JP2006189258A - 画像処理装置 - Google Patents

Abstract

【課題】走査型サイトメータに用いられ、単離細胞のみに対する細胞分析を簡易に行うことができる画像処理装置を提供すること。
【解決手段】多数の細胞が散布された細胞集団にレーザ光を照射しつつ走査し、細胞集団が発する蛍光をもとに取得した蛍光画像を画像処理し、細胞を分析する走査型サイトメータに用いる画像処理装置１において、蛍光画像内で蛍光を発する個々の閉領域を細胞集団の細胞領域として特定する領域特定部１１と、細胞領域内の細胞核のデータを除去する細胞核除去部１２と、細胞核のデータが除去された細胞領域である細胞質領域の蛍光強度をもとに細胞が重複した細胞領域を特定する重複細胞特定部１３と、細胞が重複した細胞領域のデータを蛍光画像のデータから除去した分析画像を生成する分析画像生成部１４とを備える。
【選択図】 図１

Description

本発明は、多数の細胞が散布された細胞集団にレーザ光を照射しつつ走査し、細胞集団が発する蛍光をもとに取得した蛍光画像を画像処理し、細胞を分析する走査型サイトメータに用いる画像処理装置に関するものである。

従来から、癌細胞などの変遷過程を知る上では、多数の細胞が散布された細胞集団にレーザ光を照射して蛍光画像を取得し、細胞の素性、性質の分析を行うサイトメトリが多用されている。細胞集団から蛍光画像を取得する方法として、単離された細胞である単離細胞を浮遊させた単離細胞浮遊液をジェット水流にしてレーザ光上を流して通過させるフローサイトメータが知られている。このフローサイトメータは、個々の単離細胞の蛍光画像が取得できるが、蛍光画像の取得に時間がかかり、また、同じ細胞を再観察するリコール観察等が行えないというデメリットがある。このフローサイトメータのデメリットを補完する方法として、細胞集団をスライドグラス上に静置し、このスライドグラス上にレーザ光を走査させて蛍光画像を取得する走査型サイトメータに関する技術が提示されている（特許文献１参照）。

特開平３−２５５３６５号公報

ところで、この従来の走査型サイトメータは、多数の細胞をスライドグラス上に固定する必要があるため、複数の細胞が互いに重なり合った状態で細胞が出現する確率が高い。この複数の細胞が重なり合った細胞を一つの細胞として認識すると、誤った細胞分析がなされ、結果的に分析が不正確になるという問題点があった。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、単離細胞のみに対する細胞分析を簡易に行うことができる画像処理装置を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、請求項１にかかる画像処理装置は、多数の細胞が散布された細胞集団にレーザ光を照射しつつ走査し、前記細胞集団が発する蛍光をもとに取得した蛍光画像を画像処理し、前記細胞を分析する走査型サイトメータ装置において、前記蛍光画像内で蛍光を発する個々の閉領域を前記細胞集団の細胞領域として特定する細胞特定手段と、前記細胞領域内の細胞核に対応するデータを除去する細胞核除去手段と、前記細胞核に対応するデータが除去された細胞領域である細胞質領域の蛍光強度をもとに前記細胞が重複した細胞領域を特定する重複細胞特定手段と、前記細胞が重複した細胞領域のデータを前記蛍光画像のデータから除去した分析画像を生成する分析画像生成手段と、を備えたことを特徴とする。

また、請求項２にかかる画像処理装置は、上記の発明において、前記重複細胞特定手段は、前記細胞質領域の蛍光強度に対する画素数のヒストグラムを作成し、該ヒストグラムのピーク形状をもとに前記細胞が重複した細胞領域を特定することを特徴とする。

また、請求項３にかかる画像処理装置は、上記の発明において、前記重複細胞特定手段は、前記ヒストグラムのピーク数が２以上である細胞領域を前記細胞が重複した細胞領域として特定することを特徴とする。

また、請求項４にかかる画像処理装置は、上記の発明において、前記重複細胞特定手段は、単離された細胞に対する前記細胞質領域の蛍光強度を越える所定強度を閾値として設定し、この設定した閾値を超えて前記ヒストグラムにピーク値が存在する場合、前記細胞質領域を前記細胞が重複した細胞領域として特定することを特徴とする。

また、請求項５にかかる画像処理装置は、上記の発明において、前記細胞核除去手段は、前記細胞領域内の蛍光強度が所定値以上である領域を前記細胞核として特定し、この特定した細胞核に対応するデータを除去することを特徴とする。

また、請求項６にかかる画像処理装置は、上記の発明において、前記細胞核除去手段は、前記細胞領域内の蛍光波長の違いによって前記細胞核を特定し、この特定した細胞核に対応するデータを除去することを特徴とする。

また、請求項７にかかる画像処理装置は、上記の発明において、前記分析画像生成手段は、前記細胞が重複した細胞領域に対して細胞が重複して存在する領域であることを示す表示処理を施した分析画像を生成することを特徴とする。

本発明にかかる画像処理装置は、蛍光強度に対する画素数のヒストグラムを作成し、このヒストグラムをもとに重なり合った細胞を分析対象から除去するようにしているので、単離細胞のみに対する細胞分析を簡易に行うことができ、精度の高い細胞分析が実現できるという効果を奏する。

以下に添付図面を参照して、この発明にかかる画像処理装置の好適な実施の形態を詳細に説明する。この発明にかかる画像処理装置が適用される走査型サイトメータは、細胞集団にレーザ光を照射しつつ走査し、蛍光画像を取得し、この蛍光画像に対して画像処理を施し、重なり合った細胞を分析対象から除去し、単離された細胞のみが含まれる分析画像をもとに細胞分析を行う。この発明にかかる画像処理装置は、走査型サイトメータに組み込まれてもよいし、外部から走査型サイトメータに接続されるパーソナルコンピュータなどによって実現される画像処理装置としてもよい。

（実施の形態１）
図１は、この発明の実施の形態１にかかる画像処理装置の概要構成を示すブロック図である。この画像処理装置１は、取得された蛍光画像である入力画像Ｐ１が入力されると、細胞が重複した重複細胞の画像データを分析対象から除去した分析画像Ｐ２を出力するようにしている。

図１に示すように、この画像処理装置１は、制御部１０、細胞領域を特定する領域特定部１１、細胞核の画像データを除去する細胞核除去部１２、重複細胞を特定する重複細胞特定部１３、分析画像を作成する分析画像生成部１４、および入力画像Ｐ１と作業画像Ｐ３とを格納する記憶部１５を有する。制御部１０は、領域特定部１１、細胞核除去部１２、重複細胞除去部１３、分析画像作成部１４、記憶部１５が接続され、各部を制御する。

図２は、入力画像Ｐ１が入力されてから分析画像Ｐ２を出力するまでの処理手順を示すフローチャートである。図１および図２において、まず、制御部１０は、入力画像Ｐ１が入力されると、この入力画像Ｐ１を記憶部１５に一時的に格納するとともに、この入力画像Ｐ１を複製した作業画像Ｐ３を生成させる入力処理を行う（ステップＳ１０１）。その後、制御部１０は、領域特定部１１に対して、作業画像Ｐ３内において蛍光を発する細胞領域を特定する細胞領域特定処理を行わせ、細胞領域特定画像ＰＡを生成させる（ステップＳ１０２）。その後、制御部１０は、細胞核除去部１２に対して、細胞領域特定画像ＰＡ内の細胞核のデータを除去させる細胞核除去処理を行わせ、細胞核除去画像ＰＢを生成する（ステップＳ１０３）。その後、制御部１０は、重複細胞特定部１３に対して、細胞核除去画像ＰＢに示された細胞領域である細胞質領域の蛍光強度をもとに、細胞が重複した細胞領域を特定する重複細胞特定処理を行い、重複細胞特定画像ＰＣを生成させる（ステップＳ１０４）。その後、制御部１０は、分析画像生成部１４に対して、入力画像Ｐ１から、重複細胞特定画像ＰＣのデータを除去した分析画像Ｐ２を生成させ（ステップＳ１０５）、この分析画像Ｐ２を出力し（ステップＳ１０６）、本処理を終了する。

ここで、上述した各処理を具体的に説明する。図３は、入力画像Ｐ１の一例を示し、分析対象である細胞集団にレーザ光を照射して取得された蛍光画像である。入力画像Ｐ１には、図３に示すように、単離細胞Ａ１，Ａ２，Ａ５，Ａ７と、細胞が重複した重複細胞Ａ３，Ａ４，Ａ６とが混在する。なお、図３に示した細胞領域内で黒く塗りつぶされたものは細胞核である。

領域特定部１１は、入力画像Ｐ１（作業画像Ｐ３）内において蛍光を発する領域が細胞領域であることを利用し、所定の閾値Ｔｈ０以上の蛍光強度をもつ画素領域を細胞領域Ｂ１〜Ｂ７として特定する細胞領域特定処理（ステップＳ１０２）を行い、図４に示す細胞領域特定画像ＰＡを生成する。なお、この細胞領域Ｂ１〜Ｂ７の確定は、周知の輪郭抽出処理を用いて閉領域を生成するようにしてもよい。

細胞核除去部１２は、細胞領域Ｂ１〜Ｂ７内において細胞核が細胞質に比して蛍光強度が大きいことを利用し、細胞核の蛍光強度と細胞質の蛍光強度との間に所定の閾値Ｔｈ１を設定し、この所定の閾値Ｔｈ１以上の画素をもつ画素領域を細胞核と認識し、作業画像Ｐ３から、この細胞核領域のデータを除去した細胞領域を細胞核除去画像ＰＢを生成する（図５参照）。図５に示した細胞核除去画像ＰＢでは、細胞核領域が除去された複数の細胞領域Ｃ１〜Ｃ７が細胞質領域として残されている。

その後、重複細胞特定部１３は、細胞核除去画像ＰＢをもとに細胞質のみによって示された各細胞領域Ｃ１〜Ｃ７毎に、蛍光強度に対する画素数のヒストグラムを作成する。図６の下部に示すヒストグラムは、図６の上部に示したように２つの細胞が重複した細胞領域Ｃ３，Ｃ４，Ｃ６に対応したものである。図６の下部に示したヒストグラムのように、２つの細胞が重複状態である場合、細胞質が重なり合った重複部ＣＹが存在し、重複部ＣＹの蛍光強度Ｄ２は、重複していない非重複部ＣＸの蛍光強度Ｄの約２倍となる。そして、ヒストグラム上では、蛍光強度Ｄを中心としたピーク形状と蛍光強度Ｄ２を中心としたピーク形状が現れる。一方、細胞領域Ｃ１，Ｃ２，Ｃ５，Ｃ７は、単離細胞であるが、この場合、ヒストグラム上では、蛍光強度Ｄを中心としたピーク形状のみが現れる。

そこで、蛍光強度Ｄと蛍光強度Ｄ２との間に閾値Ｔｈ２を設け、この閾値Ｔｈ２以上の蛍光強度をもつピーク形状が存在する場合、２以上の細胞が重複した細胞領域であると判定する。なお、ノイズを除去するために、画素数に閾値Ｔｈｐを設け、この閾値Ｔｈｐ以上の画素数がある場合、ピーク形状が存在するものと判定するようにしてもよい。すなわち、重複細胞特定部１３は、対象の細胞領域のヒストグラム上に、閾値Ｔｈ２以上の蛍光強度で、かつ閾値Ｔｈｐ以上の画素数をもつピーク形状が１以上存在する場合、２以上の細胞が重複した細胞領域であると判定する。これによって、重複細胞特定部１３は、２以上の細胞が重複した細胞領域である重複細胞を特定する。図７は、重複細胞特定部１３が、重複細胞である細胞領域Ｃ３，Ｃ４，Ｃ６を特定した状態を示す作業画像Ｐ３（重複細胞特定画像ＰＣ）である。なお、閾値Ｔｈｐおよび／または閾値Ｔｈ２を用いず、ヒストグラム上に、２以上のピーク形状が存在する場合に、重複細胞が存在すると判定するようにしてもよい。

その後、分析画像生成部１４は、入力画像Ｐ１から、重複細胞特定画像ＰＣが示す細胞領域Ｃ３，Ｃ４，Ｃ６の領域を除去した分析画像Ｐ２（図８―１参照）を生成し、出力する。この分析画像Ｐ２内には、単離細胞Ａ１，Ａ２，Ａ５，Ａ７のみが表示されており、単離細胞のみに対する分析を行うことができる。また場合によっては、図８―２に示すように、重複細胞Ａ４´,Ａ６´は分析対象として残してもよい。なぜなら、サイトメータにおいては、核内ＤＮＡの分析が大きな目的となるのでＡ４´,Ａ６´は細胞質が重複していても細胞核は、別々の細胞に由来するものなので独立した２個の細胞として取り扱うことができる。そのためには、図２のフローチャートの重複細胞処理（ステップＳ１０４）の中に細胞質が重複していて、かつ細胞核が分離しているものは、個別細胞として残すという条件を付加すれば良い。逆に、細胞質が重複していなくて、細胞核が分離している細胞は、分裂後期細胞として上述のフローチャートの中で分析対象として残ることは明白である。この結果、分析対象が単離細胞のみであるため、精度の高い分析を行うことができる。

なお、この実施の形態１では、分析画像生成部１４が生成した分析画像Ｐ２をそのまま出力するようにしていたが、これに限らず、図９に示すように、重複細胞の細胞領域Ａ３´，Ａ４´，Ａ６´を付加した分析画像Ｐ２として出力するようにしてもよい。この重複細胞の細胞領域Ａ３´，Ａ４´，Ａ６´に対する画像処理は、たとえば、重複細胞の細胞領域であることがわかるように特定の色で塗りつぶしを行うことによって実現できる。このような重複細胞の細胞領域Ａ３´，Ａ４´，Ａ６´を付加した分析画像Ｐ２を出力する場合、単離細胞Ａ１，Ａ２，Ａ５，Ａ７に対する分析を行うことができるとともに、重複細胞がどのように分布しているかを知ることができ、標本作成の指標とすることができる。

（実施の形態２）
つぎに、この発明の実施の形態２について説明する。上述した実施の形態１では、細胞核除去部１２が蛍光強度の違いによって細胞核と細胞質とを識別していたが、この実施の形態２では、細胞核除去部が蛍光波長（蛍光色）の違いによって細胞核と細胞質とを識別するようにしている。

図１０は、この実施の形態２にかかる画像処理装置の概要構成を示すブロック図である。図１０において、この画像処理装置１Ａは、実施の形態１で示した細胞核除去部１２に代えて細胞核除去部１２Ａを設けている。細胞核除去部１２Ａは、細胞核の領域を除去する場合、細胞質の蛍光波長と細胞核の蛍光波長との違いを検出し、細胞核の蛍光波長の画素領域を細胞領域から除去するようにしている。なお、その他の構成は、実施の形態１と同じであり、同一の構成部分には同一の符号を付している。

具体的には、たとえば、細胞が、acridine orangeである場合、細胞核の蛍光色は緑色に発色し、細胞質の蛍光色は黄色で発色することが知られている。そこで、細胞核除去部１２Ａは、図１１に示すように、蛍光波長に所定の閾値Ｔｈ１λを設定し、細胞領域特定画像ＰＡに示された各細胞領域の各画素の蛍光波長が閾値Ｔｈ１λ以上であるか否かを判別し、閾値Ｔｈ１λ以上の蛍光波長をもつ画素領域のデータを除去した細胞核除去画像ＰＢを生成する。

この実施の形態２では、蛍光波長の違いによって細胞核と細胞質とを識別して細胞核のデータを除去した細胞核除去画像ＰＢを生成するようにしているので、細胞核と細胞質との蛍光強度の差が小さい場合であっても確実に細胞核のデータを除去した細胞核除去画像ＰＢを生成することができる。なお、細胞核除去部１２Ａによる処理を、実施の形態１で示した蛍光強度による細胞核と細胞質との識別と、実施の形態２で示した蛍光波長による細胞核と細胞質との識別と組み合わせて細胞核のデータを除去するようにしてもよい。

この発明の実施の形態１にかかる画像処理装置の概要構成を示すブロック図である。 この発明の実施の形態１にかかる画像処理装置の処理手順を示すフローチャートである。 この発明の実施の形態１にかかる入力画像を示す模式図である。 この発明の実施の形態１にかかる細胞領域特定画像を示す模式図である。 この発明の実施の形態１にかかる細胞核除去画像を示す模式図である。 この発明の実施の形態１にかかる重複細胞のヒストグラムである。 この発明の実施の形態１にかかる重複細胞特定画像を示す模式図である。 この発明の実施の形態１にかかる分析画像を示す模式図である。 この発明の実施の形態１にかかる分析画像を示す模式図である。 この発明の実施の形態１にかかる他の分析画像を示す模式図である。 この発明の実施の形態２にかかる画像処理装置の概要構成を示すブロック図である。 細胞核および細胞質の蛍光強度の蛍光波長依存性を示す図である。

符号の説明

１，１Ａ 画像処理装置
１０ 制御部
１１ 領域特定部
１２,１２Ａ 細胞核除去部
１３ 重複細胞特定部
１４ 分析画像生成部
１５ 記憶部

Claims (7)

1. 多数の細胞が散布された細胞集団にレーザ光を照射しつつ走査し、前記細胞集団が発する蛍光をもとに取得した蛍光画像を画像処理し、前記細胞を分析する走査型サイトメータに用いる画像処理装置において、
   前記蛍光画像内で蛍光を発する個々の閉領域を前記細胞集団の細胞領域として特定する細胞特定手段と、
   前記細胞領域内の細胞核に対応するデータを除去する細胞核除去手段と、
   前記細胞核に対応するデータが除去された細胞領域である細胞質領域の蛍光強度をもとに前記細胞が重複した細胞領域を特定する重複細胞特定手段と、
   前記細胞が重複した細胞領域のデータを前記蛍光画像のデータから除去した分析画像を生成する分析画像生成手段と、
   を備えたことを特徴とする画像処理装置。
2. 前記重複細胞特定手段は、前記細胞質領域の蛍光強度に対する画素数のヒストグラムを作成し、該ヒストグラムのピーク形状をもとに前記細胞が重複した細胞領域を特定することを特徴とする請求項１に記載の画像処理装置。
3. 前記重複細胞特定手段は、前記ヒストグラムのピーク数が２以上である細胞領域を前記細胞が重複した細胞領域として特定することを特徴とする請求項２に記載の画像処理装置。
4. 前記重複細胞特定手段は、単離された細胞に対する前記細胞質領域の蛍光強度を越える所定強度を閾値として設定し、この設定した閾値を超えて前記ヒストグラムにピーク値が存在する場合、前記細胞質領域を前記細胞が重複した細胞領域として特定することを特徴とする請求項２に記載の画像処理装置。
5. 前記細胞核除去手段は、前記細胞領域内の蛍光強度が所定値以上である領域を前記細胞核として特定し、この特定した細胞核に対応するデータを除去することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一つに記載の画像処理装置。
6. 前記細胞核除去手段は、前記細胞領域内の蛍光波長の違いによって前記細胞核を特定し、この特定した細胞核に対応するデータを除去することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一つに記載の画像処理装置。
7. 前記分析画像生成手段は、前記細胞が重複した細胞領域に対して細胞が重複して存在する領域であることを示す表示処理を施した分析画像を生成することを特徴とする請求項１〜６のいずれか一つに記載の画像処理装置。
   
   

Images