JP2006149361A - Ｐｃｒ用サーマルサイクラーに装着される多重ウェルプレートのチューブ内での試料の蒸発及び／又は凝縮を最小化するための装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 サーマルサイクラーによるＤＮＡ増幅又はＤＮＡシーケンシング過程中において反応チューブ内の試料の蒸発を效果的に防止すると共に、上記過程を容易に自動化できる装置を提供すること。
【解決手段】 本発明の自動化装置は、複数の多重ウェルチューブに各々対応する複数のプランジャーと、前記複数のプランジャーが同時に結合されて固定される所定サイズの結合部材とを含み、前記各々のプランジャーは、所定の長さを有するロッドと、各々のチューブ内への垂直移動のための作用力を容易に伝達するために、前記ロッドの上端部に設けられたヘッドと、前記各々のチューブ内の試料液面上の空間を最小化するために、各々のチューブに密封式で嵌入されるように、前記ロッドの下端部に設けられた弾性部材とを含む。
【選択図】 図３

Description

本発明は、サーマルサイクラーによるＤＮＡ増幅又はＤＮＡシーケンシング（Sequencing）過程中において反応チューブ内での試料の蒸発を效果的に防止する自動化装置に関する。

ＰＣＲ（Polymerase chain reaction）とは、特定のＤＮＡ領域を挟んだ２種類のプライマーとＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ合成反応を、試験管内で繰り返して特定のＤＮＡ領域を数十万倍に増幅する方法を言い、生命工学分野において必須な実験に属する。

一般に、ＰＣＲ工程の１サイクルは、二重鎖ＤＮＡを単一鎖に分離するステップと、分離された単一鎖ＤＮＡに、標的領域を挟んだ２種類のプライマー（primer）をアニーリング（annealing）させるステップと、プライマーを延長して、標的領域に相補的な配列を合成するステップとからなる。この過程は、多様な温度下で高温で進行される。したがって、高熱によるチューブ内の試料の蒸発現象が生じることができる。これにより、ＰＣＲの結果に大きな影響を及ぼすので、これを最小化するために、大きく三つの方式が主に使われてきた。

第一に、試料にミネラルオイル（mineral oil）を添加して、試料の液面上にオイル層を形成し、すなわち、層を重畳させることによって、高熱による試料の蒸発を防止する方式である。第二に、蓋体又はカバー付きのチューブを使用して、試料の蒸発を防止する方式である。第三に、アルミニウムやビニルシート（sheet）に熱を加えた後、これをチューブの上面形状に符合するようにチューブの上部開放面を密封することで、その試料の蒸発及び凝縮を低減する方式である。なお、チューブの上面形状に合わせて製作された特殊な材質のカバーを使用して、各々のチューブに嵌入することによって、試料の蒸発を防止することもできる。

前述のような方法は、それぞれ次のような問題点がある。すなわち、オイル層で試料の液面上を被覆する方法の場合には、ＰＣＲ工程が完了した後、オイル層を除去するための過程を必要とする。このような工程は、不要なもので、ＰＣＲ工程の全体時間を増加させ、全体工程を複雑にする。また、蓋体又はカバー付きのチューブを使用する場合、又はアルミニウムやビニルシートを使用してチューブの上面を密封する場合には、カバー又はシートと試料の液面との間に試料量に比べて相対的に大きい空間が生じるようになるので、その空間に該当する量分の蒸発が発生することを回避できない。このような程度は、ＰＣＲ工程に使われる試料の量が相対的に少ないという点から、無視できない多い量になるので、必ず回避すべき事項である。さらに、蓋体（又はカバー）及び／又はシートは、ＰＣＲ工程を自動化させるにあたって、多くの制約をもたらすという短所を有する。

本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであり、特にＰＣＲ用サーマルサイクラー内に装着される多重ウェルプレートの容器又はチューブ内での試料の蒸発及び／又は凝縮による試料の損失を最小化するための装置を提供することを目的とする。

また、本発明は、前述した多重ウェルプレートの容器又はチューブ内での試料の蒸発及び／又は凝縮を最小化しつつ、ＰＣＲ工程を完全に自動化するための装置を提供することを他の目的とする。

上記目的を達成するために、本発明に係る装置は、基本的には、多重ウェルプレートの各々の容器又はチューブ内で試料の蒸発及び／又は凝縮を最小化するための所定形状の構造物と、このような多重ウェル容器内でのＰＣＲ工程の自動化のために、前記各々の構造物を一体に連結するための所定の連結手段とで構成される。

より具体的には、本発明の一態様によれば、ＰＣＲ用サーマルサイクラーに装着される多重ウェルプレートの複数のチューブ内の試料の蒸発及び／又は凝縮を最小化するための装置が提供され、この装置は、前記多重ウェルプレートの複数の容器に各々対応する複数のプランジャー（plunger）と、前記複数のプランジャーが同時に結合されて固定される所定サイズの結合部材とを含み、前記各々のプランジャーは、所定の長さを有するロッド（rod）と、各々のチューブ内への垂直移動のための作用力を容易に伝達するために、前記ロッドの上端部に設けられたヘッド（head）と、前記各々のチューブ内の試料液面上の空間を最小化するために、各々のチューブに密封式で嵌入されるように、前記ロッドの下端部に設けられた弾性部材とを備える。

本発明の他の態様によれば、前記プランジャーは、チューブ内の試料の蒸発及び／又は凝縮を最小化するためのプランジャーにおいて、所定の長さ及び強さを有するロッドと、前記チューブ内の試料液面上の空間を最小化するために、チューブの内面に密封式で嵌入されるように、前記ロッドの下端部に設けられたＯ-リングとを備える。

本発明の自動化装置によれば、チューブ内の試料の液面上の空間、すなわち試料の蒸発及び凝縮が発生し得る空間を最小化させることにより、ＰＣＲ又はＤＮＡシーケンシング過程中においてしきりに発生する試料の蒸発をより一層效果的に防止することかでき、凝縮をも低減することができる。さらに、本発明の結合部材は、多重ウェルプレートの上面と一定間隔を持って複数のプランジャーを結合固定させる平板状の構造物であるから、前記複数のプランジャーを容易に且つ精密に上下移動させることができるという利点を有する。したがって、前記各々のプランジャーを８個、１２個、９６個、３８４個又は１５３６個などの個数で同時に前記結合部材に集積させることにより、ＰＣＲ工程又はＤＮＡシーケンシング過程において容易に制御することができるので、ＰＣＲ工程又はＤＮＡシーケンシング過程を容易に自動化することができる。

本発明に係る自動化装置によると、結合部材と、該結合部材に固定結合される複数のプランジャーとを構成することにより、多重ウェルプレートの複数の反応容器内の試料の蒸発及び凝縮を最小化できる。すなわち、各々のプランジャーのロッドの下端部に、Ｏ−リング形態の弾性部材を固定設置し、反応容器の内壁と所定位置で密着結合させることによって、反応容器内の試料の蒸発空間を最小化すると共に、試料の浪費を低減することができる。また、このような複数のプランジャーを、反応容器の上端開口から所定の距離を置いて、平板状の１つの結合部材に固着させることにより、各プランジャーの垂直方向への移動を容易に調節できるので、複数の反応容器に対するＰＣＲ工程又はＤＮＡシーケンシング工程を容易に自動化できる。

また、複数のプランジャーが結合部材と一体に固定結合されているので、結合部材に所定の熱を加え、これをプランジャーを介して試料に隣接する弾性部材側に容易に伝達できる。したがって、反応容器内の試料の蒸発を防止することができると共に、試料の凝縮をも防止することができる。

本発明による装置を利用することにより、ミネラルオイルを用いて追加層を形成していた従来の方法や、反応チューブの上端に蓋体を設置する従来の方法に比べて、非常に簡単な構成及び／又は作業性により、ＰＣＲ過程中に発生する反応チューブ内の蒸発をより一層效果的に防止することができると共に、凝縮を低減することができる。また、複数のプランジャーを所望の個数で容易に取り付けることができ、また、取り付けられたプランジャーの垂直方向移動を容易に制御できるので、オイル除去工程及びカバー着脱工程のような不要な工程を予め除去することにより、ＰＣＲ工程及びＤＮＡシーケンシング工程の自動化を容易に達成できる。

以下、添付の図面を参照して本発明の好適な実施形態を詳細に説明する。

図１は、本発明に使用するためのプランジャー結合用孔が形成された結合部材の概略的な上部斜視図であり、図２は、本発明に使用するための典型的なプランジャー及び反応容器の各々の概略断面図であり、図３は、図２に示されたプランジャーが反応容器に挿入されて密着結合された状態を示す正面図であって、一部が断面状で示されている。

図１乃至図３に示すように、本発明による装置１は、ＰＣＲ用サーマルサイクラーによるＤＮＡ増幅又はＤＮＡシーケンシング過程中において、複数の反応容器又はチューブ内の試料の蒸発及び凝縮を最小化しつつ、前記過程を自動化するためのものであって、多重ウェルプレートの複数の容器又はチューブ３０に各々対応する複数のプランジャー１０と、この複数のプランジャー１０が同時に結合されて固定される所定サイズの結合部材２０とを含む。

図２に示すように、複数のプランジャー１０の各々は、垂直方向に延長するロッド１２と、各々の反応容器３０内への垂直移動のための作用力を容易に伝達するために、ロッド１２の上端部に設けられたヘッド１４と、反応容器３０内の試料の蒸発空間を最小化するために、各々の反応容器３０の内壁に密封圧着する方式で嵌入されるように、ロッド１２の下端部に設けられた弾性部材１６とで構成される。

図１及び図４に示すように、このような複数のプランジャー１０が結合部材２０に特定試験に適合した個数で一度に固定結合されるようになる。このような状態が図７に詳細に示されている。このために、結合部材２０は、ＰＣＲ工程に使われる多重ウェルプレートの反応容器の個数に対応する所定個数の孔２２（図１参照）及び／又は溝２４（図４参照）を有する。すなわち、このような結合部材２０には、孔２２及び／又は溝２４が、ＰＣＲサーマルサイクラーに装着される多重ウェルプレートのチューブ３０の個数に対応する個数で形成され、好ましくは、９６個（＝８×１２）、３６４個（＝１６×２４）又は１，５３６個（＝３２×４８）である。前記孔２２は、各々のプランジャー１０のロッド１２の直径とほぼ同じ直径を有する。前記孔２２の周辺部に該当する結合部材の上面の所定部分とヘッド１４の底面とは、通常の接着剤などのような固定手段を用いて互いに堅固に固定結合されることができる。また、プランジャーの結合部材への結合力をより増強するために、前記溝２４がさらに形成されることができる。前記溝２４は、結合手段２０の上面に所定の深さ（例えば、結合部材の厚さの半分程度）でヘッド１４の底面のサイズに対応するサイズで形成されることが好ましく、この溝２４の内部底面とこれに挿入される前記ヘッド１４の底面とは、前述した例と同様に、通常の接着剤などを用いて互いに堅固に結合されることができることはもちろんである。

選択的に、図５に示すようなプランジャー１０ａも使われることができ、この場合には、結合部材２０との固定結合のための接着剤などは不要である。すなわち、プランジャー１０ａは、ロッド１２の上部に円錐状突出部１２１をさらに有するという点を除いて、図２に示されたプランジャー１０とほぼ同じ構成を有する。図５に示すように、円錐状突出部１２１は、ロッド１２の外周面から半径方向に下部から上部に行くほど半径方向に若干突出し、円錐状突出部１２１の上端部とヘッド１４の底面とは、一定の距離をもって離隔した形態を有し、この距離は、結合部材２０の厚さｔと同一にすることが好ましい。この突出部１２１は、所定の弾性を有するので、ロッドの直径とほぼ同じ直径を有する結合部材２０の孔２２内に強制的に嵌入されることができる（いわゆる「スナップ締結」される）。これにより、各々のプランジャー１０ａは、結合部材２０の孔２２周辺の底面とプランジャー１０ａの円錐状突出部１２１の上端部の平面により、プランジャーの移動が制限されるので、上記のように接着剤などの固定手段を使用しなくとも十分に固定結合されることができる。もちろん、より堅固な固定結合のためには、接着剤が使われても構わない。

一方、前述したように、複数のプランジャー１０が固定結合される結合部材２０は、前述したような個数の孔及び／又は溝を有する平板状のものであり、この平板は、所定の厚さをもってプランジャーを容器内に圧着させるのに必要な力を伝達できるように十分な剛性を有しなければならない。さらに、前記結合部材を反応容器側に向かって押圧するために力を加える時、これに取り付けられた複数のプランジャーが下向き垂直方向に同じ距離だけ移動できるように、十分に丈夫でなければならないことはもちろんである。同様に、プランジャーも結合部材から伝達される垂直力を受けて目標とする距離だけ適切に移動できるように充分の剛性を有しなければならない。プランジャーの場合には、ヘッドからロッドの下端部への熱伝逹を可能にすることができる特性を有することがより好ましい。ＰＣＲ工程中に試料に加えられる温度と類似な温度の熱を伝達すれば、反応容器内の試料の蒸発、特に凝縮を防止するのに非常に効果的であるからである。このために、上記の結合部材及びプランジャーなどは、ＰＰ、ＰＳ、ステンレス鋼、アルミニウムなどの材質で製造されることが好ましい。もちろん、所定の剛性及び熱伝逹特性を有する他の材料でプランジャー及び結合部材が製造できることは当然なことである。

また、図２及び図５を参照すれば、弾性部材１６をプランジャー１０又は１０ａに密着固定するために、プランジャー１０又は１０ａの下端外周面には、弾性部材１６の固定結合のための環状溝１８が形成されることが好ましい。この環状溝１８は、プランジャー１０又は１０ａが反応容器３０内への進入時、反応容器３０の内壁と密着結合されてから後退する作用が継続的に繰り返されても、弾性部材１６がプランジャー１０又は１０ａから脱落しないようにする。前記弾性部材１６は、好ましくは、シリコン又はゴム材質のＯ−リング１６ａであることが好ましい。もちろん、前記プランジャー１６の反応容器３０内への進入時、前述した反応容器３０の内壁との密封圧着機能を保障できるなら、Ｏ−リングの代わりに、図６に示すような栓形態の弾性部材１６ｂが使われることもできる。この場合にも、栓体がプランジャーから離脱することを防止するために、Ｏ−リングの固定のための環状溝１８と類似な形態の手段が採用されることが好ましい。

一方、プランジャー１０又は１０ａのサイズ（例えば、長さなど）は、使われる反応容器のサイズ（例えば、深さ、直径など）に応じて多様に決定されることができる。一般的に、ＰＣＲ工程に使われる反応容器は、その開放端部３３から閉鎖端部３４に行くほど、その断面直径が徐々に減少する形態を有する。プランジャー１０又は１０ａの下端部に装着されたＯ−リングなどの弾性部材１６が、反応容器３０の該当内部壁面に密着されて所定地点に位置したとき、プランジャー１０又は１０ａは、結合部材２０の底面が前記容器の開放端部３３から０.５ｍｍ乃至２０ｍｍ間の範囲で離隔する程度の長さを有することが好ましい。

本発明に使用するためのプランジャー結合用孔が形成された結合部材の概略的な上部斜視図である。 本発明に使用するための典型的なプランジャーと反応容器の各々の概略断面図である。 図２に示されたプランジャーが反応容器に挿入されて密着結合された状態を示す正面図である。 本発明によるプランジャー結合用溝がさらに形成された結合部材の別の例を示す下部斜視図である。 本発明に使用するためのプランジャーの他の形態を示す正面図である。 本発明に使用するためのプランジャーのさらに他の形態を示す正面図である。 本発明による結合部材に複数のプランジャーが結合された本発明による装置を示す斜視図である。

符号の説明

１ 自動化装置
１０、１０ａ、１０ｂ プランジャー
１２ ロッド
１４ ヘッド
１６ 弾性部材
２０、２０ａ 結合部材
３０ 反応容器又はチューブ

Claims (20)

1. ＰＣＲ用サーマルサイクラーに装着される多重ウェルプレートの複数のチューブ内の試料の蒸発及び／又は凝縮を最小化するための装置において、
   前記複数のチューブに各々対応する複数のプランジャーであって、所定の長さを有するロッドと、前記各々のチューブ内の試料液面上の空間を最小化するために、各々のチューブに密封式で嵌入されるように、前記ロッドの下端部に設けられた弾性部材とを備えて構成されるプランジャーと、
   前記複数のプランジャーが同時に結合されて固定される結合部材とを含むことを特徴とする装置。
2. 前記プランジャーの弾性部材は、シリコン或いはゴム材質のＯ-リングであることを特徴とする請求項１に記載の装置。
3. 前記プランジャーの弾性部材は、シリコン或いはゴム材質の栓体であることを特徴とする請求項１に記載の装置。
4. 前記各々のプランジャーは、各々のチューブ内への垂直移動のための作用力を容易に伝達するために、前記ロッドの上端部に設けられたヘッドをさらに備えることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の装置。
5. 前記結合部材には、チューブのチューブ形成位置に対応するように、プランジャーのヘッドが固着されることを特徴とする請求項４に記載の装置。
6. 前記結合部材には、チューブのチューブ形成位置に対応するように、プランジャーのロッドが挿入固定される複数の孔が形成されることを特徴とする請求項４に記載の装置。
7. 前記結合部材の上面において前記複数の孔の周辺部に、ヘッドの形状に対応する所定深さの複数の溝がさらに形成されることを特徴とする請求項６に記載の装置。
8. 前記ヘッドは、接着剤により前記溝に固着されることを特徴とする請求項７に記載の装置。
9. 前記孔に挿入固定される前記ロッドには、前記ヘッドに隣接した部分に上部から下部に行くほど細くなるテーパ状を有する円錐状突出部が設けられ、前記円錐状突出部は、前記結合部材の厚さに相当する距離だけヘッドから下向き離隔していて、その最上部の直径は、前記孔の直径よりも若干大きいことを特徴とする請求項６に記載の装置。
10. 前記弾性部材が反応チューブ内の所定位置に密着挿入されたとき、前記プランジャーは、前記結合部材の底面が前記チューブの上端開口から０.５ｍｍ乃至２０ｍｍの距離だけ離隔される長さを有するように構成されることを特徴とする請求項４に記載の装置。
11. 前記結合部材は、該結合部材に取り付けられる複数のプランジャーを同じ高さに維持するのに十分な剛性を有することを特徴とする請求項４に記載の装置。
12. 前記結合部材は、ＰＣＲサーマルサイクラーの多重ウェルプレート用入口の形状に対応することを特徴とする請求項１１に記載の装置。
13. 前記プランジャーは、ヘッドから弾性部材への熱伝逹を可能にし、その垂直移動に必要な力を十分に耐える材質で製造されることを特徴とする請求項４に記載の装置。
14. 前記プランジャーは、ＰＰ、ＰＳ、ステンレス鋼、アルミニウムなどの材質で製造されることを特徴とする請求項１３に記載の装置。
15. ８個、１２個、９６個、３８４個又は１５３６個のプランジャーが前記結合部材に固定されることを特徴とする請求項１に記載の装置。
16. 前記複数の孔は、８個、１２個、９６個、３８４個又は１５３６個が形成されていることを特徴とする請求項６に記載の装置。
17. 前記複数の溝は、８個、１２個、９６個、３８４個又は１５３６個が形成されていることを特徴とする請求項７に記載の装置。
18. チューブ内の試料の蒸発及び／又は凝縮を最小化するためのプランジャーにおいて、
    所定の長さ及び強さを有するロッドと、
    前記チューブ内の試料液面上の空間を最小化するために、チューブの内面に密封式で嵌入されるように、前記ロッドの下端部に設けられたＯ-リングとを備えることを特徴とするプランジャー。
19. 前記Ｏ-リングは、シリコン或いはゴム材質であることを特徴とする請求項１８に記載のプランジャー。
20. 前記プランジャーは、チューブ内への垂直移動のための作用力を容易に伝達するために、前記ロッドの上端部に設けられたヘッドをさらに含み、前記ヘッドは、前記ロッドよりも大きい断面積を有することを特徴とする請求項１８又は１９に記載のプランジャー。

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