JP2006053085A - 環状突起体を有するキャピラリー - Google Patents

Abstract

【課題】蛋白質結晶のＸ線結晶解析を行うに当たり、蛋白質結晶を崩壊させることなく、かつ該結晶を結晶母液のない状態で凍結させる。
【解決手段】一方の端部に内径５０〜１０００μｍの環状突起体を備えたキャピラリーに母液を含む結晶をすくい取り、母液を吸引除去すると同時に結晶を凍結し、環状突起を屈曲し、Ｘ線結晶回折測定を行う。
【選択図】図４

Description

本発明は、化学物質の結晶、特に蛋白質の結晶を結晶母液から回収し急速冷凍するための用具、ならびに該用具を用いた蛋白質結晶のＸ線結晶回折測定方法に関する。

蛋白質の立体構造を実験的に解明する手段の一つが、蛋白質結晶のＸ線結晶回折測定法である。この方法は、蛋白質の結晶にＸ線を照射し、結晶を通過する際の回折像を測定解析することにより、蛋白質を構成するアミノ酸残基の３次元配置を決定する方法である。

蛋白質の結晶を対象としたＸ線解析では、低分子化合物や無機物を対象とした結晶解析とは異なり、蛋白質結晶の特徴に起因する、留意すべき事項が存在する。

一般に結晶母液と称される溶液中で形成される蛋白質結晶は、結晶化溶媒を多量に含んでいる。これは非常に弱い力で蛋白質結晶内に拘束されており、事実上自由水に近い。それ故、蛋白質結晶は、空気中に晒されると結晶化溶媒を失って簡単に崩壊してしまう。

また、Ｘ線結晶解析では、直接蛋白質結晶にＸ線を照射するために、蛋白質結晶の放射線損傷という不可避のダメージを受ける。さらに、蛋白質結晶はそれ自身極めて脆く、回収時の衝撃により、容易に崩壊してしまう。

上記の放射線損傷を最小にするため、蛋白質結晶の解析では、結晶母液から回収した結晶を１００Ｋ（約−１８０℃）で急速冷凍する方法（クライオクーリング）が採用される。さらに、乾燥あるいは衝撃による結晶の崩壊を回避するため、従来は、結晶母液中にある蛋白質結晶を、１０〜２０μｍ径のナイロン製ファイバーを１００〜１０００μｍ程度の環状体（ループ）とした器具（例えば米国ハンプトンリサーチ社製のクライオループ（ＣｒｙｏＬｏｏｐｓ）、図１）を用い、これで結晶母液中の蛋白質結晶を結晶母液ごと掬って回収し、これをそのまま急速凍結して測定に供していた。

このループを用いた結晶母液中の蛋白質結晶の回収方法では、一般に粘度の高い溶液である結晶母液と微小なループとの表面張力によって、ループ内部に結晶母液ごと結晶が掬われ回収されるので、回収から凍結に至るまでの間の蛋白質結晶の乾燥を防止することが出来るなどの利点を有している。

しかしながら、近年開発された、物質と相互作用の大きい長波長（例えば２．２９Å）のＸ線を用いた蛋白質結晶構造解析方法には、この従来法で回収、凍結した蛋白質結晶を直ちに用いることは難しい。何故なら、この長波長のＸ線は物質に吸収されやすいために、蛋白質結晶の周りに表面張力によってレンズ状に存在する凍結された結晶母液あるいはループにＸ線が吸収されてしまい、測定精度が極端に低下するためである（図２）。

従って、従来法と同程度に迅速かつ簡便に蛋白質結晶を回収できるとともに、回収した蛋白質結晶のみを「裸」状態で凍結し、測定に供することのできる方法が望まれていた。

本発明は、従来法で使用されてきたループと同様の環状突起体を一端に設けた中空キャピラリーを用意することで、上記課題を解決するものである。

すなわち、本発明は、一方の端部に内径５０〜１０００μｍの環状突起体を備えたキャピラリーに関する。特に、本発明は、環状突起体が端部より切除、屈曲もしくは抜去可能に備えられているキャピラリーに関する。またもうひとつの本発明は、該キャピラリーを用いて蛋白質結晶を結晶母液から環状突起体内に回収する工程、環状突起体から結晶母液を吸引除去する工程、ならびにキャピラリー先端に回収される結晶を急速凍結する工程を含む方法を含む、蛋白質結晶のＸ線解析測定方法に関する。

本発明のキャピラリーの代表的な構成を図３−１〜４に示す。図３−１は本発明のキャピラリーの全体を、図３−２〜４はキャピラリーの環状突起体部分をそれぞれ示す。

図中のａは１０〜２０μｍのナイロン製ファイバーからなる直径約１００μｍの環状突起体であり、ｂは他端ｂ２における直径約０．６ｍｍの貫通孔を有する、一端ｂ１の外径が１００〜２００μｍ、他端ｂ２の外径が約１．０ｍｍ、長さ約１ｃｍのガラス製キャピラリーである。

環状突起体ａは、同内に表面張力によって回収される結晶母液がキャピラリー端ｂ１の貫通孔に接触可能な位置となるように、キャピラリーｂの一端ｂ１側に接着剤によって接着されている（図３−２）。

本発明のキャピラリーの使用方法は次の通りである（図３−３、３−４、図４）。まず、蛋白質結晶を環状突起体ａ内に結晶母液とともに掬い、回収する。これをＸ線結晶解析装置のゴニオヘッドにセットし、キャピラリーの他端ｂ２側から提供される吸引力により突起体内部の結晶母液をキャピラリーｂの貫通孔に吸引除去するとともに、その母液の移動によって蛋白質結晶をキャピラリーの一端ｂ１の貫通孔上部に固定させる（図３−３）。固定の後あるいは固定と同時に、キャピラリーの一端ｂ１に液体窒素ガスを噴霧して蛋白質結晶を凍結する。そして、凍結した結晶の周囲に存する環状突起体ａをフック状の針金等を利用して屈曲させる（図３−４）か、あるいは切断除去するなどして、蛋白質結晶の周囲から突起体を排除し、キャピラリー先端に回収凍結された蛋白質結晶に向けてＸ線照射を行うというものである。

本発明では、蛋白質結晶は、従来法と同様に環状突起体内に結晶母液ごと掬われ回収されるので、当業者にとっての通常の操作として迅速に行うことができるとともに、結晶母液によって蛋白質結晶の乾燥崩壊を防止することが出来る。さらに、この回収された結晶母液は、他端に連結された吸引手段によってキャピラリーの貫通孔を通じて除去されるとともに、結晶母液中に浮遊している蛋白質結晶はキャピラリー貫通孔の上部に移動して固定化されるので、蛋白質結晶のみを残してその周囲から結晶母液を簡便に排除することが可能となる。また、この結晶母液の吸引除去と蛋白質結晶の凍結とは実質上殆ど同時に行われるので、かかる段階でも蛋白質結晶が乾燥崩壊することはない。

また、凍結後、キャピラリーの先端に突出しているループは、フック状の針金その他の適当な手段を用いて屈曲させる、あるいはキャピラリーから切り離す、あるいは抜去する等によって、キャピラリーの先端部から容易に排除することが出来るので、蛋白質結晶に対して周囲から照射されるＸ線の障害となることはなく、蛋白質結晶を「裸」の状態で長波長のＸ線解析に供することができる。

本発明は、極めて簡便かつ速やかに凍結された蛋白質結晶のみを「裸」状態でキャピラリーの先端に置くことができる、蛋白質結晶の乾燥崩壊あるいは損傷崩壊を防ぐことができる、長波長のＸ線を照射することでより精度の高い結晶解析を行うことができる、等の優れた効果を提供することができる。

本発明で使用される環状突起体は、蛋白質結晶を回収するに好適な径、例えば直径約５０〜１０００μｍの環状体を形成することのできる材質であれば、如何なるものでも使用することができる。典型的には、米国ハンプトンリサーチ社から市販されているナイロンファイバー製ループ（商品名クライオループ）をそのまま用いることができるが、同程度の大きさの既成の環状体であれば、いずれも利用することができる。

環状体とキャピラリーは、典型的には接着剤によって接着させればよいが、溶接でも、勘合でも、化学的あるいは物理的な任意の手段により一体化させることができる。

あるいは、環状突起体はキャピラリーと一体成型させて設けてもよい。例えば、ガラスキャピラリーの場合、その先端に所望の大きさのガラス製環状突起体を一体的に成型すればよく、そのような環状突起体は、後に容易に切断あるいは破断させて除去することができる点で有利である。

キャピラリーに関しては、これを構成する材質に特に制限はなく、ガラス、プラスチック、金属等、いずれも使用することができるが、加工性の点で、ならびに、先端に凍結固定化される蛋白質結晶に向けてＸ線が照射されることから、このＸ線に対して干渉しないという点で、ガラスでできたキャピラリーであることが好ましい。

キャピラリーの外径および貫通孔の直径は、回収しようとする蛋白質結晶の大きさに合わせて、適宜決定することができるが、概ね外径は１００〜３００μｍ、内径は５０〜２００μｍであれば、多くの蛋白質結晶に対して利用可能である。

キャピラリーの他端に連結する吸引手段は、フットポンプなどを使用することができるが、途中に結晶母液をトラップする適当な部材を設けたチューブを本発明のキャピラリーあるいは該キャピラリーを備えることのできる適当なアダプターに接続し、このチューブの他端から作業者自身が口で吸引しても良い。特に金属製のアダプターを用いることで、Ｘ線結晶解析装置のゴニオヘッドに直接設置することが可能となる。

キャピラリーの製造
外径１ｍｍ、内径０．６ｍｍ、長さ９ｃｍのガラス製チューブの中間部を電熱線で炙って引き伸ばし、一端の外径を１００〜２００μｍ、内径を５０〜１００μｍへと変形させてガラス製キャピラリーを用意した。米国ハンプトンリサーチ社製のナイロン製ファイバーループ（ファイバー径２０μｍ、ループ内径２００〜３００μｍ）を、ループ内側にキャピラリーの一端先端が向いた配置となるように、ファイバーループの連環部を接着剤を用いてキャピラリーの一端側に接着して、本発明のキャピラリーを製造した。さらにキャピラリーの他端を、吸引口を突出して供えた金属アダプターに備え付け、テフロンチューブを吸引口に連結させた。

微細キャピラリーを用いた蛋白質結晶の回収とＸ線解析
塩化ナトリウム及び酢酸緩衝液からなる結晶母液中にあるニワトリ卵白リゾチームの結晶（縦、横、高さ約０．２ｍｍの概略長方形の結晶）を、実施例１で作成したキャピラリーで掬い取った。テフロンチューブの端を口にくわえて吸引し、ループ内部の結晶母液を吸引除去すると同時に、キャピラリー先端に１００Ｋ（ケルビン）の液体窒素ガスを噴霧し、結晶を凍結した。凍結後、針金の先端を鈎針状に変形させた針金をループにかけて屈曲固定し、この状態のまま、Ｘ線結晶解析装置にセットして、測定を開始した。

上記の操作によって調製した結晶と、従来の方法により調製した、凍結された結晶母液が取り囲んでいる状態のニワトリ卵白リゾチーム結晶とを用意し、それぞれに対して波長２．２９ÅのＸ線を照射して得られる回折データを測定した際の、結晶の方位と回折データ強度の補正係数との関係を、図５に表す。同図から明らかなように、本発明の方法で調製した結晶は、結晶の方位によらず補正係数がほぼ一定の値となっており、より精度の高いデータを与えた。

図１は、従来用いられているナイロンファイバー製ループを表す。 図２は、従来法のループで回収された蛋白質結晶の環境を示す。 図３−１は、本発明のキャピラリーの全体を表す。 図３−２は、本発明のキャピラリーの先端部を表す。 図３−３は、本発明のキャピラリーの先端部を表す。 図３−４は、本発明のキャピラリーの先端部を表す。 図４は、本発明のキャピラリーの使用例を表す。 図５は、本発明の方法で測定したときの結晶の方位と回折データ強度の補正係数との関係を表す。

Claims (4)

1. 一方の端部に内径５０〜１０００μｍの環状突起体を備えたキャピラリー。
2. 環状突起体が切除、屈曲もしくは抜去可能に備えられている、請求項１に記載のキャピラリー。
3. 環状突起体ならびにキャピラリーがナイロンファイバーならびにガラスからそれぞれなる、請求項１または２に記載のキャピラリー。
4. 請求項１〜３のいずれかに記載のキャピラリーを用いて蛋白質結晶を結晶母液から環状突起体内に回収する工程、環状突起体から結晶母液をキャピラリー内へ吸引除去する工程、ならびにキャピラリー先端の蛋白質結晶を急速凍結する工程を含む、蛋白質結晶のＸ線回折測定方法。

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