JP2006180746A - ピラジナミド耐性菌検出用プローブセット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】PZA薬剤耐性は、菌が保有するピラジナミダーゼ(PZase)の変異により獲得される。PZaseをコードするpncA遺伝子のPZA薬剤耐性に関連するいずれかの変異をもれなく検出することができるプローブセットによる。検体中のpncA遺伝子を核酸増幅方法により増幅した後、これらのプローブセットを用いてPZA耐性菌を検出する。
【選択図】なし
Description
内科的療法で使用する結核治療の薬剤としては、イソニアジド(INH)、リファンピシン(RFP)、ストレプトマイシン(SM)、エタンブトール(EB)等、多くの種類の薬剤が知られているが、薬剤を患者に投与した場合、突然変異により投与した薬剤に対する耐性を有する耐性菌が生じることが問題となっている。1996年より使用が開始されたピラジナミド(以下単に「PZA」ともいう。)については多くの報告はないものの、その耐性菌の出現は危惧されている。
1.配列表の配列番号1に表された塩基配列又はその相補配列に存在しうるpncA遺伝子の変異を検出しうる複数種のプローブからなるプローブセット。
2.配列表の配列番号1に表された塩基配列又はその相補配列に存在しうるpncA遺伝子の変異が、以下に示す1以上の位置の変異である前項1に記載のプローブセット:
第-11位、第3位、第8位、第11位、第14位、第19位、第20位、第23位、第24位、第26位、第28位、第29位、第35位、第40位、第41位、第42位、第68位、第69位、第74位、第75位、第77位、第78位、第83位、第100位、第102位、第104位、第134位、第137位、第139位、第143位、第146位、第151-230位、第152位、第153位、第157位、第158位、第161位、第162位、第169位、第170位、第172位、第181位、第182位、第185位、第187位、第190位、第199位、第202位、第203位、第212位、第216位、第226位、第227位、第231位、第233位、第254位、第261位、第286位、第287位、第288位、第290位、第295位、第296位、第307位、第308位、第309位、第307-311位、第341位、第351位、第356位、第362位、第363位、第369位、第381-382位、第383位、第382-390位、第386位、第386-389位、第392位、第393位、第403位、第406位、第410位、第412位、第415位、第416位、第421位、第422位、第436位、第442位、第449位、第452位、第464位、第466位、第467位、第476位、第481位、第486-496位、第494位、第515位、第525位、第533位、第538位。
3.配列表の配列番号1に表された塩基配列又はその相補配列に存在しうるpncA遺伝子の変異が、以下に示す1以上の変異、又はその相補的な関係にある変異である前項2に記載のプローブセット:
1)第-11位の塩基AからGへの変異
2)第3位の塩基GからTへの変異
3)第8位の塩基CからAへの変異
4)第11位の塩基TからGへの変異
5)第11位の塩基TからCへの変異
6)第14位の塩基TからAへの変異
7)第19位の塩基GからTへの変異
8)第20位の塩基TからAへの変異
9)第24位の塩基CからGへの変異
10)第23位の塩基AからGへの変異
11)第26位の塩基TからGへの変異
12)第26位の塩基TからCへの変異
13)第29位の塩基AからCへの変異
14)第28位の塩基CからTへの変異
15)第29位の塩基AからGへの変異
16)第35位の塩基AからCへの変異
17)第40位の塩基TからCへの変異
18)第41位の塩基GからAへの変異
19)第42位の塩基CからGへの変異
20)第68位の塩基GからT及び第69位の塩基TからCへの変異
21)第74位の塩基CからA及び第75位の塩基CからAへの変異
22)第77位の塩基Gの欠落
23)第78位の塩基Cの欠落
24)第78位の塩基CからGへの変異
25)第83位の塩基CからAへの変異
26)第100位の塩基TからGへの変異
27)第102位の塩基CからGへの変異
28)第104位の塩基TからCへの変異
29)第134位の塩基TからGへの変異
30)第137位の塩基CからAへの変異
31)第139位の塩基AからGへの変異
32)第143位の塩基Aの欠落
33)第146位の塩基AからCへの変異
34)第151-230位の間が80塩基が欠落
35)第153位の塩基CからGへの変異
36)第152位の塩基AからCへの変異
37)第157位の塩基GからAへの変異
38)第158位の塩基Aの欠落
39)第162位の塩基Gの欠落
40)第161位の塩基Cの欠落
41)第161位の塩基CからTへの変異
42)第170位の塩基AからCへの変異
43)第169位の塩基CからGへの変異
44)第172位の塩基TからCへの変異
45)第181位の塩基AからCへの変異
46)第182位の塩基C及び第183位の塩基Aの欠落
47)第184/185位の間に塩基Tの挿入
48)第187位の塩基GからCへの変異
49)第190位の塩基TからGへの変異
50)第199位の塩基TからCへの変異
51)第202位の塩基TからCへの変異
52)第202位の塩基TからGへの変異
53)第203位の塩基GからAへの変異
54)第203位の塩基GからCへの変異
55)第212位の塩基AからCへの変異
56)第216位の塩基CからGへの変異
57)第226位の塩基AからCへの変異
58)第227位の塩基CからTへの変異
59)第230/231位の間に6110塩基の挿入
60)第233位の塩基GからAへの変異
61)第254位の塩基TからGへの変異
62)第254位の塩基TからCへの変異
63)第260/261位の間に塩基ACの挿入
64)第288位の塩基Gが欠落
65)第286位の塩基AからCへの変異
66)第286位の塩基AからGへの変異
67)第287/288位の間に塩基Tの挿入
68)第287位の塩基AからCへの変異
69)第290位の塩基GからAへの変異
70)第295位の塩基TからGへの変異
71)第296位の塩基AからCへの変異
72)第307位の塩基TからCへの変異
73)第308位の塩基AからCへの変異
74)第309位の塩基CからGへの変異
75)第307-311位の塩基TACAGの欠落
76)第341位の塩基Cが欠落
77)第350/351位の間に塩基Tの挿入
78)第356位の塩基GからAへの変異
79)第362位の塩基GからC及び第363位の塩基GからCへの変異
80)第368/369位の間に18塩基の挿入
81)第381-382位の塩基GGの欠落
82)第383位の塩基TからGへの変異
83)第382/383位の間に塩基AGの挿入
84)第382-390位の間の8塩基の欠落
85)第385/386位の間に塩基CGの挿入
86)第386-389位の塩基ATGTの欠落
87)第391/392位の間に塩基GGの挿入
88)第392/393位の間に塩基Gの挿入
89)第403位の塩基AからCへの変異
90)第406位の塩基GからAへの変異
91)第406位の塩基GからTへの変異
92)第406位の塩基Gの欠落
93)第410位の塩基AからCへの変異
94)第412位の塩基TからCへの変異
95)第412位の塩基Tの欠落
96)第412位の塩基TからAへの変異
97)第414/415位の間に塩基Gの挿入
98)第416位の塩基TからCへの変異
99)第415位の塩基GからTへの変異
100)第415位の塩基GからAへの変異
101)第422位の塩基AからCへの変異
102)第421位の塩基CからTへの変異
103)第436位の塩基GからAへの変異
104)第442位の塩基CからAへの変異
105)第449位の塩基Gの欠落
106)第452位の塩基Tの欠落
107)第464位の塩基TからGへの変異
108)第465/466位の間に塩基Tの挿入
109)第467位の塩基TからAへの変異
110)第476位の塩基TからGへの変異
111)第480/481位の間に塩基TGACの挿入
112)第486-496位の間の10塩基の欠落
113)第493/494位との間にCの挿入
114)第515位の塩基TからCへの変異
115)第525位の塩基GからCへの変異
116)第532/533位の間に塩基Cの挿入
117)第538位の塩基GからTへの変異。
4.以下に示すi)又はii)に記載のオリゴヌクレオチド鎖からなるプローブを含む前項2又は3に記載のプローブセット:
i)配列表の配列番号2〜48に表されたいずれかの塩基配列を含むオリゴヌクレオチド鎖;
ii)配列表の配列番号2〜48に表されたいずれかの塩基配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド鎖。
5. 配列表の配列番号1に表されたpncA遺伝子の塩基配列又はその相補配列の少なくとも第-20位から第560位を検出しうる、少なくとも23種類以上のプローブを含むプローブセット。
6.以下に示すi)又はii)に記載のオリゴヌクレオチド鎖からなるプローブを含む前項5に記載のプローブセット:
i)配列表の配列番号2〜48に表されたいずれかの塩基配列を含むオリゴヌクレオチド鎖;
ii)配列表の配列番号2〜48に表されたいずれかの塩基配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド鎖。
7. 前項2〜4及び6のいずれか1に記載のプローブセットに含まれる少なくとも1つのプローブを含むピラジナミド耐性結核菌の検出用試薬。
8. 前項1〜6のいずれか1に記載のプローブセットに含まれるプローブを固定したピラジナミド耐性結核菌検出用試験片。
9. 前項1〜6のいずれか1に記載のプローブセットを含むピラジナミド耐性結核菌の検出用キット。
10. 前項1〜6のいずれか1に記載のプローブセットを用いて検査することを特徴とする結核菌の判別方法。
例えば、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)のPZA耐性は、PZaseをコードするpncA遺伝子の変異により生じうることは上述の如くである。野生型の結核菌が保有するpncA遺伝子の塩基配列は、配列表の配列番号1に表された塩基配列又はその相補的な配列である。配列番号1に表された塩基配列の5'末端から数えて81〜83番目の塩基ATGはタンパク質合成の開始コドンに該当し、この81番目の塩基Aを第1位とする。すなわち、配列番号1に表された配列のうち、第1〜3位はタンパク質合成の開始コドンに該当し、第559〜561位は終止コドンに該当し、第-80〜-1位までの塩基はタンパク質合成の上流部分に該当する。
本発明におけるPZA耐性菌となりうるpncA遺伝子の変異の位置は、配列表の配列番号1に表された塩基配列又はその相補的な配列の少なくとも第-20位から第560位までに存在しうるpncA遺伝子の変異が挙げられる。具体的には、配列表の配列番号1に表された塩基配列のうち、以下の表1−1〜1−3に示す変異及びこれに相補的な位置及び関係の変異が挙げられる。これらのうち、既に非特許文献に開示されているものは、各表の表欄に示すとおりである。以下の表1−1〜1−3に示す変異のうち、いずれか1つの変異があれば、PZA耐性結核菌となりうるので、もれなくPZA耐性菌を検出するためには、以下の表1−1〜1−3に示す変異又はこれに相補的な位置及び関係のいずれかの変異をもれなく検出することが重要である。
本発明のプローブセットは、配列表の配列番号1に表された塩基配列又はこれに相補的な塩基配列の第-20位から第560位までの塩基、つまり合計580塩基を検出するように設計する。各プローブの長さは、検出する時の温度にもよるが、一般的には10〜30、好ましくは12〜26である。この際、上流又は下流から順にプローブを決定していき、隣接するプローブと約4-7塩基重なるように順に配置すれば、その配置する領域で変異が存在したとしても、どちらかのプローブで検知することができて好ましい。したがって、第-20位から第560位までの合計580塩基を検出するための本発明のプローブセットにおける全プローブ数は、例えば全てのプローブの長さを30に統一し、各プローブが隣接するプローブと4塩基重なるとを想定すれば、少なくとも22個以上であり、好ましくは30個以上、より好ましくは35個以上、さらに好ましくは40個以上である。
したがって、本発明の最も好ましいプローブセットは、図1に示すとおりである。
本発明のキットとは、本発明のプローブセットに加えて、適当な試薬等を含み、ピラジナミド耐性菌を検出するために用いられるものを示す。
本発明のキットとして、PCR−配列特異的オリゴプローブ(SSOP : sequence-specific oligonucleotide probes)法を実施するためのキットが例示される。
PCR−SSOP法とは、変異部位を含む約10〜約30塩基の、一方の対立遺伝子配列に完全相補的なプローブを作製し、変異部位を含むDNAをPCR法により増幅した後、ハイブリダイゼーションを行い、ハイブリッド形成の有無により遺伝子多型を判別する方法である。
さらに、上記PCR−SSOP法において検知を容易にするために、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質などを上記プライマー対に修飾しておくことが好ましい。
また、核酸の増幅は、PCR法以外にも、LAMP法、ICAN法などの公知の技術が挙げられ、本発明はこれらのいずれかの手法を用いてもよく、本発明にはこれらを準用したキットも含まれる。
1.検体
本発明の検体は、通常結核菌検査に必要な検体であれば良く、例えば喀痰、咽頭ぬぐい液、胃液、気管支肺胞洗浄液、気管内吸引物、喉からの拭取物及び/又は組織生検物等の体液、並びにこれらから培養して得られた結核菌そのものが挙げられる。
上記検体からDNAを抽出する方法は、公知の方法で行うことができ、例えばフェノール抽出法、グアニジンチオシナネート抽出法、バナジルリボヌクレオシド複合抽出法等が挙げられる。検体を前処理したものを本明細書において試料という。
PCR法で核酸を増幅する場合、例えば、(1)2本鎖ゲノムDNAを約92〜95℃、約30秒〜1分間の反応条件で熱処理することにより1本鎖にする変性工程、該1本鎖DNAのそれぞれに約50〜65℃を約20秒〜1分間の反応条件で、(2)少なくとも2種類の増幅プライマーを結合させることによりPCRの反応開始点となる2本鎖部分を作製するアニール工程、(3)約70〜75℃を約20秒〜5分間の反応条件でDNAポリメラーゼを用いて反応させる鎖伸張工程の(1)〜(3)の工程を通常の方法により20〜40回繰り返すことで核酸を増幅することができる。
また、測定の感度を向上させるために上記PCR反応後にさらにNested−PCR法などで核酸を増幅してもよい。Nested−PCR法におけるプライマーは、上記PCR反応において用いたプライマーよりも内側の配列を選択することができる。
結核菌の変異は、前記PCR−SSOP法を行った後、固定されたプローブの数と、PCR−SSOP法において検出されたスポットの数を比較することにより検出する。PCR−SSOP法におけるハイブリダイズの条件として、例えば配列番号2〜48に示したプローブセットの一部又は全てを使用する場合は、約60〜65℃の温度で行えば、非特異吸着反応が起きにくいため好ましい。また、スポットの数の比較は、PCR−SSOP法において検出されたスポットの数が、固定されたプローブの数と同数であれば、結核菌はPZA耐性を有さないものであり、検出スポット数が固定プローブ数以下であれば結核菌はPZA耐性を有すると判断する。
プローブ及びプライマーの配列は、標準的なプログラム及びプライマー解析ソフトウェア、例えばPrimer Express(Perkin Elmer社製)を用いることにより得ることができ、自動化オリゴヌクレオチドシンセサイザー等の標準的な方法を用いて合成することができる。
1.プローブの選択
配列表の配列番号1に表された塩基配列に相補的な配列の、第-11位、第3位、第8位、第11位、第14位、第19位、第20位、第23位、第24位、第26位、第28位、第29位、第35位、第40位、第41位、第42位、第68位、第69位、第74位、第75位、第77位、第78位、第83位、第100位、第102位、第104位、第134位、第137位、第139位、第143位、第146位、第151-230位、第152位、第153位、第157位、第158位、第161位、第162位、第169位、第170位、第172位、第181位、第182位、第185位、第187位、第190位、第199位、第202位、第203位、第212位、第216位、第226位、第227位、第231位、第233位、第254位、第261位、第286位、第287位、第288位、第290位、第295位、第296位、第307位、第308位、第309位、第307-311位、第341位、第351位、第356位、第362位、第363位、第369位、第381-382位、第383位、第382-390位、第386位、第386-389位、第392位、第393位、第403位、第406位、第410位、第412位、第415位、第416位、第421位、第422位、第436位、第442位、第449位、第452位、第464位、第466位、第467位、第476位、第481位、第486-496位、第494位、第515位、第525位、第533位又は第538位のいずれかの塩基の変異を検出しうるプローブとして、以下に示すプローブ1〜47(それぞれ、配列番号2〜48に対応)を構築した。
プローブ2 atgatcaacg cccgcatac (配列番号3)
プローブ3 cacgtcgacg atgatcaacg (配列番号4)
プローブ4 gtcgttctgc acgtcgac (配列番号5)
プローブ5 ccaccctcgc agaagtcgtt (配列番号6)
プローブ6 cgagccaccc tcgcagaag (配列番号7)
プローブ7 gttaccgcca gcgagccacc (配列番号8)
プローブ8 agcgcggcgc caccggttac cg (配列番号9)
プローブ9 gtagtcgctg atggcgcggg ccagcgcg (配列番号10)
プローブ10 gccaggtagt cgctgatggc gc (配列番号11)
プローブ11 tggtagtccg ccgcttcggc caggta (配列番号12)
プローブ12 ggttgccacg acgtgatggt ag (配列番号13)
プローブ13 gatgtggaag tccttggttg c (配列番号14)
プローブ14 cgggtcgatg tggaagtc (配列番号15)
プローブ15 tggtcacccg ggtcgatgt (配列番号16)
プローブ16 cggtgtgccg gagaagtggt ca (配列番号17)
プローブ17 ccacgacgag gaatagtccg gtgt (配列番号18)
プローブ18 tgcggtggcc acgacga (配列番号19)
プローブ19 cgctgacgca atgcggtg (配列番号20)
プローブ20 cgccgggagt accgctg (配列番号21)
プローブ21 aagtccgcgc cgggagta (配列番号22)
プローブ22 gtccagactg ggatggaagt cc (配列番号23)
プローブ23 cctcgattgc cgacgtgtcc ag (配列番号24)
プローブ24 ccttgtagaa caccgcctcg a (配列番号25)
プローブ25 tccggtgtag gcacccttgt ag (配列番号26)
プローブ26 aagccgctgt acgctccggt (配列番号27)
プローブ27 ctcgtcgact ccttcgaagc cg (配列番号28)
プローブ28 tggcgtgccg ttctcgtcga (配列番号29)
プローブ29 gcagccaatt cagcagtggc gt (配列番号30)
プローブ30 cgccgcgttg ccgcagccaa (配列番号31)
プローブ31 atcgacctca tcgacgccgc (配列番号32)
プローブ32 tggcaatacc gaccacatcg ac (配列番号33)
プローブ33 cacacaatga tcggtggcaa ta (配列番号34)
プローブ34 ggccgtctgg cgcacacaat (配列番号35)
プローブ35 cgtaccgcgt cctcggccgt (配列番号36)
プローブ36 aagccattgc gtaccgcgtc (配列番号37)
プローブ37 ccagcaccct ggtggccaag ccat (配列番号38)
プローブ38 gtcaggtcca ccagcaccct gg (配列番号39)
プローブ39 cacccgctgt caggtccacc ag (配列番号40)
プローブ40 tcggccgaca cacccgct (配列番号41)
プローブ41 ggtggtatcg gccgacac (配列番号42)
プローブ42 cggcgacggt ggtatcgg (配列番号43)
プローブ43 ccagcgcggc gacggt (配列番号44)
プローブ44 cgcatctcct ccagcgcggc (配列番号45)
プローブ45 cggtgcgcat ctcctccag (配列番号46)
プローブ46 actcgacgct ggcggtgc (配列番号47)
プローブ47 gagctgcaaa ccaactcgac (配列番号48)
上記の配列番号2〜48に示されるオリゴヌクレオチドプローブ1〜47のそれぞれの5'末端にターミナルトランスフェラーゼ(Promega社製)を用いて、ポリチミンの付加を行った。具体的には、ターミナルトランスフェラーゼ(30unit/μL)を0.4μL、チミジン三リン酸(10pmol/μL)を2μL、オリゴヌクレオチドプローブ(50mM)を2μL、製品添付の反応緩衝液を2μL、精製水3.6μLを添加して反応溶液を調製した後、37℃で4時間反応させ、10×SSC緩衝液90μLを加えることで、ポリチミンが付加されたオリゴヌクレオチドプローブ1pmol/μLを得た。
その後、ポリチミンが付加されたオリゴヌクレオチドプローブをポリエステル膜上に一定間隔でそれぞれ0.5μLずつ塗布し、312nmの紫外線を2分間照射して固定化することで、検出用試験片を作成した。
1.pncA遺伝子の抽出
本実施例では、結核菌そのものを検体とし、pncA遺伝子の変異検出を行った。各実施例に用いた検体の結核菌を下記の表2に示した。各検体からフェノール抽出法によりゲノムDNAを抽出精製し、試料とした。
配列表の配列番号49に表された塩基配列からなるフォワードプライマー、同様に配列番号50に表された塩基配列からなり、かつ5'末端にビオチンを結合させたリバースプライマー、及びTaq DNAポリメラーゼ(ロシュ・ダイアグノスティクス社製)を用いたPCR法により、試料に含まれるpncA遺伝子の増幅を行った。プライマーの塩基配列は以下に示すとおりである。
フォワードプライマー ggcgtcatggaccctatatc (配列番号49)
リバースプライマー caacagttcatcccggttc (配列番号50)
PCRの反応条件は、変性過程を94℃、30秒、アニール過程を55℃、20秒、鎖伸長過程を72℃、20秒とし、この工程を30サイクルにより、増幅を行った。これにより増幅したDNAにはビオチンが結合している。
増幅したDNA溶液10μLに、水酸化ナトリウム(5M)、エチレンジアミン四酢酸(0.05M)の溶液(10μL)を加えてよく攪拌し、5分間放置して、増幅したDNAを1本鎖に変性した。この試料溶液中に、ドデシル硫酸ナトリウム(0.01w/v%)、塩化ナトリウム(1.8w/v%)、クエン酸ナトリウム(1.0w/v%)の溶液(1mL)及び実施例1で作製した検出用試験片1枚を加え、反応温度62℃のもとで30分間振とうして反応させた。その後、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを加え、さらにニトロブルーテトラゾリウム(NBT)及び5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスファターゼ p−トルイジニル塩(BCIP)を加えて、検出用試験片上の各プローブとハイブリダイズしたビオチンを含む増幅DNAに結合したアルカリホスファターゼを発色させた。
図2(写真)に示した実施例2〜14における検出結果を表3にまとめた。本発明のプローブセットはpncA遺伝子の様々な変異を検出できることが明らかとなった。
Claims (10)
- 配列表の配列番号1に表された塩基配列又はその相補配列に存在しうるpncA遺伝子の変異を検出しうる複数種のプローブからなるプローブセット。
- 配列表の配列番号1に表された塩基配列又はその相補配列に存在しうるpncA遺伝子の変異が、以下に示す1以上の位置の変異である請求項1に記載のプローブセット:
第-11位、第3位、第8位、第11位、第14位、第19位、第20位、第23位、第24位、第26位、第28位、第29位、第35位、第40位、第41位、第42位、第68位、第69位、第74位、第75位、第77位、第78位、第83位、第100位、第102位、第104位、第134位、第137位、第139位、第143位、第146位、第151-230位、第152位、第153位、第157位、第158位、第161位、第162位、第169位、第170位、第172位、第181位、第182位、第185位、第187位、第190位、第199位、第202位、第203位、第212位、第216位、第226位、第227位、第231位、第233位、第254位、第261位、第286位、第287位、第288位、第290位、第295位、第296位、第307位、第308位、第309位、第307-311位、第341位、第351位、第356位、第362位、第363位、第369位、第381-382位、第383位、第382-390位、第386位、第386-389位、第392位、第393位、第403位、第406位、第410位、第412位、第415位、第416位、第421位、第422位、第436位、第442位、第449位、第452位、第464位、第466位、第467位、第476位、第481位、第486-496位、第494位、第515位、第525位、第533位、第538位。 - 配列表の配列番号1に表された塩基配列又はその相補配列に存在しうるpncA遺伝子の変異が、以下に示す1以上の変異、又はその相補的な関係にある変異である請求項2に記載のプローブセット:
1)第-11位の塩基AからGへの変異
2)第3位の塩基GからTへの変異
3)第8位の塩基CからAへの変異
4)第11位の塩基TからGへの変異
5)第11位の塩基TからCへの変異
6)第14位の塩基TからAへの変異
7)第19位の塩基GからTへの変異
8)第20位の塩基TからAへの変異
9)第24位の塩基CからGへの変異
10)第23位の塩基AからGへの変異
11)第26位の塩基TからGへの変異
12)第26位の塩基TからCへの変異
13)第29位の塩基AからCへの変異
14)第28位の塩基CからTへの変異
15)第29位の塩基AからGへの変異
16)第35位の塩基AからCへの変異
17)第40位の塩基TからCへの変異
18)第41位の塩基GからAへの変異
19)第42位の塩基CからGへの変異
20)第68位の塩基GからT及び第69位の塩基TからCへの変異
21)第74位の塩基CからA及び第75位の塩基CからAへの変異
22)第77位の塩基Gの欠落
23)第78位の塩基Cの欠落
24)第78位の塩基CからGへの変異
25)第83位の塩基CからAへの変異
26)第100位の塩基TからGへの変異
27)第102位の塩基CからGへの変異
28)第104位の塩基TからCへの変異
29)第134位の塩基TからGへの変異
30)第137位の塩基CからAへの変異
31)第139位の塩基AからGへの変異
32)第143位の塩基Aの欠落
33)第146位の塩基AからCへの変異
34)第151-230位の間が80塩基が欠落
35)第153位の塩基CからGへの変異
36)第152位の塩基AからCへの変異
37)第157位の塩基GからAへの変異
38)第158位の塩基Aの欠落
39)第162位の塩基Gの欠落
40)第161位の塩基Cの欠落
41)第161位の塩基CからTへの変異
42)第170位の塩基AからCへの変異
43)第169位の塩基CからGへの変異
44)第172位の塩基TからCへの変異
45)第181位の塩基AからCへの変異
46)第182位の塩基C及び第183位の塩基Aの欠落
47)第184/185位の間に塩基Tの挿入
48)第187位の塩基GからCへの変異
49)第190位の塩基TからGへの変異
50)第199位の塩基TからCへの変異
51)第202位の塩基TからCへの変異
52)第202位の塩基TからGへの変異
53)第203位の塩基GからAへの変異
54)第203位の塩基GからCへの変異
55)第212位の塩基AからCへの変異
56)第216位の塩基CからGへの変異
57)第226位の塩基AからCへの変異
58)第227位の塩基CからTへの変異
59)第230/231位の間に6110塩基の挿入
60)第233位の塩基GからAへの変異
61)第254位の塩基TからGへの変異
62)第254位の塩基TからCへの変異
63)第260/261位の間に塩基ACの挿入
64)第288位の塩基Gが欠落
65)第286位の塩基AからCへの変異
66)第286位の塩基AからGへの変異
67)第287/288位の間に塩基Tの挿入
68)第287位の塩基AからCへの変異
69)第290位の塩基GからAへの変異
70)第295位の塩基TからGへの変異
71)第296位の塩基AからCへの変異
72)第307位の塩基TからCへの変異
73)第308位の塩基AからCへの変異
74)第309位の塩基CからGへの変異
75)第307-311位の塩基TACAGの欠落
76)第341位の塩基Cが欠落
77)第350/351位の間に塩基Tの挿入
78)第356位の塩基GからAへの変異
79)第362位の塩基GからC及び第363位の塩基GからCへの変異
80)第368/369位の間に18塩基の挿入
81)第381-382位の塩基GGの欠落
82)第383位の塩基TからGへの変異
83)第382/383位の間に塩基AGの挿入
84)第382-390位の間の8塩基の欠落
85)第385/386位の間に塩基CGの挿入
86)第386-389位の塩基ATGTの欠落
87)第391/392位の間に塩基GGの挿入
88)第392/393位の間に塩基Gの挿入
89)第403位の塩基AからCへの変異
90)第406位の塩基GからAへの変異
91)第406位の塩基GからTへの変異
92)第406位の塩基Gの欠落
93)第410位の塩基AからCへの変異
94)第412位の塩基TからCへの変異
95)第412位の塩基Tの欠落
96)第412位の塩基TからAへの変異
97)第414/415位の間に塩基Gの挿入
98)第416位の塩基TからCへの変異
99)第415位の塩基GからTへの変異
100)第415位の塩基GからAへの変異
101)第422位の塩基AからCへの変異
102)第421位の塩基CからTへの変異
103)第436位の塩基GからAへの変異
104)第442位の塩基CからAへの変異
105)第449位の塩基Gの欠落
106)第452位の塩基Tの欠落
107)第464位の塩基TからGへの変異
108)第465/466位の間に塩基Tの挿入
109)第467位の塩基TからAへの変異
110)第476位の塩基TからGへの変異
111)第480/481位の間に塩基TGACの挿入
112)第486-496位の間の10塩基の欠落
113)第493/494位との間にCの挿入
114)第515位の塩基TからCへの変異
115)第525位の塩基GからCへの変異
116)第532/533位の間に塩基Cの挿入
117)第538位の塩基GからTへの変異。 - 以下に示すi)又はii)に記載のオリゴヌクレオチド鎖からなるプローブを含む請求項2又は3に記載のプローブセット:
i)配列表の配列番号2〜48に表されたいずれかの塩基配列を含むオリゴヌクレオチド鎖;
ii)配列表の配列番号2〜48に表されたいずれかの塩基配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド鎖。 - 配列表の配列番号1に表されたpncA遺伝子の塩基配列又はその相補配列の少なくとも第-20位から第560位を検出しうる、少なくとも23種類以上のプローブを含むプローブセット。
- 以下に示すi)又はii)に記載のオリゴヌクレオチド鎖からなるプローブを含む請求項5に記載のプローブセット:
i)配列表の配列番号2〜48に表されたいずれかの塩基配列を含むオリゴヌクレオチド鎖;
ii)配列表の配列番号2〜48に表されたいずれかの塩基配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド鎖。 - 請求項2〜4及び6のいずれか1に記載のプローブセットに含まれる少なくとも1つのプローブを含むピラジナミド耐性結核菌の検出用試薬。
- 請求項1〜6のいずれか1に記載のプローブセットに含まれるプローブを固定したピラジナミド耐性結核菌検出用試験片。
- 請求項1〜6のいずれか1に記載のプローブセットを含むピラジナミド耐性結核菌の検出用キット。
- 請求項1〜6のいずれか1に記載のプローブセットを用いて検査することを特徴とする結核菌の判別方法。
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