JP2006071478A - 口腔内微生物濃度測定用の被検液の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 全歯面をブラッシングした歯ブラシを生理食塩水、リン酸バッファー等の液体と接触させて、該歯ブラシに付着している歯垢及び唾液を該液体中に分散及び/又は溶解させて被検液を調製する。刺激唾液を回収する方法と異なり、口腔機能が未熟または低下している被験者からも再現性よく定量の歯垢及び唾液が回収できる。得られた被検液から亜硝酸抽出法などにより抗原又は抗体を取り出し、該抗原又は抗体の量を免疫学的方法により測定すれば、迅速かつ正確に齲蝕関連菌などの口腔内微生物濃度が把握できる。
【選択図】 なし
Description
本発明の製造方法は、上記のような全歯面をブラッシングした歯ブラシを液体と接触させて、該歯ブラシに付着した歯垢を、該液体に分散及び/又は溶解させる。該液体としては、本発明の方法で製造した被検液中に含まれる口腔内微生物濃度を測定する際に、該測定を妨害するような物質を含まない液体であれば特に限定されるものではない。口腔内微生物濃度を測定する方法にもよるが、一般的には、精製水、生理食塩水、又はリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液等の従来公知の各緩衝液等の水系の液体が好適に使用可能である。このような水系の液体に対しては、唾液は溶解し、歯垢は分散されることになる。
(1)[菌体試料懸濁液の調製]
ブレインハートインフュージョン(以下「BHI」と略すこともある)(DIFCO社)3.7gを100mlの純水に溶解後、オートクレーブ処理し、BHI液体培地を調製した。BHI液体培地2ml中でIngbritt(ストレプトコッカス・ミュータンス、血清型c)を37℃、5時間、嫌気条件下(N2:H2:CO2=80:10:10)で培養した後、培養液を4000g、5分遠心処理し、上清の培地成分を除去し菌体沈殿を回収した。
免疫は以下のように実施した。即ち、第1週は0.5mlのIngbritt菌体試料懸濁液を、5日連続で5回ウサギに対し耳介静脈注射した。第2週は1.0mlの該菌体試料懸濁液を、5日連続で5回ウサギに対し耳介静脈注射した。第3週は2.0mlの該菌体試料懸濁液を、5日連続で5回ウサギに対し耳介静脈注射した。第4週は第3週と同様に免疫した。力価の上昇をスライドグラスを利用した菌体の凝集反応の程度により確認後、最終免疫より1週間後に、定法に従い採血しストレプトコッカス・ミュータンスに対する抗血清を得た。
オートクレーブ処理したBHI液体培地1L中でIngbrittを37℃、12時間、嫌気条件下で培養した。培養液を4000g、5分遠心処理し、上清の培地成分を除去し菌体沈殿を回収した。次いで、沈殿物を100mlのPBSに懸濁させて、同様の遠心分離をする操作を3回行い、沈殿物を洗浄した。
(1)〔金コロイド標識されたストレプトコッカス・ミュータンスに対する精製ポリクローナル抗体の調製〕
コロイド粒径が40nmの市販金コロイド溶液(British BioCell International社)10mlに100mMK2CO3を2μl添加し、pHを9.0に調製後、0.22μmフィルター処理した。金コロイド溶液の520nmの吸光度を測定したところ、A520=1.0であった。
以下の方法に従い、図4、図5に示す免疫クロマトグラフィー法テストストリップを作製した。
(1)〔被検体の調製〕
異なる4人の幼児(2〜3歳)の全歯面を歯ブラシにより60秒間ブラッシングした。ブラッシングは朝食前に成人の術者により実施した。歯ブラシを2mlの滅菌処理した生理食塩水で漱ぐことにより、歯ブラシに付着した歯垢と唾液を懸濁し、歯垢懸濁液を調製した。歯垢懸濁液を20秒間、60Wで超音波処理し歯垢を含む被検体1を得た。該被検体は氷冷後直ちに使用した。同様にして、被検体1の採取日の翌日、翌々日に同一の被験者より被検体2(翌日)、被検体3(翌々日)をそれぞれ採取した。
上記(1)の方法に従い作製した被検体1、2及び3を各々滅菌処理した生理食塩水にて10〜103倍希釈し、50μlの該希釈液をMSB培地プレートにプレーティングし、2日間ローソク培養した。生じたコロニー数を数え、希釈倍率を乗じることで被検体中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度(cfu/ml)を算出した。MSB固体培地上には主としてストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスが、また、一部の口腔内細菌が生育する。コロニーの形態学的分類、及び形態学的に識別不可能なコロニーに関しては、該コロニーを純粋培養後、ミュータンスレンサ球菌の血清型特異的な抗体を利用した免疫学的測定方法及び、糖発酵試験等の生化学的方法により、ストレプトコッカス・ミュータンスをストレプトコッカス・ソブリヌス及び他の口腔内細菌と識別し、ストレプトコッカス・ミュータンス濃度を測定した。結果を表1に示す。
13mmシリンジフィルタ(ワットマン社、ガラス繊維濾紙GF/C、粒子保持能1.2μm)の濾過液排出口2の先端部に、図6に示すような濾過液排出口の内面側と外面側を連通する0.5mm×0.5mmの正方形の切り込み11bを2箇所設け、シリンジフィルター10を作製した。このシリンジフィルター10にシリンジ9(テルモ社、2.5ml)をセットし、図2の構造の濾過装置を作製した。
上記(3)で使用したシリンジ9からシリンジフィルター10を外した。製造例2の(2)で作製した免疫クロマトグラフィー法テストストリップのサンプルパッド18に、該シリンジ9内の抽出液を0.1ml添加し、10分後の検出部位20及びコントロール判定部位21の発色の有無と強度を判定した。判定は、検出部位20の発色強度を4段階(+++:発色強度が強い、++:発色強度が中程度、+:発色強度が弱い、−:発色しない)に目視で識別した。尚、コントロール判定部位21が発色しない場合は、金コロイド標識抗体の展開が不良であることを示すので、再度分析した。結果を表2に示す。
(1)〔被検体の調製と培養法による測定〕
実施例1と同一の被験者A及びCの歯を、歯ブラシを用いて全歯面を1分間ブラッシングした。ブラッシングは朝食前に成人の術者により実施した。被験者の口腔内に5mlの滅菌した生理食塩水を含ませ、この歯垢を含む生理食塩水を滅菌処理した容器に吐き出させ回収した。この回収した生理食塩水にてブラッシングに使用した歯ブラシを漱ぎ、容器壁に歯ブラシを押し付け歯ブラシに付いた溶液も回収した。回収した歯垢を含む生理食塩水を20秒間、60Wで超音波処理し歯垢を含む被検体を得た。該被検体は氷冷後直ちに実施例1(2)と同様の方法により培養した。被検体4の採取日の翌日、翌々日に同一の被験者より上記の方法に従い被検体5、被検体6をそれぞれ採取し、これらの被検体中のミュータンスレンサ球菌数を上記と同様に算出した。結果を表3に示す。
(2)〔免疫クロマトグラフィー法テストストリップによるストレプトコッカス・ミュータンスの測定〕
実施例1(3)と同様の方法により上記(1)で採取した被検体(0.2mlより抗原抽出液を調製し、実施例1(4)と同様の方法により免疫クロマト法にて分析した。結果を表4に示す。
(1)〔被検体の調製〕
実施例1と同一の被験者B及びDより、全歯面を滅菌処理した綿棒で3回擦る操作により歯垢を採取した。この、歯垢の付着した綿棒を2mlの滅菌処理した生理食塩水中で3分間振動し、綿棒に付着した歯垢を懸濁させた。この歯垢を含む生理食塩水を20秒間、60Wで超音波処理し歯垢を含む被検体4を得た。該被検体は氷冷後直ちに使用した。該被検体は氷冷後直ちに実施例1(2)と同様の方法により培養した。被検体4の採取日の翌日、翌々日に同一の被験者より上記の方法に従い被検体5、被検体6をそれぞれ採取し、これらの被検体中のミュータンスレンサ球菌数を上記と同様に算出した。結果を表3に示す。
(2)〔免疫クロマトグラフィー法テストストリップによるストレプトコッカス・ミュータンスの測定〕
実施例1(3)と同様の方法により上記(1)で採取した被検体(1.95mlより抗原抽出液を調製し、実施例1(4)と同様の方法により免疫クロマト法にて分析した。結果を表4に示す。
2・・・濾過液排出口
3・・・濾過膜
4・・・濾過膜収納部
5・・・接続部
6・・・小空間
7・・・シリンジ外筒
8・・・プランジャー
9・・・シリンジ
10・・・シリンジフィルター
11a・・・孔
11b・・・切り込み
12・・・吸排液部
13・・・容器
14・・・設置部
15a・・・器部
15b・・・器部
15c・・・器部
16・・・ニトロセルロースメンブレン
17・・・コンジュゲートパッド
18・・・サンプルパッド
19・・・吸収パッド
20・・・検出部位
21・・・コントロール判定部位
Claims (2)
- 全歯面をブラッシングした歯ブラシを液体と接触させ、該歯ブラシに付着している歯垢及び唾液を該液体中に分散及び/又は溶解させることを特徴とする口腔内微生物濃度測定用の被検液の製造方法。
- (1)全歯面をブラッシングした歯ブラシを液体と接触させ、該歯ブラシに付着している歯垢及び唾液を該液体中に分散及び/又は溶解させて被検液を得、(2)該被検液を、被濾過液供給室と濾過液排出口とが濾過膜を介して連通しており、被濾過液供給室の上流に陰圧手段を備えた濾過装置により濾過して、被検液中に存在する微生物を濾過膜上に捕捉し、次いで、(3)上記陰圧手段により濾過装置内を陰圧にして、濾過液排出口より抽出用溶液を吸液して該濾過装置内を逆流させ、被濾過液供給室に微生物抗原の抽出液を貯留することを特徴とする口腔内微生物濃度測定用の抗原抽出液の製造方法。
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