JP2004313172A - Modified product of pyrrolo-quinoline quinone (ppq)-dependent glucose dehyrogenase excellent in substrate specificity or stability - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は基質特異性及び／又は熱安定性が改良された改変型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）に関し、詳しくはピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とする改変型ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）、その製造法及びグルコースセンサーに関する。
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、臨床検査や食品分析などにおけるグルコースの定量に有用である。
The present invention relates to a modified glucose dehydrogenase (GDH) having improved substrate specificity and / or thermostability, and more particularly to a modified PQQ-dependent glucose dehydrogenase (PQQGDH) having pyrroloquinoline quinone (PQQ) as a coenzyme, It relates to a production method and a glucose sensor.
The modified PQQGDH of the present invention is useful for glucose quantification in clinical tests, food analysis, and the like.
ＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼである。グルコースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒するから、血糖の測定に用いることができる。血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーとして臨床診断上きわめて重要な指標である。現在、血中グルコース濃度の測定は、グルコースオキシダーゼを使用したバイオセンサーを用いる方法が主流となっているが、反応が溶存酸素濃度に影響されるから、測定値に誤差が生じる可能性があった。このグルコースオキシダーゼにかわる新たな酵素としてＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素が注目されている。我々のグループは、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ） ＮＣＩＭＢ１１５１７株が、ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素を産生することを見出し，遺伝子のクローニングならびに高発現系を構築した（特許文献１参照）。ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素はグルコースオキシダーゼに比べて基質特異性、熱安定性に問題点があった。
本発明は、従来技術の課題を背景になされたもので、ＰＱＱ−ＧＤＨの基質特異性及び／又は熱安定性を課題としてその改良に関するものである。 The present invention has been made on the background of the problems of the prior art, and relates to an improvement of PQQ-GDH with the object of substrate specificity and / or thermal stability.
本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意研究した結果、遂に本発明を完成するに到った。即ち本発明は、
１． 野生型のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）よりも二糖類に対する作用性が低下した、及び／又は、安定性が向上した改変型ＰＱＱＧＤＨ。
２． 野生型のグルコースデヒドロゲナーゼよりも二糖類に対する作用性が低下したことを特徴とする１．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
３． 二糖類がマルトースであることを特徴とする２．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
４． マルトースに対する作用性がグルコースに対する作用性の９０％以下であることを特徴とする２．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
５． 二糖類に対するに対するＫｍ値が大きくなったことを特徴とする２．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
６． 二糖類がマルトースであることを特徴とする５．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
７． マルトースに対するＫｍ値が８ｍＭ以上であることを特徴とする５．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
８． 二糖類に対するＫｍ値がグルコースに対するＫｍ値よりも大きいことを特徴とする２．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
９． 二糖類がマルトースであることを特徴とする８．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
１０． マルトースに対するＫｍ値がグルコースに対するＫｍ値の１．５倍以上であることを特徴とする８．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
１１． 配列番号１に記載されるＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、グルコースの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸が置換されている、２．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
１２． 配列番号１に記載されるＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、カルシウムイオンの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸が置換されている、２．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
１３． 配列番号１に記載されるＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、６７位、６８位、６９位、７６位、８９位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、３４１位、３４２位、３４３位、３５１位、４９位、１７４位、１８８位、１８９位、２０７位、２１５位、２４５位、２４９位、３００位、３４９位、１２９位、１３０位及び１３１位からなる群から選ばれる少なくとも１つの位置のアミノ酸が置換されている、２．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
１４． アミノ酸置換が、Ｑ７６Ｎ， Ｑ７６Ｅ， Ｑ７６Ｔ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， Ｑ７６Ｋ， Ｎ１６７Ｅ， Ｎ１６７Ｌ， Ｎ１６７Ｇ， Ｎ１６７Ｔ， Ｎ１６７Ｓ， Ｎ１６７Ａ， Ｎ１６７Ｍ， Ｑ１６８Ｉ， Ｑ１６８Ｖ， Ｑ１６８Ａ， Ｑ１６８Ｃ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｋ， Ｑ１６８Ｌ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｎ， Ｑ１６８Ｒ， Ｑ１６８Ｓ， Ｑ１６８Ｗ， Ｌ１６９Ｄ， Ｌ１６９Ｓ， Ｌ１６９Ｗ， Ｌ１６９Ｙ， Ｌ１６９Ａ， Ｌ１６９Ｎ， Ｌ１６９Ｍ， Ｌ１６９Ｖ， Ｌ１６９Ｃ， Ｌ１６９Ｑ， Ｌ１６９Ｈ， Ｌ１６９Ｆ， Ｌ１６９Ｒ， Ｌ１６９Ｋ， Ｌ１６９Ｉ， Ｌ１６９Ｔ， Ａ１７０Ｌ， Ａ１７０Ｉ， Ａ１７０Ｋ， Ａ１７０Ｆ， Ａ１７０Ｗ， Ａ１７０Ｐ， Ｋ８９Ｅ， Ｋ３００Ｒ， Ｓ２０７Ｃ， Ｎ１８８Ｉ， Ｔ３４９Ｓ， Ｋ３００Ｔ， Ｌ１７４Ｆ， Ｋ４９Ｎ， Ｓ１８９Ｇ， Ｆ２１５Ｙ， Ｓ１８９Ｇ， Ｅ２４５Ｄ， Ｅ２４５Ｆ， Ｅ２４５Ｈ， Ｅ２４５Ｍ， Ｅ２４５Ｎ， Ｅ２４５Ｑ， Ｅ２４５Ｖ， Ｅ２４５Ｃ， Ｎ２４９Ｇ， Ｎ２４９Ａ， Ｎ２４９Ｅ， Ｎ２４９Ｑ， Ａ３５１Ｔ， Ｐ６７Ｋ， Ｅ６８Ｋ， Ｐ６７Ｄ， Ｅ６８Ｔ， Ｉ６９Ｃ， Ｐ６７Ｒ， Ｅ６８Ｒ， Ｅ１２９Ｒ， Ｋ１３０Ｇ， Ｐ１３１Ｇ， Ｅ１２９Ｎ， Ｐ１３１Ｔ， Ｅ１２９Ｑ， Ｋ１３０Ｔ， Ｐ１３１Ｒ， Ｅ１２９Ａ， Ｋ１３０Ｒ， Ｐ１３１Ｋ， Ｅ３４１Ｌ， Ｍ３４２Ｐ， Ａ３４３Ｒ， Ａ３４３Ｉ， Ｅ３４１Ｐ， Ｍ３４２Ｖ， Ｅ３４１Ｓ， Ｍ３４２Ｉ， Ａ３４３Ｃ， Ｍ３４２Ｒ， Ａ３４３Ｎ， Ｌ１６９Ｐ， Ｌ１６９Ｇ及びＬ１６９Ｅからなる群から選択される１３．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
１５． アミノ酸置換が、Ｑ７６Ｎ， Ｑ７６Ｅ， Ｑ７６Ｔ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， Ｑ７６Ｋ， Ｑ１６８Ｉ， Ｑ１６８Ｖ， Ｑ１６８Ａ， Ｑ１６８Ｃ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｋ， Ｑ１６８Ｌ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｎ， Ｑ１６８Ｒ， Ｑ１６８Ｓ， Ｑ１６８Ｗ， Ｌ１６９Ａ， Ｌ１６９Ｖ， Ｌ１６９Ｈ， Ｌ１６９Ｋ， Ｌ１６９Ｄ， Ｌ１６９Ｓ， Ｌ１６９Ｎ， Ｌ１６９Ｇ， Ｌ１６９Ｃ， Ａ１７０Ｌ， Ａ１７０Ｉ， Ａ１７０Ｋ， Ａ１７０Ｆ， Ａ１７０Ｗ， Ａ１７０Ｐ， Ｅ２４５Ｆ， Ｅ２４５Ｈ， Ｅ２４５Ｍ， Ｅ２４５Ｎ， Ｅ２４５Ｑ， Ｅ２４５Ｖ， Ｅ２４５Ｃ， Ｎ２４９Ｇ， Ｎ２４９Ａ， Ｎ２４９Ｅ， Ｎ２４９Ｑ， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｋ８９Ｅ＋Ｋ３００Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｙ）， （Ｎ１６７Ｌ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ＋Ｌ１７４Ｆ＋Ｋ４９Ｎ）， （Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６８Ｎ＋Ｓ１８９Ｒ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ａ＋Ｓ１８９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｒ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｖ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｖ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｔ＋Ｑ１６８Ｉ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｗ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｖ）， （Ｑ１６８Ｒ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｌ＋Ｌ１６８Ｇ）， （Ｑ１６８Ｃ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｔ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ａ＋Ｓ２０７Ｃ）， （Ｎ１６７Ａ＋Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｄ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ｐ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１８８Ｉ＋Ｔ３４９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ａ＋Ｆ２１５Ｙ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｖ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｖ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ｒ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｒ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ｉ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｋ３００Ｔ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ａ）， （Ｎ１６７Ｔ＋Ｑ１６８Ｌ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｎ１６７Ｍ＋Ｑ１６８Ｙ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｓ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ｖ＋Ｓ１８９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｋ＋Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ａ３５１Ｔ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｉ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｎ１６７Ａ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｐ６７Ｋ＋Ｅ６８Ｋ）， （Ｐ６７Ｒ＋Ｅ６８Ｒ＋Ｉ６９Ｃ）， （Ｐ６７Ｄ＋Ｅ６８Ｔ＋Ｉ６９Ｃ）， （Ｅ１２９Ｒ＋Ｋ１３０Ｇ＋Ｐ１３１Ｇ）， （Ｅ１２９Ｑ＋Ｋ１３０Ｔ＋Ｐ１３１Ｒ）， （Ｅ１２９Ｎ＋Ｐ１３１Ｔ）， （Ｅ１２９Ａ＋Ｋ１３０Ｒ＋Ｐ１３１Ｋ）， （Ｅ３４１Ｌ＋Ｍ３４２Ｐ＋Ａ３４３Ｒ）， （Ｅ３４１Ｓ＋Ｍ３４２Ｉ）， Ａ３４３Ｉ， （Ｅ３４１Ｐ＋Ｍ３４２Ｖ＋Ａ３４３Ｃ）， （Ｅ３４１Ｐ＋Ｍ３４２Ｖ＋Ａ３４３Ｒ）， （Ｅ３４１Ｌ＋Ｍ３４２Ｒ＋Ａ３４３Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｆ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｈ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｉ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｍ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｖ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｗ）及び（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｙ）からなる群から選択され、該アミノ酸置換により基質特異性が向上した１３．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
１６． 配列番号１に記載されるＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、４２８位と４２９位の間にアミノ酸が挿入されている、２．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
１７． １．〜１６．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子。
１８． １７．に記載の遺伝子を含むベクター。
１９． １８．に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
２０． １９．に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＰＱＱＧＤＨの製造法。
２１． １．〜２０．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
２２． １．〜２０．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースセンサー。
２３． 野生型のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱＧＤＨ）よりも安定性が向上した改変型ＰＱＱＧＤＨ。
２４． ５８℃、３０分間の熱処理後の活性残存率が４８％以上であることを特徴とする２３．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
２５． ５８℃、３０分間の熱処理後の活性残存率が５５％以上であることを特徴とする２３．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
２６． ５８℃、３０分間の熱処理後の活性残存率が７０％以上であることを特徴とする２３．記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
２７． 配列番号１に記載されるＰＱＱＧＤＨにおいて、２０位、７６位、８９位、１６８位、１６９位、２４６位及び３００位からなる群から選ばれる少なくとも１つの位置のアミノ酸が置換されている、２３．に記載のＰＱＱＧＤＨ。
２８． アミノ酸置換が、Ｋ２０Ｅ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， Ｋ８９Ｅ， Ｑ１６８Ａ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｐ， Ｑ１６８Ｗ， Ｑ１６８Ｙ， Ｑ１６８Ｓ， Ｌ１６９Ｄ， Ｌ１６９Ｅ， Ｌ１６９Ｐ， Ｌ１６９Ｓ， Ｑ２４６Ｈ， Ｋ３００Ｒ， Ｑ７６Ｎ， Ｑ７６Ｔ， Ｑ７６Ｋ， Ｌ１６９Ａ， Ｌ１６９Ｃ， Ｌ１６９Ｅ， Ｌ１６９Ｆ， Ｌ１６９Ｈ， Ｌ１６９Ｋ， Ｌ１６９Ｎ， Ｌ１６９Ｑ， Ｌ１６９Ｒ， Ｌ１６９Ｔ， Ｌ１６９Ｙ及びＬ１６９Ｇからなる群から選択される２７．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
２９． アミノ酸置換が、Ｋ２０Ｅ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， （Ｋ８９Ｅ ＋ Ｋ３００Ｒ）， Ｑ１６８Ａ， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｓ）， Ｑ２４６Ｈ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｐ， Ｑ１６８Ｗ， Ｑ１６８Ｙ， Ｑ１６８Ｓ，（Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｆ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｈ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｙ）及び（Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｇ）からなる群から選択され、該アミノ酸置換により熱安定性が向上した２８．に記載の改変型ＰＱＱＧＤＨ。
３０． ２３．〜２９．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子。
３１． ３０．に記載の遺伝子を含むベクター。
３２． ３１．に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
３３． ３２．に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型ＰＱＱＧＤＨの製造法。
３４． ２３．〜３２．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
３５． ２３．〜３２．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースセンサー。
３６． ２３．〜３２．のいずれかに記載の改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコース測定方法。
３７． 野生型酵素の活性型立体構造における活性中心から半径１５Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られる１．に記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
３８． 野生型酵素の活性型立体構造において基質から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られる１．記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
３９． 基質がグルコースで有る３８．記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
４０． 野生型酵素の活性型立体構造において基質の１位の炭素に結合するＯＨ基から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られる１．記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
４１． 基質がグルコースである４０．記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
４２． 野生型酵素の活性型立体構造において基質の２位の炭素に結合するＯＨ基から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られる１．記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
４３．基質がグルコースで有る４２．記載の改変型グルコースデヒドロゲナーゼ。
である。
The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems, and as a result, have finally completed the present invention. That is, the present invention
1. A modified PQQGDH having reduced activity on disaccharides and / or improved stability compared to wild-type pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase (PQQGDH).
2. 1. The activity of disaccharides is lower than that of wild-type glucose dehydrogenase. 3. The modified PQQGDH according to [1].
3. 1. The disaccharide is maltose. 3. The modified PQQGDH according to [1].
4. 1. The activity on maltose is 90% or less of the activity on glucose. The modified PQQGDH as described.
5. 1. The Km value for disaccharides is increased. 3. The modified PQQGDH according to [1].
6. 4. The disaccharide is maltose. The modified PQQGDH as described.
7. 4. The Km value for maltose is 8 mM or more. The modified PQQGDH as described.
8. 1. The Km value for disaccharides is larger than the Km value for glucose. The modified PQQGDH as described.
9. 7. The disaccharide is maltose. The modified PQQGDH as described.
10. 7. The Km value for maltose is at least 1.5 times the Km value for glucose. The modified PQQGDH as described.
11. 1. In the PQQ-dependent glucose dehydrogenase described in SEQ ID NO: 1, amino acids involved in glucose binding and / or amino acids around the amino acids are substituted. 3. The modified PQQGDH according to [1].
12. 1. In the PQQ-dependent glucose dehydrogenase described in SEQ ID NO: 1, amino acids involved in calcium ion binding and / or amino acids in the vicinity thereof have been substituted. 3. The modified PQQGDH according to [1].
13. In the PQQ-dependent glucose dehydrogenase described in SEQ ID NO: 1, positions 67, 68, 69, 76, 89, 167, 168, 169, 170, 341, 342, 343, At least one selected from the group consisting of positions 351, 49, 174, 188, 189, 207, 215, 245, 249, 300, 349, 129, 130 and 131 1. the amino acid at position is substituted; 3. The modified PQQGDH according to [1].
14． Amino acid substitutions are as follows: Q76N, Q76E, Q76T, Q76M, Q76G, Q76K, N167E, N167L, N167G, N167T, N167S, N167A, N167M, Q168I, Q168V, Q16A, Q16A, Q16A, Q16A, Q16A, N Q168L, Q168M, Q168N, Q168R, Q168S, Q168W, L169D, L169S, L169W, L169Y, L169A, L169N, L169M, L169V, L169F, L169F, L169H, L169F, L169H, L169H, L169H, L169H, L169H A170F, A170W, A170P, K89E, K30 0R, S207C, N188I, T349S, K300T, L174F, K49N, S189G, F215Y, S189G, E245D, E245F, E245H, E245M, E245N, E245G, E245G, E245V, E245V, E245N, E245V, E245V P67D, E68T, I69C, P67R, E68R, E129R, K130G, P131G, E129N, P131T, E129Q, K130T, P131R, E129A, K130R, P131K, E341L, M342P, A343I, M343P, A343I, A343R, A343R M342R, A343N, L169P, L169G and L 13 selected from the group consisting of 69E. 3. The modified PQQGDH according to [1].
15. Amino acid substitutions are as follows: Q76N, Q76E, Q76T, Q76M, Q76G, Q76K, Q168I, Q168V, Q168A, Q168C, Q168D, Q168E, Q168F, Q168G, Q168H, Q16K, Q16K, Q16K, Q16K, Q16K L169V, L169H, L169K, L169D, L169S, L169N, L169G, L169C, A170L, A170I, A170K, A170F, A170W, A170P, E245F, E245N, E245N, E245N, E245N, E245N, E245N, E245N (Q168A + L169G + E245D), (Q168A + L169P + E245D), (K89E + K300R), (Q168A + L169D), (Q168S + L169S), (N167E + Q168G + L169T), (N167S + Q168N + L169R), (Q168G + L169T), (N167G + Q168S + L169Y), (N167L + Q168S + L169G), (N167G + Q168S + L169S + L174F + K49N), (Q168N + L168N + S189R), (N167E + Q168G + L169A + S189G), (N167G + Q168R + L169A) , (N167S + Q168G + L169A), (N167G + Q168V + L169S), (N167S + Q168V + L169S), (N167T + Q168I + L169G), (N 67G + Q168W + L169N), (N167G + Q168S + L169N), (N167G + Q168S + L169V), (Q168R + L169C), (N167S + Q168L + L168G), (Q168C + L169S), (N167T + Q168N + L169K), (N167G + Q168T + L169A + S207C), (N167A + Q168A + L169P), (N167G + Q168S + L169G), (N167G + Q168G), (N167G + Q168D + L169K), (Q168P + L169G) , (N167G + Q168N + L169S), (Q168S + L169G), (N188I + T349S), (N167G + Q168G + L169A + F215Y), (N167G + Q168T + L 69G), (Q168G + L169V), (N167G + Q168V + L169T), (N167E + Q168N + L169A), (Q168R + L169A), (N167G + Q168R), (N167G + Q168T), (N167G + Q168T + L169Q), (Q168I + L169G + K300T),, (N167G + Q168A), (N167T + Q168L + L169K), (N167M + Q168Y + L169G) (N167E + Q168S) , (N167G + Q168T + L169V + S189G), (N167G + Q168G + L169C), (N167G + Q168K + L169D), (Q168A + L169D), (Q168S + E245D), (Q168S + L169S), (A35) N167S + Q168S + L169S), (Q168I + L169Q), (N167A + Q168S + L169S), (Q168S + L169E), (Q168A + L169G), (Q168S + L169P), (P67K + E68K), (P67R + E68R + I69C), (P67D + E68T + I69C), (E129R + K130G + P131G), (E129Q + K130T + P131R), (E129N + P131T), (E129A + K130R + P131K) , (E341L + M342P + A343R), (E341S + M342I), A343I, (E341P + M342V + A343R), (E341P + M342V + A343R), (E341L + M342R + A343N), (Q168A + L169) ), (Q168A + L169C), (Q168A + L169E), (Q168A + L169F), (Q168A + L169H), (Q168A + L169I), (Q168A + L169K), (Q168A + L169M), (Q168A + L16A, 16QA, L16A). 12. selected from the group consisting of (Q168A + L169T), (Q168A + L169V), (Q168A + L169W) and (Q168A + L169Y), and the amino acid substitution improved the substrate specificity. 3. The modified PQQGDH according to [1].
16. 1. In the PQQ-dependent glucose dehydrogenase described in SEQ ID NO: 1, an amino acid is inserted between positions 428 and 429. 3. The modified PQQGDH according to [1].
17. 1. ~ 16. A gene encoding the modified PQQGDH according to any one of the above.
18. 17. A vector comprising the gene according to 1.
19. 18. A transformant transformed with the vector described in 1. above.
20. 19. A method for producing a modified PQQGDH, which comprises culturing the transformant described in (1).
21. 1. ~ 20. A glucose assay kit comprising the modified PQQGDH according to any one of the above.
22. 1. ~ 20. A glucose sensor comprising the modified PQQGDH according to any one of the above.
23. A modified PQQGDH having improved stability over wild-type pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase (PQQGDH).
24. 23. The activity retention ratio after heat treatment at 58 ° C. for 30 minutes is 48% or more. The modified PQQGDH as described.
25. 23. The activity retention after heat treatment at 58 ° C. for 30 minutes is 55% or more. The modified PQQGDH as described.
26. 23. The residual activity after heat treatment at 58 ° C. for 30 minutes is 70% or more. The modified PQQGDH as described.
27. 23. PQQGDH represented by SEQ ID NO: 1, wherein the amino acid at at least one position selected from the group consisting of positions 20, 76, 89, 168, 169, 246, and 300 is substituted. PQQGDH according to the above.
28. Amino acid substitutions are K20E, Q76M, Q76G, K89E, Q168A, Q168D, Q168E, Q168F, Q168G, Q168H, Q168M, Q168P, Q168W, Q168Y, Q168S, L169E, L169E, L169D, L169D, L169D, L169D, L169D 27 is selected from the group consisting of Q76K, L169A, L169C, L169E, L169F, L169H, L169K, L169N, L169Q, L169R, L169T, L169Y and L169G. 3. The modified PQQGDH according to [1].
29. Amino acid substitutions are K20E, Q76M, Q76G, (K89E + K300R), Q168A, (Q168A + L169D), (Q168S + L169S), Q246H, Q168D, Q168E, Q168F, Q168G, Q16G, Q16G, Q16G, Q168G, Q16G, Q16G, Q16G Q168S, (Q168S + L169E), (Q168S + L169P), (Q168A + L169A), (Q168A + L169C), (Q168A + L169E), (Q168A + L169F), (Q168A + L169,16A), (16A), (16A) (Q168A + L169R), (Q168A + L169T), (Q 28. selected from the group consisting of (168A + L169Y) and (Q168A + L169G), wherein the amino acid substitution has improved thermal stability. 3. The modified PQQGDH according to [1].
30. 23. ~ 29. A gene encoding the modified PQQGDH according to any one of the above.
31. 30. A vector comprising the gene according to 1.
32. 31. A transformant transformed with the vector described in 1. above.
33. 32. A method for producing a modified PQQGDH, which comprises culturing the transformant described in (1).
34. 23. ~ 32. A glucose assay kit comprising the modified PQQGDH according to any one of the above.
35. 23. ~ 32. A glucose sensor comprising the modified PQQGDH according to any one of the above.
36. 23. ~ 32. A method for measuring glucose comprising the modified PQQGDH according to any one of the above.
37. It is obtained by mutating amino acids located within a radius of 15 ° from the active center in the active conformation of the wild-type enzyme. 3. The modified glucose dehydrogenase according to 1.).
38. 1. Obtained by mutating amino acids located within a radius of 10 ° from the substrate in the active conformation of the wild-type enzyme. The modified glucose dehydrogenase described.
39. 38. the substrate is glucose The modified glucose dehydrogenase described.
40. It is obtained by mutating amino acids located within a radius of 10 ° from the OH group bonded to the carbon at position 1 in the active conformation of the wild-type enzyme. The modified glucose dehydrogenase described.
41. 40. the substrate is glucose The modified glucose dehydrogenase described.
42. It is obtained by mutating amino acids located within a radius of 10 ° from the OH group bonded to the carbon at position 2 of the substrate in the active conformation of the wild-type enzyme. The modified glucose dehydrogenase described.
43. 42. the substrate is glucose The modified glucose dehydrogenase described.
It is.
本発明による改変型ＰＱＱＧＤＨは野生型ＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下したもの、および／または、野生型ＰＱＱＧＤＨよりも熱安定性の向上した酵素である。本発明による改変型ＰＱＱＧＤＨをグルコースアッセイキット及びグルコースセンサに使用することにより、野生型ＰＱＱＧＤＨを使用したものよりもより高精度な分析が可能となったり、より安定性の高いグルコースアッセイキット及びグルコースセンサを提供することができる。 The modified PQQGDH according to the present invention is an enzyme having a lower activity on disaccharides than wild-type PQQGDH and / or an enzyme having improved thermostability compared to wild-type PQQGDH. By using the modified PQQGDH according to the present invention for a glucose assay kit and a glucose sensor, a more accurate analysis can be performed than that using wild-type PQQGDH, or a more stable glucose assay kit and glucose sensor can be obtained. Can be provided.
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書においては、アミノ酸の位置は、シグナル配列が除かれたアスパラギン酸を１として番号付けする。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
As used herein, amino acid positions are numbered with 1 aspartic acid with the signal sequence removed.
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型ＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対する作用性が低下したもの、および／または、野生型ＰＱＱＧＤＨよりも熱安定性の向上したものを含む。
二糖類としては、マルトース、シュクロース、ラクトース、セロビオースなどが例示され、特にマルトースが例示される。
二糖類に対する作用性とは、二糖類を脱水素する作用を意味する。
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、二糖類に対する作用性が野生型ＰＱＱＧＤＨより低下していれば、グルコースに対する作用性は上昇、不変、低下のいずれであっても本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに包含される。
The modified PQQGDH of the present invention includes those having a lower activity on disaccharides than wild-type PQQGDH and / or those having improved heat stability than wild-type PQQGDH.
Examples of the disaccharide include maltose, sucrose, lactose, cellobiose and the like, and particularly maltose.
The action on a disaccharide means an action of dehydrogenating the disaccharide.
The modified PQQGDH of the present invention is encompassed in the modified PQQGDH of the present invention regardless of whether its activity on glucose is increased, unchanged, or reduced, as long as its activity on disaccharides is lower than that of wild-type PQQGDH. .
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコース濃度の測定において二糖類に対する作用性が野生型ＰＱＱＧＤＨを用いた場合と比較して低下したものである。本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、特にマルトースに対する作用性が低下したものである。マルトースに対する作用性は、好ましくは野生型ＰＱＱＧＤＨの９０％以下、より好ましくは７５％以下、さらに好ましくは６０％以下、特に４０％以下である。 The modified PQQGDH of the present invention has a reduced activity on disaccharides in the measurement of glucose concentration as compared with the case where wild-type PQQGDH is used. The modified PQQGDH of the present invention has reduced activity especially on maltose. The activity on maltose is preferably 90% or less, more preferably 75% or less, still more preferably 60% or less, particularly 40% or less of wild-type PQQGDH.
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、さらに、野生型ＰＱＱＧＤＨよりも二糖類に対するに対するＫｍ値が大きくなってもよい。特にマルトースに対するＫｍ値が大きくなった改変型ＰＱＱＧＤＨが好ましい。マルトースに対するＫｍ値は、好ましくは８ｍＭ以上、より好ましくは１２ｍＭ以上、特に２０ｍＭ以上である。 The modified PQQGDH of the present invention may further have a higher Km value for disaccharides than wild-type PQQGDH. Particularly, a modified PQQGDH having a large Km value with respect to maltose is preferable. The Km value for maltose is preferably at least 8 mM, more preferably at least 12 mM, especially at least 20 mM.
あるいは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、さらに、二糖類に対するＫｍ値がグルコースに対するＫｍ値よりも大きくなってもよい。特に、マルトースに対するＫｍ値がグルコースに対するＫｍ値よりも大きい改変型ＰＱＱＧＤＨが好ましい。好ましくは、マルトースに対するＫｍ値がグルコースに対するＫｍ値の１．５倍以上、より好ましくは３倍以上である。
ここで、マルトースに対する作用性とは、グルコースを基質としたときと二糖類、特にマルトースを基質としたときの反応速度の相対比％を意味する。
Alternatively, the modified PQQGDH of the present invention may further have a Km value for a disaccharide greater than a Km value for glucose. In particular, a modified PQQGDH in which the Km value for maltose is larger than the Km value for glucose is preferable. Preferably, the Km value for maltose is 1.5 times or more, more preferably 3 times or more, the Km value for glucose.
Here, the action on maltose means a relative ratio% of a reaction rate when glucose is used as a substrate and when a disaccharide, particularly maltose is used as a substrate.
熱安定性の向上の程度は、５８℃、３０分間の熱処理後の活性残存率が野生型ＰＱＱＧＤＨよりも高いのが好ましい。活性残存率は、好ましくは４８％以上、より好ましくは５５％以上、特に７０％以上である。 The degree of improvement in thermal stability is preferably such that the residual activity ratio after heat treatment at 58 ° C. for 30 minutes is higher than that of wild-type PQQGDH. The residual activity ratio is preferably at least 48%, more preferably at least 55%, especially at least 70%.
基質特異性の改良された本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨとしては、例えば配列番号１のアミノ酸配列において、６７位、６８位、６９位、７６位、８９位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位、３４１位、３４２位、３４３位、３５１位、４９位、１７４位、１８８位、１８９位、２０７位、２１５位、２４５位、２４９位、３００位、３４９位、１２９位、１３０位及び１３１位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有するＧＤＨ及び４２８位と４２９位の間にアミノ酸が挿入されているＧＤＨが例示される。 As the modified PQQGDH of the present invention having improved substrate specificity, for example, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, positions 67, 68, 69, 76, 89, 167, 168, 169, 170 , 341, 342, 343, 351, 49, 174, 188, 189, 207, 215, 245, 249, 300, 349, 129, 130 and GDH having an amino acid substitution at at least one position at position 131 and GDH having an amino acid inserted between positions 428 and 429 are exemplified.
好ましくは、Ｑ７６Ｎ， Ｑ７６Ｅ， Ｑ７６Ｔ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， Ｑ７６Ｋ， Ｎ１６７Ｅ， Ｎ１６７Ｌ， Ｎ１６７Ｇ， Ｎ１６７Ｔ， Ｎ１６７Ｓ， Ｎ１６７Ａ， Ｎ１６７Ｍ， Ｑ１６８Ｉ， Ｑ１６８Ｖ， Ｑ１６８Ａ， Ｑ１６８Ｃ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｋ， Ｑ１６８Ｌ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｎ， Ｑ１６８Ｒ， Ｑ１６８Ｓ， Ｑ１６８Ｗ， Ｌ１６９Ｄ， Ｌ１６９Ｓ， Ｌ１６９Ｗ， Ｌ１６９Ｙ， Ｌ１６９Ａ， Ｌ１６９Ｎ， Ｌ１６９Ｍ， Ｌ１６９Ｖ， Ｌ１６９Ｃ， Ｌ１６９Ｑ， Ｌ１６９Ｈ， Ｌ１６９Ｆ， Ｌ１６９Ｒ， Ｌ１６９Ｋ， Ｌ１６９Ｉ， Ｌ１６９Ｔ， Ａ１７０Ｌ， Ａ１７０Ｉ， Ａ１７０Ｋ， Ａ１７０Ｆ， Ａ１７０Ｗ， Ａ１７０Ｐ， Ｋ８９Ｅ， Ｋ３００Ｒ， Ｓ２０７Ｃ， Ｎ１８８Ｉ， Ｔ３４９Ｓ， Ｋ３００Ｔ， Ｌ１７４Ｆ， Ｋ４９Ｎ， Ｓ１８９Ｇ， Ｆ２１５Ｙ， Ｓ１８９Ｇ， Ｅ２４５Ｄ， Ｅ２４５Ｆ， Ｅ２４５Ｈ， Ｅ２４５Ｍ， Ｅ２４５Ｎ， Ｅ２４５Ｑ， Ｅ２４５Ｖ， Ｅ２４５Ｃ， Ｎ２４９Ｇ， Ｎ２４９Ａ， Ｎ２４９Ｅ， Ｎ２４９Ｑ， Ａ３５１Ｔ， Ｐ６７Ｋ， Ｅ６８Ｋ， Ｐ６７Ｄ， Ｅ６８Ｔ， Ｉ６９Ｃ， Ｐ６７Ｒ， Ｅ６８Ｒ， Ｅ１２９Ｒ， Ｋ１３０Ｇ， Ｐ１３１Ｇ， Ｅ１２９Ｎ， Ｐ１３１Ｔ， Ｅ１２９Ｑ， Ｋ１３０Ｔ， Ｐ１３１Ｒ， Ｅ１２９Ａ， Ｋ１３０Ｒ， Ｐ１３１Ｋ， Ｅ３４１Ｌ， Ｍ３４２Ｐ， Ａ３４３Ｒ， Ａ３４３Ｉ， Ｅ３４１Ｐ， Ｍ３４２Ｖ， Ｅ３４１Ｓ， Ｍ３４２Ｉ， Ａ３４３Ｃ， Ｍ３４２Ｒ， Ａ３４３Ｎ， Ｌ１６９Ｐ， Ｌ１６９Ｇ及びＬ１６９Ｅからなる群から選ばれるアミノ酸置換を有するＧＤＨ及び４２８位と４２９位の間にＬ、ＡまたはＫが挿入されているＧＤＨである。６７位、６８位、６９位、７６位、８９位、１６７位、１６８位、１６９位、３４１位、３４２位、３４３位、３５１位、４９位、１７４位、１８８位、１８９位、２０７位、２１５位、２４５位、３００位、３４９位、１２９位、１３０位及び１３１位の置換は、１ヶ所であってもよく、また複数箇所であってもよい。 Preferably, Q76N, Q76E, Q76T, Q76M, Q76G, Q76K, N167E, N167L, N167G, N167T, N167S, N167A, N167M, Q168I, Q168V, Q168F, Q168A, Q168A, Q168A, Q168A , Q168M, Q168N, Q168R, Q168S, Q168W, L169D, L169S, L169W, L169Y, L169A, L169N, L169M, L169V, L169C, L169K, L9Q, L9Q, L169H, L169H , A170W, A170P, K89E, K300R, S207C, N188I, T349S, K300T, L174F, K49N, S189G, F215Y, S189G, E245D, E245F, E245N, E245N, 24N, 24N, 24N, 24N, 24N, 24N, 24N P67K, E68K, P67D, E68T, I69C, P67R, E68R, E129R, K130G, P131G, E129N, P131T, E129Q, K130T, P131R, E129A, K130R, P131K, E341L, A341L, M341L, M341L, M341P M342I, A3 3C, a M342R, A343N, L169P, between GDH and 428 and 429 of which have amino acid substitutions selected from the group consisting L169G and L169E L, A or K is inserted GDH. 67, 68, 69, 76, 89, 167, 168, 169, 341, 342, 343, 351, 49, 174, 188, 189, 207 The substitution at positions 215, 245, 300, 349, 129, 130 and 131 may be performed at one position or at multiple positions.
ここで、「Ｑ７６Ｎ」は、７６位のＱ（Ｇｌｎ）をＮ（Ａｓｎ）に置換することを意味する。 Here, “Q76N” means that Q (Gln) at position 76 is replaced with N (Asn).
Ｑ７６Ｎ， Ｑ７６Ｅ， Ｑ７６Ｔ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， Ｑ７６Ｋ， Ｑ１６８Ｉ， Ｑ１６８Ｖ， Ｑ１６８Ａ， Ｑ１６８Ｃ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｋ， Ｑ１６８Ｌ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｎ， Ｑ１６８Ｒ， Ｑ１６８Ｓ， Ｑ１６８Ｗ， Ｌ１６９Ａ， Ｌ１６９Ｖ， Ｌ１６９Ｈ， Ｌ１６９Ｋ， Ｌ１６９Ｄ， Ｌ１６９Ｓ， Ｌ１６９Ｎ， Ｌ１６９Ｇ， Ｌ１６９Ｃ， Ａ１７０Ｌ， Ａ１７０Ｉ， Ａ１７０Ｋ， Ａ１７０Ｆ， Ａ１７０Ｗ， Ａ１７０Ｐ， Ｅ２４５Ｆ， Ｅ２４５Ｈ， Ｅ２４５Ｍ， Ｅ２４５Ｎ， Ｅ２４５Ｑ， Ｅ２４５Ｖ， Ｅ２４５Ｃ， Ｎ２４９Ｇ， Ｎ２４９Ａ， Ｎ２４９Ｅ， Ｎ２４９Ｑ， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｋ８９Ｅ＋Ｋ３００Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｙ）， （Ｎ１６７Ｌ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ＋Ｌ１７４Ｆ＋Ｋ４９Ｎ）， （Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６８Ｎ＋Ｓ１８９Ｒ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ａ＋Ｓ１８９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｒ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｖ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｖ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｔ＋Ｑ１６８Ｉ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｗ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｖ）， （Ｑ１６８Ｒ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｌ＋Ｌ１６８Ｇ）， （Ｑ１６８Ｃ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｔ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ａ＋Ｓ２０７Ｃ）， （Ｎ１６７Ａ＋Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｄ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ｐ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１８８Ｉ＋Ｔ３４９Ｓ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ａ＋Ｆ２１５Ｙ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｖ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｖ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｎ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ｒ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｒ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ｉ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｋ３００Ｔ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ａ）， （Ｎ１６７Ｔ＋Ｑ１６８Ｌ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｎ１６７Ｍ＋Ｑ１６８Ｙ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｅ＋Ｑ１６８Ｓ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｔ＋Ｌ１６９Ｖ＋Ｓ１８９Ｇ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｇ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｎ１６７Ｇ＋Ｑ１６８Ｋ＋Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ａ３５１Ｔ）， （Ｎ１６７Ｓ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｉ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｎ１６７Ａ＋Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ）， （Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｐ６７Ｋ＋Ｅ６８Ｋ）， （Ｐ６７Ｒ＋Ｅ６８Ｒ＋Ｉ６９Ｃ）， （Ｐ６７Ｄ＋Ｅ６８Ｔ＋Ｉ６９Ｃ）， （Ｅ１２９Ｒ＋Ｋ１３０Ｇ＋Ｐ１３１Ｇ）， （Ｅ１２９Ｑ＋Ｋ１３０Ｔ＋Ｐ１３１Ｒ）， （Ｅ１２９Ｎ＋Ｐ１３１Ｔ）， （Ｅ１２９Ａ＋Ｋ１３０Ｒ＋Ｐ１３１Ｋ）， （Ｅ３４１Ｌ＋Ｍ３４２Ｐ＋Ａ３４３Ｒ）， （Ｅ３４１Ｓ＋Ｍ３４２Ｉ）， Ａ３４３Ｉ， （Ｅ３４１Ｐ＋Ｍ３４２Ｖ＋Ａ３４３Ｃ）， （Ｅ３４１Ｐ＋Ｍ３４２Ｖ＋Ａ３４３Ｒ）， （Ｅ３４１Ｌ＋Ｍ３４２Ｒ＋Ａ３４３Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｆ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｈ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｉ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｍ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｔ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｖ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｗ）及び（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｙ）の置換及び４２８位と４２９位の間へのＬ、ＡまたはＫの挿入は、ＰＱＱＧＤＨの基質特異性の向上に寄与する。ここで、基質特異性とは、グルコースを基質としたときと二糖類、特にマルトースを基質としたときの反応速度の相対比％を意味する。 Q76N, Q76E, Q76T, Q76M, Q76G, Q76K, Q168I, Q168V, Q168A, Q168C, Q168D, Q168E, Q168F, Q168G, Q168H, Q168K, Q168M, Q168L, Q168N, Q168L, Q168L L169K, L169D, L169S, L169N, L169G, L169C, A170L, A170I, A170K, A170F, A170W, A170P, E245F, E245H, E245M, E245N, E245V, E245V, N, E245N, E245N, E245N (Q168A + L169P + E245D), (K89E + K300R), (Q168A + L169D), (Q168S + L169S), (N167E + Q168G + L169T), (N167S + Q168N + L169R), (Q168G + L169T), (N167G + Q168S + L169Y), (N167L + Q168S + L169G), (N167G + Q168S + L169S + L174F + K49N), (Q168N + L168N + S189R), (N167E + Q168G + L169A + S189G), (N167G + Q168R + L169A ), (N167S + Q168G + L169A), (N167G + Q168V + L169S), (N167S + Q168V + L169S), (N167T + Q1) 8I + L169G), (N167G + Q168W + L169N), (N167G + Q168S + L169N), (N167G + Q168S + L169V), (Q168R + L169C), (N167S + Q168L + L168G), (Q168C + L169S), (N167T + Q168N + L169K), (N167G + Q168T + L169A + S207C), (N167A + Q168A + L169P), (N167G + Q168S + L169G), (N167G + Q168G), (N167G + Q168D + L169K) , (Q168P + L169G), (N167G + Q168N + L169S), (Q168S + L169G), (N188I + T349S), (N167G + Q168G + L169A + F2) 5Y), (N167G + Q168T + L169G), (Q168G + L169V), (N167G + Q168V + L169T), (N167E + Q168N + L169A), (Q168R + L169A), (N167G + Q168R), (N167G + Q168T), (N167G + Q168T + L169Q), (Q168I + L169G + K300T), (N167G + Q168A), (N167T + Q168L + L169K), (N167M + Q168Y + L169G) , (N167E + Q168S), (N167G + Q168T + L169V + S189G), (N167G + Q168G + L169C), (N167G + Q168K + L169D), (Q168A + L169D), (Q168S + E245D) , (Q168S + L169S), (A351T), (N167S + Q168S + L169S), (Q168I + L169Q), (N167A + Q168S + L169S), (Q168S + L169E), (Q168A + L169G), (Q168S + L169P), (P67K + E68K), (P67R + E68R + I69C), (P67D + E68T + I69C), (E129R + K130G + P131G), ( (E129Q + K130T + P131R), (E129N + P131T), (E129A + K130R + P131K), (E341L + M342P + A343R), (E341S + M342I), A343I, (E341P + M342V + A343C), (E341A), (E341A) (E341L + M342R + A343N), (Q168A + L169A), (Q168A + L169C), (Q168A + L169E), (Q168A + L169F), (Q168A + L169H), (Q168A + L169I), (Q168A + L169K), (Q168A + L169M), (Q168A + L169N), (Q168A + L169P), (Q168A + L169Q), (Q168A + L169R ), (Q168A + L169S), (Q168A + L169T), (Q168A + L169V), (Q168A + L169W) and (Q168A + L169Y) and the insertion of L, A or K between positions 428 and 429 improve the substrate specificity of PQQGDH. Contribute. Here, the substrate specificity means a relative ratio% of a reaction rate when glucose is used as a substrate and a disaccharide, particularly, maltose is used as a substrate.
熱安定性の改良された本発明のＰＱＱＧＤＨは、配列番号１のアミノ酸配列において、２０位、７６位、８９位、１６８位、１６９位、２４６位及び３００位の少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を有し、好ましくは、Ｋ２０Ｅ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， Ｋ８９Ｅ， Ｑ１６８Ａ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｐ， Ｑ１６８Ｗ， Ｑ１６８Ｙ， Ｑ１６８Ｓ， Ｌ１６９Ｄ， Ｌ１６９Ｅ， Ｌ１６９Ｐ， Ｌ１６９Ｓ， Ｑ２４６Ｈ， Ｋ３００Ｒ， Ｑ７６Ｎ， Ｑ７６Ｔ， Ｑ７６Ｋ， Ｌ１６９Ａ， Ｌ１６９Ｃ， Ｌ１６９Ｅ， Ｌ１６９Ｆ， Ｌ１６９Ｈ， Ｌ１６９Ｋ， Ｌ１６９Ｎ， Ｌ１６９Ｑ， Ｌ１６９Ｒ， Ｌ１６９Ｔ， Ｌ１６９Ｙ及びＬ１６９Ｇからなる群から選ばれるアミノ酸置換を有する。２０位、７６位、８９位、１６８位、１６９位、２４６位及び３００位の置換は、１ヶ所であってもよく、複数ヶ所であってもよい。 The PQQGDH of the present invention having improved thermostability has an amino acid substitution at at least one of positions 20, 76, 89, 168, 169, 246 and 300 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. And preferably K20E, Q76M, Q76G, K89E, Q168A, Q168D, Q168E, Q168F, Q168G, Q168H, Q168M, Q168P, Q168W, Q168Y, Q168S, L169E, L169D, L169D, L169D, L169D Q76T, Q76K, L169A, L169C, L169E, L169F, L169H, L169K, L169N, L169Q, L169R, L169T, L169Y and L169 Have amino acid substitutions selected from the group consisting of. The substitution at the 20-position, 76-position, 89-position, 168-position, 169-position, 246-position and 300-position may be performed at one position or at multiple positions.
ここで、「Ｋ２０Ｅ」は、２０位のＫ（Ｌｙｓ）をＥ（Ｇｌｕ）に置換することを意味する。 Here, “K20E” means that K (Lys) at the 20th position is replaced with E (Glu).
特に、Ｋ２０Ｅ， Ｑ７６Ｍ， Ｑ７６Ｇ， （Ｋ８９Ｅ ＋ Ｋ３００Ｒ）， Ｑ１６８Ａ， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｓ）， Ｑ２４６Ｈ， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｐ， Ｑ１６８Ｗ， Ｑ１６８Ｙ， Ｑ１６８Ｓ，（Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｃ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｆ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｈ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｔ）、（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｙ）及び（Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｇ）のアミノ酸置換は、ＰＱＱＧＤＨの熱安定性の向上に寄与する。 Particularly, K20E, Q76M, Q76G, (K89E + K300R), Q168A, (Q168A + L169D), (Q168S + L169S), Q246H, Q168D, Q168E, Q168F, Q168G, Q168G, Q168G, Q168G, Q168H (Q168S + L169E), (Q168S + L169P), (Q168A + L169A), (Q168A + L169C), (Q168A + L169E), (Q168A + L169F), (Q168A + L169H), (Q168A + L16A, 16K, 816A + L169A) ), (Q168A + L 69T), amino acid substitution (Q168A + L169Y) and (Q168A + L169G) contributes to the improvement of the thermal stability of PQQGDH.
配列番号１で示される改変されるべき野生型ＰＱＱＧＤＨタンパク質及び配列番号２で示されるその塩基配列は、公知であり、特開平１１−２４３９４９号公報に記載されている。 The wild-type PQQGDH protein to be modified shown in SEQ ID NO: 1 and its base sequence shown in SEQ ID NO: 2 are known and described in JP-A-11-243949.
また、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ） ＬＭＤ７９．４１株由来の酵素のＸ線結晶構造解析の結果が報告され、活性中心をはじめとした本酵素の高次構造が明らかとなった（非特許文献１，２，３，４参照）。
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、配列番号１に記載されるＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、グルコースの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸が置換されているものを含む。
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、配列番号１に記載されるＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼにおいて、カルシウムイオンの結合に関与するアミノ酸及び／またはその周辺のアミノ酸が置換されているものを含む。
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型酵素の活性型立体構造における活性中心から半径１５Å以内、好ましくは半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものを含む。
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型酵素の活性型立体構造において基質から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものを含む。特に、基質がグルコースであるとき、野生型酵素の活性型立体構造において基質から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものが好ましい。
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型酵素の活性型立体構造において基質の１位の炭素に結合するＯＨ基から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものを含む。特に、基質がグルコースであるとき、野生型酵素の活性型立体構造において基質から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものが好ましい。
また、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨは、野生型酵素の活性型立体構造において基質の２位の炭素に結合するＯＨ基から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものを含む。特に、基質がグルコースであるとき、野生型酵素の活性型立体構造において基質から半径１０Å以内の範囲に位置するアミノ酸を変異することにより得られるものが好ましい。
The modified PQQGDH of the present invention includes PQQ-dependent glucose dehydrogenase represented by SEQ ID NO: 1 in which amino acids involved in glucose binding and / or amino acids in the vicinity thereof are substituted.
Further, the modified PQQGDH of the present invention includes those in which the amino acids involved in calcium ion binding and / or peripheral amino acids in the PQQ-dependent glucose dehydrogenase shown in SEQ ID NO: 1 are substituted.
The modified PQQGDH of the present invention also includes those obtained by mutating amino acids located within a radius of 15 °, preferably within a radius of 10 ° from the active center in the active conformation of the wild-type enzyme.
The modified PQQGDH of the present invention also includes those obtained by mutating amino acids located within a radius of 10 ° from the substrate in the active conformation of the wild-type enzyme. In particular, when the substrate is glucose, it is preferably obtained by mutating amino acids located within a radius of 10 ° from the substrate in the active conformation of the wild-type enzyme.
Further, the modified PQQGDH of the present invention includes those obtained by mutating amino acids located within a radius of 10 ° from the OH group bonded to the carbon at position 1 in the active conformation of the wild-type enzyme. . In particular, when the substrate is glucose, it is preferably obtained by mutating amino acids located within a radius of 10 ° from the substrate in the active conformation of the wild-type enzyme.
The modified PQQGDH of the present invention also includes those obtained by mutating amino acids located within a radius of 10 ° from the OH group bonded to the carbon at position 2 in the active conformation of the wild-type enzyme. . In particular, when the substrate is glucose, it is preferably obtained by mutating amino acids located within a radius of 10 ° from the substrate in the active conformation of the wild-type enzyme.
本発明の改変タンパク質の製造方法は、特に限定されないが、以下に示すような手順で製造することが可能である。タンパク質を構成するアミノ酸配列を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。 The method for producing the modified protein of the present invention is not particularly limited, but it can be produced by the following procedure. As a method for modifying an amino acid sequence constituting a protein, a commonly used technique for modifying genetic information is used. That is, a DNA having the genetic information of the modified protein is prepared by converting a specific base of the DNA having the genetic information of the protein or by inserting or deleting a specific base. As a specific method for converting bases in DNA, for example, commercially available kits (Transformer Mutagenesis Kit; manufactured by Clonetech, EXOIII / Mung Bean Deletion Kit; manufactured by Stratagene, and available from QuickChange Site Digest, a company of QuickChange Sites, etc.) The use of the chain reaction method (PCR) is mentioned.
作製された改変タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡは、プラスミドと連結された状態にて宿主微生物中に移入され、改変タンパク質を生産する形質転換体となる。この際のプラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，ｐＵＣ１８などが使用できる。宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリー Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５αなどが利用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡績製）を用いても良い。 The prepared DNA having the genetic information of the modified protein is transferred into a host microorganism in a state of being linked to a plasmid, and becomes a transformant that produces the modified protein. As a plasmid at this time, for example, when Escherichia coli is used as a host microorganism, pBluescript, pUC18 and the like can be used. Examples of the host microorganism include Escherichia coli W3110, Escherichia coli C600, Escherichia coli JM109, and Escherichia coli DH5α. As a method for transferring the recombinant vector to the host microorganism, for example, when the host microorganism is a microorganism belonging to the genus Escherichia, a method for transferring the recombinant DNA in the presence of calcium ions can be used. Electroporation may be used. Further, a commercially available competent cell (for example, competent high JM109; manufactured by Toyobo) may be used.
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の改変タンパク質を安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコ−ス，シュークロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。培養温度は菌が発育し、改変蛋白質を生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、改変タンパク質が最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し改変タンパク質を生産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度である。 The microorganism thus obtained as a transformant can stably produce a large amount of the modified protein by being cultured in a nutrient medium. The culture form of the host microorganism, which is a transformant, may be selected in consideration of the nutritional and physiological properties of the host, and is usually liquid culture in most cases. Is advantageous. As the nutrient source of the medium, those commonly used for culturing microorganisms can be widely used. The carbon source may be any carbon compound that can be assimilated, and for example, glucose, sucrose, lactose, maltose, fructose, molasses, pyruvic acid and the like are used. Any available nitrogen compound may be used as the nitrogen source, and examples thereof include peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, and soybean meal alkaline extract. In addition, phosphates, carbonates, sulfates, salts such as magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, and zinc, specific amino acids, and specific vitamins are used as needed. The culture temperature can be appropriately changed within a range in which the bacteria grow and produce the modified protein. In the case of Escherichia coli, the culture temperature is preferably about 20 to 42 ° C. The cultivation time varies somewhat depending on the conditions, but the cultivation may be terminated at an appropriate time in anticipation of the time when the modified protein reaches the maximum yield, and is usually about 6 to 48 hours. The pH of the medium can be appropriately changed within a range in which the bacteria grow and produce the modified protein, and particularly preferably, the pH is about 6.0 to 9.0.
培養物中の改変タンパク質を生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には常法に従って改変タンパク質が培養液中に存在する場合は、濾過，遠心分離などにより、改変タンパク質含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。改変タンパク質が菌体内に存在する場合には、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加して改変タンパク質を可溶化し、水溶液として分離採取する。 The culture solution containing the cells producing the modified protein in the culture can be directly collected and used. However, in general, when the modified protein is present in the culture solution according to a conventional method, filtration, centrifugation, etc. It is used after separating the modified protein-containing solution from the microbial cells. When the modified protein is present in the cells, the cells are collected from the obtained culture by means such as filtration or centrifugation, and then the cells are disrupted by a mechanical method or an enzymatic method such as lysozyme. The modified protein is solubilized by adding a chelating agent such as EDTA and / or a surfactant, if necessary, and separated and collected as an aqueous solution.
この様にして得られた改変タンパク質含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーにより、精製された改変タンパク質を得ることができる。 The modified protein-containing solution thus obtained is subjected to, for example, concentration under reduced pressure, membrane concentration, salting-out treatment with ammonium sulfate, sodium sulfate, or the like, or a fractional precipitation method using a hydrophilic organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, or the like. It may be allowed to settle. Heat treatment and isoelectric point treatment are also effective purification means. A purified modified protein can be obtained by gel filtration using an adsorbent or a gel filtration agent, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, or affinity chromatography.
本発明では、配列番号１に示されるＰＱＱＧＤＨの７６位、１６７位、１６８位、１６９位、１７０位および２４５位に着目し、そのアミノ酸置換体を作成したところ、基質特異性が改善されたＰＱＱＧＤＨ改変体を得ることができた。基質特異性に関しては、Ｑ７６Ｋ， Ｑ１６８Ａ， Ａ１７０Ｐ， Ｅ２４５Ｄ， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｅ２４５Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｇ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｃ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｍ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｓ） および （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｔ）が特に好ましい。 In the present invention, by focusing on positions 76, 167, 168, 169, 170 and 245 of PQQGDH shown in SEQ ID NO: 1, and creating amino acid substitutions thereof, PQQGDH with improved substrate specificity A variant could be obtained. Regarding the substrate specificity, Q76K, Q168A, A170P, E245D, (Q168A + L169G + E245D), (Q168A + L169P + E245D), (Q168S + L169S), (Q168A + L169D), (Q168S16G9,16Q16E16) ), (Q168S + L169P), (Q168A + L169A), (Q168A + L169C), (Q168A + L169E), (Q168A + L169K), (Q168A + L169M), (Q168A + L16, L16A, L16A) (Q168A + L169S) and (Q168A + L169T) are particularly preferred.
本発明では、配列番号１に示されるＰＱＱＧＤＨの２０位、７６位、８９位、１６８位、１６９位、２４６位及び３００位に着目し、そのアミノ酸置換体を作成したところ、安定性が改善されたＰＱＱＧＤＨ改変体を得ることができた。熱安定性に関する限り、Ｋ２０Ｅ， （Ｋ８９Ｅ ＋ Ｋ３００Ｒ）， Ｑ１６８Ａ， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｄ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｓ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ｓ ＋ Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｇ）， Ｑ１６８Ｄ， Ｑ１６８Ｅ， Ｑ１６８Ｆ， Ｑ１６８Ｇ， Ｑ１６８Ｈ， Ｑ１６８Ｍ， Ｑ１６８Ｐ， Ｑ１６８Ｓ， Ｑ１６８Ｗ， Ｑ１６８Ｙ， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ａ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｃ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｅ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｆ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｈ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｋ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｎ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｐ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｑ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｒ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｔ）， （Ｑ１６８Ａ ＋ Ｌ１６９Ｙ） 及びＱ２４６Ｈの置換が特に望ましい。 In the present invention, focusing on positions 20, 76, 89, 168, 169, 246, and 300 of PQQGDH shown in SEQ ID NO: 1 and preparing amino acid substitutions thereof, the stability is improved. A modified PQQGDH could be obtained. As far as the thermal stability is concerned, K20E, (K89E + K300R), Q168A, (Q168A + L169D), (Q168S + L169S), (Q168S + L169E), (Q168S + L169P), (Q168A + Q168D, Q168A, L168G) Q168F, Q168G, Q168H, Q168M, Q168P, Q168S, Q168W, Q168Y, (Q168A + L169A), (Q168A + L169C), (Q168A + L169E), (Q168A16,16QA16) ), (Q168A + L169N), (Q168A + L169P), (Q168A + L169Q), (Q16 A + L169R), (Q168A + L169T), (Q168A + L169Y) and substitution Q246H is particularly desirable.
改変タンパク質は、液状（水溶液、懸濁液等）、粉末、凍結乾燥など種々の形態をとることができる。凍結乾燥法としては、特に制限されるものではなく常法に従って行えばよい。本発明の酵素を含む組成物は凍結乾燥物に限られず、凍結乾燥物を再溶解した溶液状態であってもよい。また、グルコース測定を行なう際には、グルコースアッセイキット、グルコースセンサーなどの種々の形態をとることができる。この様にして得られた精製された改変タンパク質は、以下のような方法により安定化することができる。 The modified protein can be in various forms such as liquid (aqueous solution, suspension, etc.), powder, freeze-dried. The freeze-drying method is not particularly limited, and may be performed according to a conventional method. The composition containing the enzyme of the present invention is not limited to a lyophilized product, and may be a solution in which the lyophilized product is redissolved. When performing glucose measurement, various forms such as a glucose assay kit and a glucose sensor can be used. The purified modified protein thus obtained can be stabilized by the following method.
精製された改変タンパク質に（１）アスパラギン酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、α−ケトグルコン酸、α−サイクロデキストリンおよびそれらの塩からなる群から選ばれた１種または２種以上の化合物および（２）アルブミンを共存せしめることにより、改変タンパク質をさらに安定化することができる。
凍結乾燥組成物中においては、ＰＱＱＧＤＨ含有量は、酵素の起源によっても異なるが、通常は約５〜５０％（重量比）の範囲で好適に用いられる。酵素活性に換算すると、１００〜２０００Ｕ／ｍｇの範囲で好適に用いられる。
アスパラギン酸、グルタミン酸、αーケトグルタル酸、リンゴ酸、及びαーケトグルコン酸の塩としては、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、及びマグネシウム等の塩が挙げられるが特に限定されるものではない。上記化合物とその塩及びα−シクロデキストリンの添加量は、１〜９０％（重量比）の範囲で添加することが好ましい。これらの物質は単独で用いてもよいし、複数組み合わせてもよい。
含有される緩衝液としては特に限定されるものではないが、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。該緩衝液のｐＨは５．０〜９．０程度の範囲で使用目的に応じて調整される。凍結乾燥物中においては緩衝剤の含有量は、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１％（重量比）以上、特に好ましくは０．１〜３０％（重量比）の範囲で使用される。
使用できるアルブミンとしては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）などが挙げられる。特にＢＳＡが好ましい。該アルブミンの含有量は、好ましくは１〜８０％（重量比）、より好ましくは５〜７０％（重量比）の範囲で使用される。
組成物には、さらに他の安定化剤などをＰＱＱＧＤＨの反応に特に悪い影響を及ぼさないような範囲で添加してもよい。本発明の安定化剤の配合法は特に制限されるものではない。例えばＰＱＱＧＤＨを含む緩衝液に安定化剤を配合する方法、安定化剤を含む緩衝液にＰＱＱＧＤＨを配合する方法、あるいはＰＱＱＧＤＨと安定化剤を緩衝液に同時に配合する方法などが挙げられる。
(1) one or more compounds selected from the group consisting of aspartic acid, glutamic acid, α-ketoglutaric acid, malic acid, α-ketogluconic acid, α-cyclodextrin and salts thereof And (2) the modified protein can be further stabilized by coexisting albumin.
In the lyophilized composition, the PQQGDH content is preferably used generally in the range of about 5 to 50% (weight ratio), although it varies depending on the origin of the enzyme. In terms of enzyme activity, it is suitably used in the range of 100 to 2000 U / mg.
Salts of aspartic acid, glutamic acid, α-ketoglutaric acid, malic acid, and α-ketogluconic acid include, but are not particularly limited to, sodium, potassium, ammonium, calcium, and magnesium salts. It is preferable that the above-mentioned compound, its salt and α-cyclodextrin are added in an amount of 1 to 90% (weight ratio). These substances may be used alone or in combination.
The buffer to be contained is not particularly limited, and examples thereof include a Tris buffer, a phosphate buffer, a borate buffer, and a GOOD buffer. The pH of the buffer is adjusted in the range of about 5.0 to 9.0 depending on the purpose of use. The content of the buffer in the lyophilized product is not particularly limited, but is preferably 0.1% (weight ratio) or more, and particularly preferably 0.1 to 30% (weight ratio). used.
Examples of albumin that can be used include bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin (OVA). BSA is particularly preferred. The albumin content is preferably used in the range of 1 to 80% (weight ratio), more preferably 5 to 70% (weight ratio).
Further, other stabilizers and the like may be added to the composition in such a range that the reaction of PQQGDH is not particularly adversely affected. The method of compounding the stabilizer of the present invention is not particularly limited. Examples of the method include a method of mixing a stabilizer with a buffer containing PQQGDH, a method of mixing PQQGDH with a buffer containing a stabilizer, and a method of simultaneously mixing PQQGDH and a stabilizer with a buffer.
また、カルシウムイオンと特定のアミノ酸を併用しても安定化効果が得られる。すなわち、（１）カルシウムイオンまたはカルシウム塩、および（２）グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸を含有させることにより、改変タンパク質を安定化させることができる。
カルシウム塩としては、塩化カルシウムまたは酢酸カルシウムもしくはクエン酸カルシウム等の無機酸または有機酸のカルシウム塩などが例示される。また、水性組成物において、カルシウムイオンの含有量は、１×１０−４〜１×１０−２Ｍであることが好ましい。カルシウムイオンまたはカルシウム塩のみを含有させた場合、安定性にわずかな効果が見られるが、さらに下記アミノ酸を含有させることにより、安定性がさらに向上する。
グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されるアミノ酸は、１種または２種以上であってもよい。前記の水性組成物において、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸の含有量は、０．０１〜０．２重量％であることが好ましい。
さらに血清アルブミンを含有させてもよい。前記の水性組成物に血清アルブミンを添加する場合、その含有量は０．０５〜０．５重量％であることが好ましい。
緩衝剤としては、通常のものが使用され、通常、組成物のｐＨを５〜１０とするものが好ましい。具体的にはトリス塩酸、ホウ酸、グッド緩衝液が用いられるが、カルシウムと不溶性の塩を形成しない緩衝液はすべて使用できる。
前記の水性組成物には、必要により他の成分、例えば界面活性剤、安定化剤、賦形剤などを添加しても良い。
Further, a stabilizing effect can be obtained even when calcium ion and a specific amino acid are used in combination. That is, the modified protein can be stabilized by containing (1) calcium ion or calcium salt, and (2) an amino acid selected from the group consisting of glutamic acid, glutamine and lysine.
Examples of the calcium salt include calcium salts of inorganic or organic acids such as calcium chloride, calcium acetate and calcium citrate. Further, in the aqueous composition, the content of calcium ions is preferably 1 × 10 −4 to 1 × 10 −2 M. When only calcium ions or calcium salts are contained, a slight effect is seen on the stability, but by further containing the following amino acids, the stability is further improved.
The amino acid selected from the group consisting of glutamic acid, glutamine and lysine may be one kind or two or more kinds. In the above aqueous composition, the content of the amino acid selected from the group consisting of glutamic acid, glutamine and lysine is preferably 0.01 to 0.2% by weight.
Further, serum albumin may be contained. When serum albumin is added to the aqueous composition, the content is preferably 0.05 to 0.5% by weight.
As the buffering agent, an ordinary one is used, and usually, one having a pH of the composition of 5 to 10 is preferable. Specifically, Tris-HCl, boric acid, and Good's buffer are used, but any buffer that does not form an insoluble salt with calcium can be used.
If necessary, other components such as a surfactant, a stabilizer, and an excipient may be added to the aqueous composition.
本発明においては以下の種々の方法によりグルコースを測定することができる。
グルコースアッセイキット
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で提供し、使用時にホロ化することもできる。
In the present invention, glucose can be measured by the following various methods.
Glucose Assay Kit The present invention also features a glucose assay kit comprising a modified PQQGDH according to the present invention. The glucose assay kit of the present invention comprises the modified PQQGDH according to the present invention in an amount sufficient for at least one assay. Typically, the kit contains, in addition to the modified PQQGDH of the present invention, buffers necessary for the assay, mediators, glucose standard solutions for preparing calibration curves, and guidelines for use. The modified PQQGDH according to the invention can be provided in various forms, for example, as a lyophilized reagent or as a solution in a suitable storage solution. Preferably, the modified PQQGDH of the present invention is provided in a holo-form, but can also be provided in the form of an apoenzyme and holo-formed at the time of use.
グルコースセンサー
本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で提供することもできる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
Glucose Sensor The present invention also features a glucose sensor using the modified PQQGDH according to the present invention. As the electrode, a carbon electrode, a gold electrode, a platinum electrode, or the like is used, and the enzyme of the present invention is immobilized on the electrode. Examples of the immobilization method include a method using a crosslinking reagent, a method of enclosing in a polymer matrix, a method of coating with a dialysis membrane, a photocrosslinkable polymer, a conductive polymer, and a redox polymer. It may be fixed in a polymer together with a representative electron mediator or adsorbed and fixed on an electrode, or may be used in combination. Preferably, the modified PQQGDH of the present invention is immobilized on the electrode in a holated form, but it can also be immobilized in the form of an apoenzyme and PQQ provided as a separate layer or in solution. Typically, the modified PQQGDH of the present invention is immobilized on a carbon electrode using glutaraldehyde, and then treated with a reagent having an amine group to block glutaraldehyde.
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱＱおよびＣａＣｌ２、およびメディエーターを加えて一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。 The measurement of the glucose concentration can be performed as follows. The buffer is placed in a thermostat cell, and PQQ and CaCl 2 and a mediator are added to maintain a constant temperature. As the mediator, potassium ferricyanide, phenazine methosulfate and the like can be used. An electrode on which the modified PQQGDH of the present invention is immobilized is used as a working electrode, and a counter electrode (for example, a platinum electrode) and a reference electrode (for example, an Ag / AgCl electrode) are used. After a constant voltage is applied to the carbon electrode and the current becomes steady, a sample containing glucose is added and the increase in the current is measured. The glucose concentration in the sample can be calculated according to a calibration curve prepared using a standard concentration glucose solution.
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
実施例１ ：ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素遺伝子の発現プラスミドの構築
野生型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の発現プラスミドｐＮＰＧ５は、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のマルチクローニング部位にアシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ） ＮＣＩＭＢ１１５１７株由来のＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする構造遺伝子を挿入したものである。その塩基配列を配列表の配列番号２に、また該塩基配列から推定されるＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples.
Example 1 Construction of Expression Plasmid for PQQ-Dependent Glucose Dehydrogenase Gene Expression plasmid pNPG5 for wild-type PQQ-dependent glucose dehydrogenase was constructed at the multiple cloning site of vector pBluescript SK (-) in Acinetobacter baumannini. This is the one into which a structural gene encoding PQQ-dependent glucose dehydrogenase derived from NCIMB11517 strain has been inserted. The nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and the amino acid sequence of PQQ-dependent glucose dehydrogenase deduced from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
実施例２：変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の作製
野生型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素遺伝子を含む組換えプラスミドｐＮＰＧ５と配列番号３記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を用いて、そのプロトコールに従って変異処理操作を行い、更に塩基配列を決定して、配列番号２記載のアミノ酸配列の７６番目のグルタミンがアスパラギンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号４記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の７６番目のグルタミンがグルタミン酸に置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ２）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号５記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の７６番目のグルタミンがスレオニンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ３）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号６記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の７６番目のグルタミンがメチオニンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ４）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号７記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の７６番目のグルタミンがグリシンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ５）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号８記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の７６番目のグルタミンがリジンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ６）取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号９記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがイソロイシンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ７）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号１０記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがバリンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ８）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号１１記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがアラニンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ９）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号２２記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の２０番目のリジンがグルタミン酸に置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１０）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号２３記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の８９番目のリジンがグルタミン酸に置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミドを取得した。更にこのプラスミドと配列番号２４記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の８９番目のリジンがグルタミン酸に、３００番目のリジンがアルギニンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１１）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号２５記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の２４６番目のグルタミンがヒスチジンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１２）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号２６記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがセリンに、１６９番目のロイシンがセリンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１３）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号２７記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがアラニンに、１６９番目のロイシンがアスパラギン酸に置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１４）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号６６記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがセリンに、１６９番目のロイシンがグルタミン酸に置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１５）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号６７記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがセリンに、１６９番目のロイシンがプロリンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１６）を取得した。
ｐＮＰＧ５と配列番号６８記載の合成オリゴヌクレオチド及びこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを基に、上記方法と同様にして配列番号２記載のアミノ酸配列の１６８番目のグルタミンがアラニンに、１６９番目のロイシンがグリシンに置換された変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素をコードする組換えプラスミド（ｐＮＰＧ５Ｍ１７）を取得した。
ｐＮＰＧ５、ｐＮＰＧ５Ｍ１、ｐＮＰＧ５Ｍ２、ｐＮＰＧ５Ｍ３、ｐＮＰＧ５Ｍ４、ｐＮＰＧ５Ｍ５、ｐＮＰＧ５Ｍ６、ｐＮＰＧ５Ｍ７、ｐＮＰＧ５Ｍ８、ｐＮＰＧ５Ｍ９、ｐＮＰＧ５Ｍ１０、ｐＮＰＧ５Ｍ１１、ｐＮＰＧ５Ｍ１２、ｐＮＰＧ５Ｍ１３、ｐＮＰＧ５Ｍ１４、ｐＮＰＧ５Ｍ１５、ｐＮＰＧ５Ｍ１６，ｐＮＰＧ５Ｍ１７の各組換えプラスミドで大腸菌コンピテントセル（エシェリヒア・コリーＪＭ１０９；東洋紡績製）を形質転換し、該形質転換体をそれぞれ取得した。
Example 2 Preparation of Mutant PQQ-Dependent Glucose Dehydrogenase A recombinant plasmid pNPG5 containing a wild-type PQQ-dependent glucose dehydrogenase gene, a synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 3 and a synthetic oligonucleotide complementary thereto were prepared. Using QuickChange ™ Site-Directed Mutagenesis Kit (manufactured by STRATAGENE), a mutagenesis operation was performed according to the protocol, the base sequence was determined, and the glutamine at position 76 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 was converted to asparagine. A recombinant plasmid (pNPG5M1) encoding the substituted mutant PQQ-dependent glucose dehydrogenase was obtained.
Mutant PQQ in which glutamine at position 76 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has been substituted with glutamic acid in the same manner as described above, based on pNPG5, the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 4, and a synthetic oligonucleotide complementary thereto A recombinant plasmid (pNPG5M2) encoding a dependent glucose dehydrogenase was obtained.
Mutant PQQ in which glutamine at position 76 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is replaced with threonine in the same manner as described above, based on pNPG5, the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 5, and the synthetic oligonucleotide complementary thereto A recombinant plasmid (pNPG5M3) encoding a dependent glucose dehydrogenase was obtained.
Mutant PQQ in which glutamine at position 76 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 has been substituted with methionine in the same manner as described above, based on pNPG5, the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 6, and the synthetic oligonucleotide complementary thereto. A recombinant plasmid (pNPG5M4) encoding a dependent glucose dehydrogenase was obtained.
Mutant PQQ in which glutamine at position 76 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has been substituted with glycine in the same manner as described above, based on pNPG5, the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 7, and the synthetic oligonucleotide complementary thereto. A recombinant plasmid (pNPG5M5) encoding a dependent glucose dehydrogenase was obtained.
Mutant PQQ in which glutamine at position 76 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has been substituted with lysine in the same manner as described above, based on pNPG5, the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 8, and the synthetic oligonucleotide complementary thereto. A recombinant plasmid (pNPG5M6) encoding a dependent glucose dehydrogenase was obtained.
Mutant PQQ in which glutamine at position 168 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is replaced with isoleucine in the same manner as described above, based on pNPG5, the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 9, and the synthetic oligonucleotide complementary thereto. A recombinant plasmid (pNPG5M7) encoding a dependent glucose dehydrogenase was obtained.
Mutant PQQ in which glutamine at position 168 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is substituted with valine in the same manner as described above, based on pNPG5, the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 10 and the synthetic oligonucleotide complementary thereto. A recombinant plasmid (pNPG5M8) encoding a dependent glucose dehydrogenase was obtained.
Mutant PQQ obtained by substituting 168th glutamine of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 with alanine in the same manner as described above, based on pNPG5, the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 11 and the synthetic oligonucleotide complementary thereto. A recombinant plasmid (pNPG5M9) encoding a dependent glucose dehydrogenase was obtained.
Mutant PQQ in which lysine at position 20 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has been substituted with glutamic acid in the same manner as described above, based on pNPG5 and the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 22 and the synthetic oligonucleotide complementary thereto. A recombinant plasmid (pNPG5M10) encoding a dependent glucose dehydrogenase was obtained.
Mutant PQQ in which lysine at position 89 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has been substituted with glutamic acid in the same manner as described above, based on pNPG5, the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 23, and a synthetic oligonucleotide complementary thereto. A recombinant plasmid encoding dependent glucose dehydrogenase was obtained. Further, based on this plasmid and the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 24 and the synthetic oligonucleotide complementary thereto, the lysine at position 89 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 was replaced with glutamic acid, A recombinant plasmid (pNPG5M11) encoding a mutant PQQ-dependent glucose dehydrogenase in which lysine was substituted with arginine was obtained.
A mutant PQQ in which glutamine at position 246 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has been substituted with histidine in the same manner as described above, based on pNPG5, the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 25, and a synthetic oligonucleotide complementary thereto. A recombinant plasmid (pNPG5M12) encoding a dependent glucose dehydrogenase was obtained.
Based on pNPG5 and the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 26 and the synthetic oligonucleotide complementary thereto, glutamine at position 168 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 was replaced by serine, and leucine at position 169 was replaced by the same method as described above. A recombinant plasmid (pNPG5M13) encoding a mutant PQQ-dependent glucose dehydrogenase substituted with serine was obtained.
Based on pNPG5, the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 27 and the synthetic oligonucleotide complementary thereto, glutamine at position 168 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 was replaced with alanine and leucine at position 169 was replaced with the same method as described above. A recombinant plasmid (pNPG5M14) encoding a mutant PQQ-dependent glucose dehydrogenase substituted with aspartic acid was obtained.
Based on pNPG5 and the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 66 and a synthetic oligonucleotide complementary thereto, glutamine at position 168 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 was replaced with serine, and leucine at position 169 was replaced with the same method as described above. A recombinant plasmid (pNPG5M15) encoding a mutant PQQ-dependent glucose dehydrogenase substituted with glutamic acid was obtained.
Based on pNPG5 and the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 67 and the synthetic oligonucleotide complementary thereto, 168th glutamine and 169th leucine of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 were used in the same manner as described above. A recombinant plasmid (pNPG5M16) encoding a mutant PQQ-dependent glucose dehydrogenase substituted with proline was obtained.
Based on pNPG5 and the synthetic oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 68 and the synthetic oligonucleotide complementary thereto, glutamine at position 168 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 was replaced with alanine, and leucine at position 169 was replaced with the same method as described above. A recombinant plasmid (pNPG5M17) encoding a mutant PQQ-dependent glucose dehydrogenase substituted with glycine was obtained.
pNPG5, pNPG5M1, pNPG5M2, pNPG5M3, pNPG5M4, pNPG5M5, pNPG5M6, pNPG5M7, pNPG5M8, pNPG5M9, pNPG5M10, pNPG5M11, pNPG5M5, pNPG5M5, pNPG5M5 ; Manufactured by Toyobo Co., Ltd.) to obtain the transformants.
実施例３：シュードモナス属細菌で複製できる発現ベクターの構築
実施例２で得た組換えプラスミドｐＮＰＧ５Ｍ１のＤＮＡ５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸＨｏＩ（東洋紡績製）で切断して、変異型ＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素の構造遺伝子部分を単離した。単離したＤＮＡとＢａｍＨＩおよびＸＨｏＩで切断したｐＴＭ３３（１μｇ）とをＴ４ＤＮＡリガーゼ１単位で１６℃、１６時間反応させ、ＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリＤＨ５αのコンピテントセルを用いて形質転換を行った。得られた発現プラスミドをｐＮＰＧ６Ｍ１と命名した。
ｐＮＰＧ５、ｐＮＰＧ５Ｍ２、ｐＮＰＧ５Ｍ３、ｐＮＰＧ５Ｍ４、ｐＮＰＧ５Ｍ５、ｐＮＰＧ５Ｍ６、ｐＮＰＧ５Ｍ７、ｐＮＰＧ５Ｍ８、ｐＮＰＧ５Ｍ９、ｐＮＰＧ５Ｍ１０、ｐＮＰＧ５Ｍ１１、ｐＮＰＧ５Ｍ１２、ｐＮＰＧ５Ｍ１３、ｐＮＰＧ５Ｍ１４、ｐＮＰＧ５Ｍ１５、ｐＮＰＧ５Ｍ１６，ｐＮＰＧ５Ｍ１７の各組換えプラスミドについても上記方法と同様にして発現プラスミドを取得した。得られた発現プラスミドそれぞれｐＮＰＧ６、ｐＮＰＧ６Ｍ２、ｐＮＰＧ６Ｍ３、ｐＮＰＧ６Ｍ４、ｐＮＰＧ６Ｍ５、ｐＮＰＧ６Ｍ６、ｐＮＰＧ６Ｍ７、ｐＮＰＧ６Ｍ８、ｐＮＰＧ６Ｍ９、ｐＮＰＧ６Ｍ１０、ｐＮＰＧ６Ｍ１１、ｐＮＰＧ６Ｍ１２、ｐＮＰＧ６Ｍ１３、ｐＮＰＧ６Ｍ１４、ｐＮＰＧ６Ｍ１５、ｐＮＰＧ６Ｍ１６，ｐＮＰＧ６Ｍ１７と命名した。
Example 3 Construction of Expression Vector Capable of Replicating in Pseudomonas Bacteria 5 μg of the DNA of the recombinant plasmid pNPG5M1 obtained in Example 2 was digested with restriction enzymes BamHI and XHoI (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and mutant PQQ-dependent glucose dehydrogenation was performed. The structural gene portion of the enzyme was isolated. The isolated DNA and pTM33 (1 μg) digested with BamHI and XHoI were reacted with 1 unit of T4 DNA ligase at 16 ° C. for 16 hours to ligate the DNA. The ligated DNA was transformed using competent cells of Escherichia coli DH5α. The resulting expression plasmid was named pNPG6M1.
pNPG5, pNPG5M2, pNPG5M3, pNPG5M4, pNPG5M5, pNPG5M6, pNPG5M7, pNPG5M8, pNPG5M9, pNPG5M10, pNPG5M11, pNPG5M12, pNPG5M13, pNPG5M14, pNPG5M15, pNPG5M16, obtain an expression plasmid in the same manner as the above-mentioned method also each recombinant plasmid pNPG5M17 did. Each resulting expression plasmid pNPG6, pNPG6M2, pNPG6M3, pNPG6M4, pNPG6M5, pNPG6M6, pNPG6M7, pNPG6M8, pNPG6M9, pNPG6M10, pNPG6M11, pNPG6M12, pNPG6M13, pNPG6M14, pNPG6M15, pNPG6M16, was named PNPG6M17.
実施例４：シュードモナス属細菌の形質転換体の作製
シュードモナス・プチダＴＥ３４９３（微工研寄１２２９８号）をＬＢＧ培地（ＬＢ培地＋０．３％グリセロール）で３０℃、１６時間培養し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）により菌体を回収し、この菌体に氷冷した３００ｍＭシュークロースを含む５ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）８ｍｌを加え、菌体を懸濁した。再度遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０分間）により菌体を回収し、この菌体に氷冷した３００ｍＭシュークロースを含む５ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．４ｍｌを加え、菌体を懸濁した。
該懸濁液に実施例３で得た発現プラスミドｐＮＰＧ６Ｍ１を０．５μｇ加え、エレクトロポレーション法により形質転換した。１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に生育したコロニーより、目的とする形質転換体を得た。
ｐＮＰＧ６、ｐＮＰＧ６Ｍ２、ｐＮＰＧ６Ｍ３、ｐＮＰＧ６Ｍ４、ｐＮＰＧ６Ｍ５、ｐＮＰＧ６Ｍ６、ｐＮＰＧ６Ｍ７、ｐＮＰＧ６Ｍ８、ｐＮＰＧ６Ｍ９、ｐＮＰＧ６Ｍ１０、ｐＮＰＧ６Ｍ１１、ｐＮＰＧ６Ｍ１２、ｐＮＰＧ６Ｍ１３、ｐＮＰＧ６Ｍ１４、ｐＮＰＧ６Ｍ１５、ｐＮＰＧ６Ｍ１６，ｐＮＰＧ６Ｍ１７の各発現プラスミドについても上記方法と同様にして、該形質転換体をそれぞれ取得した。
Example 4 Preparation of Transformant of Pseudomonas Species Bacteria Pseudomonas putida TE3493 (Miyakoken No. 12298) was cultured in an LBG medium (LB medium + 0.3% glycerol) at 30 ° C. for 16 hours, and centrifuged (12). (000 rpm, 10 minutes), and 8 ml of ice-cooled 5 mM K-phosphate buffer (pH 7.0) containing 300 mM sucrose was added to suspend the cells. The cells were collected again by centrifugation (12,000 rpm, 10 minutes), and 0.4 ml of an ice-cooled 5 mM K-phosphate buffer (pH 7.0) containing 300 mM sucrose was added. Suspended.
0.5 μg of the expression plasmid pNPG6M1 obtained in Example 3 was added to the suspension, and the suspension was transformed by electroporation. The desired transformant was obtained from a colony grown on an LB agar medium containing 100 μg / ml streptomycin.
pNPG6, pNPG6M2, pNPG6M3, pNPG6M4, pNPG6M5, pNPG6M6, pNPG6M7, pNPG6M8, pNPG6M9, pNPG6M10, pNPG6M11, pNPG6M12, pNPG6M12, pNPG6M12, pNPG6M13, pNPG6M13, pNPG6M6, pNPG6M13, pNPG6M16, pNPG6M16, pNPG6M16, pNPG6M6, pNPG6M13, pNPG6M6, pNPG6M6, pNPG6M6, pNPG6M6, pNPG6M6, pNPG6M6 Were acquired respectively.
試験例１
ＧＤＨ活性の測定方法
測定原理
Ｄ−グルコース＋ＰＭＳ＋ＰＱＱＧＤＨ → Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ ＰＭＳ（ｒｅｄ）
２ＰＭＳ（ｒｅｄ） ＋ ＮＴＢ → ２ＰＭＳ ＋ ジホルマザン
フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）（ｒｅｄ）によるニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）の還元により形成されたジホルマザンの存在は、５７０ｎｍで分光光度法により測定した。
単位の定義
１単位は、以下に記載の条件下で１分当たりジホルマザンを０．５ミリモル形成させるＰＱＱＧＤＨの酵素量をいう。
（３）方法
試薬
Ａ．Ｄ−グルコース溶液：０．５Ｍ（０．９ｇ Ｄ−グルコース（分子量１８０．１６）／１０ｍｌ Ｈ２Ｏ）
Ｂ．ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液， ｐＨ６．５：５０ｍＭ（６０ｍＬの水中に懸濁した１．５１ｇのＰＩＰＥＳ（分子量３０２．３６）を、５Ｎ ＮａＯＨに溶解し、２．２ｍｌの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加える。５Ｎ ＮａＯＨを用いて２５℃でｐＨを６．５±０．０５に調整し、水を加えて１００ｍｌとした。）
Ｃ．ＰＭＳ溶液：３．０ｍＭ（９．１９ｍｇのフェナジンメトサルフェート（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｄ．ＮＴＢ溶液：６．６ｍＭ（５３．９６ｍｇのニトロテトラゾリウムブルー（分子量８１７．６５）／１０ｍｌＨ２Ｏ）
Ｅ．酵素希釈液：１ｍＭ ＣａＣｌ２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．１％ ＢＳＡを含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
手順
遮光ビンに以下の反応混合物を調製し、氷上で貯蔵した（用時調製）
１．８ｍｌ Ｄ−グルコース溶液 （Ａ）
２４．６ｍｌ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） （Ｂ）
２．０ｍｌ ＰＭＳ溶液 （Ｃ）
１．０ｍｌ ＮＴＢ溶液 （Ｄ）
Test example 1
Measurement method of GDH activity Measurement principle D-glucose + PMS + PQQGDH → D-glucono-1,5-lactone + PMS (red)
2PMS (red) + NTB → 2PMS + The presence of diformazan formed by reduction of nitrotetrazolium blue (NTB) with diformazanphenazine methosulfate (PMS) (red) was measured spectrophotometrically at 570 nm.
Definition of Unit One unit refers to the amount of PQQGDH enzyme that forms 0.5 mmol of diformazan per minute under the conditions described below.
(3) Method reagent A. D- glucose solution: 0.5M (0.9 g D- glucose (molecular weight 180.16) / 10ml H 2 O)
B. PIPES-NaOH buffer, pH 6.5: Dissolve 1.51 g of PIPES (molecular weight 302.36) suspended in 60 mL of water in 5N NaOH and add 2.2 ml of 10% Triton X-100. The pH was adjusted to 6.5 ± 0.05 at 25 ° C. using 5N NaOH, and water was added to make 100 ml.)
C. PMS solution: 3.0 mM (9.19 mg of phenazine methosulfate (molecular weight 817.65) / 10 ml H 2 O)
D. NTB solution: 6.6 mM (53.96 mg nitrotetrazolium blue (molecular weight 817.65) / 10 ml H 2 O)
E. FIG. Enzyme diluent: 50 mM PIPES-NaOH buffer (pH 6.5) containing 1 mM CaCl 2 , 0.1% Triton X-100, 0.1% BSA
Procedure Prepare the following reaction mixture in a light-shielded bottle and store on ice (prepared before use)
1.8 ml D-glucose solution (A)
24.6 ml PIPES-NaOH buffer (pH 6.5) (B)
2.0ml PMS solution (C)
1.0 ml NTB solution (D)
３．０ｍｌの反応混合液を試験管（プラスチック製）に入れ、３７℃で５分間予備加温した。
０．１ｍｌの酵素溶液を加え、穏やかに反転して混合した。
５７０ｎｍでの水に対する吸光度の増加を３７℃に維持しながら分光光度計で４〜５分間記録し、曲線の初期直線部分からの１分当たりのΔＯＤを計算した（ＯＤテスト）。
同時に、酵素溶液に代えて酵素希釈液（Ｅ）加えることを除いては同一の方法を繰り返し、ブランク（ΔＯＤブランク）を測定した。
アッセイの直前に氷冷した酵素希釈液（Ｅ）で酵素粉末を溶解し、同一の緩衝液で０．１−０．８Ｕ／ｍｌに希釈した（該酵素の接着性のためにプラスチックチューブの使用が好ましい）。
計算
活性を以下の式を用いて計算する：
Ｕ／ｍｌ＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト− ΔＯＤブランク）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（２０．１×１．０×Ｖｓ）
Ｕ／ｍｇ＝（Ｕ／ｍｌ）×１／Ｃ
Ｖｔ：総体積（３．１ｍｌ）
Ｖｓ：サンプル体積（１．０ｍｌ）
２０．１：ジホルマザンの１／２ミリモル分子吸光係数
１．０：光路長（ｃｍ）
ｄｆ：希釈係数
Ｃ：溶液中の酵素濃度（ｃ ｍｇ／ｍｌ）
3.0 ml of the reaction mixture was placed in a test tube (made of plastic) and preliminarily heated at 37 ° C. for 5 minutes.
0.1 ml of enzyme solution was added and mixed by gentle inversion.
The increase in absorbance for water at 570 nm was recorded on a spectrophotometer for 4-5 minutes while maintaining at 37 ° C., and the ΔOD per minute from the initial linear portion of the curve was calculated (OD test).
At the same time, a blank (ΔOD blank) was measured by repeating the same method except that an enzyme diluent (E) was added instead of the enzyme solution.
Immediately before the assay, the enzyme powder was dissolved in ice-cold enzyme diluent (E) and diluted to 0.1-0.8 U / ml with the same buffer (use of a plastic tube for adhesion of the enzyme). Is preferred).
Calculation Activity is calculated using the following formula:
U / ml = {ΔOD / min (ΔOD test−ΔOD blank) × Vt × df} / (20.1 × 1.0 × Vs)
U / mg = (U / ml) × 1 / C
Vt: Total volume (3.1 ml)
Vs: sample volume (1.0 ml)
20.1: 1/2 mmol molecular absorption coefficient of diformazan 1.0: Optical path length (cm)
df: dilution coefficient C: enzyme concentration in solution (c mg / ml)
ホロ型発現精製酵素の調製方法
５００ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈを２Ｌ容坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したストレプトマイシンを１００μｇ／ｍｌになるように添加した。この培地に１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＰＹ培地で予め３０℃、２４時間培養したシュードモナス・プチダＴＥ３４９３（ｐＮＰＧ６Ｍ１）の培養液を５ｍｌ接種し、３０℃で４０時間通気攪拌培養した。培養終了時のＰＱＱ依存性グルコース脱水素酵素活性は、前記活性測定において、培養液１ｍｌ当たり約１２０Ｕ／ｍｌであった。
上記菌体を遠心分離により集菌し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液をＨｉＴｒａｐ−ＳＰ（アマシャム−ファルマシア）イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離・精製した。次いで１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）で透析した後に終濃度が１ｍＭになるように塩化カルシウムを添加した。最後にＨｉＴｒａｐ−ＤＥＡＥ（アマシャム−ファルマシア）イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵素標品を得た。本方法により得られた標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示した。
ｐＮＰＧ６、ｐＮＰＧ６Ｍ２、ｐＮＰＧ６Ｍ３、ｐＮＰＧ６Ｍ４、ｐＮＰＧ６Ｍ５、ｐＮＰＧ６Ｍ６、ｐＮＰＧ６Ｍ７、ｐＮＰＧ６Ｍ８、ｐＮＰＧ６Ｍ９、ｐＮＰＧ６Ｍ１０、ｐＮＰＧ６Ｍ１１、ｐＮＰＧ６Ｍ１２、ｐＮＰＧ６Ｍ１３、ｐＮＰＧ６Ｍ１４、ｐＮＰＧ６Ｍ１５、ｐＮＰＧ６Ｍ１６，ｐＮＰＧ６Ｍ１７によるシュードモナス・プチダＴＥ３４９３形質転換体についても上記方法と同様にして精製酵素標品を取得した。
このようにして取得した精製酵素を用いて性能を評価した。
Preparation method of holo-type expression purified enzyme 500 ml of Terrific broth was dispensed into a 2 L Sakaguchi flask, autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes, and allowed to cool, and then separately sterile-filtered streptomycin was added to 100 μg / ml. To this medium, 5 ml of a culture solution of Pseudomonas putida TE3493 (pNPG6M1) previously cultured at 30 ° C. for 24 hours in a PY medium containing 100 μg / ml streptomycin was inoculated, and cultured under aeration and stirring at 30 ° C. for 40 hours. The PQQ-dependent glucose dehydrogenase activity at the end of the culture was about 120 U / ml per 1 ml of the culture in the above activity measurement.
The cells were collected by centrifugation, suspended in 20 mM phosphate buffer (pH 7.0), disrupted by sonication, and further centrifuged to obtain a supernatant as a crude enzyme solution. . The obtained crude enzyme solution was separated and purified by HiTrap-SP (Amersham-Pharmacia) ion exchange column chromatography. Then, after dialysis against a 10 mM PIPES-NaOH buffer (pH 6.5), calcium chloride was added to a final concentration of 1 mM. Finally, it was separated and purified by HiTrap-DEAE (Amersham-Pharmacia) ion exchange column chromatography to obtain a purified enzyme preparation. The sample obtained by this method showed an almost single band on SDS-PAGE.
pNPG6, pNPG6M2, pNPG6M3, pNPG6M4, pNPG6M5, pNPG6M6, pNPG6M7, pNPG6M8, pNPG6M9, pNPG6M10, pNPG6M11, pNPG6M12, pNPG6M12, pNPG6M13, pNPG6M6, pNPG6M6, pNPG6M13, pNPG6M6, pNPG6M13, pNPG6M6 An enzyme preparation was obtained.
The performance was evaluated using the purified enzyme thus obtained.
Ｋｍ値の測定
上記の活性測定方法に従い、ＰＱＱＧＤＨの活性を測定した。グルコースに対するＫｍ値の測定は、上記活性測定方法の基質濃度を変化させて実施した。また、マルトースに対するＫｍ値の測定は、上記活性測定方法のグルコース溶液をマルトース溶液に置き換え、グルコースに対するＫｍ値の測定同様基質濃度を変化させて実施した。結果を表２Ａ表２Ｂ、表６，表９及び表１４に示す。
Measurement of Km value The activity of PQQGDH was measured according to the activity measurement method described above. The measurement of the Km value for glucose was performed by changing the substrate concentration in the above-described activity measurement method. Further, the Km value for maltose was measured by replacing the glucose solution of the above-described activity measurement method with a maltose solution and changing the substrate concentration as in the measurement of the Km value for glucose. The results are shown in Table 2A, Table 2B, Table 6, Table 9, and Table 14.
基質特異性
上記の活性測定方法に従い、ＰＱＱＧＤＨの活性を測定した。グルコースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性値とマルトースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性値を測定し、グルコースを基質とした場合の測定値を１００とした場合の相対値を求めた。マルトースを基質溶液とした場合の脱水素酵素活性に際しては、０．５Ｍのマルトース溶液を調製して活性測定に用いた。結果を表２Ａ、表２Ｂ、表４、表５、表６、表８、表９、表１１、表１３及び表１４に示す。
Substrate specificity The activity of PQQGDH was measured according to the activity measurement method described above. The dehydrogenase activity value when glucose was used as the substrate solution and the dehydrogenase activity value when maltose was used as the substrate solution were measured, and the relative value when the measured value was 100 when glucose was used as the substrate was determined. Was. For dehydrogenase activity when maltose was used as a substrate solution, a 0.5 M maltose solution was prepared and used for activity measurement. The results are shown in Table 2A, Table 2B, Table 4, Table 5, Table 6, Table 8, Table 9, Table 11, Table 13, and Table 14.
熱安定性の測定
各種ＰＱＱＧＤＨを酵素濃度５Ｕ／ｍｌ、緩衝液（１ｍＭ ＣａＣｌ２、１μＭ ＰＱＱを含む１０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）中で保存し、５８℃で熱処理後の活性残存率を求めた。結果を表２Ａ、表２Ｂ、表６、表９及び表１４に示す。なお、熱処理を行なった時間は、表２Ｂの試験のみ３０分間、その他の試験は２０分間である。
Measurement of thermal stability Various PQQGDHs were stored in a buffer solution (1 mM CaCl 2 , 10 mM PIPES-NaOH (pH 6.5) containing 1 μM PQQ) at an enzyme concentration of 5 U / ml, and the residual activity after heat treatment at 58 ° C. was determined. The results are shown in Table 2A, Table 2B, Table 6, Table 9, and Table 14. The heat treatment time was 30 minutes for only the test in Table 2B and 20 minutes for the other tests.
至適ｐＨの測定
０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．０〜８．０）、０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０〜６．０）、０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０〜７．０）、０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０）中で酵素活性を測定した。結果を図１に示す。また、最も高い活性を示したｐＨを表２Ａに示す。
Measurement of optimal pH 50 mM phosphate buffer (pH 5.0 to 8.0) containing 0.22% Triton-X100, 50 mM acetate buffer (pH 3.0 to 6.0) containing 0.22% Triton-X100 ), 50 mM PIPES-NaOH buffer (pH 6.0-7.0) containing 0.22% Triton-X100, 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0-9.0) containing 0.22% Triton-X100. The enzyme activity was measured in. The results are shown in FIG. The pH showing the highest activity is shown in Table 2A.
Ｑ７６Ｋのグルコース定量性の確認
０．４５Ｕ／ｍｌのＱ７６Ｋを含んだ下記反応試薬を調整した。
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００
０．４ｍＭ ＰＭＳ
０．２６ｍＭ ＷＳＴ−１（水溶性テトラゾリウム塩、同仁化学研究所製）
下記に示すグルコース量の測定方法に従い、試料として精製水、１００ｍｇ／ｄｌ標準液及びグルコース水溶液（６００ｍｇ／ｄｌ）の１０水準の希釈系列を測定し、直線性を確認した。
結果を図２に示した。
Confirmation of glucose quantitative property of Q76K The following reaction reagent containing 0.45 U / ml of Q76K was prepared.
50 mM PIPES-NaOH buffer (pH 6.5)
1 mM CaCl2
0.22% Triton-X100
0.4 mM PMS
0.26 mM WST-1 (water-soluble tetrazolium salt, Dojindo Laboratories)
According to the glucose amount measurement method described below, 10 levels of dilution series of purified water, 100 mg / dl standard solution and glucose aqueous solution (600 mg / dl) were measured as samples, and the linearity was confirmed.
The results are shown in FIG.
グルコース量の測定方法
試料量３μｌに試薬３００μｌを加え、試薬添加後２分後からの１分間における吸光度変化を求め、精製水及びグルコース１００ｍｇ／ｄｌ標準液での２点検量線に基づき試料中のグルコース量を求めた。尚、測定装置は日立７１５０形自動分析装置を使用し、測定波長は、主波長４８０ｎｍのみ、測定温度は３７℃で実施した。
図２より、０−６００ｍｇ／ｄｌの範囲で良好な直線性が確認された。
Measurement method of glucose amount 300 μl of a reagent was added to a sample amount of 3 μl, the change in absorbance in 1 minute from 2 minutes after the addition of the reagent was determined, and the amount of glucose in the sample was determined based on two calibration curves with purified water and glucose 100 mg / dl standard solution. The amount of glucose was determined. The measurement was performed using a Hitachi 7150 type automatic analyzer, the measurement wavelength was only 480 nm, and the measurement temperature was 37 ° C.
From FIG. 2, good linearity was confirmed in the range of 0 to 600 mg / dl.
Ｑ７６Ｋのマルトース作用性の確認
０．４５Ｕ／ｍｌのＱ７６Ｋを含んだ下記反応試薬を調整した。
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
０．２２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００
０．４ｍＭ ＰＭＳ
０．２６ｍＭ ＷＳＴ−１（同仁化学研究所製）
サンプルとしては１００ｍｇ／ｄｌまたは３００ｍｇ／ｄｌのグルコースをベースに０，１２０，２４０，３６０ｍｇ／ｄｌのマルトースを上乗せした物を準備した。 上記、グルコース量の測定方法に従い、測定を実施した。
マルトースを含まない１００ｍｇ／ｄｌグルコース溶液と１００とし、ベースに１００ｍｇ／ｄｌのグルコースを含むサンプルの測定値をそれぞれ相対評価した。同様にマルトースを含まない３００ｍｇ／ｄｌグルコース溶液と１００とし、ベースに３００ｍｇ／ｄｌのグルコースを含むサンプルの測定値をそれぞれ相対評価した。結果を図３に示す。
Confirmation of maltose action of Q76K The following reaction reagent containing 0.45 U / ml of Q76K was prepared.
50 mM PIPES-NaOH buffer (pH 6.5)
1 mM CaCl2
0.22% Triton-X100
0.4 mM PMS
0.26 mM WST-1 (manufactured by Dojindo Laboratories)
A sample was prepared by adding 0,120,240,360 mg / dl maltose based on 100 mg / dl or 300 mg / dl glucose. The measurement was performed according to the above-described method for measuring the amount of glucose.
A 100 mg / dl glucose solution containing no maltose was set to 100, and the measured values of the sample containing 100 mg / dl glucose in the base were relatively evaluated. Similarly, a 300 mg / dl glucose solution containing no maltose was set to 100, and the measured values of samples containing 300 mg / dl glucose in the base were relatively evaluated. The results are shown in FIG.
Ｑ７６Ｅのマルトース作用性の確認
Ｑ７６Ｋのマルトース作用性の確認同様にＱ１６８Ｅを用いて作用性を評価した。酵素は、０．２４Ｕ／ｍｌの濃度で添加した。結果を図４に示す。
Confirmation of maltose action of Q76E The action was evaluated using Q168E similarly to the confirmation of maltose action of Q76K. Enzyme was added at a concentration of 0.24 U / ml. FIG. 4 shows the results.
Ｑ１６８Ｖのマルトース作用性の確認
Ｑ７６Ｋのマルトース作用性の確認同様にＱ１６８Ｖを用いて作用性を評価した。酵素は、０．３５Ｕ／ｍｌの濃度で添加した。結果を図５に示す。
Confirmation of maltose action of Q168V The action was evaluated using Q168V similarly to the confirmation of maltose action of Q76K. Enzyme was added at a concentration of 0.35 U / ml. FIG. 5 shows the results.
Ｑ１６８Ａのマルトース作用性の確認
Ｑ７６Ｋのマルトース作用性の確認同様にＱ１６８Ａを用いて作用性を評価した。酵素は、０．６Ｕ／ｍｌの濃度で添加した。結果を図６に示す。
Confirmation of maltose action of Q168A In the same manner as confirmation of maltose action of Q76K, the action was evaluated using Q168A. The enzyme was added at a concentration of 0.6 U / ml. FIG. 6 shows the results.
野生型酵素のマルトース作用性の確認
Ｑ７６Ｋのマルトース作用性の確認同様に野生型酵素を用いて作用性を評価した。酵素は、０．１Ｕ／ｍｌの濃度で添加した。結果を図７に示す。
図３、図４、図５、図６、図７より、Ｑ７６Ｋ、Ｑ７６Ｅ、Ｑ１６８Ｖ及びＱ１６８Ａは野生型酵素に比べ、マルトースに対する作用性が低下していることが確認された。
Confirmation of maltose action of wild-type enzyme Action of maltose action of Q76K was evaluated in the same manner as that of wild-type enzyme. The enzyme was added at a concentration of 0.1 U / ml. FIG. 7 shows the results.
From FIG. 3, FIG. 4, FIG. 5, FIG. 6, and FIG. 7, it was confirmed that Q76K, Q76E, Q168V, and Q168A had lower action on maltose than the wild-type enzyme.
実施例５：変異ライブラリーの構築とスクリーニング
発現プラスミドｐＮＰＧ５をテンプレートとして、ＰＣＲ法により構造遺伝子中の１６７−１６９領域にランダム変異を導入した。ＰＣＲ反応は表３に示す組成の溶液中で、９８℃２分間、次に、９８℃２０秒間、６０℃３０秒間、及び７２℃４分間を３０サイクルの条件で行った。
Example 5: Construction and screening of mutation library Using the expression plasmid pNPG5 as a template, random mutation was introduced into the 167-169 region in the structural gene by PCR. The PCR reaction was performed in a solution having the composition shown in Table 3 at 98 ° C. for 2 minutes, and then at 98 ° C. for 20 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 4 minutes for 30 cycles.
得られた変異ライブラリーを大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、形成された各コロニーを１８０μｌ／ｗｅｌｌのＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと２６μＭのＰＱＱを含む）の分注されたマイクロタイタープレートに植菌し、３７℃、２４時間培養した。培養液各５０μｌを別のマイクロタイタープレートに移し、凍結融解の繰り返しによって培養菌体を破砕した後、遠心分離（２０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、上清を回収した。回収した上清を２枚のマイクロタイタープレートに各１０μｌ分注した。１枚のマイクロタイタープレートはグルコースを基質とした活性測定試薬を用いて活性測定し、もう一枚はマルトースを基質とした活性測定試薬を用いて活性測定し、反応性を比較した。マルトースに対する反応性の変化したクローンが多数得られた。
マルトースに対する反応性の変化したクローンをＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと２６μＭのＰＱＱを含む）５ｍｌの分注された試験管で培養し、確認実験を行ったところ、マルトースに対する反応性の変化したクローンが多数得られた。
結果を表４に示す。
The resulting mutant library was transformed into Escherichia coli DH5α, and each formed colony was inoculated on a microtiter plate in which 180 μl / well of LB medium (containing 100 μg / ml of ampicillin and 26 μM of PQQ) was dispensed. Then, the cells were cultured at 37 ° C for 24 hours. Each 50 μl of the culture solution was transferred to another microtiter plate, and the cultured cells were disrupted by repeated freezing and thawing, followed by centrifugation (2000 rpm, 10 minutes) to collect the supernatant. The collected supernatant was dispensed into two microtiter plates in an amount of 10 μl each. One microtiter plate was measured for activity using an activity measuring reagent using glucose as a substrate, and the other was measured for activity using an activity measuring reagent using maltose as a substrate, and the reactivity was compared. Numerous clones with altered reactivity to maltose were obtained.
A clone having a changed reactivity to maltose was cultured in a test tube in which 5 ml of LB medium (containing 100 μg / ml of ampicillin and 26 μM of PQQ) was dispensed, and a confirmation experiment was performed. Many clones were obtained.
Table 4 shows the results.
同様にして６７−６９領域（フォワードプライマー：配列番号１４に記載、リバースプライマー：配列番号１５に記載を使用）、１２９−１３１領域（フォワードプライマー：配列番号１６に記載、リバースプライマー：配列番号１７に記載を使用）、３４１−３４３領域（フォワードプライマー：配列番号１８に記載、リバースプライマー：配列番号１９に記載を使用）にも変異導入した。また、４２８と４２９（フォワードプライマー：配列番号２０に記載、リバースプライマー：配列番号２１に記載を使用）の間に挿入を試みた。
結果を表５に示す。
Similarly, regions 67-69 (forward primer: described in SEQ ID NO: 14, reverse primer: used in SEQ ID NO: 15), regions 129-131 (forward primer: described in SEQ ID NO: 16, reverse primer: SEQ ID NO: 17) Mutations were also introduced into the 341-343 region (forward primer: described in SEQ ID NO: 18 and reverse primer: used in SEQ ID NO: 19). Insertion was attempted between 428 and 429 (forward primer: described in SEQ ID NO: 20, reverse primer: described in SEQ ID NO: 21).
Table 5 shows the results.
これらのうち、マルトースに対する作用性が大きく低下している変異体を選抜（Ｑ１６８Ｓ＋Ｅ２４５Ｄ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｄ、Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｓ、Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｅ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ、Ｑ１６８Ｓ＋Ｌ１６９Ｐ）し、これらの変異体からプラスミドを抽出し、実施例３並びに実施例４記載の方法に準じてシュードモナスを形質転換してホロ型酵素を発現し、精製酵素を取得して特性を評価した。結果を表６に示す。 Among these, mutants having significantly reduced activity on maltose were selected (Q168S + E245D, Q168A + L169D, Q168S + L169S, Q168S + L169E, Q168A + L169G, Q168S + L169P), and plasmids were extracted from these mutants, Example 3 and Example 4. According to the method described, Pseudomonas was transformed to express a holo-type enzyme, a purified enzyme was obtained, and its properties were evaluated. Table 6 shows the results.
実施例６：Ｑ１６８部位の変異による基質特異性への影響
実施例５に記載の方法に準じて、Ｑ１６８Ｃ、Ｑ１６８Ｄ、Ｑ１６８Ｅ，Ｑ１６８Ｆ，Ｑ１６８Ｇ，Ｑ１６８Ｈ，Ｑ１６８Ｋ，Ｑ１６８Ｌ，Ｑ１６８Ｍ，Ｑ１６８Ｎ，Ｑ１６８Ｐ、Ｑ１６８Ｒ，Ｑ１６８Ｓ，Ｑ１６８Ｔ、Ｑ１６８Ｗ、Ｑ１６８Ｙの各変異体を調製した。各変異体の調製に使用したプライマーを表７に示す。また、調製した各変異体を用い、試験管培養にて調製した破砕液でマルトースに対する反応性を比較した結果を表８に示す。更に、各変異体からプラスミドを抽出し、実施例３並びに実施例４記載の方法に準じてシュードモナスを形質転換してホロ型酵素を発現し、精製酵素を取得して特性を評価した。結果を表９に示す。
Example 6: Effect of mutation at Q168 site on substrate specificity According to the method described in Example 5, Q168C, Q168D, Q168E, Q168F, Q168G, Q168H, Q168K, Q168L, Q168M, Q168N, Q168P, Q168R, Each mutant of Q168S, Q168T, Q168W, and Q168Y was prepared. Table 7 shows the primers used for preparing each mutant. In addition, Table 8 shows the results of comparing the reactivity of maltose with the crushed liquid prepared in a test tube culture using each prepared mutant. Further, a plasmid was extracted from each mutant, and Pseudomonas was transformed according to the method described in Example 3 and Example 4 to express a holo-type enzyme, and a purified enzyme was obtained and its properties were evaluated. Table 9 shows the results.
実施例７：Ｌ１６９部位の変異による基質特異性への影響
実施例２に記載の方法に準じて、Ｌ１６９Ａ，Ｌ１６９Ｖ，Ｌ１６９Ｈ、Ｌ１６９Ｙ、Ｌ１６９Ｋ，Ｌ１６９Ｄ，Ｌ１６９Ｓ，Ｌ１６９Ｎ，Ｌ１６９Ｇ，Ｌ１６９Ｃの各変異体を調製した。各変異体の調製に使用したプライマーを表１０に示す。また、調製した各変異体を用い、試験管培養にて調製した破砕液でマルトースに対する反応性を比較した結果を表１１に示す。
Example 7: Influence on substrate specificity by mutation of L169 site According to the method described in Example 2, each mutant of L169A, L169V, L169H, L169Y, L169K, L169D, L169S, L169N, L169G and L169C was used. Prepared. Table 10 shows the primers used for preparing each mutant. Table 11 shows the results of comparison of the reactivity of maltose with the crushed liquid prepared in a test tube culture using each prepared mutant.
実施例８：Ｑ１６８Ａ変異体に対するＬ１６９部位の変異の組み合わせによる基質特異性への影響
実施例５に記載の方法に準じて、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ａ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｃ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｅ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｆ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｈ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｉ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｋ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｍ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｎ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｑ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｒ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｓ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｔ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｖ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｗ、Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｙの各変異体を調製した。各変異体の調製に使用したプライマーを表１２に示す。また、調製した各変異体を用い、試験管培養にて調製した破砕液でマルトースに対する反応性を比較した結果を表１３に示す。更に、各変異体からプラスミドを抽出し、実施例３並びに実施例４記載の方法に準じてシュードモナスを形質転換してホロ型酵素を発現し、精製酵素を取得して特性を評価した。結果を表１４に示す。
Example 8 Effect of Combination of Mutations at L169 Site on Q168A Mutant on Substrate Specificity According to the method described in Example 5, Q168A + L169A, Q168A + L169C, Q168A + L169E, Q168A + L169F, Q168A + L169H, Q168A + 16A, Q168A + L16H Each mutant of Q168A + L169P, Q168A + L169Q, Q168A + L169R, Q168A + L169S, Q168A + L169T, Q168A + L169V, Q168A + L169W, and Q168A + L169Y was prepared. Table 12 shows the primers used for preparing each mutant. Table 13 shows the results of comparison of the reactivity of maltose with the crushed liquid prepared in a test tube culture using each prepared mutant. Further, a plasmid was extracted from each mutant, and Pseudomonas was transformed according to the method described in Example 3 and Example 4 to express a holo-type enzyme, and a purified enzyme was obtained and its properties were evaluated. Table 14 shows the results.
実施例９：Ａ１７０部位の変異による基質特異性への影響
実施例２に記載の方法に準じて、Ａ１７０Ｃ、Ａ１７０Ｄ、Ａ１７０Ｅ，Ａ１７０Ｆ，Ａ１７０Ｇ，Ａ１７０Ｈ，Ａ１７０Ｋ，Ａ１７０Ｌ，Ａ１７０Ｍ，Ａ１７０Ｎ，Ａ１７０Ｐ、Ａ１７０Ｒ，Ａ１７０Ｓ，Ａ１７０Ｔ、Ａ１７０Ｗ、Ａ１７０Ｙ，Ａ１７０Ｖ，Ａ１７０Ｉ，Ａ１７０Ｑの各変異体を調製した。各変異体の調製にはフォワードプライマーとして配列番号６９記載の合成オリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号６９と相補的な合成オリゴヌクレオチド使用した。調製した変異ライブラリーをスクリーニングして目的の変異体を取得した。試験管培養にて調製した破砕液を用いてマルトースに対する反応性を比較した結果を表１５に示す。
Example 9: Influence of mutation at A170 site on substrate specificity According to the method described in Example 2, A170C, A170D, A170E, A170F, A170G, A170H, A170K, A170L, A170M, A170N, A170P, A170R, Each mutant of A170S, A170T, A170W, A170Y, A170V, A170I and A170Q was prepared. For preparation of each mutant, a synthetic oligonucleotide described in SEQ ID NO: 69 was used as a forward primer, and a synthetic oligonucleotide complementary to SEQ ID NO: 69 was used as a reverse primer. The prepared mutant library was screened to obtain the target mutant. Table 15 shows the results of comparing the reactivity to maltose using the crushed liquid prepared by test tube culture.
実施例１０：Ｅ２４５部位の変異による基質特異性への影響
実施例２に記載の方法に準じて、Ｅ２４５Ｃ、Ｅ２４５Ｄ、Ｅ２４５Ａ，Ｅ２４５Ｆ，Ｅ２４５Ｇ，Ｅ２４５Ｈ，Ｅ２４５Ｋ，Ｅ２４５Ｌ，Ｅ２４５Ｍ，Ｅ２４５Ｎ，Ｅ２４５Ｐ、Ｅ２４５Ｒ，Ｅ２４５Ｓ，Ｅ２４５Ｔ、Ｅ２４５Ｗ、Ｅ２４５Ｙ，Ｅ２４５Ｖ，Ｅ２４５Ｉ，Ｅ２４５Ｑの各変異体を調製した。各変異体の調製にはフォワードプライマーとして配列番号７０記載の合成オリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号７０と相補的な合成オリゴヌクレオチド使用した。調製した変異ライブラリーをスクリーニングして目的の変異体を取得した。試験管培養にて調製した破砕液を用いてマルトースに対する反応性を比較した結果を表１６に示す。
Example 10: Effect on mutation of E245 site on substrate specificity According to the method described in Example 2, E245C, E245D, E245A, E245F, E245G, E245H, E245K, E245L, E245M, E245N, E245P, E245R, Each mutant of E245S, E245T, E245W, E245Y, E245V, E245I, and E245Q was prepared. For the preparation of each mutant, a synthetic oligonucleotide described in SEQ ID NO: 70 was used as a forward primer, and a synthetic oligonucleotide complementary to SEQ ID NO: 70 was used as a reverse primer. The prepared mutant library was screened to obtain the target mutant. Table 16 shows the results of comparing the reactivity to maltose using the crushed liquid prepared in the test tube culture.
実施例１１：Ｎ２４９部位の変異による基質特異性への影響
実施例２に記載の方法に準じて、Ｎ２４９Ｃ、Ｎ２４９Ｄ、Ｎ２４９Ａ，Ｎ２４９Ｆ，Ｎ２４９Ｇ，Ｎ２４９Ｈ，Ｎ２４９Ｋ，Ｎ２４９Ｌ，Ｎ２４９Ｍ，Ｎ２４９Ｅ，Ｎ２４９Ｐ、Ｎ２４９Ｒ，Ｎ２４９Ｓ，Ｎ２４９Ｔ、Ｎ２４９Ｗ、Ｎ２４９Ｖ，Ｎ２４９Ｉ，Ｎ２４９Ｑの各変異体を調製した。各変異体の調製にはフォワードプライマーとして配列番号７１記載の合成オリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号７１と相補的な合成オリゴヌクレオチド使用した。調製した変異ライブラリーをスクリーニングして目的の変異体を取得した。試験管培養にて調製した破砕液を用いてマルトースに対する反応性を比較した結果を表１７に示す。
Example 11: Effect of mutation at N249 site on substrate specificity According to the method described in Example 2, N249C, N249D, N249A, N249F, N249G, N249H, N249K, N249L, N249M, N249E, N249P, N249R, Each mutant of N249S, N249T, N249W, N249V, N249I, and N249Q was prepared. For preparation of each mutant, a synthetic oligonucleotide described in SEQ ID NO: 71 was used as a forward primer, and a synthetic oligonucleotide complementary to SEQ ID NO: 71 was used as a reverse primer. The prepared mutant library was screened to obtain the target mutant. Table 17 shows the results of comparing the reactivity to maltose using the crushed liquid prepared in the test tube culture.
実施例１２：Ｅ２４５Ｄ変異の組み合わせによる基質特異性への影響
実施例２に記載の方法に準じて、（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ＋Ｅ２４５Ｄ）、（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ＋Ｅ２４５Ｄ）の各変異体を調製した。各変異体の調製にはフォワードプライマーとして配列番号７２記載の合成オリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号７２と相補的な合成オリゴヌクレオチド使用した。また、鋳型ＤＮＡとしては実施例８で取得した（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｇ）または（Ｑ１６８Ａ＋Ｌ１６９Ｐ）のｐｌａｓｍｉｄを使用した。調製した変異体を、試験管培養にて調製した破砕液でマルトースに対する反応性を比較した結果を表１８に示す。
Example 12: Effect of combination of E245D mutation on substrate specificity According to the method described in Example 2, (Q168A + L169G + E245D) and (Q168A + L169P + E245D) mutants were prepared. For preparation of each mutant, a synthetic oligonucleotide described in SEQ ID NO: 72 was used as a forward primer, and a synthetic oligonucleotide complementary to SEQ ID NO: 72 was used as a reverse primer. As the template DNA, the plasmid (Q168A + L169G) or the plasmid (Q168A + L169P) obtained in Example 8 was used. Table 18 shows the results of comparing the reactivity of the prepared mutants with maltose in a crushed liquid prepared in a test tube culture.
本発明によれば、基質特異性及び／又は熱安定性が改善されたＰＱＱＧＤＨを得ることができる。この改変型ＰＱＱＧＤＨは、グルコースアッセイキット、グルコースセンサに利用できる。 According to the present invention, PQQGDH with improved substrate specificity and / or thermal stability can be obtained. This modified PQQGDH can be used for a glucose assay kit and a glucose sensor.
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