carbon source may be any carbon compound that can be assimilated. For example, glucose, saccharose, lactose, maltose, fructose, molasses and the like are used. The nitrogen source may be any available nitrogen compound, and for example, peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate and the like are used. In addition, phosphates, carbonates, sulfates, salts such as magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, and zinc, specific amino acids, specific vitamins, and the like are used as necessary.
培養温度は微生物が発育し、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合、好ましくは20から42℃程度である。培養時間は、条件によって多少異なるが、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく、エシェリヒア・コリの場合、通常は12から48時間程度である。培地pHは菌が発育し、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場合、好ましくはpH6から8程度である。 The culture temperature can be appropriately changed within the range in which microorganisms grow and produce aspartate dehydrogenase. In the case of Escherichia coli, it is preferably about 20 to 42 ° C. Although the culture time varies slightly depending on the conditions, the culture may be terminated at an appropriate time in anticipation of the time when the aspartate dehydrogenase reaches the maximum yield. The pH of the medium can be appropriately changed as long as the bacteria grow and produce aspartate dehydrogenase. In the case of Escherichia coli, the pH is preferably about 6 to 8.
これらの方法によって得られる酵素は安定化剤として、各種の塩類、糖類、タンパク質、脂質、海面活性化剤などを加え、あるいは加えることなく、限外濾過濃縮、凍結乾燥などの方法により、液状又は固形のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを得ることができ、また、適宜凍結乾燥を行ってもよく、この場合安定化剤としてサッカロース、マンニトール、食塩、アルブミンなどを0.5から10％程度添加しても良い。 Enzymes obtained by these methods can be used as stabilizers in the form of a liquid or a mixture of various salts, saccharides, proteins, lipids, sea surface activators, etc., with or without addition, by methods such as ultrafiltration concentration and freeze-drying. Solid aspartate dehydrogenase can be obtained, and lyophilization may be performed as appropriate. In this case, saccharose, mannitol, sodium chloride, albumin or the like may be added as a stabilizer in an amount of about 0.5 to 10%.
本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼとしては、グルタミン酸を基質としないアスパラギン酸デヒドロゲナーゼが好ましく、特に、L−アスパラギン酸に基質特異性が高いアスパラギン酸デヒドロゲナーゼが好ましい。さらにはL−アスパラギン酸のみを基質とするアスパラギン酸デヒドロゲナーゼが好ましい。 Aspartate dehydrogenase of the present invention is preferably aspartate dehydrogenase that does not use glutamic acid as a substrate, and in particular, aspartate dehydrogenase having high substrate specificity to L-aspartate is preferred. Furthermore, aspartate dehydrogenase using only L-aspartate as a substrate is preferable.
また、本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼは熱安定性がよいものが好ましい。例えば、70℃20分で85％以上の活性を保持する酵素であれば好ましく、80℃20分で85％以上の活性を保持する酵素であればさらに好ましく、90℃20分で85％以上の活性を保持する酵素であれば大変に好ましい。その結果、特に本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを液状試薬に使用することにより大幅な試薬の安定性の向上が見込まれる。 In addition, the aspartate dehydrogenase of the present invention preferably has good heat stability. For example, an enzyme that retains 85% or more activity at 70 ° C. for 20 minutes is preferable, an enzyme that retains 85% or more activity at 80 ° C. for 20 minutes is more preferable, and 85% or more at 90 ° C. for 20 minutes. Enzymes that retain activity are highly preferred. As a result, the reagent stability is expected to be greatly improved by using the aspartate dehydrogenase of the present invention as a liquid reagent.
本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼとして、具体的に次のような理化学的性質を有するものを挙げることができる。。
（１）熱安定性が、10mM リン酸カリウム緩衝液（pH7.2）中で、少なくとも70℃、20分間熱処理した場合に酵素活性が85％以上保持され、80℃で85％以上保持され、さらに90℃で85%以上保持される。
（２）至適pHが、pH11からpH12である。
（３）至適温度が、約80℃である。
（４）pH安定性が、pH5からpH11.0の範囲で安定である。
（５）基質特異性がL-アスパラギン酸に特異的である。
このような理化学的性質を有するアスパラギン酸デヒドロゲナーゼは、L−アスパラギン酸に対して特異的であり、かつ高い熱安定性により、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの測定に好適に用いることができる。
Specific examples of the aspartate dehydrogenase of the present invention include the following physicochemical properties. .
(1) The thermostability is maintained at 85% or more when heated at least 70 ° C. for 20 minutes in 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.2), and 85% or more at 80 ° C. Furthermore, it is kept at 85% or more at 90 ° C.
(2) The optimum pH is pH 11 to pH 12.
(3) The optimum temperature is about 80 ° C.
(4) The pH stability is stable in the range of pH 5 to pH 11.0.
(5) The substrate specificity is specific to L-aspartic acid.
Aspartate dehydrogenase having such physicochemical properties is specific for L-aspartate and can be suitably used for measurement of aspartate aminotransferase due to its high thermal stability.
本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの酵素作用について説明する。本作用は、in vivoでの反応は式６と考えられるが、in vitroではイミノアスパラギン酸が自発的に加水分解されるので見かけ上の反応は式７である。
L-アスパラギン酸 ＋ NAD(P)+ ⇔ イミノアスパラギン酸 ＋ NAD(P)H ＋ H+（式６）
L-アスパラギン酸 ＋ NAD(P)+ ＋ H2O ⇔ オキサロ酢酸 ＋ NAD(P)H ＋ NH4 +（式7）
The enzyme action of the aspartate dehydrogenase of the present invention will be described. In this action, the reaction in vivo is considered to be Formula 6, but since the iminoaspartic acid is spontaneously hydrolyzed in vitro, the apparent reaction is Formula 7.
L-aspartic acid + NAD (P) + ⇔ iminoaspartic acid + NAD (P) H + H + (Formula 6)
L-aspartic acid + NAD (P) + + H 2 O オ キ サ oxaloacetic acid + NAD (P) H + NH 4 + (Formula 7)
本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを用いたASTの測定原理について説明する。本方法は、ASTを含有する体液などの試料にアスパラギン酸デヒドロゲナーゼとNAD又はNADPを作用させることで、NAD又はNADPが還元されて生成するNADH又はNADPHについて、その増加速度を紫外部における吸光度により測定し、定量するものである。 The measurement principle of AST using the aspartate dehydrogenase of the present invention will be described. This method measures the rate of increase of NADH or NADPH produced by reduction of NAD or NADP by acting aspartate dehydrogenase and NAD or NADP on a sample such as a body fluid containing AST by absorbance in the ultraviolet region. And quantified.
本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼによるASTの測定方法の特徴は、（1）NADH、NADPH又はホルマザン色素の増加速度を測定する方法であるために、その測定可能な濃度範囲がNADH、NADPH又はホルマザン色素の減少速度を測定する方法に比べて広く、高濃度（２０００U/ml以下）まで測定できる、（2）該酵素はデヒドロゲナーゼであるために、高濃度（１０００U/ml以上）のASTを測定する場合、溶存酸素の濃度が全反応を律速しない、という点にある。 The feature of the method for measuring AST by aspartate dehydrogenase of the present invention is (1) a method for measuring the increase rate of NADH, NADPH or formazan dye, and therefore the measurable concentration range is NADH, NADPH or formazan dye. Compared to the method for measuring the rate of decrease, it can be measured to a high concentration (2000 U / ml or less). (2) Since the enzyme is a dehydrogenase, when measuring AST at a high concentration (1000 U / ml or more), The concentration of dissolved oxygen does not limit the overall reaction.
本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを用いたASTの測定法の反応式は次のようである。式8のASTの反応により生じたアスパラギン酸を本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの存在下にオキサロ酢酸に変化させる。このとき、補酵素NAD(P)はNAD(P)+となるため、340nmにおけるNADHの吸光度は増加する（式９）。このNADHの吸光度よりASTを定量し、ASTの増加速度を測定することができる。また、ジアホラーゼとニトロブルーテトラゾリウム(NBT)を使用してホルマザン色素の増加を測定することで（式10）、ASTを定量することもできる。 The reaction formula of the AST measurement method using the aspartate dehydrogenase of the present invention is as follows. Aspartate produced by the reaction of AST of formula 8 is converted to oxaloacetate in the presence of the aspartate dehydrogenase of the present invention. At this time, since coenzyme NAD (P) becomes NAD (P) + , the absorbance of NADH at 340 nm increases (Equation 9). AST can be quantified from the absorbance of NADH, and the rate of increase of AST can be measured. AST can also be quantified by measuring the formazan dye increase using diaphorase and nitro blue tetrazolium (NBT) (Equation 10).
L-グルタミン酸 ＋ オキサロ酢酸 → L-アスパラギン酸 ＋ α-ケトグルタル酸 （式８）
L-アスパラギン酸 ＋ NAD(P)+ ＋ H2O → オキサロ酢酸 ＋ NAD(P)H ＋NH4 + （式９）
NAD(P)H ＋ NBT ＋ H+ → ホルマザン色素 ＋ NAD(P)+ (式11)
L-glutamic acid + oxaloacetic acid → L-aspartic acid + α-ketoglutaric acid (Formula 8)
L-aspartic acid + NAD (P) + + H 2 O → oxaloacetic acid + NAD (P) H + NH 4 + (formula 9)
NAD (P) H + NBT + H + → formazan dye + NAD (P) + (Formula 11)
本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを用いたASTの測定法において、使用しうる試料とは、ASTを含有するものであれば特に限定されないが、生体試料、例えば、血漿、血清、尿などを挙げる事ができる。 In the method for measuring AST using the aspartate dehydrogenase of the present invention, the sample that can be used is not particularly limited as long as it contains AST, but biological samples such as plasma, serum, urine and the like may be mentioned. it can.
また、本発明の測定法において、使用しうる試薬とは、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼの作用により試料中のAST反応生成物であるアスパラギン酸を測定する試薬、及び該反応によって変化するNAD(P)H又はホルマザン色素などの光学的増加によりASTを測定する試薬のことをいう。 In the measurement method of the present invention, the reagent that can be used includes a reagent for measuring aspartic acid, which is an AST reaction product in a sample by the action of aspartate dehydrogenase, and NAD (P) H or A reagent that measures AST by optical increase of formazan dye or the like.
本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを用いたASTの測定法において、使用するアスパラギン酸デヒドロゲナーゼは反応液中、0から100U/ml、好ましくは0から10U／mlさらに好ましくは0から1U／mlである。 In the method for measuring AST using the aspartate dehydrogenase of the present invention, the aspartate dehydrogenase used is 0 to 100 U / ml, preferably 0 to 10 U / ml, more preferably 0 to 1 U / ml in the reaction solution.
緩衝剤としては公知のいずれの緩衝剤も使用されうるが、好ましくはpH８以上の緩衝液が用いられ、例えば、トリス緩衝液、グリシルグリシン緩衝液、２−アミノ−２−メチル１，３−プロパンジオール緩衝液、ジエタノールアミン緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液、炭酸ナトリウム炭酸水素ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液、やGOODの緩衝液、その他BrittonとRobinsonの広域緩衝液などが挙げられる。緩衝液の濃度は反応液のpHを長期間安定に保つ濃度で有ればよいが、1から2000mM、好ましくは10から500mM、さらに好ましくは20から300mMである。 Any known buffering agent can be used as the buffering agent. Preferably, a buffering solution having a pH of 8 or higher is used. For example, Tris buffer, glycylglycine buffer, 2-amino-2-methyl 1,3- Examples include propanediol buffer solution, diethanolamine buffer solution, borate buffer solution, glycine buffer solution, sodium carbonate sodium bicarbonate buffer solution, phosphate buffer solution, GOOD buffer solution, and Britton and Robinson wide-area buffer solution. The concentration of the buffer solution may be a concentration that keeps the pH of the reaction solution stable for a long time, but is 1 to 2000 mM, preferably 10 to 500 mM, more preferably 20 to 300 mM.
使用するオキサロ酢酸濃度は反応液中に反応液を長期間安定に保つために必要充分量入っていれば良いが、1から1000mM、好ましくは1から500mM、さらに好ましくは10から100mMである。使用するNAD(P)濃度は反応液中に反応液を長期間安定に保つために必要充分量入っていれば良いが、1から1000mM、好ましくは1から500mM、さらに好ましくは10から100mMである。 The concentration of oxaloacetic acid to be used is sufficient if it is necessary and sufficient to keep the reaction solution stable for a long period of time, but it is 1 to 1000 mM, preferably 1 to 500 mM, more preferably 10 to 100 mM. The NAD (P) concentration used is sufficient if it is contained in the reaction solution in a necessary and sufficient amount to keep the reaction solution stable for a long period of time, but it is 1 to 1000 mM, preferably 1 to 500 mM, more preferably 10 to 100 mM. .
使用するグルタミン酸濃度は反応液中に反応液を長期間安定に保つために必要充分量入っていれば良いが、1から1000mM、好ましくは1から500mM、さらに好ましくは10から100mMである。その他、必要に応じてジアホラーゼを１から500U／ml、好ましくは１から50U／ml、ホルマザン色素を0.1から10％、好ましくは0.1から2％、界面活性剤を0.001％から5％、好ましくは0.05％から１％添加してもよい。 The glutamic acid concentration to be used may be a necessary and sufficient amount in order to keep the reaction solution stable for a long period of time, but it is 1 to 1000 mM, preferably 1 to 500 mM, more preferably 10 to 100 mM. In addition, diaphorase is 1 to 500 U / ml, preferably 1 to 50 U / ml, formazan dye is 0.1 to 10%, preferably 0.1 to 2%, and surfactant is 0.001% to 5%, preferably 0.05 as necessary. % To 1% may be added.
本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを含有するアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ組成物も本発明の範囲内である。
当該組成物としては、少なくとも本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを含有する組成物であれば特に限定されないが、例えば、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼに加えて、さらにpH緩衝剤、オキサロ酢酸、NAD(P)、およびグルタミン酸から選択される少なくとも１つ以上の成分を含むことを特徴とする組成物が挙げられる。
また、これらに加えて、さらに、ジアホラーゼ、ホルマザン色素、界面活性剤、および賦形剤から選択される少なくとも１つ以上の成分を含むことを特徴とする組成物も好適な一例として挙げられる。
本発明の酵素を含有する組成物の使用目的は特に限定されないが、例えば、AST測定に使用することは好ましい態様である。AST測定に使用する態様としては、例えば、AST測定キットへの使用、ポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）のキャピラリーや試験片への使用、又は酵素センサーや酵素電極としての使用等が挙げられるが、AST測定キットへの使用が好ましい。
該組成物中のpH緩衝剤は公知のいずれのpH緩衝剤も使用されうる。本発明のAST測定には好ましくはpH８以上に調整できるpH緩衝剤が用いられ、例えば、トリス緩衝剤、グリシルグリシン緩衝剤、２−アミノ−２−メチル１，３−プロパンジオール緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、炭酸ナトリウム炭酸水素ナトリウム緩衝剤、リン酸緩衝剤やＧＯＯＤの緩衝剤、その他ＢｒｉｔｔｏｎとＲｏｂｉｎｓｏｎの広域緩衝剤などが挙げられる。
該組成物中のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ濃度は、１０mU/ml、緩衝剤濃度は１０mM、オキサロ酢酸濃度は１mM、NAD(P)濃度は１mM、グルタミン酸濃度は１mMが好ましく、必要に応じてジアホラーゼを１U/ml、ホルマザン色素を0.1%界面活性剤を0.05%加えても良い。別の態様においては、上記の各物質の成分の濃度が必要に応じて濃縮された組成物であってもよい。例えば、ＰＯＣのキャピラリーや試験片への使用又は酵素センサーや酵素電極としての使用の場合、各成分の濃度は通常よりも濃い濃度が好ましく、例えば、紙に染み込ませたり、ゲル状組成物として使用することが好ましい。
Aspartate dehydrogenase compositions containing the aspartate dehydrogenase of the present invention are also within the scope of the present invention.
The composition is not particularly limited as long as it contains at least the aspartate dehydrogenase of the present invention. For example, in addition to aspartate dehydrogenase, a pH buffer, oxaloacetate, NAD (P), and glutamate The composition characterized by including the at least 1 or more component selected from is mentioned.
In addition to these, a composition comprising at least one component selected from diaphorase, a formazan dye, a surfactant, and an excipient is also a suitable example.
Although the intended purpose of the composition containing the enzyme of the present invention is not particularly limited, for example, it is a preferred embodiment to use it for AST measurement. As an aspect used for AST measurement, for example, use to an AST measurement kit, use to a capillary or a test piece of a point of care (POC), or use as an enzyme sensor or an enzyme electrode can be mentioned. Use in an AST measurement kit is preferred.
Any known pH buffering agent may be used as the pH buffering agent in the composition. The AST measurement of the present invention preferably uses a pH buffer that can be adjusted to pH 8 or higher, such as Tris buffer, glycylglycine buffer, 2-amino-2-methyl 1,3-propanediol buffer, diethanolamine. Buffering agents, boric acid buffering agents, glycine buffering agents, sodium carbonate sodium bicarbonate buffering agents, phosphate buffering agents and GOOD buffering agents, and other Britton and Robinson broad-area buffering agents.
The aspartate dehydrogenase concentration in the composition is preferably 10 mU / ml, the buffer concentration is 10 mM, the oxaloacetate concentration is 1 mM, the NAD (P) concentration is 1 mM, and the glutamate concentration is 1 mM. ml, formazan dye and 0.05% of 0.1% surfactant may be added. In another embodiment, the composition may be a composition in which the concentration of each of the above-described substances is concentrated as necessary. For example, when using POC in capillaries and test pieces, or as an enzyme sensor or an enzyme electrode, the concentration of each component is preferably higher than usual. For example, it is soaked in paper or used as a gel composition. It is preferable to do.
本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを用いたASTの測定法を行うにあたり、測定に用いる試薬を組み合わせ、キットとすることもできる。
本発明の酵素を含有するキットとしては、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼを含有し、ASTを測定できるキットであれば特に限定されないが、例えば、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ、緩衝液、オキサロ酢酸、NAD(P)、グルタミン酸を含有するキットが好ましい。該キットには、必要に応じて適宜、ジアホラーゼ、ホルマザン色素、界面活性剤を添加してもよい。また、例えば、含有する試薬の安定化や測定精度の安定化や向上の目的で、2試薬以上に分けて、キットとしても良い。
In performing the AST measurement method using the aspartate dehydrogenase of the present invention, a reagent used for the measurement may be combined to form a kit.
The kit containing the enzyme of the present invention is not particularly limited as long as it contains aspartate dehydrogenase and can measure AST. For example, aspartate dehydrogenase, buffer solution, oxaloacetate, NAD (P), and glutamate can be used. The containing kit is preferred. If necessary, diaphorase, formazan dye, and surfactant may be added to the kit. Further, for example, a kit may be divided into two or more reagents for the purpose of stabilizing the contained reagent and stabilizing or improving the measurement accuracy.
本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼを含有するキットを用いて試料中のAST活性を測定する方法では、反応槽中で試料と本発明の酵素を含有するキットを混和して20から50℃で0から15分間、通常好ましくは、37℃で5分間反応させることにより、NAD(P)Hまたはホルマザン色素の変化を測定することができる。測定には例えばNAD(P)Hまたはホルマザン色素の吸収極大を利用した光学的方法や電位差などの電気的な変化を測定する方法が例示される。 In the method of measuring the AST activity in a sample using the kit containing the aspartate dehydrogenase of the present invention, the sample and the kit containing the enzyme of the present invention are mixed in a reaction vessel and mixed at 20 to 50 ° C. from 0 to 15 Changes in NAD (P) H or formazan dye can be measured by reacting for 5 minutes, usually preferably at 37 ° C. for 5 minutes. Examples of the measurement include an optical method using the absorption maximum of NAD (P) H or formazan dye and a method of measuring an electrical change such as a potential difference.
これらの試薬やキットは液状品、液状品の凍結物、液状品の凍結乾燥品、又は液状品の乾燥品（加熱乾燥及び／又は風乾及び／又は減圧乾燥等による）として提供できる。液状品、液状品の凍結物、液状品の凍結乾燥品が好ましく、液状品、液状品の凍結乾燥品がより好ましく、液状品が最も好ましい。別の態様として、液状品の凍結物が好ましい場合もある。さらに別の態様としては、液状品の凍結乾燥が好ましい場合もある。 These reagents and kits can be provided as liquid products, frozen products of liquid products, freeze-dried products of liquid products, or dried products of liquid products (by heat drying and / or air drying and / or vacuum drying, etc.). Liquid products, liquid frozen products, and liquid freeze-dried products are preferred, liquid products and liquid freeze-dried products are more preferred, and liquid products are most preferred. In another embodiment, a frozen liquid product may be preferable. As yet another aspect, lyophilization of a liquid product may be preferred.
以下、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明は何らこれらにより限定されるものではない。なお、実施例中、常法に従い、と記述した遺伝子操作技術は、例えば、市販の各種酵素、キット類に添付された手順に従えば実施できるものである。また、実験に使用した組み換えDNA実験酵素試薬(制限酵素など）、ベクターDNA、キット類は特に指摘しない限り宝酒造株式会社より購入したものである。
Examples of the present invention will be described in detail below, but the present invention is not limited thereto. It should be noted that the genetic manipulation technique described in the examples according to a conventional method can be carried out, for example, according to the procedures attached to various commercially available enzymes and kits. Recombinant DNA experimental enzyme reagents (such as restriction enzymes), vector DNA, and kits used in the experiments were purchased from Takara Shuzo Co. unless otherwise specified.
アスパラギン酸デヒドロゲナーゼの酵素活性測定方法
＜酵素活性測定法＞
アスパラギン酸デヒドロゲナーゼの酵素活性は還元的アミノ化反応を測定して求めた。酵素活性測定反応液の組成は次の通りである。
100mM トリス-塩酸緩衝液（pH7.5）
5mM オキサロ酢酸
800mM 塩化アンモニウム
0.2mM NADH
この酵素活性測定溶液0.95mlを層長1cmの石英セル中で50℃、3分間予備加温した後、適当に希釈した酵素液0.05mlを添加して酵素反応を開始し、反応開始後1分後から2分後の340nmにおける吸光度差を測定した（As）。また、盲検として適当に希釈した酵素液の代わりに蒸留水を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定した（Ab）。この酵素液使用の吸光度（As）と盲検の吸光度（Ab）の吸光度差（As-Ab）より酵素活性を求めた。酵素活性1単位（1ユニット）は50℃で1分間に1マイクロモルのNADHをNADに酸化する酵素量とした。本条件下におけるNADHのミリモル吸光係数は6.22を使用した。
Method for measuring enzyme activity of aspartate dehydrogenase <Method for measuring enzyme activity>
The enzyme activity of aspartate dehydrogenase was determined by measuring the reductive amination reaction. The composition of the enzyme activity measurement reaction solution is as follows.
100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5)
5 mM oxaloacetic acid
800 mM ammonium chloride
0.2mM NADH
0.95 ml of this enzyme activity measurement solution is pre-warmed in a quartz cell with a layer length of 1 cm at 50 ° C. for 3 minutes, and then 0.05 ml of an appropriately diluted enzyme solution is added to start the enzyme reaction. The difference in absorbance at 340 nm was measured 2 minutes later (As). In addition, as a blind test, the same procedure was performed using distilled water instead of the appropriately diluted enzyme solution, and the difference in absorbance was measured (Ab). The enzyme activity was determined from the difference in absorbance (As-Ab) between the absorbance using this enzyme solution (As) and the absorbance in the blind (Ab). One unit of enzyme activity (one unit) was defined as the amount of enzyme that oxidizes 1 micromole of NADH to NAD per minute at 50 ° C. Under this condition, NADH had a millimolar extinction coefficient of 6.22.
アスパラギン酸デヒドロゲナーゼの理化学的性質
後述する試験例１〜５により製造されたアーキオグロブス・フルジダス DSM4304菌株由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの理化学的性質について測定結果を示す。
＜熱安定性＞
アスパラギン酸デヒドロゲナーゼを1mg/mlになるように10mM リン酸カリウム緩衝液（pH7.2）中に溶解し、各温度で20分間熱処理した後の残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果を図1に示した。これより少なくとも90℃、20分で85％以上の活性を保持していることが確認された。
Physicochemical properties of aspartate dehydrogenase The measurement results of the physicochemical properties of aspartate dehydrogenase derived from Archaerobus fluidas DSM4304 strain produced in Test Examples 1 to 5 described later are shown.
<Thermal stability>
Aspartate dehydrogenase was dissolved in 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.2) at 1 mg / ml, and the residual activity after heat treatment at each temperature for 20 minutes was measured according to the enzyme activity measurement method. The results are shown in FIG. From this, it was confirmed that 85% or more activity was retained at 90 ° C for 20 minutes.
＜Km値＞
本発明のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの各基質、各補酵素に対するKm値をLineweaver-Burkプロットにより算出した、その結果を表１にまとめて示した。
<Km value>
The Km value for each substrate and each coenzyme of the aspartate dehydrogenase of the present invention was calculated by Lineweaver-Burk plot, and the results are summarized in Table 1.
＜分子量＞
分子量はSuperose6（登録商標、Pharmacia Biotech社）によるゲル濾過法にて48.7kDa、SDSポリアクリルアミド電気泳動法にて25.5kDa、アミノ酸一次配列からの計算値にて26,208であった。したがって、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼは2量体と推定された。
<Molecular weight>
The molecular weight was 48.7 kDa by gel filtration using Superose 6 (registered trademark, Pharmacia Biotech), 25.5 kDa by SDS polyacrylamide electrophoresis, and 26,208 calculated from the primary amino acid sequence. Therefore, aspartate dehydrogenase was assumed to be a dimer.
＜至適pH＞
前記酵素活性測定法にしたがって、至適pHを調べ、その結果を図2に示した。図2は、pH6.5からpH7.5の範囲はリン酸カリウム緩衝液（図中○印）、pH7.5からpH9.2の範囲はグリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（図中●印）、pH9.0からpH10.5の範囲はグリシン-水酸化ナトリウム緩衝液（図中△印）、及びpH10.5からpH12.0の範囲はリン酸1水素ナトリウム-水酸化ナトリウム緩衝液（図中▲印）を使用した場合の最大活性を100％とした相対活性を示すもので、これよりアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの至適pHはpH11からpH12であることが確認された。
<Optimum pH>
The optimum pH was examined according to the enzyme activity measurement method, and the results are shown in FIG. Figure 2 shows that the pH range from 6.5 to 7.5 is potassium phosphate buffer (circles in the figure), and the range from pH7.5 to pH9.2 is glycylglycine-sodium hydroxide buffer (circles in the figure). ), PH 9.0 to pH 10.5 range is glycine-sodium hydroxide buffer (△ mark in the figure), and pH 10.5 to pH 12.0 range is sodium monohydrogen phosphate-sodium hydroxide buffer (Figure This shows a relative activity with a maximum activity of 100% when middle ▲ is used. From this, it was confirmed that the optimum pH of aspartate dehydrogenase was pH 11 to pH 12.
＜至適温度＞
前記酵素活性測定法にしたがって、活性測定時の反応温度を調べ、その結果を図3に示した。図3は活性測定時の反応温度を20℃から90℃の範囲とした場合の最大活性を100％とした相対活性を示すもので、これよりアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの至適温度は約80℃であることが確認された。
<Optimum temperature>
According to the enzyme activity measurement method, the reaction temperature at the time of activity measurement was examined, and the result is shown in FIG. Figure 3 shows the relative activity with the maximum activity being 100% when the reaction temperature at the time of activity measurement is in the range of 20 ° C to 90 ° C. From this, the optimum temperature for aspartate dehydrogenase is about 80 ° C. It was confirmed.
＜pH安定性＞
前記酵素活性測定法に従って、100mMの各種緩衝液中のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ1mg/mlを50℃で30分間処理した場合の残存活性を測定し、その結果を図4に示した。図4は、pH3.5からpH5.5の範囲は100mMの酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液（図中○印）、pH5.5からpH7.5の範囲は100mMのBisTris-塩酸緩衝液（図中●印）、pH6.5からpH7.5の範囲は100mMのリン酸カリウム緩衝液（図中△印）、pH7.5からpH9.0の範囲はグリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（図中▲印）、pH9.0からpH11の範囲はグリシン-水酸化ナトリウム緩衝液（図中□印）、及びpH11.0からpH12.0の範囲はリン酸1水素ナトリウム-水酸化ナトリウム緩衝液（図中■印）を使用したときの最大活性を100％とした相対活性を示すもので、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼはpH5からpH11.0の範囲で安定であることが確認された。
<PH stability>
According to the enzyme activity measurement method, residual activity was measured when 1 mg / ml of aspartate dehydrogenase in 100 mM of various buffer solutions was treated at 50 ° C. for 30 minutes, and the results are shown in FIG. Fig. 4 shows that the pH 3.5 to pH 5.5 range is 100 mM acetic acid-sodium acetate buffer (circle in the figure), and the pH 5.5 to pH 7.5 range is 100 mM BisTris-HCl buffer (in the figure ●). ), PH 6.5 to pH 7.5 is 100 mM potassium phosphate buffer (△ in the figure), pH 7.5 to pH 9.0 is glycylglycine-sodium hydroxide buffer (▲ in the figure) ), PH 9.0 to pH 11 range is glycine-sodium hydroxide buffer (□ in the figure), and pH 11.0 to pH 12.0 range is sodium monohydrogen phosphate-sodium hydroxide buffer (in the figure) It shows a relative activity with the maximum activity of 100% being used, and aspartate dehydrogenase was confirmed to be stable in the range of pH 5 to pH 11.0.
＜基質特異性＞
表１に示す各化合物を基質として活性染色法にて基質特異性を測定した。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼはL-アスパラギン酸のみを基質とすることが確認された。
<Substrate specificity>
Substrate specificity was measured by an activity staining method using each compound shown in Table 1 as a substrate. Aspartate dehydrogenase was confirmed to use only L-aspartate as a substrate.
［試験例１］
＜アーキオグロブス・フルジダス DSM4304菌株からのDNAの抽出＞
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen （DSMZ）から購入したアーキオグロブス・フルジダス DSM4304を50mMのトリス-塩酸（pH8.0）、50mMのEDTA、15％シュークロースを含む1mg/mlリゾチーム溶液で37℃、10分処理した後、SDSを最終濃度0.25％になるよう添加して菌体を溶解した。さらに等量のフェノール／クロロホルム=1：1混合液を加え、30分攪拌した後、12,000rpmで15分遠心分離処理をして水層を回収した。
回収した水層に10分の1量の3Mの酢酸ナトリウム（pH5.5）を混合後、2倍量のエタノールを静かに重層し、ゲノムDNAをガラス棒に巻き付かせて分離した。分離したゲノムDNAを、10mM トリス-塩酸（pH8.0）、1mMのEDTA水溶液（TEバッファー）20mlに溶解し、20mg/mlのRNaseAを200μl加え、37℃で1時間保温し、混在しているRNAを分解した。次いで、等量のフェノール/クロロホルム混合液を加え、前記と同様に処理して、水層を分取した。分取した水層に10分の1量の3Mの酢酸ナトリウム（pH5.5）と2倍量のエタノールを加えて前記の方法でもう一度ゲノムDNAを分離した。
この染色体を50mlのTE（10mMのトリス-塩酸緩衝液（pH8.0）、1mMのEDTA（pH8.0））に溶解し、TE飽和のフェノールとクロロホルムの1：1混和液20mlを加え、全体を懸濁した後、同様の遠心分離を繰り返し、上層を再び別の容器に移した。この分離した上層20mlに3M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）2mlとエタノール50mlを加え、撹拌後-70℃で5分間冷却した後、遠心分離（2,000G、4℃、15分）し、沈澱した染色体を75% エタノールで洗い、減圧乾燥した。以上の操作によりアーキオグロブス・フルジダス DSM4304標品1mgを得た。
[Test Example 1]
<Extraction of DNA from Archoglobus fulgidus DSM4304>
Archeoglobus Fluidas DSM4304 purchased from Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) at 37 ° C in a 1 mg / ml lysozyme solution containing 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM EDTA, 15% sucrose After the minute treatment, SDS was added to a final concentration of 0.25% to dissolve the cells. Further, an equal amount of phenol / chloroform = 1: 1 mixture was added and stirred for 30 minutes, and then centrifuged at 12,000 rpm for 15 minutes to recover the aqueous layer.
The recovered aqueous layer was mixed with 1/10 volume of 3M sodium acetate (pH 5.5), and then twice as much ethanol was gently overlaid, and the genomic DNA was wrapped around a glass rod and separated. Dissolved genomic DNA is dissolved in 20 ml of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 1 mM EDTA aqueous solution (TE buffer), 200 μl of 20 mg / ml RNaseA is added, and the mixture is incubated at 37 ° C. for 1 hour. RNA was degraded. Next, an equal amount of a phenol / chloroform mixed solution was added, and the mixture was treated in the same manner as described above to separate the aqueous layer. One-tenth volume of 3M sodium acetate (pH 5.5) and twice the volume of ethanol were added to the separated aqueous layer, and genomic DNA was separated once again by the method described above.
Dissolve this chromosome in 50 ml of TE (10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0)), add 20 ml of a 1: 1 mixture of TE-saturated phenol and chloroform. After suspending, the same centrifugation was repeated, and the upper layer was transferred again to another container. Add 2 ml of 3M sodium acetate buffer (pH 5.5) and 50 ml of ethanol to the separated 20 ml of the upper layer. After stirring, cool at -70 ° C for 5 minutes, then centrifuge (2,000G, 4 ° C, 15 minutes) to precipitate. The chromosomes were washed with 75% ethanol and dried under reduced pressure. By the above operation, 1 mg of Archeoglobus fluzidus DSM4304 was obtained.
［試験例２］
＜PCR法による配列表に示す遺伝子の増幅＞
PCRは以下の条件で行った。
（1）プライマー
配列表配列番号3に示したヌクレオチドをセンスプライマーとして、配列表配列番号4に示したヌクレオチドをアンチセンスプライマーとして用いた。
(2) PCR反応溶液組成
KOD DNAポリメラーゼ １μl
10倍濃縮のKOD DNAポリメラーゼに添付の緩衝液 5μl
1mM塩化マグネシウム 2μl
0.2mM ｄＮＴＰ 7.5μl
101μg/ml アーキオグロブス・フルジダス DSM4304のDNA 10μl
10pmol/μl センスプライマー 5μl
アンチセンスプライマー 5μl
蒸留水 14.5μl
（3）PCR反応条件
（a）98℃15秒、（b）65℃2秒、（c）74℃30秒、（a）から（c）を30回繰り返した。
[Test Example 2]
<Amplification of gene shown in sequence listing by PCR method>
PCR was performed under the following conditions.
(1) Primer The nucleotide shown in SEQ ID NO: 3 was used as a sense primer, and the nucleotide shown in SEQ ID NO: 4 was used as an antisense primer.
(2) PCR reaction solution composition
1 μl of KOD DNA polymerase
5 μl of buffer supplied with 10-fold concentrated KOD DNA polymerase
1 mM magnesium chloride 2 μl
0.2 mM dNTP 7.5 μl
101μg / ml Archoglobus fluidas DSM4304 DNA 10μl
10 pmol/μl sense primer 5μl
Antisense primer 5μl
Distilled water 14.5μl
(3) PCR reaction conditions (a) 98 ° C for 15 seconds, (b) 65 ° C for 2 seconds, (c) 74 ° C for 30 seconds, and (a) to (c) were repeated 30 times.
［試験例３］
＜アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ発現プラスミドの構築＞
実施例2で増幅したPCR産物はNdeIとBamHIで切断して精製し、これをpET-11aのNdeIとBamHIの切断部位に挿入し、アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ発現プラスミド遺伝子が連結されたプラスミドを構築し、本プラスミドをpET-11a/AF1838と命名した。プラスミドpET-11a/AF1838の構造を図5に示した。なお、図中のBamHIとNdeI間はアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ構造遺伝子を、「Ap」はアンピシリン耐性構造遺伝子を、「ori」は大腸菌プラスミドの複製起点領域を、「lacI」はlacプロモーター領域をそれぞれ表す。このpET-11a/AF1838をエシェリヒア・コリ BL21codon Plus(DE3)株に導入した。
[Test Example 3]
<Construction of Aspartate Dehydrogenase Expression Plasmid>
The PCR product amplified in Example 2 was cleaved with NdeI and BamHI and purified, and inserted into the NdeI and BamHI cleavage sites of pET-11a to construct a plasmid in which the aspartate dehydrogenase expression plasmid gene was ligated, This plasmid was designated as pET-11a / AF1838. The structure of plasmid pET-11a / AF1838 is shown in FIG. In the figure, between BamHI and NdeI is an aspartate dehydrogenase structural gene, “Ap” is an ampicillin resistance structural gene, “ori” is an E. coli plasmid replication origin region, and “lacI” is a lac promoter region. This pET-11a / AF1838 was introduced into Escherichia coli BL21codon Plus (DE3) strain.
［試験例４］
<pET-11a/AF1838保持大腸菌の培養とその細胞抽出液の調製＞
pET-11a/AF1838を導入したエシェリヒア・コリ ＢＬ21codon Plus(DE3)株を50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地に接種し、培養液の600nmの吸光度が0.6になったときにpETプロモーター誘導剤である1mMのIPTG（和光純薬社製）を添加した。その後、37℃でさらに4時間培養し、遠心分離（15,000G、1分、4℃）により集菌し、10mMのトリス-塩酸緩衝液（pH8.5）で懸濁して超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（15,000Ｇ、5分、4℃）し、上清を取得して粗酵素液とした。
[Test Example 4]
<Culture of pET-11a / AF1838 E. coli and preparation of cell extract>
Escherichia coli BL21codon Plus (DE3) strain into which pET-11a / AF1838 has been introduced is inoculated into LB medium containing 50 μg / ml ampicillin and is a pET promoter inducer when the absorbance at 600 nm of the culture solution becomes 0.6 1 mM IPTG (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added. Then, incubate for an additional 4 hours at 37 ° C, collect by centrifugation (15,000G, 1 minute, 4 ° C), suspend in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) and use an ultrasonic crusher. The cells were crushed and centrifuged (15,000 G, 5 minutes, 4 ° C.), and the supernatant was obtained to obtain a crude enzyme solution.
［試験例５］
＜アスパラギン酸デヒドロゲナーゼの精製法＞
実施例4で得た粗酵素液を80℃で20分間加熱処理した。その後、遠心分離（15,000G、5分、4℃）し、上清を取得した。この上清を10mMのトリス-塩酸緩衝液（pH8.5）で平衡化したRed Sepharose CL-4B（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に吸着させた。10mMのトリス-塩酸緩衝液（pH8.5）で充分に洗浄した後、0及び0.5Mの塩化カリウムを含む10mMのトリス-塩酸緩衝液（pH8.5）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分を10mMのトリス-塩酸緩衝液（pH8.5）で平衡化したG-25で脱塩して精製酵素とし、SDS-PAGEで単一バンドである事を確認した。精製工程のまとめを表3に、SDS−PAGE結果を図6に示した。
[Test Example 5]
<Purification method of aspartate dehydrogenase>
The crude enzyme solution obtained in Example 4 was heat-treated at 80 ° C. for 20 minutes. Thereafter, centrifugation (15,000 G, 5 minutes, 4 ° C.) was performed to obtain a supernatant. The supernatant was adsorbed on Red Sepharose CL-4B (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5). After thoroughly washing with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), elution was performed with a linear gradient using 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) containing 0 and 0.5 M potassium chloride. . The active fraction was desalted with G-25 equilibrated with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) to obtain a purified enzyme, and a single band was confirmed by SDS-PAGE. A summary of the purification steps is shown in Table 3, and the SDS-PAGE results are shown in FIG.
［実施例１］＜アスパラギン酸デヒドロゲナーゼを用いたASTの測定＞
サンプルとしてエンザイムレファレンスマテリアル（日本・常用酵素標準物質、ERM（旭化成ファーマ社製））ロット2を使用した。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼを使用したAST測定試薬は100mM トリス-塩酸緩衝液（pH9及びpH10）、1mM オキサロ酢酸、2mM NAD、2.5mU/ml アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ、2mM グルタミン酸、5U/ml ジアホラーゼ（旭化成ファーマ社製）、0.0125% NBT、0.1% トリトンX-100から成る。AST測定試薬0.7mlを層長1cmの石英セル中37℃で3分間予備加温した後、AST活性161U/LのERMを10μl添加して酵素反応を開始し、反応開始後4分後から6分後の550nmにおける吸光度差を測定した（As）。また、盲検としてアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの代わりに蒸留水を用いたAST測定試薬を使用して同一の操作を行って吸光度差を測定した（Ab）。この酵素液使用の吸光度（As）と盲検の吸光度（Ab）の吸光度差（As-Ab）をまとめて表4に示した。アスパラギン酸デヒドロゲナーゼを用いて、ASTを増加反応で測定できた。
[Example 1] <Measurement of AST using aspartate dehydrogenase>
As a sample, Enzyme Reference Material (Japan / Regular enzyme standard, ERM (Asahi Kasei Pharma)) lot 2 was used. AST measurement reagent using aspartate dehydrogenase is 100mM Tris-HCl buffer (pH9 and pH10), 1mM oxaloacetate, 2mM NAD, 2.5mU / ml aspartate dehydrogenase, 2mM glutamate, 5U / ml diaphorase (manufactured by Asahi Kasei Pharma) , 0.0125% NBT, 0.1% Triton X-100. After pre-warming 0.7 ml of AST measurement reagent in a quartz cell with a layer length of 1 cm at 37 ° C for 3 minutes, 10 μl of ERM with AST activity 161 U / L was added to start the enzyme reaction. The difference in absorbance at 550 nm after a minute was measured (As). Further, as a blind test, the same operation was performed using an AST measurement reagent using distilled water instead of aspartate dehydrogenase, and the difference in absorbance was measured (Ab). Table 4 summarizes the difference in absorbance (As-Ab) between the absorbance using this enzyme solution (As) and the absorbance in the blind (Ab). Using aspartate dehydrogenase, AST could be measured in an incremental reaction.
本発明により、安定性が良く、高濃度のASTの定量が可能なアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ、その製造法、及びそれを用いたASTの測定法、測定試薬を提供できる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to provide an aspartate dehydrogenase having good stability and capable of quantifying AST at a high concentration, a production method thereof, an AST measurement method using the same, and a measurement reagent.
Claims (20)
Km１＜Km２
の関係を満たす性質を有する請求項１〜４のいずれかに記載のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ。 Aspartate dehydrogenase has a Km value for L-aspartate when NAD is a coenzyme and L-aspartate is used as a substrate, and Km2 is a Km value for oxaloacetate when NADH is a coenzyme and oxaloacetate is a substrate. Then,
Km1 <Km2
The aspartate dehydrogenase according to any one of claims 1 to 4, which has a property satisfying the relationship:
（ａ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ。
（ｂ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。 A protein having the following amino acid sequence (a) or (b):
(A) Aspartate dehydrogenase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
(B) a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having aspartate dehydrogenase activity.
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるアスパラギン酸デヒドロゲナーゼタンパク質。
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。 A gene encoding the following protein (a) or (b).
(A) Aspartate dehydrogenase protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(B) A protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having aspartate dehydrogenase activity.
（ａ）配列番号２に示される遺伝子配列を含むアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子。
（ｂ）配列番号２に示される遺伝子配列において１もしくは複数個の核酸が欠失、置換もしくは付加された核酸配列からなり、かつアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。 The following gene (a) or (b):
(A) An aspartate dehydrogenase gene comprising the gene sequence shown in SEQ ID NO: 2.
(B) A gene encoding a protein comprising a nucleic acid sequence in which one or a plurality of nucleic acids are deleted, substituted or added in the gene sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having aspartate dehydrogenase activity.
A reagent kit for measuring aspartate amyltransferase comprising the aspartate dehydrogenase or protein according to any one of claims 1 to 6.
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