JP4518923B2

JP4518923B2 - 被検物質の定量方法

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Publication number: JP4518923B2
Application number: JP2004341811A
Authority: JP
Inventors: 才子石原; 敬夫荒木; ダニエルチッテリオ; 将文萩原; 鈴木　　孝治; 健一丸山
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2004-11-26
Filing date: 2004-11-26
Publication date: 2010-08-04
Anticipated expiration: 2024-11-26
Also published as: JP2006153548A

Description

本発明は、酵素電極を用いた被検物質の定量方法に関する。

酵素を電極に固定化した酵素電極は基質に対する高い選択性や感度を持ち、現在では医療、環境、食品など幅広い分野における分析に用いられている。その中でもグルコースオキシダーゼ(GOD)を用いたグルコース電極は臨床現場における血糖値測定等に使われている。しかし、一般的に用いられている検出電位では、アスコルビン酸やアセトアミノフェン、尿酸など共存物質の酸化電流による妨害が無視できない。この影響を防ぐため、現在までに様々な方法による電極の修飾やメディエーターを用いた応答電位の最適化、妨害物質を除去する手法などが研究されている（非特許文献１）。しかしこれらの方法は電極の作製と応答機構を複雑にし、再現性や感度を低下させることもある。

一方、本願発明者らは、先にニューラルネットワークを利用して、複数の化学物質の濃度の測定方法を発明し、特許出願した（特許文献１）。しかしながら、この方法は、ネットワークインバージョンを用いるものであり、また、酵素電極を用いたボルタンメトリーによる被検物質（酵素基質）の測定に適用すること並びにそれによって被検物質（酵素基質）及び共存する妨害物質の濃度が正確に定量できることについては開示も示唆もない。

Anal. Chem. 2003, 75, 593-600 国際公開公報WO 03/044498 A1

本発明の目的は、妨害物質が共存する被検試料中の被検物質の濃度を簡便、かつ正確に測定することができる被検物質の定量方法を提供することである。

本願発明者らは、鋭意研究の結果、例えばグルコースのような被検物質を基質とする、例えばグルコースオキシダーゼのような酵素を含む酵素電極を作用電極として用いるボルタンメトリーにおいて、被検試料の複数の電位における電流を測定し、予め既知濃度の標準試料を用いた測定値をバックプロパゲーション法により学習させておいたニューラルネットワークに入力し、前記被検試料中の被検物質濃度を求めることにより、妨害物質が共存していても被検試料中の被検物質を正確に定量できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、既知濃度の被検物質及び既知濃度の妨害物質を含む複数の標準試料について、前記被検物質を基質とする酵素を含む酵素電極を作用電極として用いるボルタンメトリーにおいて複数の電位における電流を測定する工程と、得られた測定値をニューラルネットワークにバックプロパゲーション法で学習させる工程と、未知濃度の被検物質及び未知濃度の妨害物質を含む被検試料について、上記と同じ方法で電流を測定する工程と、得られた測定値を前記ニューラルネットワークに入力し、前記被検試料中の被検物質濃度を求める工程とを含む、被検試料中の被検物質濃度の測定方法を提供する。

本発明によれば、汎用の単純な構造の酵素電極を用い、妨害物質が共存していても被検試料中の被検物質を簡便に、正確に定量できる。従って、本発明の方法は、酵素電極を用いて測定されている、グルコースのような種々の被検物質の定量に大いに貢献するものと期待される。

本発明の方法に供される被検試料は、定量しようとする被検物質と、妨害物質を含むものである。被検物質としては、該被検物質を基質とする酵素が存在し、かつ、その酵素を含む酵素電極を用いたボルタンメトリーにより定量が可能なものであり、例えば、グルコース（これを基質とする酵素は例えばグルコースオキシダーゼ）、ラクトース、その塩若しくはエステル（これを基質とする酵素は例えばラクテートオキシダーゼ）、各種アルコール（これを基質とする酵素は例えばアルコールオキシダーゼ）等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。これらの被検物質を含む被検試料の例としては、血液、血清、血漿、尿、唾液等の体液やそれらの希釈物を例示することができるがこれらに限定されるものではない。血液中の妨害物質としては、被検物質がグルコースの場合、アスコルビン酸、アセトアミノフェン、尿酸等を例示することができる。本発明の方法は、これらの妨害物質を含む被検試料中のグルコースの定量に特に優れた効果を発揮するが、妨害物質は上記のものに限定されるものではない。

本発明の方法には、被検物質を基質とする酵素を含む酵素電極が用いられる。酵素としては、対応する基質の濃度をボルタンメトリーにより測定できるものであれば何ら限定されず、上記したグルコースオキシダーゼ、ラクテートオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ等の各種オキシダーゼ、各種デヒドロゲナーゼ、各種レダクターゼ等を挙げることができる。これらのうち、グルコースオキシダーゼ(GOD)を含むグルコース電極が特に好ましい。酵素を含む酵素電極自体は周知であり、周知の酵素電極のいずれをも用いることができる。もっとも、本発明の方法では、単純な構造の酵素電極を用いても、妨害物質が共存する被検試料中の被検物質を正確に定量することができるので、汎用されている単純な構造の酵素電極を用いることが有利である。例えば、グルコース電極の場合、ポリ(1-ビニルイミダゾール)_n-オスミウム(PVI_n-Os)のような、オスミウムメディエーター中にGODを含有させたグルコース電極（Anal. Chem. 1993, 65, 3512-3517）を好ましく用いることができる。GODとオスミウムメディエーターを用いたグルコース電極のグルコースに対する応答機構を図１に示す。

本発明の方法では、先ず、既知濃度の被検物質及び既知濃度の妨害物質を含む複数の標準試料について、該被検物質を基質とする酵素を含む酵素電極を作用電極として用いるボルタンメトリーにおいて複数の電位における電流を測定する。なお、標準試料には、単一物質（被検物質又は妨害物質の１つ）のみを含み、他の物質を含まない標準試料が包含されていてもよい。ボルタンメトリーは、特に限定されず、公知のボルタンメトリーのいずれでもよいが、リニアスイープボルタンメトリー(linear sweep voltammetry (LSV))及びサイクリックボルタンメトリー(cyclic voltammetry(CV))を好ましい例として挙げることができる。これらは、市販のポテンショスタット並びに市販のPt対極のような対極及び市販の飽和KCl銀塩化銀参照電極のような参照電極を用いた周知の方法により行うことができる。なお、本発明の方法を行なうためには、複数の電位における電流を測定すればよいが、電位を連続的に変化させて、それに対応する電流値を連続的に測定してもよい。また、変化させる電位の範囲は特に限定されないが、血中グルコースを測定する場合には、0〜600mV程度でよい（下記実施例参照）。

次に、測定した複数の電位における測定値を、コンピューターを用いて、ニューラルネットワークにバックプロパゲーション法（逆誤差伝搬法(back propagation)、以下、「ＢＰ」と言うことがある）で学習させる。ＢＰは、階層型ニューラルネットワークの学習法の一つで周知のアルゴリズムである。ＢＰは、例えば、「基礎と実践ニューラルネットワーク」、コロナ社、臼井支朗、岩田彰など、「ニューロコンピューティング入門」、森北出版、坂和正敏、田中雅博及び「ニューロ・ファジィ・遺伝的アルゴリズム」、産業図書、萩原将文等の教科書的な書物に解説されている、当業者にとって周知の基本的なアルゴリズムであり、下記実施例にもプログラムの具体例が記載されている。一般的なニューラルネットワークは、入力層、中間層、出力層から成る３層構造を有しており、本発明においてもこのような一般的な３層構造の階層型ニューラルネットワークを好ましく用いることができる。

入力する測定値の数は、各標準試料中に含まれる成分の数と同数又はそれ以上であることが好ましく、例えば、標準試料中にグルコース及び３種類の妨害物質が含まれる場合には、入力する測定値は、４点以上を測定することが好ましい。入力する測定値の数は、多くなるほど精度が高くなるが、あまりに多くなると、コンピューターに多大の負荷がかかって処理が困難になるため、５０点ないし２００点程度が好ましく、さらには８０点ないし１５０点程度が好ましい。また、測定値は、電流値をそのまま用いてもよいが、正規化後の値を用いてもよい。正規化後の値は、例えば、次の式により算出することができる。

Vjk = (Vjk - min_j(Vjk)) / (max_j(Vjk) - min_j(Vjk))
(Vjk: j番目のデータの第k入力成分、min_j(Vjk): 全てのデータの第k入力成分の最小値、max_j(Vjk): 全てのデータの第k入力成分の最大値)
各入力成分について最大値と最小値を見付け、それらが１と０になるように各入力データを線形変換する。

次に、未知濃度の被検物質及び未知濃度の妨害物質を含む被検試料について、上記と同じ方法で電流を測定する。

次いで、得られた測定値を前記ニューラルネットワークに入力し、前記被検試料中の被検物質濃度を求める。なお、当然ながら、学習工程で、正規化後の値を入力した場合には、この工程において入力される測定値も、学習工程と同じ方法で正規化されたものとなる。上記学習工程により学習済みの階層型ニューラルネットワークの入力層に測定値を入力すると、ニューラルネットワークの出力層から各成分の濃度が出力される。従って、出力された各成分の濃度から、被検試料中のグルコース濃度を知ることができる。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

１．材料及び方法
(1) 試薬
本研究に用いた試薬は以下の通りである。
GOD: Aspergillus niger 由来Type II-S (EC 1.1.3.4) Sigma-Aldrich社製
ポリ (エチレングリコール)ジグリシジルエーテル (分子量400): Aldrich社製
アスコルビン酸(AA):和光純薬工業製
アセトアミノフェン(AAP): 和光純薬工業製
尿酸(UA): 和光純薬工業製
リン酸緩衝食塩水 (PBS), pH7.4: Gibco BRL製

(2) オスミウムメディエーターの作製
ポリ (1-ビニルイミダゾール)_n-オスミウム（PVIn-Os）はAdam Hellerらの手法（Anal. Chem. 1993, 65, 3512-3517）に従って合成した。具体的には次のようにして合成した。すなわち、6 mlの1-ビニルイミダゾールと0.5 gの2,2'-アゾビス（イソブチロニトリル）をアルゴン気流下で２時間、70℃で加熱した。反応溶液を放冷後、生じた沈殿をメタノールに溶解し、その溶液をアセトンに攪拌しながら滴下した。溶液を濾過し、黄色い沈殿（ポリビニルイミダゾール）を濾取した。ポリイミダゾールとビス（2,2'-ビピリジン）ジクロロオスミウムをエタノール中で３日間還流し、オスミウムメディエーター（PVIn-Os）を合成した。

(3) 装置
電気化学測定には以下のポテンショスタットおよび電極を用いた。
ALS CH Instruments Electrochemical Analyzer Model 1000
φ3 mm PFCEカーボン電極（BAS社製）
Ptカウンター電極（BAS社製）
飽和KCl銀塩化銀参照電極（BAS社製）

(4) グルコース電極の作製
メディエーターPVI_n-Osおよび架橋剤ポリ (エチレングリコール)ジグリシジルエーテル（peg 400）をそれぞれ5 mg/ml，2.5 mg/mlになるよう、純水(Milli-Q(商品名）水）にて溶解した。また、GODは4 mg/ml になるよう、PBSにて溶解した。

研磨したカーボン電極表面にPVI_n-Os溶液2μl，GOD溶液2μl，peg 400溶液1.2μlをマイクロシリンジにて滴下し、シリンジの先を用いて溶液をよく混合した。室温・遮光条件で48時間乾燥させ、電極表面上に酵素固定化膜を作製した。

(5) 測定
グルコースおよび共存妨害物質の電気化学測定は酵素を固定した作用電極、Pt対極、Ag|AgCl参照極を用いた３電極系によるLSVまたはCVにて行った。装置の設定値は以下のとおりであった。
最低電位: 0 V
最高電位: 0.6 V
スキャン速度: 0.5 V/s
試料間隔(sample interval): 0.001 V
感度: 1x10^-5 A/V

LSV及びCVは、具体的には次のようにして行なった。すなわち、電気化学測定用セルに測定溶液を入れ、ポテンショスタットにつないだ作用電極、対極、参照極を差し入れた。電極に溶液をなじませて３分間静止した後、ポテンショスタットにて作用電極に0-600 mVの間で1 mV間隔に観測される電流を検出した。

測定では、10 mlのPBSにグルコースと共存妨害物質の溶液を添加した後３分間静置して各濃度のサンプルに対する電流を測った。実験は、
実験１：グルコース／アスコルビン酸（LSV測定）
実験２：グルコース／アセトアミノフェン（CV測定）
実験３：グルコース／尿酸（CV測定）
実験４：グルコース／アスコルビン酸／アセトアミノフェン（CV測定）
実験５：グルコース／アスコルビン酸／アセトアミノフェン／尿酸（CV測定）
の５つの系にて行った。各実験に用いた測定サンプルに含まれる各成分の濃度を表1.1及び表1.2に示す。各成分の濃度は、血中における標準値を基準に設定した。

(6) ニューラルネットワーク(NN)及びバックプロパゲーション(BP)学習
使用したNNは、一般的な3層構造（入力層，中間層，出力層）を持つ。入力層に正規化されたサンプルの電流応答を入力すると、そこに含まれる各成分の濃度が出力層から出力される構造になっている。このNNのソースコードを図5.1ないし図5.8に示す。

LSVまたはCV測定における各電位で検出された電流値を学習データとして用いた。すなわち、入力値には、LSV測定では、1mV間隔で測定した電流値を、連続する6mVごとにグループ化し、各グループの電流値の平均を正規化した値を用いた。より具体的には、電位1mV〜6mVのグループ、7mV〜12mVのグループ、・・・、595mV〜600mVのグループというように、6mV毎に１００個のグループに分け、各グループ内での1mVごとの各電位における電流値の平均をそのグループの電流値とし、それを上記した数式に従って正規化した値（合計１００個）を用いた。CV測定では、電位の掃引はサイクリックであるので、電位を0mVから600mVに上げた後、600mV〜0mVにまで戻す。このため、10mV毎に、往復で１２０個のグループに分け、各グループ内での1mVごとの各電位における電流値の平均をそのグループの電流値とし、それを上記した数式に従って正規化した値（合計１２０個）を用いた。このようにグループ化することにより、入力する数値の数を減らしてコンピューターに過大な負荷がかからないようにすることができ、また、各グループの平均値を用いることにより測定ノイズや測定誤差が生じても、かなり相殺することができる。各実験系において構築したBP-NNのパラメータを表２に示す。

(7) BP-NNの評価
BP-NNの評価は、leave-one-out法に基づいたクロスバリデーションにて行った。この手法では、まず各実験に用いたN個の測定サンプルのうち、任意の１サンプルを除いた(N-1)個のサンプルに対する電流応答を用いて、応答と成分濃度の関係をBP-NNに学習させる。このBP-NNに、学習に用いなかった１サンプルの応答を“未知サンプルの応答”として入力すると、そのサンプルに含まれる各成分の濃度が推定される。出力された推定値と実際に含まれる成分濃度を比較することで、BP-NNの推定能力を評価できる。実験ごとに、すべてのサンプルに対して同様なクロスバリデーションを行い、N個のサンプルの平均誤差をroot-mean-square error of prediction（RMSEP）および相対誤差の平均値（average relative error: ARE）として算出した。

２．結果
作製したグルコース電極のグルコース溶液に対するCV応答を図２に示す。この応答におけるグルコース検出電位では血中に共存するAA、AAPおよびUAの酸化電流が妨害となる。血中における共存物質であるAA、AAP及びUAは同電極に対し図３に示す妨害を持つ。

４成分が混入した実験５では、図４のような複雑なCV応答から必要な情報のみをニューラルネットワークが抽出し、各成分の定量を行う。

実験１〜５において，サンプル中に実際に含まれる成分濃度と、クロスバリデーションにおいてネットワークが推定した結果を表３．１及び表３．２に示す。

また、各実験のクロスバリデーション結果より算出されたRMSEPおよびAREを表４に示す。表４に見られるように、実験１〜３のような２成分系の同時定量のみに限らず、実験４のような３成分系、また実験５のような４成分系においても高い精度で測定対象物質であるグルコースおよび共存妨害物質を同時定量することができた。

本発明の実施例で用いた、グルコースオキシダーゼ及びオスミウムメディエーターを含むグルコース電極の動作原理を説明する図である。実施例において作製したグルコース電極の、グルコース溶液に対するサイクリックボルタンメトリー応答を示す図である。実施例において作製したグルコース電極の、各種妨害物質（アスコルビン酸(AA)、アセトアミノフェン(AAP)及び尿酸(UA)溶液に対するサイクリックボルタンメトリー応答を示す図である。実施例において測定した、グルコース及び３種類の妨害物質が共存する４成分系の溶液に対するサイクリックボルタンメトリー応答を示す図である。実施例において用いたニューラルネットワークのソースコードを示す図である。図５．１の続きを示す図である。図５．２の続きを示す図である。図５．３の続きを示す図である。図５．４の続きを示す図である。図５．５の続きを示す図である。図５．６の続きを示す図である。図５．７の続きを示す図である。

Claims

既知濃度の被検物質及び既知濃度の妨害物質を含む複数の標準試料について、前記被検物質を基質とする酵素を含む酵素電極を作用電極として用いるボルタンメトリーにおいて複数の電位における電流を測定する工程と、得られた測定値をニューラルネットワークにバックプロパゲーション法で学習させる工程と、未知濃度の被検物質及び未知濃度の妨害物質を含む被検試料について、上記と同じ方法で電流を測定する工程と、得られた測定値を前記ニューラルネットワークに入力し、前記被検試料中の被検物質濃度を求める工程とを含む、被検試料中の被検物質濃度の測定方法。
前記酵素がオキシダーゼである請求項１記載の方法。
前記オキシダーゼがグルコースオキシダーゼであり、前記酵素電極がグルコース電極である請求項２記載の方法。
前記妨害物質が、アスコルビン酸、アセトアミノフェン及び尿酸から成る群より選ばれる少なくとも１種である請求項３記載の方法。
前記グルコース電極が、オスミウムメディエーターを含む請求項３又は４記載の方法。
前記ボルタンメトリーが、リニアスウィープボルタンメトリー又はサイクリックボルタンメトリーである請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。