JP2006230252A - ポリペプチド発現システム - Google Patents
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Abstract
【課題】足場非依存的な増殖能を有し、かつウイルスの感染を阻害する物質を産生する動物細胞において、前記ウイルスを介した生物学的な手法により、迅速に容易に、高い効率で、ポリペプチドを発現させる。手段を提供すること。
【解決手段】足場非依存的な増殖能を有し、かつウイルスの感染を阻害する物質を産生する動物細胞に、該ウイルスに対するレセプターをコードする核酸が発現可能に導入されたウイルス易感染性細胞、それを含有したポリペプチド発現システム及びポリペプチドの大量発現用の発現システム、並びにそれを用いるポリペプチドの発現方法。
【選択図】なし
【解決手段】足場非依存的な増殖能を有し、かつウイルスの感染を阻害する物質を産生する動物細胞に、該ウイルスに対するレセプターをコードする核酸が発現可能に導入されたウイルス易感染性細胞、それを含有したポリペプチド発現システム及びポリペプチドの大量発現用の発現システム、並びにそれを用いるポリペプチドの発現方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、ポリペプチド発現システムに関する。さらに詳しくは、ポリペプチドの大量生産を行ないうる、ポリペプチド発現システム、ポリペプチドの発現方法及びそれに用いるウイルス易感染性細胞に関する。
チャイニーズハムスターオバリー細胞〔Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ） ｃｅｌｌ〕は、主に、細胞の機能解析に用いられている細胞の１つである。
近年、ＣＨＯ細胞の中から足場非依存性増殖をできるクローンを選別し、モノクローナル抗体などのタンパク質を大量に生産する哺乳類細胞系として使用されている（例えば、非特許文献１参照）。
しかしながら、かかるＣＨＯ細胞は、レトロウイルス等による感染に抵抗性を示し（例えば、非特許文献２参照）、レトロウイルス等の感染を阻害する物質を産生している可能性が示唆されている。
そのため、ＣＨＯ細胞における異種タンパク質の発現には、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等の物理学的な遺伝子導入方法により、発現対象の核酸を導入する必要がある。また、ＣＨＯ細胞を用いる異種タンパク質の発現システムは、生物学的活性の発現が確かめられている既知配列の核酸を、薬剤耐性遺伝子等を保持したベクター等を介して導入し、薬剤選抜によりクローナルなＣＨＯ細胞を選択する必要がある。そのため、ＣＨＯ細胞を用いる異種タンパク質の発現システムは、複雑な操作が必要であり、時間を要し、発現対象の核酸が既知である必要があるという欠点がある。
トゥリル(Trill)ら著、「ＣＯＳ細胞及びＣＨＯ細胞におけるモノクローナル抗体の生産(Production of monoclonal antibodies in COS and CHO cells.)」、Curr Opin Biotechnol.、 １９９５年１０月、第６巻、第５号、ｐ５５３−５６０ タイシュ（Teich N.）著、「ＲＮＡ癌ウイルス(RNA tumor viruses)」、１９８４年、第１巻、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行、ｐ２５−２０８
トゥリル(Trill)ら著、「ＣＯＳ細胞及びＣＨＯ細胞におけるモノクローナル抗体の生産(Production of monoclonal antibodies in COS and CHO cells.)」、Curr Opin Biotechnol.、 １９９５年１０月、第６巻、第５号、ｐ５５３−５６０ タイシュ（Teich N.）著、「ＲＮＡ癌ウイルス(RNA tumor viruses)」、１９８４年、第１巻、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行、ｐ２５−２０８
本発明は、１つの側面では、足場非依存的な増殖能を有し、かつウイルス（例えば、レトロウイルス等）の感染を阻害する物質を産生する動物細胞、例えば、ＣＨＯ−Ｓ細胞等において、前記ウイルスを介した生物学的な手法によりポリペプチドを発現させること、高い効率で、ポリペプチドを前記細胞で発現させること、活性の発現や配列が未知のランダム変異タンパク質をコードする核酸を前記細胞に導入し発現させること、迅速に容易に操作できること等の少なくとも１つを達成する、ポリペプチド発現システムを提供することに関する。また、本発明は、他の側面では、前記細胞において、前記ウイルスを介した生物学的な手法によりポリペプチドを発現させること、高い効率で、ポリペプチドを前記細胞で発現させること、前記細胞において、迅速かつ簡便な操作で、活性の発現や配列が未知のランダム変異タンパク質を発現させること等の少なくとも１つを達成する、ポリペプチドの発現方法を提供することに関する。本発明は、別の側面では、前記ポリペプチドの発現方法を行なうに適したウイルス易感染性細胞を提供することに関する。なお、本発明の他の課題は、本明細書の記載から明らかであり、導き出される。
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕 足場非依存的な増殖能を有し、かつウイルスの感染を阻害する物質を産生する動物細胞に、該ウイルスに対するレセプターをコードする核酸が発現可能に導入されてなる、ウイルス易感染性細胞、
〔２〕 該動物細胞が、チャイニーズハムスターオバリー細胞である、前記〔１〕記載のウイルス易感染性細胞、
〔３〕 該ウイルスが、エコトロピックレトロウイルスである、前記〔１〕又は〔２〕記載のウイルス易感染性細胞、
〔４〕 該ウイルスに対するレセプターが、アミノ酸トランスポーターである、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載のウイルス易感染性細胞、
〔５〕 該アミノ酸トランスポーターが、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を含有したポリペプチドである、前記〔４〕記載のウイルス易感染性細胞、
〔６〕 Ａ）前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のウイルス易感染性細胞と、
Ｂ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸を導入するためのウイルス由来のベクターと、
を含有してなる、ポリペプチド発現システム、
〔７〕 該ウイルス由来のベクターが、
ａ）２つのＬＴＲと、
ｂ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸の挿入部位を有する核酸と、
ｃ）選択マーカーをコードする核酸と
を含有し、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置されてなり、配列番号：３に示される塩基配列からなるベクターである、前記〔６〕記載のポリペプチド発現システム、
〔８〕 該ウイルス由来のベクターが、ｄ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結するためのタグ配列をコードする核酸をさらに含有し、ここで、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸と、前記ｄ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置され、前記ｄ）の核酸が、前記ｂ）の核酸を介して、発現対象のポリペプチドをコードする核酸に作動可能になるように配置されてなるベクターである、前記〔６〕又は〔７〕記載のポリペプチド発現システム、
〔９〕 該ウイルス由来のベクターが、ｅ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸をさらに含有し、ここで、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸と、前記ｅ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置され、前記ｂ）の核酸の挿入部位に、前記ｅ）の核酸が挿入されてなるベクターである、前記〔６〕又は〔７〕記載のポリペプチド発現システム、
〔１０〕 該ウイルス由来のベクターが、ｅ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸をさらに含有し、ここで、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸と、前記ｄ）の核酸と、前記ｅ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置され、前記ｄ）の核酸が、前記ｂ）の核酸を介して、前記ｅ）の核酸に作動可能に連結されてなるベクターである、前記〔８〕記載のポリペプチド発現システム、
〔１１〕 Ａ’）前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のウイルス易感染性細胞に、発現対象のポリペプチドをコードする核酸を導入するためのウイルス由来のベクターを保持したウイルスを感染させたウイルス感染細胞と、
Ｂ’）前記〔９〕又は〔１０〕記載のウイルス由来のベクターと、
を含有してなる、ポリペプチドの大量発現用の発現システム、
〔１２〕 前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のウイルス易感染性細胞に、下記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクター：
（Ｉ）ａ）２つのＬＴＲと、
ｂ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸の挿入部位を有する核酸と、
ｃ）選択マーカーをコードする核酸と、
ｅ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸と、
を含有し、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸と、前記ｅ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置され、前記ｂ）の核酸の挿入部位に、前記ｅ）の核酸が挿入されてなるウイルス由来のベクター、又は
（ＩＩ）ａ）２つのＬＴＲと、
ｂ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸の挿入部位を有する核酸と、
ｃ）選択マーカーをコードする核酸と、
ｄ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結するためのタグ配列をコードする核酸と、
ｅ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸と、
を含有し、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸と、前記ｄ）の核酸と、前記ｅ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置され、前記ｄ）の核酸が、前記ｂ）の核酸を介して、前記ｅ）の核酸に作動可能に連結されてなるウイルス由来のベクター、
を保持するウイルスを感染させ、目的とするポリペプチドを発現させることを特徴とする、ポリペプチドの発現方法、
〔１３〕 （１）前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のウイルス易感染性細胞に、前記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクターを保持するウイルスを感染させ、ウイルス感染細胞を得る工程、及び
（２）前記ステップ（１）で得られたウイルス感染細胞を培養して、目的とするポリペプチドを発現させる工程、
を含む、前記〔１２〕記載の発現方法、
〔１４〕 （１）前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のウイルス易感染性細胞に、前記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクターを保持するウイルスを感染させ、ウイルス感染細胞を得る工程、
（２’）前記ステップ（１）で得られたウイルス感染細胞に、前記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクターを保持するウイルスをさらに感染させ、ウイルス多重感染細胞を得る工程、
（３）前記ステップ（２’）で得られたウイルス多重感染細胞を培養して、目的とするポリペプチドを発現させる工程、
を含む、前記〔１２〕記載の発現方法、並びに
〔１５〕 足場非依存的な増殖能を有し、かつエコトロピックレトロウイルスレセプターをコードする核酸が発現可能に導入されてなる、チャイニーズハムスターオバリー細胞、
に関する。
〔１〕 足場非依存的な増殖能を有し、かつウイルスの感染を阻害する物質を産生する動物細胞に、該ウイルスに対するレセプターをコードする核酸が発現可能に導入されてなる、ウイルス易感染性細胞、
〔２〕 該動物細胞が、チャイニーズハムスターオバリー細胞である、前記〔１〕記載のウイルス易感染性細胞、
〔３〕 該ウイルスが、エコトロピックレトロウイルスである、前記〔１〕又は〔２〕記載のウイルス易感染性細胞、
〔４〕 該ウイルスに対するレセプターが、アミノ酸トランスポーターである、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載のウイルス易感染性細胞、
〔５〕 該アミノ酸トランスポーターが、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を含有したポリペプチドである、前記〔４〕記載のウイルス易感染性細胞、
〔６〕 Ａ）前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のウイルス易感染性細胞と、
Ｂ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸を導入するためのウイルス由来のベクターと、
を含有してなる、ポリペプチド発現システム、
〔７〕 該ウイルス由来のベクターが、
ａ）２つのＬＴＲと、
ｂ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸の挿入部位を有する核酸と、
ｃ）選択マーカーをコードする核酸と
を含有し、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置されてなり、配列番号：３に示される塩基配列からなるベクターである、前記〔６〕記載のポリペプチド発現システム、
〔８〕 該ウイルス由来のベクターが、ｄ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結するためのタグ配列をコードする核酸をさらに含有し、ここで、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸と、前記ｄ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置され、前記ｄ）の核酸が、前記ｂ）の核酸を介して、発現対象のポリペプチドをコードする核酸に作動可能になるように配置されてなるベクターである、前記〔６〕又は〔７〕記載のポリペプチド発現システム、
〔９〕 該ウイルス由来のベクターが、ｅ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸をさらに含有し、ここで、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸と、前記ｅ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置され、前記ｂ）の核酸の挿入部位に、前記ｅ）の核酸が挿入されてなるベクターである、前記〔６〕又は〔７〕記載のポリペプチド発現システム、
〔１０〕 該ウイルス由来のベクターが、ｅ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸をさらに含有し、ここで、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸と、前記ｄ）の核酸と、前記ｅ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置され、前記ｄ）の核酸が、前記ｂ）の核酸を介して、前記ｅ）の核酸に作動可能に連結されてなるベクターである、前記〔８〕記載のポリペプチド発現システム、
〔１１〕 Ａ’）前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のウイルス易感染性細胞に、発現対象のポリペプチドをコードする核酸を導入するためのウイルス由来のベクターを保持したウイルスを感染させたウイルス感染細胞と、
Ｂ’）前記〔９〕又は〔１０〕記載のウイルス由来のベクターと、
を含有してなる、ポリペプチドの大量発現用の発現システム、
〔１２〕 前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のウイルス易感染性細胞に、下記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクター：
（Ｉ）ａ）２つのＬＴＲと、
ｂ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸の挿入部位を有する核酸と、
ｃ）選択マーカーをコードする核酸と、
ｅ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸と、
を含有し、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸と、前記ｅ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置され、前記ｂ）の核酸の挿入部位に、前記ｅ）の核酸が挿入されてなるウイルス由来のベクター、又は
（ＩＩ）ａ）２つのＬＴＲと、
ｂ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸の挿入部位を有する核酸と、
ｃ）選択マーカーをコードする核酸と、
ｄ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結するためのタグ配列をコードする核酸と、
ｅ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸と、
を含有し、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸と、前記ｄ）の核酸と、前記ｅ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置され、前記ｄ）の核酸が、前記ｂ）の核酸を介して、前記ｅ）の核酸に作動可能に連結されてなるウイルス由来のベクター、
を保持するウイルスを感染させ、目的とするポリペプチドを発現させることを特徴とする、ポリペプチドの発現方法、
〔１３〕 （１）前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のウイルス易感染性細胞に、前記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクターを保持するウイルスを感染させ、ウイルス感染細胞を得る工程、及び
（２）前記ステップ（１）で得られたウイルス感染細胞を培養して、目的とするポリペプチドを発現させる工程、
を含む、前記〔１２〕記載の発現方法、
〔１４〕 （１）前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のウイルス易感染性細胞に、前記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクターを保持するウイルスを感染させ、ウイルス感染細胞を得る工程、
（２’）前記ステップ（１）で得られたウイルス感染細胞に、前記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクターを保持するウイルスをさらに感染させ、ウイルス多重感染細胞を得る工程、
（３）前記ステップ（２’）で得られたウイルス多重感染細胞を培養して、目的とするポリペプチドを発現させる工程、
を含む、前記〔１２〕記載の発現方法、並びに
〔１５〕 足場非依存的な増殖能を有し、かつエコトロピックレトロウイルスレセプターをコードする核酸が発現可能に導入されてなる、チャイニーズハムスターオバリー細胞、
に関する。
本発明のポリペプチド発現システムによれば、足場非依存的な増殖能を有し、かつウイルス（例えば、レトロウイルス等）の感染を阻害する物質を産生する動物細胞、例えば、ＣＨＯ−Ｓ細胞等において、前記ウイルスを介した生物学的な手法により、迅速に容易に、高い効率で、ポリペプチドを発現させることができ、活性の発現や配列が未知のランダム変異タンパク質をコードする核酸を前記細胞に導入し発現させることができるという優れた効果を奏する。また、本発明のポリペプチドの発現方法によれば、迅速かつ簡便に、高い効率で、前記細胞において、前記ウイルスを介した生物学的な手法によりポリペプチドを発現させることができ、活性の発現や配列が未知のランダム変異タンパク質を発現させることができるという優れた効果を奏する。本発明のウイルス易感染性細胞によれば、本発明のポリペプチドの発現方法を迅速に容易に行なうことができ、高い効率で、ポリペプチドを発現させることができ、活性の発現や配列が未知のランダム変異タンパク質をコードする核酸を前記細胞に導入し発現させることができるという優れた効果を奏する。
本発明は、１つの側面では、Ａ） 足場非依存的な増殖能を有し、かつウイルスの感染を阻害する物質を産生する動物細胞に、該ウイルスに対するレセプターをコードする核酸が発現可能に導入された、ウイルス易感染性細胞と、Ｂ） 発現対象のポリペプチドをコードする核酸を導入するためのウイルス由来のベクターと、
を含有したポリペプチド発現システム（「ポリペプチド発現システム１」とも表記する）に関する。
を含有したポリペプチド発現システム（「ポリペプチド発現システム１」とも表記する）に関する。
本発明のポリペプチド発現システム１は、前記Ａ）のウイルス易感染性細胞及び前記Ｂ）のウイルス由来のベクターそれぞれの使用方法、それらの保存方法、前記Ａ）のウイルス易感染性細胞と、前記Ｂ）のウイルス由来のベクターとを用いて、ポリペプチドを製造する方法、例えば、後述の本発明のポリペプチドの発現方法等の少なくとも１つが記載された使用説明書をさらに含有してもよい。なお、前記使用説明書は、本発明のポリペプチド発現システム１に添付する形態であってもよく、電磁的手法、例えば、電気通信回線を通じて提供する形態であってもよい。
また、本発明のポリペプチド発現システム１は、前記ウイルス易感染性細胞を培養するに適した培地等を適宜含有してもよい。
本発明のポリペプチド発現システム１において、前記Ｂ）のウイルス由来のベクターは、発現対象のポリペプチドをコードする核酸を組み込むに適した状態、例えば、直鎖状の核酸としても提供されうる。
さらに、本発明のポリペプチド発現システム１は、前記Ｂ）のウイルス由来ベクターに、発現対象のポリペプチドをコードする核酸を組み込むに適した試薬、例えば、リガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、制限酵素等を適宜含有していてもよい。
また、本発明のポリペプチド発現システム１は、前記Ｂ）のウイルス由来ベクターをパッケージングするに適したパッケージング細胞をさらに含有していてもよい。
本明細書において、「ポリペプチド発現システム」の用語は、別の側面では、ポリペプチド発現用キットを意味する。
本発明のポリペプチド発現システム１は、足場非依存的な増殖能を有し、かつウイルスの感染を阻害する物質を産生する動物細胞に、該ウイルスに対するレセプターをコードする核酸が発現可能に導入された、ウイルス易感染性細胞を含有することに１つの大きな特徴がある。したがって、従来、感染を阻害する物質の作用等によりウイルス由来のベクターを用いて感染させることが困難であったウイルス由来のベクターにより、予想外にも、発現対象のポリペプチドを発現させることができるという優れた効果を発揮する。そのため、本発明のポリペプチド発現システム１によれば、慣用のエコトロピックレトロウイルス由来のベクター等を用いることができる。
なお、前記「ウイルスに対するレセプターをコードする核酸が発現可能に導入」とは、染色体に組み込まれる場合のみに限定されるものではなく、一過的に導入される場合、複製起点を有するプラスミドや人工染色体等の形で導入される場合も含まれる。
本発明のポリペプチド発現システム１は、前記細胞と、ウイルス由来のベクターとを含有しているため、本発明のポリペプチド発現システム１によれば、物理学的な遺伝子導入方法により核酸を導入した場合のようにクローナルな形質転換された細胞を実質的に選択することなく、迅速に容易に発現対象のポリペプチドを発現させることができる。
前記「ウイルス」としては、特に限定されるものではないが、好ましくは、エコトロピックレトロウイルス、エコトロピックウイルスのレセプターを介して感染できる改変レンチウイルス等が挙げられる。前記「ウイルス」としては、具体的には、例えば、エコトロピックレトロウイルスとして、ＭｏＬｖ〔モロニー白血病ウイルス(Moloney Leukemia virus)〕、その他ＭＭＴＶ〔マウス乳癌ウイルス(murine mammary tumor virus)〕、マウス幹細胞ウイルス(murine stem cell virus)等が挙げられる
また、本発明のポリペプチド発現システム１に用いられる細胞は、足場非依存的な増殖能を有する細胞であるため、例えば、大型の培養容器等を用いた大量培養が可能になるため、大量に目的とするポリペプチドを得ることができるという優れた効果を発揮する。前記細胞としては、本質的にエコトロピックウイルスに感染しないか、あるいは感染効率が低い細胞、例えば、ハムスター細胞、ヒト細胞等が挙げられ、より具体的には、例えば、ＣＨＯ−Ｓ細胞〔足場非依存性増殖可能なＣＨＯ（チャイニーズハムスターオバリー：Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞；ギブコ−ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）社供給〕等が挙げられる。前記ＣＨＯ−Ｓ細胞は、操作が容易であり、細胞又は培養培地から発現タンパク質が高効率で回収できる観点から、前記ＣＨＯ−Ｓ細胞が好ましい。
前記レセプターは、ウイルスが細胞に感染する際に必要な細胞表面に局在するタンパク質であればよい。前記レセプターとしては、例えば、エコトロピックレトロウイルスレセプター、アンフォトロフィックレトロウイルスレセプター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）レセプター等が挙げられ、具体的には、例えば、エコトロピックレトロウイルスレセプターとして、アミノ酸トランスポーター等、アンフォトロフィックレトロウイルスレセプターとして、Ｎａ依存性リン酸シンポーター(sodium dependent phosphate symporters)〔カバナウ(Kavanaugh)ら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA.、１９９４年、第９１巻、第７０５１頁〜第７０５５頁〕等、ＨＩＶのレセプターとして、ＣＤ４、ケモカインレセプター等（例えば、ＣＣＲ４）等が挙げられる。
前記アミノ酸トランスポーターとしては、例えば、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を含有したポリペプチド等が挙げられる。
前記アミノ酸トランスポーターをコードする核酸（配列番号：１）は、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞〔アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）供給〕のｍＲＮＡを鋳型とし、配列番号：４に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号：５に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマー対を用い、ＲＴ−ＰＣＲにより得られうる。
なお、本発明においては、前記レセプターは、前記足場非依存的な増殖能を有し、かつウイルスの感染を阻害する物質を産生する動物細胞へのウイルスの感染を可能にする機能を呈するものであれば、天然型のアミノ酸配列からなるポリペプチドに限定されるものではなく、いわゆるバリアントであってもよい。また、本発明においては、前記レセプター又はそのバリアントのアミノ酸配列のうち、ウイルスの結合に機能を発揮する領域と、細胞へのウイルスの感染に機能を発揮する領域とを有するポリペプチドを、前記ウイルスの感染を阻害する物質を産生する細胞中において発現させてもよい。
なお、前記レセプターの機能の評価は、例えば、レセプターを、ウイルスが感染しない細胞に発現させ、ウイルスの感染が起こるかどうかをウイルスに存在するマーカーとなる遺伝子が発現するかどうかをテストすること等により行なわれうる。
すなわち、本発明に用いられるレセプターのバリアントは、前記レセプターの機能の評価の手法により、レセプターとしての機能を有することが示されるものであれば、
Ａ． 天然型のレセプターのアミノ酸配列において、少なくとも１個、好ましくは、１個又は複数個、好ましくは、１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を有する配列を含有したポリペプチド
Ｂ． 天然型のレセプターのアミノ酸配列をコードする核酸のアンチセンス鎖とストリンジェント、好ましくは、中ストリンジェント、より好ましくは、高ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする、いいかえれば、十分にハイブリダイズする核酸によりコードされるポリペプチド、
Ｃ． 天然型のレセプターのアミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１，Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １，ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０，ｗｏｒｄｓｉｚｅ ３の条件下にアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも５０％、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上であるアミノ酸配列を含有したポリペプチド
等であってもよい。ここで、前記ストリンジェントな条件とは、６×ＳＳＣ〔組成：０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．９Ｍ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）〕と０．５重量％ （ＳＤＳ）と５×デンハルトと１００μｇ／ｍｌ 変性ＤＮＡと５０％ ホルムアミドとを含有したハイブリダイゼーション溶液中、天然型のレセプターのアミノ酸配列をコードする核酸のアンチセンス鎖の核酸とともに、５５℃、よりストリンジェントには、６０℃で１０時間〜２４時間インキュベーションし、ついで、例えば、２×ＳＳＣ〔組成：０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）〕、よりストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ〔組成：０．０１５ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）〕等の条件及び／又は室温、ストリンジェントには、４２℃以上、よりストリンジェントには、５０℃以上、より一層ストリンジェントには、６０℃以上等の条件下での洗浄を行なう条件等をいう。かかるストリンジェントな条件は、モレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル 第３版〔ザンブルーク(Sambrook)ら、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd ed.(2001)〕等を参照して適宜設定されうる。
Ａ． 天然型のレセプターのアミノ酸配列において、少なくとも１個、好ましくは、１個又は複数個、好ましくは、１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を有する配列を含有したポリペプチド
Ｂ． 天然型のレセプターのアミノ酸配列をコードする核酸のアンチセンス鎖とストリンジェント、好ましくは、中ストリンジェント、より好ましくは、高ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする、いいかえれば、十分にハイブリダイズする核酸によりコードされるポリペプチド、
Ｃ． 天然型のレセプターのアミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ １１，Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ １，ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ １０，ｗｏｒｄｓｉｚｅ ３の条件下にアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも５０％、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上であるアミノ酸配列を含有したポリペプチド
等であってもよい。ここで、前記ストリンジェントな条件とは、６×ＳＳＣ〔組成：０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．９Ｍ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）〕と０．５重量％ （ＳＤＳ）と５×デンハルトと１００μｇ／ｍｌ 変性ＤＮＡと５０％ ホルムアミドとを含有したハイブリダイゼーション溶液中、天然型のレセプターのアミノ酸配列をコードする核酸のアンチセンス鎖の核酸とともに、５５℃、よりストリンジェントには、６０℃で１０時間〜２４時間インキュベーションし、ついで、例えば、２×ＳＳＣ〔組成：０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）〕、よりストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ〔組成：０．０１５ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）〕等の条件及び／又は室温、ストリンジェントには、４２℃以上、よりストリンジェントには、５０℃以上、より一層ストリンジェントには、６０℃以上等の条件下での洗浄を行なう条件等をいう。かかるストリンジェントな条件は、モレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル 第３版〔ザンブルーク(Sambrook)ら、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd ed.(2001)〕等を参照して適宜設定されうる。
前記バリアントは、例えば、天然型のレセプターのアミノ酸配列をコードする核酸を、当業者に周知の変異導入方法で変異を導入すること、前記天然型のレセプターのアミノ酸配列をコードする核酸のアンチセンス鎖の核酸をプローブとして用いて、スクリーニングすること等により得られうる。
また、前記Ａ）の細胞は、慣用のベクター等を用い、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、パーティクルガンを用いたボンバードメント法等の遺伝子導入方法により、前記ウイルスに対するレセプターをコードする核酸を、前記ウイルスの感染を阻害する物質を産生する細胞に導入することにより得られうる。例えば、前記アミノ酸トランスポーターをコードする核酸を発現可能に導入されたＣＨＯ−Ｓ細胞は、配列番号：１の塩基配列を有する核酸を慣用のベクター等を用い、前記遺伝子導入方法により、ＣＨＯ−Ｓ細胞に導入し発現させることにより得られうる。前記アミノ酸トランスポーターをコードする核酸がＣＨＯ−Ｓ細胞に導入されたことの確認は、用いられたベクターに由来するマーカーの発現の有無をマーカーに応じた手法により検出すること等により行なわれ得、例えば、レセプターに対する標識抗体を用いたＥＬＩＳＡやウエスタンブロット解析による検出、蛍光マーカーの蛍光観察、ＲＴ−ＰＣＲ等による検出等が挙げられる。
なお、本発明においては、前記足場非依存的な増殖能を有し、かつウイルスの感染を阻害する物質を産生する動物細胞に代えて、足場非依存的な増殖能を有し、かつウイルスに難感染性の動物細胞、もともとウイルス感染阻害物質能を有していたが、何らかの人為的な操作、例えば、突然変異処理、遺伝子破壊、アンチセンス技術、ＲＮＡｉ技術等により、ウイルスの感染を阻害する物質を産生しなくなった細胞等を用いてよい。ここで、前記「難感染性」とは、ウイルスレセプターを強制発現した際、その細胞へのウイルスの感染効率が上昇することをいう。前記「難感染性」は、具体的には、例えば、エコトロピックレトロウイルスに対する感染性において、ＭＥＦ細胞又はＮＩＨ３Ｔ３細胞と比べて感染効率が低いことをいう。前記ウイルスの感染効率は、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞と目的の細胞とを、それぞれ同数培養し、同じウイルスの力価で感染させた場合に、マーカー遺伝子の存在又は発現を指標として比較することにより評価されうる。
本発明は、別の側面では、足場非依存的な増殖能を有し、かつウイルスの感染を阻害する物質を産生する動物細胞に、該ウイルスに対するレセプターをコードする核酸が発現可能に導入された細胞、すなわち、ウイルス易感染性細胞に関する。
また、本発明は、さらに他の側面では、足場非依存的な増殖能を有し、かつエコトロピックレトロウイルスをコードする核酸が発現可能に導入されてなる、チャイニーズハムスターオバリー細胞に関する。
また、本発明は、他の側面では、前記Ａ）のウイルス易感染性細胞を含有したポリペプチド発現システム（「ポリペプチド発現システム２」とも表記する）に関する。
かかるポリペプチド発現システム２は、前記Ａ）のウイルス易感染性細胞の使用方法、その保存方法、前記Ａ）のウイルス易感染性細胞を用いて、ポリペプチドを製造する方法、例えば、後述の本発明のポリペプチドの発現方法等の少なくとも１つが記載された使用説明書をさらに含有してもよい。なお、前記使用説明書は、本発明のポリペプチド発現システム２に添付する形態であってもよく、電磁的手法、例えば、電気通信回線を通じて提供する形態であってもよい。
前記Ｂ）のウイルス由来のベクターとしては、例えば、ｐＣＸベクター誘導体、ｐＭＸ、ｐＢａｂｅ、ｐＺｉｐ、ｐＧＸ等に由来するベクター等が挙げられる。前記ウイルス由来のベクターとしては、具体的には、ａ）２つのＬＴＲと、
ｂ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸の挿入部位を有する核酸と、
ｃ）選択マーカーをコードする核酸と、
を含有し、２つのＬＴＲの間に、該発現対象のポリペプチドをコードする核酸と、該選択マーカーをコードする核酸とが、それぞれ発現可能に配置されるベクター（例えば、図１に例示されるベクター等）、より具体的には、配列番号：３に示される塩基配列を有するベクター（「ｐＧＸ」という）が挙げられる。
ｂ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸の挿入部位を有する核酸と、
ｃ）選択マーカーをコードする核酸と、
を含有し、２つのＬＴＲの間に、該発現対象のポリペプチドをコードする核酸と、該選択マーカーをコードする核酸とが、それぞれ発現可能に配置されるベクター（例えば、図１に例示されるベクター等）、より具体的には、配列番号：３に示される塩基配列を有するベクター（「ｐＧＸ」という）が挙げられる。
前記ａ）のＬＴＲは、ウイルス、例えば、レトロウイルス等、好ましくは、エコトロピックレトロウイルスに由来するもの等が挙げられる。前記ＬＴＲは、例えば、下遠野ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８０年発行、第２８５巻、第５５０頁〜第５５４頁等に記載のもの等が挙げられる。
前記ｂ）の挿入部位を有する核酸としては、各種制限酵素の認識部位等を有する塩基配列からなる核酸等が挙げられる。なお、前記「挿入部位」には、例えば、各種制限酵素の認識部位（制限酵素切断部位）、組換え部位等が含まれるが、これらに限定されるものではない。
前記ｃ）の選択マーカーをコードする核酸としては、例えば、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ、ＲＦＰ等）をコードする核酸、ネオマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。検出の容易性の観点から、前記ｃ）の核酸は、ＧＦＰをコードする核酸、ネオマイシンをコードする核酸、ブラストサイジンをコードする核酸、ピューロマイシンをコードする核酸が望ましい。
前記Ｂ）のウイルス由来のベクターは、発現細胞を迅速に選択する観点から、発現対象のポリペプチドをコードする核酸と、選択マーカーをコードする核酸とが、それぞれ発現可能に配置されたものであり、例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）を配置させることにより、同じｍＲＮＡから、発現対象のポリペプチドと、選択マーカーとを発現できるベクターであることが望ましい。
前記Ｂ）のウイルス由来のベクターは、ｄ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結するためのタグ配列をコードする核酸をさらに含有するベクターであってもよい。前記タグ配列としては、例えば、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジンタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等が挙げられる。前記タグ配列をコードする核酸を含有したベクターは、発現対象のポリペプチドを容易に精製することできる点で有利である。すなわち、かかるタグ配列を有するウイルス由来のベクターとしては、前記ａ）〜ｃ）に加え、前記ｄ）の核酸をさらに含有し、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸と、前記ｄ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置され、前記ｄ）の核酸が、前記ｂ）の核酸を介して、発現対象のポリペプチドをコードする核酸に作動可能になるように配置されてなるベクターが挙げられる。
また、前記Ｂ）のウイルス由来のベクターは、発現対象のポリペプチドをコードする核酸の挿入部位に発現対象のポリペプチドをコードする核酸を挿入されたベクターであってもよい。かかるベクターは、
− 前記発現対象のポリペプチドをコードする核酸を保持しないウイルス由来のベクターに、発現対象のポリペプチドをコードする核酸を挿入し、
− 得られたベクターを、慣用の方法、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、パーティクルガンを用いたボンバードメント法等により、適切なパッケージング細胞にトランスフェクションし、
− 得られた細胞を、適切な条件下にコンフルエントになるまで培養し、前記Ｂ）のベクターをパッケージングしたウイルスを産生させ、
− 得られた培養物の上清を回収すること
等により得られうる。すなわち、かかるベクターとしては、前記ａ）〜ｃ）に加え、前記ｅ）の核酸をさらに含有し、ここで、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸と、前記ｅ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置され、前記ｂ）の核酸の挿入部位に、前記ｅ）の核酸が挿入されたベクター；前記ａ）〜ｃ）に加え、前記ｅ）の核酸をさらに含有し、ここで、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸と、前記ｄ）の核酸と、前記ｅ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置され、前記ｄ）の核酸が、前記ｂ）の核酸を介して、前記ｅ）の核酸に作動可能に連結されたベクター等が挙げられる。
− 前記発現対象のポリペプチドをコードする核酸を保持しないウイルス由来のベクターに、発現対象のポリペプチドをコードする核酸を挿入し、
− 得られたベクターを、慣用の方法、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、パーティクルガンを用いたボンバードメント法等により、適切なパッケージング細胞にトランスフェクションし、
− 得られた細胞を、適切な条件下にコンフルエントになるまで培養し、前記Ｂ）のベクターをパッケージングしたウイルスを産生させ、
− 得られた培養物の上清を回収すること
等により得られうる。すなわち、かかるベクターとしては、前記ａ）〜ｃ）に加え、前記ｅ）の核酸をさらに含有し、ここで、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸と、前記ｅ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置され、前記ｂ）の核酸の挿入部位に、前記ｅ）の核酸が挿入されたベクター；前記ａ）〜ｃ）に加え、前記ｅ）の核酸をさらに含有し、ここで、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸と、前記ｄ）の核酸と、前記ｅ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置され、前記ｄ）の核酸が、前記ｂ）の核酸を介して、前記ｅ）の核酸に作動可能に連結されたベクター等が挙げられる。
発現対象のポリペプチドとしては、特に限定されるものではなく、種々のポリペプチド、例えば、従来、発現させることが極めて困難であったポリペプチド、具体的には、例えば、分子量１００ｋＤａ以上のタンパク質、哺乳動物細胞に特異的な修飾を有するタンパク質等が挙げられる。
前記パッケージング細胞としては、例えば、ＰＬＴ細胞〔北村俊雄博士提供、モリタら（S Morita）ら、Gene Therapy、第７巻、第１０６３頁〜第１０６６頁（２０００）〕、Ｂｏｓｃ２３細胞〔２９３ＣＯＳ及び２９３Ｔ細胞に、レトロウイルスのコンポーネントであるｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖを、別のベクターでトランスフェクションして得られた細胞〕等が挙げられる。
前記Ｂ）のウイルス由来のベクターには、誘導可能なプロモーター（例えば、テトラサイクリン、ＩＰＴＧ等により誘導又は抑制されるプロモーター等）や、増幅可能な配列を有するＤＮＡ（例えば、ＤＨＦＲ遺伝子やｍｙｃ遺伝子の複製起点等）を適宜含有してもよい。
本発明のポリペプチド発現システム１の実施態様の具体例としては、特に限定されないが、塩基性アミノ酸トランスポーターをコードする核酸が発現可能に導入されたＣＨＯ−Ｓ細胞と、配列番号：３に示される塩基配列を有するベクターとを含有したポリペプチド発現システム；塩基性アミノ酸トランスポーターをコードする核酸が発現可能に導入されたＣＨＯ−Ｓ細胞と、配列番号：３に示される塩基配列を有するベクターと、使用説明書とを含有したポリペプチド発現システム等が挙げられる。
本発明のポリペプチド発現システム２の実施態様の具体例としては、特に限定されないが、塩基性アミノ酸トランスポーターをコードする核酸が発現可能に導入されたＣＨＯ−Ｓ細胞を含有したポリペプチド発現システム；塩基性アミノ酸トランスポーターをコードする核酸が発現可能に導入されたＣＨＯ−Ｓ細胞と、使用説明書とを含有したポリペプチド発現システム等が挙げられる。
本発明のポリペプチド発現システムによれば、ポリペプチドの迅速な発現及び精製を行なうことができ、また、活性の発現や配列が未知のランダム変異タンパク質をコードする核酸を前記細胞に導入し発現させることができる。
また、本発明のポリペプチド発現システムによれば、例えば、大腸菌、酵母等のタンパク質発現系では、１５０ｋＤａもの分子量を有するポリペプチドの発現、哺乳動物細胞のタンパク質修飾を伴うタンパク質の発現は、困難であるが、物理学的な遺伝子導入法を用いる発現系よりも大きい分子量を有するポリペプチドの発現も可能になる。また、本発明のポリペプチド発現システムによれば、前記発現系に比べ、選択に要する時間を短縮することができ、極めて短時間で発現対象のポリペプチドを得ることができる。したがって、本発明のポリペプチド発現システムによれば、各種変異体の機能解析等のハイスループットの解析が可能になる。
また、本発明は、さらに他の側面では、Ａ’）前記ウイルス易感染性細胞に、発現対象のポリペプチドをコードする核酸を導入するための前記ウイルス由来のベクターを保持したウイルスを感染させたウイルス感染細胞と、
Ｂ’）発現対象のポリペプチドをコードする核酸を導入するための前記ウイルス由来のベクターと、
を含有した、ポリペプチドの大量発現用の発現システムに関する。なお、かかるポリペプチドの大量発現用の発現システムにおけるＡ’）及びＢ’）の発現対象のポリペプチドは、同一のポリペプチドである。
Ｂ’）発現対象のポリペプチドをコードする核酸を導入するための前記ウイルス由来のベクターと、
を含有した、ポリペプチドの大量発現用の発現システムに関する。なお、かかるポリペプチドの大量発現用の発現システムにおけるＡ’）及びＢ’）の発現対象のポリペプチドは、同一のポリペプチドである。
かかるポリペプチドの大量発現用の発現システムによれば、発現対象のポリペプチドをコードする核酸を導入するための前記ウイルス由来のベクターを多重感染させることができ、それにより、発現対象のポリペプチドを大量に得ることができる。
本発明は、他の側面では、前記ウイルス易感染性細胞に、下記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクター：
（Ｉ）ａ）２つのＬＴＲと、
ｂ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸の挿入部位を有する核酸と、
ｃ）選択マーカーをコードする核酸と、
ｅ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸と、
を含有し、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸と、前記ｅ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置され、前記ｂ）の核酸の挿入部位に、前記ｅ）の核酸が挿入されてなるウイルス由来のベクター、又は
（ＩＩ）ａ）２つのＬＴＲと、
ｂ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸の挿入部位を有する核酸と、
ｃ）選択マーカーをコードする核酸と、
ｄ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結するためのタグ配列をコードする核酸と、
ｅ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸と、
を含有し、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸と、前記ｄ）の核酸と、前記ｅ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置され、前記ｄ）の核酸が、前記ｂ）の核酸を介して、前記ｅ）の核酸に作動可能に連結されてなるウイルス由来のベクター、
を保持するウイルスを感染させ、目的とするポリペプチドを発現させることを特徴とする、ポリペプチドの発現方法に関する。
（Ｉ）ａ）２つのＬＴＲと、
ｂ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸の挿入部位を有する核酸と、
ｃ）選択マーカーをコードする核酸と、
ｅ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸と、
を含有し、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸と、前記ｅ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置され、前記ｂ）の核酸の挿入部位に、前記ｅ）の核酸が挿入されてなるウイルス由来のベクター、又は
（ＩＩ）ａ）２つのＬＴＲと、
ｂ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸の挿入部位を有する核酸と、
ｃ）選択マーカーをコードする核酸と、
ｄ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結するためのタグ配列をコードする核酸と、
ｅ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸と、
を含有し、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸と、前記ｄ）の核酸と、前記ｅ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置され、前記ｄ）の核酸が、前記ｂ）の核酸を介して、前記ｅ）の核酸に作動可能に連結されてなるウイルス由来のベクター、
を保持するウイルスを感染させ、目的とするポリペプチドを発現させることを特徴とする、ポリペプチドの発現方法に関する。
本発明のポリペプチドの発現方法には、本発明のポリペプチド発現システムを用いることができる。
本発明のポリペプチドの発現方法は、前記ウイルス易感染性細胞と、前記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクターとが用いられているため、足場非依存的な増殖能を有し、かつウイルス（例えば、レトロウイルス等）の感染を阻害する物質を産生する動物細胞；例えば、ＣＨＯ−Ｓ細胞等において、前記ウイルスを介した生物学的な手法により、迅速かつ簡便な操作で、高い効率で、ポリペプチドを発現させることができる。また、本発明のポリペプチドの発現方法は、前記ウイルス易感染性細胞と前記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクターとが用いられているため、前記細胞において、活性の発現や配列が未知のランダム変異タンパク質を発現させることができる。そのため、本発明のポリペプチドの発現方法によれば、ハイスループットでのタンパク質の機能解析等が可能になる。例えば、迅速にレセプタータンパク質を発現させた細胞を得ることにより、結合物質を迅速にスクリーニングすること、抗体を発現させ、安全性等を迅速に評価すること等の新規医薬品、健康食品、生理活性物質のスクリーニング系を迅速に構築することができる。
本発明のポリペプチドの発現方法は、１つの実施態様では、
（１）前記ウイルス易感染性細胞に、前記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクターを保持するウイルスを感染させ、ウイルス感染細胞を得る工程、及び
（２）前記ステップ（１）で得られたウイルス感染細胞を培養して、目的とするポリペプチドを発現させる工程、
を含む方法（実施態様１の方法）が挙げられる。
（１）前記ウイルス易感染性細胞に、前記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクターを保持するウイルスを感染させ、ウイルス感染細胞を得る工程、及び
（２）前記ステップ（１）で得られたウイルス感染細胞を培養して、目的とするポリペプチドを発現させる工程、
を含む方法（実施態様１の方法）が挙げられる。
前記工程（１）においては、前記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクターをパッケージングしたウイルスを作製し、得られたウイルスを前記ウイルス易感染性細胞に感染させればよい。
なお、前記工程（１）において、ウイルス由来のベクターは、前記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクターに代えて、他のウイルス、例えば、エコトロピックウイルス由来のベクターを用いてもよい。
また、前記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクターが、慣用のフローサイトメトリーを用いたセルソーターによりソーティング可能な選択マーカー、例えば、ＧＦＰ等を保持するベクターである場合、前記工程（１）の後、該選択マーカーに基づきソーティングすることにより、発現対象のポリペプチドを発現する細胞を、より効率よく得ることができる。
ついで、工程（２）において、得られたウイルス感染細胞を培養して、目的とするポリペプチドを発現させる。
ウイルス感染細胞の培養は、細胞の種類に応じた培養条件下で行なわれうる。
発現対象のポリペプチドは、得られた細胞から、細胞溶解液を調製し、目的のポリペプチドを分離することにより得られる。前記ポリペプチドの分離は、慣用のタンパク質の精製方法により行なわれうる。
ここで、前記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクターが、タグ配列をコードする核酸を保持するものである場合、前記工程（２）において、前記タグ配列に応じたアフィニティーカラムを用いることにより、発現対象のポリペプチドを当該タグ配列との融合ポリペプチドとして容易に分離することができる。具体的には、タグ配列が、ＧＳＴの場合、例えば、グルタチオンビーズを用いること、ポリヒスチジンタグの場合、例えば、ニッケルキレートカラムを用いること等により、発現対象のポリペプチドを融合ポリペプチドとして容易に分離できる。発現対象のポリペプチドが、融合ポリペプチドとして得られた場合、適切な手法によりタグ配列を、発現対象のポリペプチドから除去することもできる。
なお、本発明のポリペプチドの発現方法によれば、前記ウイルス易感染性細胞が用いられているため、前記工程１において、前記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクターをパッケージングしたウイルスを多重感染させることもできる。これにより、１細胞あたりの発現対象のポリペプチドの発現量を増大させることができるため、発現対象のポリペプチドを大量に、迅速かつ簡便に得ることができる。
したがって、本発明のポリペプチドの発現方法は、他の実施態様では、
（１）前記ウイルス易感染性細胞に、前記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクターを保持するウイルスを感染させ、ウイルス感染細胞を得る工程、
（２’）前記ステップ（１）で得られたウイルス感染細胞に、前記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクターを保持するウイルスをさらに感染させ、ウイルス多重感染細胞を得る工程、
（３）前記ステップ（２’）で得られたウイルス多重感染細胞を培養して、目的とするポリペプチドを発現させる工程、
を含む方法（実施態様２の方法）が挙げられる。なお、かかる実施態様２の方法の各工程における発現対象のポリペプチドは、同一のポリペプチドであってもよく、異種のポリペプチドであってもよい。
（１）前記ウイルス易感染性細胞に、前記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクターを保持するウイルスを感染させ、ウイルス感染細胞を得る工程、
（２’）前記ステップ（１）で得られたウイルス感染細胞に、前記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクターを保持するウイルスをさらに感染させ、ウイルス多重感染細胞を得る工程、
（３）前記ステップ（２’）で得られたウイルス多重感染細胞を培養して、目的とするポリペプチドを発現させる工程、
を含む方法（実施態様２の方法）が挙げられる。なお、かかる実施態様２の方法の各工程における発現対象のポリペプチドは、同一のポリペプチドであってもよく、異種のポリペプチドであってもよい。
前記実施態様２の方法の各工程において、同一のポリペプチドを保持するベクターを用いる場合には、大量にポリペプチドを発現させることができるという優れた効果を発揮する。したがって、かかる実施態様のポリペプチドの発現方法は、ポリペプチドの大量生産に有利である。
また、前記実施態様２の方法の各工程において、異種のポリペプチドを保持するそれぞれ別のベクターを用いる場合には、動物細胞において、効率よく、少なくとも２種のポリペプチドを発現させることができる。したがって、かかる実施態様のポリペプチドの発現方法は、少なくとも２種のポリペプチドが関連して生理学的活性を発揮する事象におけるポリペプチドの発現に有利である。前記「少なくとも２種のポリペプチドが関連して生理学的活性を発揮する事象」としては、複数種のポリペプチドが、多量体を形成して生理学的活性を発揮すること、複数種のポリペプチドが、逐次的又は複合的に作用して生理学的活性を発揮すること等が挙げられる。
前記工程（１）は、前記実施態様１の方法と同様である。なお、前記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクターが、慣用のフローサイトメトリーを用いたセルソーターによりソーティング可能な選択マーカー、例えば、ＧＦＰ等を保持するベクターである場合、前記工程（１）の後、該選択マーカーに基づきソーティングすることにより、ウイルス感染細胞を濃縮することができ、それにより、発現対象のポリペプチドを発現する細胞を、より効率よく得ることができる。
その後、前記工程（２’）において、前記ステップ（１）と同様の手法により、前記ステップ（１）で得られたウイルス感染細胞に、前記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクターをパッケージングしたウイルスを感染させる。ここで、前記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクターが、慣用のフローサイトメトリーを用いたセルソーターによりソーティング可能な選択マーカー、例えば、ＧＦＰ等を保持するベクターである場合、前記工程（１）の後、該選択マーカーに基づきソーティングすることにより、ウイルス多重感染細胞を濃縮することができる。
ついで、前記工程（３）において、得られたウイルス多重感染細胞を培養して、目的とするポリペプチドを発現させる。ウイルス感染細胞の培養は、細胞の種類に応じた培養条件下で行なわれうる。
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により何ら限定されるものではない。なお、以下の実施例等において、細胞培養のための培地等について、特に断りのない限り、例えば、フレッシュニー(Freshney, R. Ian)、Culture of animal cells A manual of basic technique, 2nd ed.、第６６頁−第８４頁（１９８７）、Aran R. Liss. Inc.；カートワイト(Cartwight, T.)ら、Culture media, Basic Cell Culture: A Practical Approach、第５７頁〜第９１頁（１９９４）、IRL Press等が参照される。
エコトロピックレトロウイルスレセプター発現ＣＨＯ細胞の作製
（１）エコトロピックレトロウイルスレセプターのクローニング
ＮＩＨ３Ｔ３細胞〔アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）供給〕から、商品名：Ｉｓｏｇｅｎ〔株式会社ニッポンジーン製〕を用いて、ｍＲＮＡを調製した。得られたｍＲＮＡと、インビトロジェン社製、商品名：ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩと、プライマー対とを用い、ＲＴ−ＰＣＲを行ない、エコトロピックレトロウイルスレセプター（以下、「ＥｃｏＲ」という）をコードするｃＤＮＡを得た。なお、前記プライマー対として、
5'プライマー：5'-gctaccgtggactctgctgtg-3'（配列番号：４）と
3'プライマー：5'-ccggaattctcatttgcactggtccaagttgc-3'（配列番号：５）と
からなるプライマー対を用いた。また、ＲＴ−ＰＣＲにおけるサーマルプロファイルは、９４℃で２分間のインキュベーション後、順に、９４℃で１分間と７２℃で４分間とを１サイクルとする５サイクル、９４℃で１分間と６８℃で４分間とを１サイクルとする５サイクル、９４℃で１分間と６２℃で４分間とを１サイクルとする５サイクル、９４℃で１分間と５５℃で４分間とを１サイクルとする２０サイクル、７２℃で１０分間のインキュベーションとした。
（１）エコトロピックレトロウイルスレセプターのクローニング
ＮＩＨ３Ｔ３細胞〔アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）供給〕から、商品名：Ｉｓｏｇｅｎ〔株式会社ニッポンジーン製〕を用いて、ｍＲＮＡを調製した。得られたｍＲＮＡと、インビトロジェン社製、商品名：ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩと、プライマー対とを用い、ＲＴ−ＰＣＲを行ない、エコトロピックレトロウイルスレセプター（以下、「ＥｃｏＲ」という）をコードするｃＤＮＡを得た。なお、前記プライマー対として、
5'プライマー：5'-gctaccgtggactctgctgtg-3'（配列番号：４）と
3'プライマー：5'-ccggaattctcatttgcactggtccaagttgc-3'（配列番号：５）と
からなるプライマー対を用いた。また、ＲＴ−ＰＣＲにおけるサーマルプロファイルは、９４℃で２分間のインキュベーション後、順に、９４℃で１分間と７２℃で４分間とを１サイクルとする５サイクル、９４℃で１分間と６８℃で４分間とを１サイクルとする５サイクル、９４℃で１分間と６２℃で４分間とを１サイクルとする５サイクル、９４℃で１分間と５５℃で４分間とを１サイクルとする２０サイクル、７２℃で１０分間のインキュベーションとした。
得られた産物を、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとで、消化し、得られた断片を、商品名：ｐｃＤＮＡ３．１〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＩＮＣ.）社製〕にサブクローニングした。得られたプラスミドを用い、挿入断片の塩基配列を決定した。決定された塩基配列を配列番号：１に示す。
また、前記プラスミドを、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩとで消化して、断片を切り出した。切り出された断片を、ｐＣＸ４ｂｓｒ〔赤城剛博士提供；赤城(T. Akagi)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、第９７巻、第７２９０頁〜第７２９５頁、２０００年１月２０日〕にサブクローニングし、ｐＣＸ４−ＢＳＲ−ＥｃｏＲベクターを得た。
（２）ｐＧＸベクターの構築
商品名：ＥＧＦＰＣ１ベクター〔クローンテック(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＩＮＣ．)社製〕を、ＮｃｏＩとＸｈｏＩとで消化し、ＧＦＰをコードする遺伝子を含むＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ断片を得た。前記ＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ断片を、予めＮｃｏＩとＳａｌＩとで消化したｐＣＸｂｓｒベクター（赤城剛博士提供）にサブクローニングし、ｐＣＸＧＦＰベクターを得た。
商品名：ＥＧＦＰＣ１ベクター〔クローンテック(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＩＮＣ．)社製〕を、ＮｃｏＩとＸｈｏＩとで消化し、ＧＦＰをコードする遺伝子を含むＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ断片を得た。前記ＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ断片を、予めＮｃｏＩとＳａｌＩとで消化したｐＣＸｂｓｒベクター（赤城剛博士提供）にサブクローニングし、ｐＣＸＧＦＰベクターを得た。
一方、商品名：ｐＧＥＸ４Ｔ１〔アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＩＮＣ．）社製〕を鋳型とし、
5'プライマー：gaagatctaccatgtcccctatactaggttattgg（配列番号：６）と
3'プライマー：cgcgaggcagatcgtcag（配列番号：７）と
を用い、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲ法で増幅した。なお、ＰＣＲにおけるサーマルプロファイルは、９４℃で２分間のインキュベーション後、順に、９４℃で１分間と５５℃で２分間と７２℃で３分間とを１サイクルとする３０サイクル、７２℃で１０分間のインキュベーションとした。
5'プライマー：gaagatctaccatgtcccctatactaggttattgg（配列番号：６）と
3'プライマー：cgcgaggcagatcgtcag（配列番号：７）と
を用い、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲ法で増幅した。なお、ＰＣＲにおけるサーマルプロファイルは、９４℃で２分間のインキュベーション後、順に、９４℃で１分間と５５℃で２分間と７２℃で３分間とを１サイクルとする３０サイクル、７２℃で１０分間のインキュベーションとした。
得られたｃＤＮＡを、商品名：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ〔ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＩＮＣ．）社製〕のＥｃｏＲＶ部位にサブクローニングした。得られたプラスミドから、ＢｇｌＩＩとＮｏｔＩとで消化して、ＧＳＴをコードするｃＤＮＡ（ＧＳＴ ｃＤＮＡ）を得た。得られたＧＳＴ ｃＤＮＡを、ＢａｍＨＩと、ＮｏｔＩとで消化した。得られた断片を、前記ｐＣＸＧＦＰにサブクローニングして、ｐＧＸベクターを得た。得られたｐＧＸベクターの概略図を図１に示す。また、前記ｐＧＸベクターの塩基配列を配列番号：３に示す。
（３）ｐＣＸ４−ＢＳＲ−ＥｃｏＲベクターをパッケージングしたウイルス産生
ウイルス産生には、パッケージング細胞であるＰＬＴ細胞〔北村俊雄博士提供、モリタら（S Morita）ら、Gene Therapy、第７巻、第１０６３頁〜第１０６６頁（２０００）〕を用いた。
ウイルス産生には、パッケージング細胞であるＰＬＴ細胞〔北村俊雄博士提供、モリタら（S Morita）ら、Gene Therapy、第７巻、第１０６３頁〜第１０６６頁（２０００）〕を用いた。
前記ＰＬＴ細胞 １．２×１０6細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ） ４ｍｌに懸濁し、６ｃｍディッシュに播種し、３７℃、ＣＯ2濃度 ５容量％で２４時間培養した。
一方、商品名：Ｆｕｇｅｎｅ６〔ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製〕 １０μｌと、ＤＭＥＭ ２００μｌとを混合し、５分間室温で静置させた。得られた混合物に、商品名：ｐＧＰベクター（タカラバイオ社製） １μｇと、商品名：ＰＳ−ｅｃｏ（タカラバイオ社製） １μｇと、ｐＣＸ４−ＢＳＲ−ＥｃｏＲベクター １μｇとを添加し、混合し、１５分間室温で静置した。
得られた混合物を、前記ＰＬＴが入ったディッシュに添加し、３５℃、ＣＯ2濃度 ５容量％で２４時間インキュベーションし、トランスフェクションを行なった。その後、培地を新たなＤＭＥＭに交換し、さらに３５℃、ＣＯ2濃度 ５容量％で２４時間インキュベーションした。その後、得られた培養物の上清 ４ｍｌを回収し、０．２μｍ（内径）孔フィルター〔コーニング（ＣＯＲＮＩＮＧ）社製〕に通した。これにより、ウイルス液を得た。
（４）ＣＨＯ−Ｓ細胞に一過的にＥｃｏＲを発現させるためのトランスフェクション
ＣＨＯ−Ｓ細胞〔ギブコ−ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）社供給〕 ２×１０6細胞を、商品名：ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ〔ギブコ−ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）社製〕 ４ｍｌに懸濁させ、得られた懸濁物を、６ｃｍディッシュに播種し、３７℃、ＣＯ2濃度 ８容量％で２４時間培養した。なお、培地は、前記商品名：ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ〔ギブコ−ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）社製〕に限定されるものではなく、ＣＨＯ細胞を培養できる培地、ＤＭＥＭ等でも代替できる。
ＣＨＯ−Ｓ細胞〔ギブコ−ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）社供給〕 ２×１０6細胞を、商品名：ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ〔ギブコ−ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）社製〕 ４ｍｌに懸濁させ、得られた懸濁物を、６ｃｍディッシュに播種し、３７℃、ＣＯ2濃度 ８容量％で２４時間培養した。なお、培地は、前記商品名：ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ〔ギブコ−ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）社製〕に限定されるものではなく、ＣＨＯ細胞を培養できる培地、ＤＭＥＭ等でも代替できる。
一方、商品名：Ｆｕｇｅｎｅ６〔ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製〕 １０μｌと、ＤＭＥＭ ２００μｌとを混合し、５分間室温で静置させた。得られた混合物に、ｐＣＸ４−ＢＳＲ−ＥｃｏＲベクター １μｇを添加し、１５分間室温で静置した。
得られた混合物を、前記ＣＨＯ−Ｓ細胞が入ったディッシュに添加し、３７℃、ＣＯ2濃度 ８容量％で２４時間静置した。
（５）ｐＣＸ４−ＢＳＲ−ＥｃｏＲをパッケージングしたウイルスによるＣＨＯ−Ｓ細胞の感染
前記（４）で得られたＣＨＯ−Ｓ細胞 ４．０×１０5細胞を、商品名：ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ〔ギブコ−ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）社製〕 ４ｍｌに懸濁した。得られた懸濁物を、６ｃｍディッシュに播種し、３７℃、ＣＯ2濃度 ８容量％で２４時間培養した。
前記（４）で得られたＣＨＯ−Ｓ細胞 ４．０×１０5細胞を、商品名：ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ〔ギブコ−ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）社製〕 ４ｍｌに懸濁した。得られた懸濁物を、６ｃｍディッシュに播種し、３７℃、ＣＯ2濃度 ８容量％で２４時間培養した。
その後、前記ディッシュに、ｐＣＸ４−ＢＳＲ−ＥｃｏＲをパッケージングしたウイルス液 ５００μｌ添加して、感染させ、３５℃、ＣＯ2濃度 ５容量％で２４時間培養した。その後、培地を新たな商品名：ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩに交換し、３７℃、ＣＯ2濃度 ８容量％で２４時間培養した。
トランスフェクション後の細胞 ４．０×１０5細胞を、商品名：ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ ４ｍｌに懸濁した。得られた懸濁物を、６ｃｍディッシュ １枚に播種した。同様の条件で、トランスフェクション後の細胞を播種したディッシュ ５枚を作製し、それぞれのディッシュ上の細胞について、ブラスチシジンＳ濃度 ２．５μｇ／ｍｌ、５．０μｇ／ｍｌ、１０．０μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ又は２５．０μｇ／ｍｌ存在下に、３７℃、ＣＯ2濃度 ８容量％で７日間培養することにより、薬剤選抜を行なった。また、対照として、トランスフェクションを行なっていないＣＨＯ−Ｓ細胞についても同様に薬剤選抜を行なった。
その結果、ブラストシチジンＳ １０μｇ／ｍｌで薬剤選抜を行なった場合、トランスフェクション後のＣＨＯ−Ｓ細胞と、トランスフェクションを行なっていないＣＨＯ−Ｓ細胞との間において有意差が見られた。また、ブラストシチジンＳ ２５．０μｇ／ｍｌで薬剤選抜を行なった場合にもトランスフェクション後の細胞が生存したため、ブラストシチジンＳ ２５．０μｇ／ｍｌ存在下で1週間培養し、生存したＣＨＯ−Ｓ細胞（以下ＣＨＯ−ＥｃｏＲという）をＥｃｏＲ発現ＣＨＯ−Ｓ細胞として用いた。
前記実施例１で得られたＣＨＯ−ＥｃｏＲ細胞 ４．０×１０5細胞を、商品名：ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ〔ギブコ−ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）社製〕 ４ｍｌに懸濁し、６ｃｍディッシュに播種し、３７℃、ＣＯ2濃度 ８容量％で２４時間培養した。その後、前記培養物に、ｐＧＸをパッケージングしたウイルスのウイルス液 ５００μｌを添加し、感染させた。
得られた細胞について、商品名：ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトンディッキンソン社製）でｐＧＸの導入により発現したＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）による蛍光の有無を検出した。結果を図２のパネル（Ｂ）に示す。
その結果、パネル（Ｂ）に示されるように、ＥｃｏＲを人為的に発現させたＣＨＯ−Ｓ細胞のうち、驚くべきことに４６％もの細胞において、ＧＦＰによる蛍光が検出された。したがって、ＣＨＯ−Ｓ細胞にＥｃｏＲ遺伝子を導入し、発現させることにより、予想外にも、ＣＨＯ−Ｓ細胞のレトロウイルス感染阻害物質の影響を受けることなく、ＣＨＯ−Ｓ細胞にレトロウイルスが感染することが示唆される。
一方、対照として、ＣＨＯ−ＥｃｏＲ細胞の代わりに、ＣＨＯ−Ｓ細胞 ４．０×１０5細胞を用いたことを除き、同様に行なった。結果を図２のパネル（Ａ）に示す。
その結果、図２のパネル（Ａ）に示されるように、ＧＦＰによる蛍光が実質的に検出できなかったため、ＣＨＯ−Ｓ細胞には、レトロウイルスが感染しないことが示された。
かかる結果より、前記実施例２で示されたＣＨＯ−Ｓ細胞におけるＧＦＰの発現は、該ＣＨＯ−Ｓ細胞へのレトロウイルスの感染によるものであることがわかる。
さらに、対照として、ＣＨＯ−ＥｃｏＲ細胞の代わりに、ＮＩＨ３Ｔ３細胞 ４．０×１０5細胞を用いたことを除き、同様に行なった。結果を図２のパネル（Ｃ）に示す。
その結果、図２のパネル（Ｃ）に示されるように、ＥｃｏＲを本質的に発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞のうち、４０％の細胞において、ＧＦＰの発現が検出された。
したがって、ＮＩＨ３Ｔ３細胞と、ＣＨＯ−ＥｃｏＲ細胞とは、同程度の感染効率を示すことがわかる。
さらに、前記ＣＨＯ−ＥｃｏＲ細胞及びＳＶ４０Ｔ抗原で不死化したＭＥＦ(mouse embryonic fibroblast)細胞において、同じウイルス量（５００μｌ）を用いた場合のＧＦＰの発現量を、商品名：ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトンディッキンソン社製）を用いてＧＦＰによる蛍光を測定することにより比較した。結果を図３に示す。
その結果、図３に示されるように、ＭＥＦ細胞に比べ、ＣＨＯ−ＥｃｏＲ細胞を用いた場合のほうが、ＧＦＰをより高発現することがわかった。
ＣＨＯ−ＥｃｏＲ細胞を用いたｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｎａｂｌｅｄ（Ｍｅｎａ）の発現
（１）Ｍｅｎａ発現用ベクターをパッケージングしたウイルス産生
Ｍｅｎａ全長ｃＤＮＡ〔谷（K. Tani）、J. Biol. Chem.、第２７８巻、第２１６８５頁〜第２１６９２頁、２００３年１月１３日〕を、ｐＧＸベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入し、ｐＧＸ−Ｍｅｎａベクターを得た。
（１）Ｍｅｎａ発現用ベクターをパッケージングしたウイルス産生
Ｍｅｎａ全長ｃＤＮＡ〔谷（K. Tani）、J. Biol. Chem.、第２７８巻、第２１６８５頁〜第２１６９２頁、２００３年１月１３日〕を、ｐＧＸベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入し、ｐＧＸ−Ｍｅｎａベクターを得た。
前記実施例１の（３）において、ｐＣＸ４−ＢＳＲ−ＥｃｏＲベクターの代わりに、ｐＧＸ−Ｍｅｎａベクター １μｇを用いることを除き、同様に行ない、ウイルス液を得た。
（２）ｐＧＸ−ＭｅｎａベクターをパッケージングしたウイルスによるＣＨＯ−ＥｃｏＲ細胞の感染
ＣＨＯ−ＥｃｏＲ細胞 ４．０×１０5細胞を、商品名：ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ〔ギブコ−ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）社製〕 ４ｍｌに懸濁した。得られた懸濁物を、６ｃｍディッシュに播種し、３７℃、ＣＯ2濃度８容量％で２４時間培養した。その後、前記ディッシュに、前記（１）で得られたウイルス液 ５００μｌを添加して、感染させ、３５℃、ＣＯ2濃度５容量％で２４時間培養した。その後、培地を新たなＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩに交換し、３７℃、ＣＯ2濃度８容量％で４日間培養した。
ＣＨＯ−ＥｃｏＲ細胞 ４．０×１０5細胞を、商品名：ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ〔ギブコ−ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）社製〕 ４ｍｌに懸濁した。得られた懸濁物を、６ｃｍディッシュに播種し、３７℃、ＣＯ2濃度８容量％で２４時間培養した。その後、前記ディッシュに、前記（１）で得られたウイルス液 ５００μｌを添加して、感染させ、３５℃、ＣＯ2濃度５容量％で２４時間培養した。その後、培地を新たなＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩに交換し、３７℃、ＣＯ2濃度８容量％で４日間培養した。
得られた細胞 ４．０×１０5細胞を、商品名：ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ ４ｍｌに懸濁し、６ｃｍディッシュに播種した。
得られた細胞について、商品名：ＦＡＣＳｖａｎｔａｇｅ(ベクトンディッキンソン社製）を用いて、蛍光強度が対照の細胞に比べ、１０倍以上高い細胞を分取する条件でソーティングし、ＧＦＰの蛍光を示す細胞として、ｐＧＸ−Ｍｅｎａをパッケージングしたウイルスを感染させた細胞の細胞群（１Ｓ）を回収した。
（３）ｐＧＸ−Ｍｅｎａをパッケージングしたウイルスを感染させた細胞によるＭｅｎａ発現
前記ｐＧＸ−Ｍｅｎａをパッケージングしたウイルスを感染させた細胞の細胞群（１Ｓ） ３×１０7細胞を、溶解緩衝液〔組成：１重量％ ＴｒｉｔｏｎTM Ｘ−１００、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭ フッ化ナトリウム、２０ｍＭ β−グリセロリン酸塩、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ エチレングリコールビス２アミノエチルエーテル四酢酸（ＥＧＴＡ）、１ｍＭ バナジウム酸ナトリウム、２０μｇ／ｍｌ アプロチニン、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフッ化物〕 １０００μｌに溶解させた。得られたライゼートのうち、２０μｇタンパク質相当量を、グルタチオンビーズ〔アマシャム ファルマシア(Amersham Pharmacia)社製、商品名：Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ＳｅｐｈａｒｏｓｅTM ４Ｂ〕 １０μｌと混合し、ＧＳＴ融合Ｍｅｎａタンパク質をプルダウンした。
前記ｐＧＸ−Ｍｅｎａをパッケージングしたウイルスを感染させた細胞の細胞群（１Ｓ） ３×１０7細胞を、溶解緩衝液〔組成：１重量％ ＴｒｉｔｏｎTM Ｘ−１００、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭ フッ化ナトリウム、２０ｍＭ β−グリセロリン酸塩、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ エチレングリコールビス２アミノエチルエーテル四酢酸（ＥＧＴＡ）、１ｍＭ バナジウム酸ナトリウム、２０μｇ／ｍｌ アプロチニン、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフッ化物〕 １０００μｌに溶解させた。得られたライゼートのうち、２０μｇタンパク質相当量を、グルタチオンビーズ〔アマシャム ファルマシア(Amersham Pharmacia)社製、商品名：Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ＳｅｐｈａｒｏｓｅTM ４Ｂ〕 １０μｌと混合し、ＧＳＴ融合Ｍｅｎａタンパク質をプルダウンした。
前記ライゼートのうち、２μｇタンパク質相当量と、前記プルダウンにより得られた試料とを、８重量％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ついで、ゲル上のタンパク質を、商品名：Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｅｒｓ〔ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社製〕に転写させた。転写後の膜を、Ｍｅｎａに対する抗体〔谷(K. Tani)ら、J. Biol. Chem.、第２７８頁、第２１６８５頁〜第２１６９２頁、２００３年１月１３日〕と共に室温で２時間インキュベーションし、ついで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ウサギ抗体〔ジャクソンイムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社製〕と共に、室温で１時間インキュベーションした。その後、商品名：ＥＣＬ ｐｌｕｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ〔アマシャム ファルマシア(Amersham Pharmacia)社製〕を用いて、製造者の説明書に従い、発色反応を行ない、それにより、Ｍｅｎａの検出を行なった。その結果を図４のパネル（Ａ）に示す。
図４のパネル（Ａ）に示されるように、ＣＨＯ-ＥｃｏＲ細胞にウイルスを感染させることができ、それにより、約１００ｋＤａの分子量のＧＳＴ融合Ｍｅｎａを、ＣＨＯ−ＥｃｏＲ細胞において発現できることがわかる。
また、前記と同様に、前記ｐＧＸ−Ｍｅｎａをパッケージングしたウイルスを感染させた細胞の細胞群（１Ｓ）及びｐＧＸをパッケージングしたウイルスを感染させた細胞の細胞群 ５×１０6細胞のライゼート ５００μｇを、前記溶解溶液 １ｍｌに懸濁した。得られた懸濁物に、前記グルタチオンビーズ １０μｌを添加し、得られた混合物を、１時間、４℃の低温室で振とうさせた。その後、得られた産物を、３０００×ｇ、３０秒間遠心分離し、上清を除去した。残ったビーズに氷冷リン酸緩衝化生理食塩水 ５００ｍｌを添加して該ビーズを洗浄し、３０００×ｇで３０秒間遠心分離し、上清を除去した。ビーズの洗浄及び遠心分離を、５回繰り返した。洗浄後、２×ストップバッファー〔組成：８重量％ グリセロール、４重量％ ＳＤＳ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．７）、２容積％ β−メルカプトエタノール、０．１％ ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）〕 ２０μlにビーズをよく懸だくし、１０５℃で１０分間加熱した。得られた産物の上清 全量を、８重量％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブリリアントブルーによりゲル上のタンパク質を染色した。なお、対照として、１０、１００、５００、１０００、２０００ｎｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、同様に、前記８重量％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブリリアントブルーによりゲル上のタンパク質を染色した。その結果を、図４のパネル（Ｂ）を示す。
図４のパネル（Ｂ）に示されるように、ｐＧＸ−Ｍｅｎａをパッケージングしたウイルスを感染させた細胞の細胞群では、ＧＳＴ−Ｍｅｎａが検出され、ｐＧＸをパッケージングしたウイルスを感染させた細胞の細胞群では、ＧＳＴ-Ｍｅｎａは検出されなかった。また、パネル（Ｂ）におけるＧＳＴ−Ｍｅｎａの強度を、コダック社製、商品名：Ｋｏｄａｃ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １Ｄ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅで解析し、ＢＳＡを標準として用いて、タンパク質量を算出した。その結果、ＧＳＴ−Ｍｅｎａのバンドは、２００ｎｇ相当のタンパク質であることがわかった。したがって、ｐＧＸ−Ｍｅｎａをパッケージングしたウイルスを感染させた細胞の細胞群 約５×１０6細胞のライゼート ５００μｇから、約２００ｎｇの精製ＧＳＴ−Ｍｅｎａタンパク質が得られることがわかった。
ウイルスの多重感染によるタンパク質の発現量の増加
（１）ｐＧＸ−Ｍｅｎａベクターをパッケージングしたウイルスの濃縮ウイルス液の作製
前記ＰＬＴ細胞 ３．５×１０6細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ） １０ｍｌに懸濁し、１０ｃｍディッシュに播種し、３７℃、ＣＯ2濃度 ５容量％で２４時間培養した。
（１）ｐＧＸ−Ｍｅｎａベクターをパッケージングしたウイルスの濃縮ウイルス液の作製
前記ＰＬＴ細胞 ３．５×１０6細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ） １０ｍｌに懸濁し、１０ｃｍディッシュに播種し、３７℃、ＣＯ2濃度 ５容量％で２４時間培養した。
一方、商品名：Ｆｕｇｅｎｅ６〔ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製〕 １０μｌと、ＤＭＥＭ ２００μｌとを混合し、５分間室温で静置させた。得られた混合物に、商品名：ｐＧＰベクター（タカラバイオ社製） １μｇと、商品名：ＰＳ−ｅｃｏ（タカラバイオ社製） １μｇと、ｐＧＸ−Ｍｅｎａベクター １μｇとを添加し、混合し、１５分間室温で静置した。
得られた混合物を、前記ＰＬＴが入ったディッシュに添加し、３５℃、ＣＯ2濃度 ５容量％で２４時間インキュベーションした。その後、培地を新たなＤＭＥＭに交換し、さらに３５℃、ＣＯ2濃度 ５容量％で２４時間インキュベーションした。その後、得られた培養物の上清 １０ｍｌを回収し、０．２μｍ（内径）孔フィルター〔コーニング（ＣＯＲＮＩＮＧ）社製〕に通した。これにより、ウイルス液を得た。得られたウイルス液を、４℃で、８０００×ｇの条件で１６時間遠心分離を行なった。その後、上清を除去し、沈殿ウイルスを、商品名：ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ〔ギブコ−ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）社製〕 １００μｌに懸濁し、濃縮ウイルス液を得た。
（２）ウイルスの多重感染によるＭｅｎａの発現量の変化
前記実施例３の（２）で得られたｐＧＸ−Ｍｅｎａをパッケージングしたウイルスを感染させた細胞の細胞群（１Ｓ）に、ｐＧＸ−Ｍｅｎａベクターをパッケージングしたウイルスをさらに感染させた。また、前記濃縮ウイルス液を用い、前記１Ｓに、ｐＧＸ−Ｍｅｎａベクターをパッケージングしたウイルスをさらに感染させた。得られた細胞について、商品名：ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトンディッキンソン社製）でＧＦＰによる蛍光強度を測定した。その結果を図５に示す。なお、図中、「１Ｓ２」は、１Ｓの細胞に、ｐＧＸ−Ｍｅｎａをパッケージングしたウイルスを再度感染させた細胞の細胞群を示し、「１ＳＣ」は、１Ｓの細胞に、前記濃縮ウイルスを用いて、ウイルスを感染させた細胞の細胞群を示す。
前記実施例３の（２）で得られたｐＧＸ−Ｍｅｎａをパッケージングしたウイルスを感染させた細胞の細胞群（１Ｓ）に、ｐＧＸ−Ｍｅｎａベクターをパッケージングしたウイルスをさらに感染させた。また、前記濃縮ウイルス液を用い、前記１Ｓに、ｐＧＸ−Ｍｅｎａベクターをパッケージングしたウイルスをさらに感染させた。得られた細胞について、商品名：ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトンディッキンソン社製）でＧＦＰによる蛍光強度を測定した。その結果を図５に示す。なお、図中、「１Ｓ２」は、１Ｓの細胞に、ｐＧＸ−Ｍｅｎａをパッケージングしたウイルスを再度感染させた細胞の細胞群を示し、「１ＳＣ」は、１Ｓの細胞に、前記濃縮ウイルスを用いて、ウイルスを感染させた細胞の細胞群を示す。
その結果、図５に示されるように、１Ｓに比べ、１Ｓ２では、ＧＦＰ蛍光のピークが２倍程度、１ＳＣでは８倍程度強くなっていることがわかる。
また、前記１Ｓのうち蛍光強度の高い細胞群を、蛍光強度が相対的に高い細胞を分取する条件下に、ソーティングして、回収した。かかる細胞群を、１ＳＨという。さらに、前記１ＳＣのうち蛍光強度の高い細胞群を、蛍光強度が相対的に高い細胞を分取する条件下に、ソーティングして、回収した。かかる細胞群を、１ＳＣＨという。
前記１Ｓ、１Ｓ２、１ＳＣ、１ＳＨ及び１ＳＣＨのそれぞれについて、３×１０7細胞を、前記溶解緩衝液 １０００μｌに溶解させ、各細胞のライゼートを得た。
試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、前記実施例３の（３）と同様に、Ｍｅｎａを検出した。その結果を、図６に示す。なお、図６中、α−ＧＦＰ及びα−アクチンについては、５μｇタンパク質相当量の試料を、１０重量％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果であり、α−Ｍｅｎａについては、５０ｎｇタンパク質相当量の試料を８重量％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果である。
図６に示されるように、１Ｓの細胞に比べ、１ＳＨ、１ＳＣ及び１ＳＣＨにおいて、タンパク質が過剰発現していることから、濃縮ウイルス液を用いて、多重感染させ、ＧＦＰの蛍光強度の高い細胞をソーティングすることで、より目的タンパク質の過剰発現した細胞が得られることがわかる。
また、図６のパネル３）に示されるように、アクチン量は、ほぼそろっているのに対して、パネル１）に示されるように、ソーティングと多重感染とを組み合わせた１ＳＣ及び１ＳＣＨ細胞のライゼート中のＭｅｎａ発現量は、他のものと比較して上昇していることがわかる。
さらに、パネル２）に示されるように、ＧＦＰ発現量は、Ｍｅｎａ発現量の変化と連動して、上昇していることがわかる。したがって、ＧＦＰを指標として、Ｍｅｎａ発現量が高い細胞を採取できることが示唆される。
ｃ−ＡｂｌをコードするｃＤＮＡとして、ｐｃＤＮＡ３ｃ−Ａｂｌ〔宍戸ら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA.、２０００年、第９７巻、第６４３９頁〜第６４４４頁〕に含まれる核酸を用いた。
得られたｃＤＮＡを、ｐＧＸのＥｃｏＲＩ部位に挿入し、ｐＧＸ−ｃ−Ａｂｌベクターを得た。
得られたｐＧＸ−ｃ−Ａｂｌベクターを用い、前記実施例３におけるＭｅｎａの代わりに、ｃ−Ａｂｌを、同様の手法により、発現させた。
得られた細胞について、商品名：ＦＡＣＳｖａｎｔａｇｅ(ベクトンディッキンソン社製）を用いて、蛍光強度が対照の細胞に比べ、１０倍以上高い細胞を分取する条件でソーティングし、ＧＦＰの蛍光を示す細胞として、ｐＧＸ−ｃ−Ａｂｌをパッケージングしたウイルスを感染させた細胞の細胞群を回収した。
得られたｐＧＸ−ｃ−Ａｂｌをパッケージングしたウイルスを感染させた細胞の細胞群から、前記実施例３の（３）と同様に、ライゼートを調製し、２００μｇタンパク質相当量を、グルタチオンビーズ〔アマシャム ファルマシア(Amersham Pharmacia)社製、商品名：Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ＳｅｐｈａｒｏｓｅTM ４Ｂ〕 １０μｌと混合し、ＧＳＴ融合ｃ−Ａｂｌタンパク質をプルダウンした。
前記ライゼートのうち、２０μｇタンパク質相当量と、前記プルダウンにより得られた試料とを、８重量％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ついで、ゲル上のタンパク質を、商品名：Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｅｒｓ〔ミリポア(Millipore)社製〕に転写させた。転写後の膜について、一次抗体として、ｃ−Ａｂｌに対する抗体〔商品名：８Ｅ９、ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）社製〕と二次抗体として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウス抗体〔ジャクソンイムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社製〕とを用い、室温で１時間インキュベーションし、その後、商品名：ＥＣＬ ｐｌｕｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ〔アマシャム ファルマシア(Amersham Pharmacia)社製〕を用いて、製造者の説明書に従い、発色反応を行ない、それにより、ｃ−Ａｂｌの検出を行なった。結果を、図７に示す。
その結果、図７に示されるように、ＣＨＯ-ＥｃｏＲ細胞に、ｃ−Ａｂｌをコードする核酸を保持するベクター（図中、ｐＧＸ−ｃ−Ａｂｌ）がパッケージングされたウイルスが感染し、ＧＳＴとの融合タンパク質として、ｃ−Ａｂｌが、効率よく発現させることができることがわかった。
ウイルスの多重感染によるｃ−Ａｂｌの発現量の変化
前記実施例５で得られたｐＧＸ−ｃ−Ａｂｌを用い、実施例４と同様の手法により、ウイルスの多重感染によるｃ−Ａｂｌの発現量の変化を調べた。結果を図８に示す。なお、図８中、α−ＧＦＰ及びα−アクチンについては、５μｇタンパク質相当量の試料を、１０重量％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果であり、α−８Ｅ９については、５μｇタンパク質相当量の試料を、８重量％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果である。
前記実施例５で得られたｐＧＸ−ｃ−Ａｂｌを用い、実施例４と同様の手法により、ウイルスの多重感染によるｃ−Ａｂｌの発現量の変化を調べた。結果を図８に示す。なお、図８中、α−ＧＦＰ及びα−アクチンについては、５μｇタンパク質相当量の試料を、１０重量％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果であり、α−８Ｅ９については、５μｇタンパク質相当量の試料を、８重量％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果である。
図８のパネル３）に示されるように、アクチン量はそろっているのに対して、パネル１）に示されるように、ソーティングと多重感染とを組み合わせた１ＳＣ及び１ＳＣＨ細胞のライゼート中のｃ−Ａｂｌ発現量は、他のものと比較して上昇していることがわかる。また、ＧＦＰ発現量はｃ−Ａｂｌ発現量の変化と連動して、上昇していることがわかる。したがって、ＧＦＰを指標として、ｃ−Ａｂｌ発現量が高い細胞を採取できることがわかる。
Ａｂｉ−１をコードするｃＤＮＡとして、ｐＧＡＤ４２４Ａｂｉ−１〔谷ら、J. Biol. Chem.、２００３年、第２７８巻、第２１６８５頁〜第２１６９２頁〕に含まれる核酸を用いた。
得られたｃＤＮＡを、ｐＧＸのＥｃｏＲＩ部位に挿入し、ｐＧＸ−ｃ−Ａｂｉ−１ベクターを得た。
得られたｐＧＸ−Ａｂｉ−１ベクターを用い、前記実施例３におけるＭｅｎａの代わりに、Ａｂｉ−１を、同様の手法により、発現させた。
得られた細胞について、商品名：ＦＡＣＳｖａｎｔａｇｅ(ベクトンディッキンソン社製）を用いて、蛍光強度が対照の細胞に比べて１０倍以上高い細胞を分取する条件でソーティングし、ＧＦＰの蛍光を示す細胞として、ｐＧＸ−Ａｂｉ−１をパッケージングしたウイルスを感染させた細胞の細胞群を回収した。
得られたｐＧＸ−Ａｂｉ−１をパッケージングしたウイルスを感染させた細胞の細胞群から、前記実施例３の（３）と同様に、ライゼートを調製し、２００μｇタンパク質相当量を、グルタチオンビーズ〔アマシャム ファルマシア(Amersham Pharmacia)社製、商品名：Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ＳｅｐｈａｒｏｓｅTM ４Ｂ〕 １０μｌと混合し、ＧＳＴ融合Ａｂｉ−１タンパク質をプルダウンした。
前記ライゼートのうち、２０μｇタンパク質相当量と、前記プルダウンにより得られた試料とを、８重量％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ついで、ゲル上のタンパク質を、商品名：Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｅｒｓ〔ミリポア(Millipore)社製〕に転写させた。転写後の膜について、一次抗体として、Ａｂｉ−１に対する抗体〔商品名：１Ｇ９、谷(K. Tani)ら、J. Biol. Chem.、第２７８頁、第２１６８５頁〜第２１６９２頁、２００３年１月１３日〕と二次抗体として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウス抗体〔ジャクソンイムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社製〕とを用い、室温で１時間インキュベーションし、その後、商品名：ＥＣＬ ｐｌｕｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ〔アマシャム ファルマシア(Amersham Pharmacia)社製〕を用いて、製造者の説明書に従い、発色反応を行ない、それにより、Ａｂｉ−１の検出を行なった。結果を、図９に示す。
その結果、図９に示されるように、ＣＨＯ-ＥｃｏＲ細胞に、Ａｂｉ−１をコードする核酸を保持するベクター（図中、ｐＧＸ−Ａｂｉ−１）がパッケージングされたウイルスが感染し、ＧＳＴとの融合タンパク質として、Ａｂｉ−１が、効率よく発現させることができることがわかった。
本発明により、足場非依存的な増殖能を有し、ウイルスの感染を阻害する物質を産生する動物細胞、さらには、例えば、ＣＨＯ細胞等において、前記ウイルスを介した生物学的な手法によりポリペプチドを発現させることができ、高い効率で、ポリペプチドを前記細胞で発現させること、前記細胞において、迅速かつ簡便な操作で、活性の発現や配列が未知のランダム変異タンパク質を発現させることができ、ハイスループットでのタンパク質の機能解析等が可能になる。
配列番号：３は、ｐＧＸベクターの配列である。
配列番号：４は、プライマーの配列である。
配列番号：５は、プライマーの配列である。
配列番号：６は、プライマーの配列である。
配列番号：７は、プライマーの配列である。
Claims (15)
- 足場非依存的な増殖能を有し、かつウイルスの感染を阻害する物質を産生する動物細胞に、該ウイルスに対するレセプターをコードする核酸が発現可能に導入されてなる、ウイルス易感染性細胞。
- 該動物細胞が、チャイニーズハムスターオバリー細胞である、請求項１記載のウイルス易感染性細胞。
- 該ウイルスが、エコトロピックレトロウイルスである、請求項１又は２記載のウイルス易感染性細胞。
- 該ウイルスに対するレセプターが、アミノ酸トランスポーターである、請求項１〜３いずれか１項に記載のウイルス易感染性細胞。
- 該アミノ酸トランスポーターが、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を含有したポリペプチドである、請求項４記載のウイルス易感染性細胞。
- Ａ）請求項１〜５いずれか１項に記載のウイルス易感染性細胞と、
Ｂ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸を導入するためのウイルス由来のベクターと、
を含有してなる、ポリペプチド発現システム。 - 該ウイルス由来のベクターが、
ａ）２つのＬＴＲと、
ｂ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸の挿入部位を有する核酸と、
ｃ）選択マーカーをコードする核酸と
を含有し、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置されてなり、配列番号：３に示される塩基配列からなるベクターである、請求項６記載のポリペプチド発現システム。 - 該ウイルス由来のベクターが、ｄ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結するためのタグ配列をコードする核酸をさらに含有し、ここで、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸と、前記ｄ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置され、前記ｄ）の核酸が、前記ｂ）の核酸を介して、発現対象のポリペプチドをコードする核酸に作動可能になるように配置されてなるベクターである、請求項６又は７記載のポリペプチド発現システム。
- 該ウイルス由来のベクターが、ｅ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸をさらに含有し、ここで、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸と、前記ｅ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置され、前記ｂ）の核酸の挿入部位に、前記ｅ）の核酸が挿入されてなるベクターである、請求項６又は７記載のポリペプチド発現システム。
- 該ウイルス由来のベクターが、ｅ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸をさらに含有し、ここで、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸と、前記ｄ）の核酸と、前記ｅ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置され、前記ｄ）の核酸が、前記ｂ）の核酸を介して、前記ｅ）の核酸に作動可能に連結されてなるベクターである、請求項８記載のポリペプチド発現システム。
- Ａ’）請求項１〜５いずれか１項に記載のウイルス易感染性細胞に、発現対象のポリペプチドをコードする核酸を導入するためのウイルス由来のベクターを保持したウイルスを感染させたウイルス感染細胞と、
Ｂ’）請求項９又は１０記載のウイルス由来のベクターと、
を含有してなる、ポリペプチドの大量発現用の発現システム。 - 請求項１〜５いずれか１項に記載のウイルス易感染性細胞に、下記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクター：
（Ｉ）ａ）２つのＬＴＲと、
ｂ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸の挿入部位を有する核酸と、
ｃ）選択マーカーをコードする核酸と、
ｅ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸と、
を含有し、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸と、前記ｅ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置され、前記ｂ）の核酸の挿入部位に、前記ｅ）の核酸が挿入されてなるウイルス由来のベクター、又は
（ＩＩ）ａ）２つのＬＴＲと、
ｂ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸の挿入部位を有する核酸と、
ｃ）選択マーカーをコードする核酸と、
ｄ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結するためのタグ配列をコードする核酸と、
ｅ）発現対象のポリペプチドをコードする核酸と、
を含有し、２つのＬＴＲの間に、前記ｂ）の核酸と、前記ｃ）の核酸と、前記ｄ）の核酸と、前記ｅ）の核酸とが、それぞれ作動可能に配置され、前記ｄ）の核酸が、前記ｂ）の核酸を介して、前記ｅ）の核酸に作動可能に連結されてなるウイルス由来のベクター、
を保持するウイルスを感染させ、目的とするポリペプチドを発現させることを特徴とする、ポリペプチドの発現方法。 - （１）請求項１〜５いずれか１項に記載のウイルス易感染性細胞に、前記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクターを保持するウイルスを感染させ、ウイルス感染細胞を得る工程、及び
（２）前記ステップ（１）で得られたウイルス感染細胞を培養して、目的とするポリペプチドを発現させる工程、
を含む、請求項１２記載の発現方法。 - （１）請求項１〜５いずれか１項に記載のウイルス易感染性細胞に、前記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクターを保持するウイルスを感染させ、ウイルス感染細胞を得る工程、
（２’）前記ステップ（１）で得られたウイルス感染細胞に、前記Ｉ）又はＩＩ）のウイルス由来のベクターを保持するウイルスをさらに感染させ、ウイルス多重感染細胞を得る工程、
（３）前記ステップ（２’）で得られたウイルス多重感染細胞を培養して、目的とするポリペプチドを発現させる工程、
を含む、請求項１２記載の発現方法。 - 足場非依存的な増殖能を有し、かつエコトロピックレトロウイルスレセプターをコードする核酸が発現可能に導入されてなる、チャイニーズハムスターオバリー細胞。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2020122049A1 (ja) * | 2018-12-11 | 2020-06-18 | 富士フイルム株式会社 | 動物細胞、動物細胞の製造方法および目的タンパク質の製造方法 |
-
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Non-Patent Citations (1)
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| JPN6010053731, Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, 1994, ｖｏｌ．２６９, ｐ．３７１７−３７２４ * |
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