JP2006153548A - 被検物質の定量方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 被検試料中の被検物質濃度の測定方法は、既知濃度の被検物質及び既知濃度の妨害物質を含む複数の標準試料について、前記被検物質を基質とする酵素を含む酵素電極を作用電極として用いるボルタンメトリーにおいて複数の電位における電流を測定する工程と、得られた測定値をニューラルネットワークにバックプロパゲーション法で学習させる工程と、未知濃度の被検物質及び未知濃度の妨害物質を含む被検試料について、上記と同じ方法で電流を測定する工程と、得られた測定値を前記ニューラルネットワークに入力し、前記被検試料中の被検物質濃度を求める工程とを含む。
【選択図】 なし
Description
(Vjk: j番目のデータの第k入力成分、min_j(Vjk): 全てのデータの第k入力成分の最小値、max_j(Vjk): 全てのデータの第k入力成分の最大値)
各入力成分について最大値と最小値を見付け、それらが1と0になるように各入力データを線形変換する。
(1) 試薬
本研究に用いた試薬は以下の通りである。
GOD: Aspergillus niger 由来Type II-S (EC 1.1.3.4) Sigma-Aldrich社製
ポリ (エチレングリコール)ジグリシジルエーテル (分子量400): Aldrich社製
アスコルビン酸(AA):和光純薬工業製
アセトアミノフェン(AAP): 和光純薬工業製
尿酸(UA): 和光純薬工業製
リン酸緩衝食塩水 (PBS), pH7.4: Gibco BRL製
ポリ (1-ビニルイミダゾール)n-オスミウム(PVIn-Os)はAdam Hellerらの手法(Anal. Chem. 1993, 65, 3512-3517)に従って合成した。具体的には次のようにして合成した。すなわち、6 mlの1-ビニルイミダゾールと0.5 gの2,2'-アゾビス(イソブチロニトリル)をアルゴン気流下で2時間、70℃で加熱した。反応溶液を放冷後、生じた沈殿をメタノールに溶解し、その溶液をアセトンに攪拌しながら滴下した。溶液を濾過し、黄色い沈殿(ポリビニルイミダゾール)を濾取した。ポリイミダゾールとビス(2,2'-ビピリジン)ジクロロオスミウムをエタノール中で3日間還流し、オスミウムメディエーター(PVIn-Os)を合成した。
電気化学測定には以下のポテンショスタットおよび電極を用いた。
ALS CH Instruments Electrochemical Analyzer Model 1000
φ3 mm PFCEカーボン電極(BAS社製)
Ptカウンター電極(BAS社製)
飽和KCl銀塩化銀参照電極(BAS社製)
メディエーターPVIn-Osおよび架橋剤ポリ (エチレングリコール)ジグリシジルエーテル(peg 400)をそれぞれ5 mg/ml,2.5 mg/mlになるよう、純水(Milli-Q(商品名)水)にて溶解した。また、GODは4 mg/ml になるよう、PBSにて溶解した。
グルコースおよび共存妨害物質の電気化学測定は酵素を固定した作用電極、Pt対極、Ag|AgCl参照極を用いた3電極系によるLSVまたはCVにて行った。装置の設定値は以下のとおりであった。
最低電位: 0 V
最高電位: 0.6 V
スキャン速度: 0.5 V/s
試料間隔(sample interval): 0.001 V
感度: 1x10-5 A/V
実験1:グルコース/アスコルビン酸(LSV測定)
実験2:グルコース/アセトアミノフェン(CV測定)
実験3:グルコース/尿酸(CV測定)
実験4:グルコース/アスコルビン酸/アセトアミノフェン(CV測定)
実験5:グルコース/アスコルビン酸/アセトアミノフェン/尿酸(CV測定)
の5つの系にて行った。各実験に用いた測定サンプルに含まれる各成分の濃度を表1.1及び表1.2に示す。各成分の濃度は、血中における標準値を基準に設定した。
使用したNNは、一般的な3層構造(入力層,中間層,出力層)を持つ。入力層に正規化されたサンプルの電流応答を入力すると、そこに含まれる各成分の濃度が出力層から出力される構造になっている。このNNのソースコードを図5.1ないし図5.8に示す。
BP-NNの評価は、leave-one-out法に基づいたクロスバリデーションにて行った。この手法では、まず各実験に用いたN個の測定サンプルのうち、任意の1サンプルを除いた(N-1)個のサンプルに対する電流応答を用いて、応答と成分濃度の関係をBP-NNに学習させる。このBP-NNに、学習に用いなかった1サンプルの応答を“未知サンプルの応答”として入力すると、そのサンプルに含まれる各成分の濃度が推定される。出力された推定値と実際に含まれる成分濃度を比較することで、BP-NNの推定能力を評価できる。実験ごとに、すべてのサンプルに対して同様なクロスバリデーションを行い、N個のサンプルの平均誤差をroot-mean-square error of prediction(RMSEP)および相対誤差の平均値(average relative error: ARE)として算出した。
作製したグルコース電極のグルコース溶液に対するCV応答を図2に示す。この応答におけるグルコース検出電位では血中に共存するAA、AAPおよびUAの酸化電流が妨害となる。血中における共存物質であるAA、AAP及びUAは同電極に対し図3に示す妨害を持つ。
Claims (6)
- 既知濃度の被検物質及び既知濃度の妨害物質を含む複数の標準試料について、前記被検物質を基質とする酵素を含む酵素電極を作用電極として用いるボルタンメトリーにおいて複数の電位における電流を測定する工程と、得られた測定値をニューラルネットワークにバックプロパゲーション法で学習させる工程と、未知濃度の被検物質及び未知濃度の妨害物質を含む被検試料について、上記と同じ方法で電流を測定する工程と、得られた測定値を前記ニューラルネットワークに入力し、前記被検試料中の被検物質濃度を求める工程とを含む、被検試料中の被検物質濃度の測定方法。
- 前記酵素がオキシダーゼである請求項1記載の方法。
- 前記オキシダーゼがグルコースオキシダーゼである請求項2記載の方法。
- 前記妨害物質が、アスコルビン酸、アセトアミノフェン及び尿酸から成る群より選ばれる少なくとも1種である請求項3記載の方法。
- 前記グルコース電極が、オスミウムメディエーターを含む請求項3又は4記載の方法。
- 前記ボルタンメトリーが、リニアスウィープボルタンメトリー又はサイクリックボルタンメトリーである請求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。
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