JP2006006143A - 伝染性膿痂疹の診断方法および診断キット、ならびにこれらに用いるポリペプチドおよび抗体 - Google Patents

Abstract

【課題】 表皮剥脱毒素を定量的に検出して伝染性膿痂疹を診断するための方法およびキットを提供する。
【解決手段】 表皮剥脱毒素を簡易迅速定量的に検出するための基質タンパク質を取得する。特に、特定のアミノ酸配列の２４０〜３８５位を含むヒトＤｓｇ１ポリペプチドを発現する発現ベクターを構築して、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて大量発現し得るヒトＤｓｇ１ポリペプチドを取得する。該ポリペプチド並びにその抗体を用いた表皮剥脱毒素の測定方法および測定キットを提供する。
【選択図】 なし

Description

本発明は、表皮剥脱毒素の標的基質タンパク質Ｄｓｇ１を用いる毒素の簡易迅速測定方法に関するものである。

黄色ブドウ球菌は、ヒトにおいて化膿性炎などの多様な疾患を引き起こす代表的な病原性細菌の１つである。黄色ブドウ球菌に基づく疾患の１つとして、伝染性膿痂疹が知られている。伝染性膿痂疹は、水疱形成を特徴とする皮膚疾患であり、一般的に「飛び火」と呼ばれている。「飛び火」という呼称は、掻痒感のために患部を掻くと、主に手指を介して水疱形成が広がっていくことに起因している。罹患するのは主に新生児、幼児から小児までであり、成人が罹患する例は稀である。しかし、免疫不全症もしくは基礎疾患の起因して抵抗力が低下した成人、または老人にも感染することが知られている。「飛び火」は、皮膚科または小児科において、梅雨時期から秋口までの間に特に多く見られる非常に主要な疾患である。

皮膚に水疱が生じる疾患は数多く認められ、例えば、感染症、自己免疫性疾患、アレルギーなどが挙げられる。これらの疾患に応じて治療方針が異なる。飛び火の場合、抗菌治療が中心であるが、そのためには他の疾患との識別が重要である。

黄色ブドウ球菌感染による水疱形成は、菌が産生するタンパク質毒素である「表皮剥脱毒素（Ｅｘｆｏｌｉａｔｉｖｅ Ｔｏｘｉｎ（ＥＴ））」の作用によって表皮内で剥離が生じることに起因することが明らかになっている。ＥＴの表皮剥脱活性は、１９７０年代に米国において見出された。黄色ブドウ球菌の培養濾液を新生児マウスに投与すると、ヒトで観察される表皮剥脱と同様の症状が観察された。その後、表皮剥脱活性を有するタンパク質が分離、精製されて表皮剥脱毒素と名付けられた。

表皮剥脱毒素は、分子量約２７，０００のポリペプチドであり、古典的には、血清型に基づいてＥＴＡおよびＥＴＢに分類されている。表皮剥脱毒素のアミノ酸配列が同定され、その配列相同性からキモトリプシン様タンパク質分解酵素であることが示唆された。また、表皮剥脱毒素は、公知のセリンプロテアーゼにおいて保存されている活性基（Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｐの３つのアミノ酸からなる触媒トライアッド（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄ））を保有する。さらに、ＥＴＡおよびＥＴＢの結晶構造解析は、表皮剥脱毒素がタンパク質分解酵素として機能することを支持する。

近年、本発明者らの研究室において、新たな血清型を有するＥＴＤが見出され、現在までに、ヒトに感染する黄色ブドウ球菌が産生する表皮剥脱毒素として３種類の血清型が存在することが知られている。

２０００年には、ＥＴＡの標的基質タンパク質が表皮細胞デスモゾームタンパク質デスモグレイン（Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ）１（Ｄｓｇ１）であることが明らかにされ、ＥＴＡがインビトロでＤｓｇ１を切断する活性（タンパク質分解酵素活性）を有することが示された（非特許文献１を参照のこと）。デスモグレインは、表皮細胞の細胞間接着に関与し、Ｄｓｇ１およびＤｓｇ３が知られているが、表皮剥脱毒素は、Ｄｓｇ１のみを基質とし、選択的に消化および切断する。また本発明者らは、ＥＴＡだけではなくＥＴＢおよびＥＴＤもまた、Ｄｓｇ１の同一部位（ＶＬＮＶＩＥ^*ＧＰＶＦＲＰ（配列番号３７）：^*は切断部位を示す）を消化および切断することを示した（非特許文献２を参照のこと）。

現在までに、この表皮の剥離を引き起こす表皮剥脱毒素のタンパク質分解酵素活性は、極めて特異性が高いこと、および、表皮細胞の細胞間接着に関与するタンパク質Ｄｓｇ１を消化および切断して、表皮細胞の細胞間接着に異常を引き起こすことが知られてきた。また、従来の表皮剥脱毒素（ＥＴＡおよびＥＴＢ）に関する識別診断には、患部から菌体を採取して培養し、当該毒素に対する抗体によって毒素を検出する診断方法が用いられてきた。
「Ｔｏｘｉｎ ｉｎ ｂｕｌｌｏｕｓ ｉｍｐｅｔｉｇｏ ａｎｄ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｓｃａｌｄｅｄ ｓｋｉｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｔａｒｇｅｔｓ ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ １．」、Ａｍａｇａｉ，Ｍ．，Ｍａｔｓｕｙｏｓｈｉ，Ｎ．，Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｈ．，Ａｎｄｌ，Ｃ．，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｊ．Ｒ．：Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６，１２７５−１２７７（２０００） 「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｅｔｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｓｌａｎｄ ｗｈｉｃｈ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｅｘｆｏｌｉａｔｉｖｅ ｔｏｘｉｎ，ＥＴＤ，ａｎｄ ＥＤＩＮ−Ｂ．」（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｔ．，Ｎｉｓｈｉｆｕｊｉ，Ｋ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｍ．，Ｆｕｄａｂａ，Ｙ．，Ａｅｐｆｅｌｂａｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｔａｋａｔａ，Ｔ．，Ｏｈａｒａ，Ｍ．，Ｋｏｍａｔｓｕｚａｗａ，Ｈ．，Ａｍａｇａｉ，Ｍ．，Ｓｕｇａｉ，Ｍ．：Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０，５８３５−５８４５（２００２））

しかしながら、新規毒素ＥＴＤが発見されたことは、さらなる未知の毒素の存在が存在する可能性を示唆するので、従来の診断方法の適用範囲は限定される危険性がある。上記の従来の診断方法の欠点を補うための新たな診断アッセイとして、表皮剥脱毒素の基質タンパク質であるヒトＤｓｇ１タンパク質を用いる酵素アッセイが提案されているが、当該アッセイを実施するためには十分量の基質Ｄｓｇ１タンパク質が必要である。しかし、基質タンパク質であるヒトＤｓｇ１タンパク質を大量生成することは困難であった。つまり、表皮剥脱毒素を迅速かつ簡便に検出する方法、および定量的に表皮剥脱毒素を測定する方法は、存在しなかった。

本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、表皮剥脱毒素感受性が高く大量生産可能なヒトＤｓｇ１ポリペプチドを見出すことである。このようなポリペプチドを用いることによってヒトＤｓｇ１タンパク質を用いる酵素アッセイの感度を向上させることができる。

また本発明は、基質タンパク質であるヒトＤｓｇ１ポリペプチドを大量生成する方法、表皮剥脱毒素によるヒトＤｓｇ１タンパク質の切断を効率よく検出する方法、および被験体中に存在する表皮剥脱毒素を定量的に測定する方法を提供することを目的とする。換言すれば、本発明の目的は、表皮剥脱毒素の基質タンパク質であるヒトＤｓｇ１タンパク質を用いる酵素アッセイを利用する、より感度の高い伝染性膿痂疹の診断方法および診断キットを供給することである。

本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４０〜３８５位を含むことを特徴としている。

上記の構成によれば、本発明に係るポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現し得るという効果を奏する。さらに、本発明に係るポリペプチドは、表皮剥脱毒素感受性が高いという効果を奏する。

本発明に係るポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現し得るポリペプチドであって、
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０〜５４５位；または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０〜５４５位において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなるポリペプチドあるいはそのフラグメントでありかつ配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４０〜３８５位を含むことを特徴としている。

本発明に係るポリペプチドは、
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０〜５４５位からなるポリペプチドまたはそのフラグメントでありかつ配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４０〜３８５位を含むことを特徴とするポリペプチド；あるいは
（Ｂ）上記（Ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現し得ることを特徴としている。

本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０〜５４５位からなるポリペプチドまたはそのフラグメントでありかつ配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４０〜３８５位を含むことを特徴としている。

本発明に係るポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現し得るポリペプチドであって、
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０〜５４５位；
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０〜５４５位において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１９０〜５４５位；
（Ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１９０〜５４５位において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
（Ｅ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の２２１〜５４５位；
（Ｆ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の２２１〜５４５位において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
（Ｇ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４０〜５４５位；
（Ｈ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４０〜５４５位において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列；
（Ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０〜３８５位；または
（Ｊ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０〜３８５位において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなることを特徴としている。

本発明に係るポリペプチドは、配列番号９、１１、１３、１５または１７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなることを特徴としている。

本発明に係るポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現し得るポリペプチドであって、配列番号２に示される塩基配列の７９５〜１２３２位を含むポリヌクレオチドによってコードされることを特徴としている。

上記の構成によれば、本発明に係るポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現し得るという効果を奏する。さらに、本発明に係るポリペプチドは、表皮剥脱毒素感受性が増大するという効果を奏する。

本発明に係るポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現し得るポリペプチドであって、
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の５５５〜１７１２位；または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の５５５〜１７１２位において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列；
からなるポリヌクレオチドあるいはそのフラグメントでありかつ配列番号２に示される塩基配列の７９５〜１２３２位を含むポリヌクレオチド
によってコードされることを特徴としている。

本発明に係るポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現し得るポリペプチドであって、
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の５５５〜１７１２位からなるポリヌクレオチドまたはそのフラグメントでありかつ配列番号２に示される塩基配列の７９５〜１２３２位を含むポリヌクレオチド；あるいは、
（Ｂ）上記（Ａ）のポリヌクレオチドの塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリヌクレオチド
によってコードされることを特徴としている。

本発明に係るポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現し得るポリペプチドであって、
配列番号２に示される塩基配列の５５５〜１７１２位からなるポリヌクレオチドあるいはそのフラグメントであり、かつ配列番号２に示される塩基配列の７９５〜１２３２位を含むポリヌクレオチド
によってコードされることを特徴としている。

本発明に係るポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現し得るポリペプチドであって、
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の５５５〜１７１２位；
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の５５５〜１７１２位において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列；
（Ｃ）配列番号２に示される塩基配列の６４５〜１７１２位；
（Ｄ）配列番号２に示される塩基配列の６４５〜１７１２位において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列；
（Ｅ）配列番号２に示される塩基配列の７０８〜１７１２位；
（Ｆ）配列番号２に示される塩基配列の７０８〜１７１２位において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列；
（Ｇ）配列番号２に示される塩基配列の７９５〜１７１２位；
（Ｈ）配列番号２に示される塩基配列の７９５〜１７１２位において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列；
（Ｉ）配列番号２に示される塩基配列の５５５〜１２３２位；または
（Ｊ）配列番号２に示される塩基配列の５５５〜１２３２位において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、
からなるポリヌクレオチド
によってコードされることを特徴としている。

本発明に係るポリペプチドは、配列番号１０、１２、１４、１６または１８のいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされる
ことを特徴としている。

本発明に係るポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドをコードすること、あるいは、上記ポリペプチドをコードする特徴とするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＥ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現し得るポリペプチドをコードすること、を特徴としている。

上記の構成によれば、本発明に係るポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現し得るポリペプチドをコードするという効果を奏する。さらに、本発明に係るポリヌクレオチドは、表皮剥脱毒素感受性が増大したヒトＤｓｇ１ポリペプチドをコードするという効果を奏する。

本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号２に示される塩基配列の７９５〜１２３２位を含むことを特徴としている。

上記の構成によれば、本発明に係るポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現し得るポリペプチドをコードするという効果を奏する。さらに、本発明に係るポリヌクレオチドは、表皮剥脱毒素感受性が高いヒトＤｓｇ１ポリペプチドをコードするという効果を奏する。

本発明に係るポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号２に示される塩基配列の５５５〜１７１２位からなるポリヌクレオチドあるいはそのフラグメントでありかつ配列番号２に示される塩基配列の７９５〜１２３２位を含むことを特徴としている。

本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１０、１２、１４、１６または１８のいずれか１つに示される塩基配列からなることを特徴としている。

本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号２３〜３４のいずれか１つに示される塩基配列を含むことを特徴としている。

上記の構成によれば、本発明に係るポリヌクレオチドは、ＰＣＲプライマーとして使用した場合にＥ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現し得るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを増幅するという効果を奏する。

本発明に係るベクターは、上記ポリヌクレオチドを含むことを特徴としている。

上記の構成によれば、本発明に係るベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現し得るポリペプチドを作製することができるという効果を奏する。

本発明に係るベクターは、発現ベクターであることが好ましい。

本発明に係るベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターであることが好ましい。

本発明に係る細胞は、上記ベクターを含有することを特徴としている。

上記の構成によれば、本発明に係る細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現し得るポリペプチドを作製することができるという効果を奏する。

本発明に係る細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉであることが好ましい。

本発明に係るポリペプチド生成方法は、上記ベクターを用いることを特徴としている。

上記の構成によれば、本発明に係るポリペプチド生成方法は、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現し得るポリペプチドを作製することができるという効果を奏する。

本発明に係るポリペプチド生成方法において、上記ベクターが、ヒスチジンタグおよびチオレドキシンタグを付加させることが好ましい。

本発明に係るポリペプチド生成方法は、Ｈｉｓタグとの親和性樹脂を用いて精製する工程をさらに包含し、当該工程においてイミダゾールを使用しないことが好ましい。

本発明に係るポリペプチド生成方法は、インビトロ翻訳に必要な酵素をさらに用いることが好ましい。

本発明に係る表皮剥脱毒素の測定キットは、上記ポリペプチドを備えることを特徴としている。

上記の構成によれば、本発明に係る表皮剥脱毒素の測定キットを用いれば、被験体（特に、水疱形成を生じる患者）が黄色ブドウ球菌を保有するか否かを簡便に同定できるという効果を奏する。

本発明に係る表皮剥脱毒素の測定キットは、上記ポリペプチドに対する抗体または上記ポリペプチドに連結した標識に対する抗体をさらに備えることが好ましい。

本発明に係る表皮剥脱毒素の測定方法は、
（１）被験体サンプルを上記ポリペプチドとインキュベートする工程；および
（２）当該インキュベートする工程において切断された当該ポリペプチドを検出する工程、
を包含することを特徴としている。

上記の構成によれば、本発明に係る表皮剥脱毒素の測定方法は、被験体（特に、水疱形成を生じる患者）が黄色ブドウ球菌を保有するか否かを簡便に同定できるという効果を奏する。

本発明に係る表皮剥脱毒素の測定方法は、上記検出する工程が、上記ポリペプチドに対する抗体または上記ポリペプチドに連結した標識に対する抗体を用いることが好ましい。

本発明に係る抗体は、上記ポリペプチドと特異的に結合することを特徴としている。

本発明に係る抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の３７７〜３８１位と特異的に結合することが好ましい。

上記の構成によれば、本発明に係る抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の３７７〜３８１位に特異的に結合できるという効果を奏する。

本発明に係る抗体を生成する方法は、追加免疫を５回以上行なうことを特徴としている。

上記の構成によれば、本発明に係る抗体を生成する方法は、上記ポリペプチドと特異的に結合する抗体を生成することができるという効果を奏する。

本発明に係る表皮剥脱毒素の測定キットは、上記抗体を備えることを特徴としている。

上記の構成によれば、本発明に係るを用いれば、被験体（特に、水疱が形成した患者）が黄色ブドウ球菌を保有するか否かを簡便に同定できるという効果を奏する。

本発明に係る表皮剥脱毒素の測定キットは、上記抗体に対する抗体または上記抗体に連結した標識に対する抗体をさらに備えることが好ましい。

本発明に係る表皮剥脱毒素の測定方法は、
（１）被験体サンプルを上記抗体とインキュベートする工程；および
（２）上記抗体と結合した物質を検出する工程、
を包含することを特徴としている。

上記の構成によれば、本発明に係る表皮剥脱毒素の測定方法は、被験体（特に、水疱形成を生じる患者）が黄色ブドウ球菌を保有するか否かを簡便に同定できるという効果を奏する。

本発明に係る表皮剥脱毒素の測定方法において、上記検出する工程が、上記抗体に対する抗体または上記抗体に連結した標識に対する抗体を用いることが好ましい。

本発明に係る細菌検出器具は、上記ポリペプチドが支持体上に固定化されていることを特徴としている。

上記の構成によれば、本発明に係る細菌検出器具を用いれば、複数の被験体をスクリーニングして表皮剥脱毒素を産生する黄色ブドウ球菌を保有する被験体を同定することができるという効果を奏する。さらに他種の細菌を網羅的に検査する場合は、表皮剥脱毒素を産生する黄色ブドウ球菌がどのような細菌種と共存する傾向があるかを知ることができるという効果を奏する。

本発明に係る表皮剥脱毒素のスクリーニング方法は、
（１）被験体サンプルを上記ポリペプチドとインキュベートする工程；および
（２）当該インキュベートする工程において切断された当該ポリペプチドを検出する工程、
を包含することを特徴としている。

上記の構成によれば、本発明に係る表皮剥脱毒素のスクリーニング方法は、被験体（特に、水疱形成を生じる患者）に存在する黄色ブドウ球菌の産生する表皮剥脱毒素が新規であるか否かを簡便に同定できるという効果を奏する。

本発明に係る表皮剥脱毒素のスクリーニング方法は、
（１）被験体サンプルを上記抗体とインキュベートする工程；および
（２）上記抗体と結合した物質を検出する工程、
を包含することを特徴としている。

上記の構成によれば、本発明に係る表皮剥脱毒素のスクリーニング方法は、表皮剥脱毒素の存在を検出するとともに、既知の表皮剥脱毒素と比較することによって新たな表皮剥脱毒素を見出すことができるという効果を奏する。

本発明に係る表皮剥脱毒素のスクリーニング方法は、切断されたポリペプチドが検出された被験体サンプルを表皮剥脱毒素に対する抗体とインキュベートする工程をさらに包含することが好ましい。

本発明に係る表皮剥脱毒素のスクリーニング方法は、被験体サンプルから単離した表皮剥脱毒素を配列決定して既知の表皮剥脱毒素の配列と比較する工程をさらに包含することが好ましい。

本発明に係る表皮剥脱毒素の測定方法によれば、迅速かつ簡便に表皮剥脱毒素を検出および定量的に測定することができ、その結果、伝染性膿痂疹の進行度を数値化することができるので、伝染性膿痂疹の処置に用いる抗生物質の量を容易に設定することができるという効果を奏する。

本発明に係るポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉで大量生成することができるという効果を奏する。また本発明に係るポリペプチドは、表皮剥脱毒素の基質タンパク質として優れている。

本発明者らは、表皮剥脱毒素の検出手段を探索した結果、従来方法の問題点を解決できることを見出した。すなわち、本発明は、表皮剥脱毒素の標的基質タンパク質Ｄｓｇ１を用いる毒素の簡易迅速測定方法に関する。

（１）ヒトＤｓｇ１
（Ａ）ポリペプチド
本発明者らは、ヒトＤｓｇ１タンパク質を用いる酵素アッセイの感度を向上させることを目的として、表皮剥脱毒素との反応に重要なヒトＤｓｇ１タンパク質の領域、および表皮剥脱毒素の基質としてより良好なヒトＤｓｇ１ポリペプチドを見出した。さらにこのヒトＤｓｇ１ポリペプチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系において大量調製可能であることを見出した。

本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。

用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。

本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、本発明に係るポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。

１つの局面において、本発明は、ヒトＤｓｇ１ポリペプチドを提供する。本明細書中で使用される場合、「ヒトＤｓｇ１ポリペプチド」は、表皮剥脱毒素を検出および／または測定するアッセイに最適なポリペプチドであって、表皮剥脱毒素との反応に重量な領域を有しかつＥ．ｃｏｌｉにおいて発現することができるポリペプチドが意図される。

配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトＤｓｇ１タンパク質は、その細胞外ドメインにＥＣ１領域（配列番号１のアミノ酸５４〜１３５位）、ＥＣ２領域（配列番号１のアミノ酸１６２〜２６０位）、ＥＣ３領域（配列番号１のアミノ酸２７４〜３５６位）、およびＥＣ４領域（配列番号１のアミノ酸４０３〜４８４位）などの分子間相互作用に関与する領域を有する。表皮剥脱毒素によって切断される部位は、３８１位のグルタミン酸のＣ末端側であり、ＥＣ３領域内に存在する。

本発明者らは、ヒトＤｓｇ１タンパク質の細胞外ドメイン（配列番号１のアミノ酸５０〜５４８位）の種々の欠失変異体（図１を参照のこと）を構築して、表皮剥脱毒素に対する感受性を検討した。その結果、ヒトＤｓｇ１タンパク質の細胞外ドメインの特定の領域を有するヒトＤｓｇ１ポリペプチドが、表皮剥脱毒素による切断反応が有意に増強されし、かつＥ．ｃｏｌｉ発現系で大量生産が可能であることを見出した。具体的には、ヒトＤｓｇ１タンパク質のアミノ酸１１２〜３８５を含むポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて大量生産できることがわかった。また、ヒトＤｓｇ１タンパク質のアミノ酸１６０〜３８５を含むポリペプチドは、表皮剥脱毒素に対する感受性が高く、酵素アッセイにおいて良好な基質となることがわかった。

１つの実施形態において、本発明のヒトＤｓｇ１ポリペプチドは、表皮剥脱毒素による切断部位を含んで表皮剥脱毒素の基質として機能するポリペプチドが意図される。好ましくは、本実施形態に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４０〜３８５位を含む。

特定の実施形態において、本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０〜５４５位からなるポリペプチドまたはそのフラグメントであって、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４０〜３８５位を含む。最も好ましくは、本実施形態に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドは、配列番号９、１１、１３、１５または１７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる。本実施形態に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドは表皮剥脱毒素切断部位を含むので、表皮剥脱毒素による切断アッセイにおける基質タンパク質として使用することができる。

本発明は、さらに、実質的なヒトＤｓｇ１ポリペプチド活性を示すヒトＤｓｇ１ポリペプチドの変異体を含む。本明細書中で使用される場合、用語「ヒトＤｓｇ１ポリペプチド活性」は、従来不可能であった大腸菌における発現を可能とするヒトＤｓｇ１ポリペプチドの新規特性が意図される。

このような変異体は、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む。小さな変化、またはこのような「中性」アミノ酸置換は、一般的にほとんど活性に影響しない。

ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。

当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望の活性を有するか否かを容易に決定し得る。

好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、ヒトＤｓｇ１ポリペプチド活性を変化しない。

代表的に保存的置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。

上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ， Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０ （１９９０）（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。

好ましい実施形態において、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０〜５４５位において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列を含むポリペプチド変異体を提供する。好ましくは、本実施形態に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０〜５４５位において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドであって配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４０〜３８５位を含む。本実施形態に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドはまた、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０〜５４５位からなるポリペプチドまたはそのフラグメントであって配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４０〜３８５位を含むポリペプチド、あるいは当該ポリペプチドのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現し得ることを特徴とするポリペプチドである。

別の局面において、本発明に係るポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間の、または続く操作および保存の間の、安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。

特定の局面において、本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドは、例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列であるタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）にＮ末端またはＣ末端へ付加され得る。このような配列は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、タグアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供されるタグ）であり、他の中では、それらの多くは公的および／または商業的に入手可能である。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）（本明細書中に参考として援用される）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）（本明細書中に参考として援用される）によって記載されている。他のそのような融合タンパク質は、ＮまたはＣ末端にてＦｃに融合される本実施形態に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。

本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドは、下記で詳述されるように組換え生成されても、化学合成されてもよい。

組換え生成は、当該分野において周知の方法を使用して行なうことができ、例えば、以下に詳述されるようなベクターおよび細胞を用いて行なうことができる。

合成ペプチドは、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、４週間未満で調製されそして特徴付けられたＨＡ１ポリペプチドセグメントの単一アミノ酸改変体を示す１０〜２０ｍｇの２４８の異なる１３残基ペプチドのような多数のペプチドの合成のための簡単な方法を記載している。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）。この「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、さらにＨｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）の米国特許第４，６３１，２１１号に記載される。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、別々の溶媒透過性パケットに含まれ、固相法に関連する多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全なマニュアル手順は、５００〜１０００以上の合成が同時に行われるのを可能にする（Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、前出、５１３４）。これらの文献は、本明細書中に参考として援用される。

下記に詳細に記載するように、本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドは、表皮剥脱毒素の検出および測定、ならびに伝染性膿痂疹（飛び火）の診断において有用である。

このように、本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドは、少なくとも、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４０〜３８５位を含んでいればよいといえる。すなわち、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４０〜３８５位とヒトＤｓｇ１タンパク質における他の任意の領域とからなるポリペプチドも本発明に含まれることに留意すべきである。また、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４０〜３８５位とヒトＤｓｇ１タンパク質における他の任意の領域は、それぞれの機能を阻害しないように適切なリンカーペプチドで連結されていてもよい。

つまり、本発明の目的は、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現し得るヒトＤｓｇ１ポリペプチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるヒトＤｓｇ１ポリペプチドも本発明の範囲に属することに留意しなければならない。

（Ｂ）ポリヌクレオチド
１つの局面において、本発明は、配列番号２に示される塩基配列の７９５〜１２３２位を含むポリヌクレオチドを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号２に示される塩基配列の５５５〜１７１２位を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号２に示される塩基配列の５５５〜１７１２位の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。

本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、またはそれは、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。

本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化合合成されてもよい。

本発明に係るポリヌクレオチドのフラグメントは、少なくとも１２ｎｔ（ヌクレオチド）、好ましくは約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントが意図される。少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメントによって、例えば、配列番号２に示される塩基配列からの２０以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。本明細書を参照すれば配列番号２に示される塩基配列が提供されるので、当業者は，配列番号２に基づくＤＮＡフラグメントを容易に作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢＩ，８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ９４４０４）３９２型シンセサイザーなどによって合成される。

ヒトＤｓｇ１ポリペプチドをコードする本発明に係るポリヌクレオチドは、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。

本発明はさらに、ヒトＤｓｇ１ポリペプチドをコードする本発明に係るポリヌクレオチドの変異体に関する。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。

このような変異体としては、ヒトＤｓｇ１ポリペプチドをコードする本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、または付加した変異体が挙げられる。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変異され得る。コード領域における変異は、保存的もしくは非保存的なアミノ酸欠失、置換、または付加を生成し得る。

別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上記の本発明に係るポリヌクレオチド（例えば、配列番号２に示される塩基配列の５５５〜１７１２位からなるポリヌクレオチド）またはその一部にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離したポリヌクレオチドを提供する。用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０〜７０ｎｔにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本明細書中においてより詳細に考察されるような診断用プライマーおよび診断用プローブとしても有用である。

ヒトＤｓｇ１ポリペプチドをコードする本発明に係るポリヌクレオチドは、宿主細胞における増殖のための選択マーカーを含有するベクターに結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物中か、または荷電された脂質との複合体中で導入される。また、下記で詳述するように、ＤＥＡＥデキストラン法やエレクトロポレーション法を用いてもよい。ベクターがウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。

さらに、本発明は、ヒトＤｓｇ１ポリペプチドをコードするか否かに関係なく、配列番号２に示される塩基配列の少なくとも１２個連続する配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）に関する。このようなオリゴヌクレオチドとしては、配列番号２３〜３４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが好ましい。このようなオリゴヌクレオチドは、特定のポリヌクレオチドがヒトＤｓｇ１ポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、本発明に係るポリヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして本発明に係るポリペプチドを作製するために使用され得ることを容易に理解する。

このように、本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリヌクレオチドは、少なくとも、配列番号２に示される塩基配列の７９５〜１２３２位を含んでいればよいといえる。すなわち、配列番号２に示される塩基配列の７９５〜１２３２位とヒトＤｓｇ１タンパク質の他の任意の領域をコードするポリヌクレオチド塩基配列からなるポリヌクレオチドも本発明に含まれることに留意すべきである。また、配列番号２に示される塩基配列の７９５〜１２３２位とヒトＤｓｇ１タンパク質の他の任意の領域をコードするポリヌクレオチド塩基配列は、適切なリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドで連結されていてもよい。

つまり、本発明の目的は、Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現し得るヒトＤｓｇ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリヌクレオチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるヒトＤｓｇ１ポリヌクレオチドも本発明の範囲に属することに留意しなければならない。

（Ｃ）ベクターおよび細胞
本発明は、ヒトＤｓｇ１ポリペプチドを生成するために使用されるベクターに関する。本発明に係るベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。

本発明はまた、本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドを組換え的に生成するための本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換え構築物で形質転換された宿主細胞、および組換え技術によるヒトＤｓｇ１ポリペプチドまたはそのフラグメントの産生方法に関する。

組換え構築物は、感染、形質導入、トランスフェクション、エレクトロポレーション、および形質転換のような周知の技術を用いて宿主細胞に導入され得る。組換え構築物としてのベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製可能かまたは複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルスの増殖は、一般的に、相補宿主細胞においてのみ生じる。

発現させる目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当該分野において周知の方法を用いて取得することができる。公知のタンパク質の部分配列は、所望の部位の対してプライマーを設計してＰＣＲ増幅することによって対応するポリヌクレオチドを取得し、発現ベクターに挿入して細胞内で容易に得られる。

目的の挿入ポリヌクレオチドに対するシス作用性制御領域を含有するベクターが好ましい。適切なトランス作用性因子は、宿主によって供給され得るか、相補ベクターによって供給され得るか、または宿主への導入の際にベクター自体によって供給され得る。

特定の実施態様において、ベクターは、誘導性および／または細胞型特異的であり得る特異的な発現を提供するベクターが好ましい。このようなベクターの中で特に好ましいベクターは、温度および栄養添加物のような操作することが容易である環境因子によって誘導性のベクターである。

本発明において有用な発現ベクターとしては、染色体ベクター、エピソームベクター、およびウイルス由来ベクター（例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、トリポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルス）、ならびにそれらの組合せに由来するベクター（例えば、コスミドおよびファージミド）が挙げられる。

ＤＮＡ挿入物は、適切なプロモーター（例えば、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、およびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよび後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。発現構築物は、さらに、転写開始、転写終結のための部位、および、転写領域中に翻訳のためのリボゾーム結合部位を含む。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、翻訳されるべきポリペプチドの始めに転写開始ＡＵＧを含み、そして終わりに適切に位置される終止コドンを含む。

発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；ならびに植物細胞が挙げられる。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で公知である。

好ましい実施形態において、本発明に係るベクターは、細菌（特に、Ｅ．ｃｏｌｉ）において本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドを発現し得る。細菌における使用に好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈｒｍａｃｉａから入手可能）が含まれる。

本発明における使用に適した公知の細菌プロモーターの中には、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３プロモーターおよびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λＰＲプロモーターおよびλＰＬプロモーター、ならびにｔｒｐプロモーターが含まれる。適切な真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期ＳＶ４０プロモーターおよび後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）、ならびにメタロチオネインプロモーター（例えば、マウスメタロチオネインＩプロモーター）が挙げられる。

別の実施形態において、本発明に係るベクターは、高等真核生物細胞において本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドを発現し得る。高等真核生物細胞によるＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増大させ得る。エンハンサーは、所定の宿主細胞型におけるプロモーターの転写活性を増大するように働く、通常約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーの例としては、ＳＶ４０エンハンサー（これは、複製起点の後期側上の１００〜２７０ｂｐに位置される）、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。

好ましい真核生物ベクターとしては、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈｒｍａｃｉａから入手可能）が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。

宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によってもたらされ得る。このような方法は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）（本明細書中に参考として援用される）のような多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。

このように、本発明に係るベクターは、少なくとも、本発明に係るポリヌクレオチドを含めばよいといえる。すなわち、発現ベクター以外のベクターも、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。

また、本発明に係る細胞は、少なくとも、本発明に係るベクターを含めばよいといえる。すなわち、市販の細胞以外の初代培養細胞も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。

つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリヌクレオチドを含有するベクターおよび当該ベクターを含有する細胞を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法を用いて取得したベクターおよび細胞も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。

（Ｄ）抗体
本発明は、ヒトＤｓｇ１ポリペプチドと特異的に結合する抗体を提供する。好ましい局面において、本発明に係る抗体は、表皮剥脱毒素に切断されたヒトＤｓｇ１ポリペプチドと特異的に結合する。より好ましい局面において、本発明に係る抗体は、表皮剥脱毒素によって切断されたヒトＤｓｇ１ポリペプチドの切断部位と特異的に結合する。

本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されない。本発明に係る抗体は、従来の免疫方法では取得し得なかったが、本発明者らが免疫方法に創意工夫を重ねることによって取得された。好ましい実施形態において、本発明に係る抗体は、ヒトＤｓｇ１ポリペプチドの表皮剥脱毒素による切断部位であるペプチド断片を抗原に用いて作製される。本実施形態に係る抗体は、黄色ブドウ球菌の産生する表皮剥脱毒素の検出および／または伝染性膿痂疹（飛び火）診断に有用であり得る。

ペプチド抗体は、当該分野に周知の方法によって作製される。例えば、Ｃｈｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。一般には、動物は遊離ペプチドで免疫化され得る；しかし、抗ペプチド抗体力価はペプチドを高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にカップリングすることにより追加免疫され得る。例えば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを使用してキャリアにカップリングされ得、一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングされ得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離またはキャリア−カップリングペプチドのいずれかで、例えば、約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびＦｒｅｕｎｄのアジュバントを含むエマルジョンの腹腔内および／または皮内注射により免疫化される。いくつかの追加免疫注射が、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを使用してＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る有用な力価の抗ペプチド抗体を提供するために、例えば、約２週間の間隔で必要とされ得る。免疫化動物からの血清における抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当該分野で周知の方法による固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出により増加され得る。

本明細書中で使用される場合、用語「ヒトＤｓｇ１ポリペプチドと特異的に結合する抗体」または「ヒトＤｓｇ１ポリペプチドと特異的に結合する抗体」は、ヒトＤｓｇ１ポリペプチド抗原と特異的に結合し得る完全な抗体分子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）₂フラグメント）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）₂フラグメントは完全な抗体のＦｃ部分を欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、そして完全な抗体の非特異的組織結合をほとんど有し得ない（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３）（本明細書中に参考として援用される））。従って、これらのフラグメントが好ましい。

さらに、ヒトＤｓｇ１ポリペプチドのペプチド抗原と結合し得るさらなる抗体が、抗イディオタイプ抗体の使用を通じて二工程手順で産生され得る。このような方法は、抗体それ自体が抗原であるという事実を使用し、従って、二次抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法に従って、ヒトＤｓｇ１ポリペプチドと特異的に結合する抗体は、動物（好ましくは、マウス）を免疫するために使用される。次いで、このような動物の脾細胞はハイブリドーマ細胞を産生するために使用され、そしてハイブリドーマ細胞は、ヒトＤｓｇ１ポリペプチドと特異的に結合する抗体に結合する能力がヒトＤｓｇ１ポリペプチド抗原によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、ヒトＤｓｇ１ポリペプチドと特異的に結合する抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そしてさらなるヒトＤｓｇ１ポリペプチドと特異的に結合する抗体の形成を誘導するために動物を免疫するために使用され得る。

ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）₂ならびに本発明に係る抗体の他のフラグメントは、本明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが、明らかである。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生される。あるいは、ヒトＤｓｇ１ポリペプチド結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または合成化学によって産生され得る。

ヒトにおける診断のために、インビボでのイメージングを用いて、切断されたヒトＤｓｇ１ポリペプチドの上昇レベルを検出する場合、「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましくあり得る。このような抗体は、上記のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞由来の遺伝構築物を用いて生成され得る。キメラ抗体を生成するための方法は、当該分野で公知である。総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）（これらは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。

このように、本発明に係る抗体は、少なくとも、本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドの表皮剥脱毒素による切断断片を認識する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）₂フラグメント）を備えていればよいといえる。すなわち、本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドの表皮剥脱毒素による切断断片を認識する抗体フラグメントと、異なる抗体分子のＦｃフラグメントとからなる免疫グロブリンも本発明に含まれることに留意すべきである。

つまり、本発明の目的は、本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドの表皮剥脱毒素による切断断片を認識する抗体を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の免疫グロブリンの種類（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）、キメラ抗体作製方法、ペプチド抗原作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される抗体も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。

（２）表皮剥脱毒素の測定方法および伝染性膿痂疹の診断方法
感染因子、または、代謝産物、核酸、およびタンパク質を含む病気の指標となる分子の検出および測定は、医学的疾患の診断および治療、ならびに研究における基本的な要素である。現在、多くの方法論が検出に使用されている。これらの方法論は、一般に、病気を引き起こす因子の成分をコードする遺伝物質のような、核酸に対する診断アッセイ、および病気を引き起こす因子または病気の副産物のいずれかの成分であるタンパク質に対する抗体をベースにした診断アッセイに分けられる。

本発明は、表皮剥脱毒素の測定方法および伝染性膿痂疹の診断方法を提供する。本発明に係る黄色ブドウ球菌の産生する表皮剥脱毒素の測定方法および伝染性膿痂疹の診断方法は、伝染性膿痂疹を引き起こす黄色ブドウ球菌が産生する表皮剥脱毒素によって切断されたヒトＤｓｇ１ポリペプチドを検出する方法である。

本明細書中で使用される場合、用語「表皮剥脱毒素の測定」は、「表皮剥脱毒素の検出」を包含することが意図される。当業者は、本発明に係る表皮剥脱毒素の測定方法が、表皮剥脱毒素を検出するとともに存在する表皮剥脱毒素の量を定量的に測定することができることを、容易に理解する。

本発明に従うと、被験体から得られたサンプル中に黄色ブドウ球菌が産生する表皮剥脱毒素が存在するか否かを、有効かつ効率的に判定し得る。また、本発明に従うと、被験体が黄色ブドウ球菌を保有するか否かを判定し得る。さらに、他の主要な細菌同定法と組み合わせることによって、より詳細な細菌感染チャートを作製することが可能である。

１つの局面において、本発明は、生物学的サンプル（特に、被験体から得られた組織または他の細胞または体液である被験体サンプル）とヒトＤｓｇ１ポリペプチドとをインキュベートした後に、切断されたヒトＤｓｇ１ポリペプチドの有無を検出することに基づく表皮剥脱毒素を測定する方法、および黄色ブドウ球菌関連障害（特に、伝染性膿痂疹）を診断する方法を提供する。

本明細書中で使用される場合、用語「生物学的サンプル」は、個体、体液、細胞株、組織培養物もしくは組織切片、または黄色ブドウ球菌を含む他の供給源から得られる、任意の生物学的サンプルが意図される。生物学的サンプルとしては、黄色ブドウ球菌を含む体液（例えば、血液、唾液、歯垢、血清、血漿、尿、滑液、および随液）あるいは組織供給源が挙げられる。好ましい生物学的サンプルは、被験体サンプルである。好ましい被験体サンプルは、被験体から得た皮膚病変部、喀痰、咽頭粘液、鼻腔粘液、膿、または分泌物であり、最も好ましくは、皮膚病変部である。本明細書中で使用される場合、用語「組織サンプル」は、組織供給源より得られた生物学的サンプルが意図される。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は当該分野で周知である。本明細書中で使用される場合、用語「サンプル」としては、上記生物学的サンプルおよび上記組織サンプル以外に、上記生物学的サンプルおよび上記組織サンプルより抽出したゲノムＤＮＡサンプルおよび／または総ＲＮＡサンプルも挙げられる。

好ましくは、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４０〜３８５位を含むポリペプチドを用いて、切断されたヒトＤｓｇ１ポリペプチドを検出することに基づいて表皮剥脱毒素を測定、または伝染性膿痂疹を診断することを特徴とする。

１つの実施形態において、本発明に係る表皮剥脱毒素の測定方法または伝染性膿痂疹の診断方法は、（１）被験体サンプルをヒトＤｓｇ１ポリペプチドとインキュベートする工程；および、（２）当該インキュベートする工程において切断された当該ポリペプチドを検出する工程、を包含する。

上記検出する工程は、抗原抗体反応に基づいた免疫学的な結合反応を利用して検出することが意図される。免疫学的な結合反応を利用した検出アッセイとしては、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット、放射性イムノアッセイ、および免疫拡散アッセイのような抗体アッセイが挙げられる。これらのアッセイは、分子の固定化および検出のためにアビジンおよびビオチンのような分子を用いる。これらの試薬を調製する技術およびそれを使用する方法は、当業者に公知である。さらに、多くの結合アッセイは、染料、酵素、または放射性もしくは蛍光物質による標識を用いて検出が増強される。

好ましくは、本発明に係る表皮剥脱毒素の測定方法または伝染性膿痂疹の診断方法において、上記検出する工程が、上記ポリペプチドに連結したタグ標識に対する抗体を用いる。上記タグ標識がヒトＤｓｇ１ポリペプチドのＣ末端に連結されている場合、表皮剥脱毒素によってヒトＤｓｇ１ポリペプチドが切断されて当該タグ標識が遊離する。上記タグ標識がヒトＤｓｇ１ポリペプチドのＮ末端に連結されている場合、表皮剥脱毒素によってヒトＤｓｇ１ポリペプチドが切断されても当該タグ標識は遊離せず長いＮ末端切断フラグメント中に存在する。

好ましい実施形態において、本発明に係る表皮剥脱毒素の測定方法または伝染性伝染性膿痂疹の診断方法において、上記ヒトＤｓｇ１ポリペプチドとして、表皮剥脱毒素切断部位を含むポリペプチドと毒素切断部位を含まないポリペプチドを併用する。

別の局面において、本発明は、黄色ブドウ球菌が産生する表皮剥脱毒素によって切断されたヒトＤｓｇ１ポリペプチドと特異的に結合する抗体を用いて免疫反応を行う工程を包含する表皮剥脱毒素を測定する方法または伝染性膿痂疹の診断方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明に係る表皮剥脱毒素の測定方法または伝染性膿痂疹の診断方法は、（１）被験体サンプルを切断されたヒトＤｓｇ１ポリペプチドと特異的に結合する抗体とインキュベートする工程；および、（２）当該抗体を検出する工程、を包含する。好ましい被験体サンプルは、被験体由来の生検サンプルまたは組織切片である。本方法に従えば、生体内で表皮剥脱毒素が有意に産生する部位を同定して有効な局所治療を行なうことができる。本方法において、切断されたヒトＤｓｇ１ポリペプチドと特異的に結合する抗体を標識することによって、より効果的に検出することができる。

生物学的サンプル中の表皮剥脱毒素レベルのアッセイは、任意の当該分野で公知の方法を使用して行われ得る。抗体に基づく技術が、生物学的サンプル中の表皮剥脱毒素レベルをアッセイするために好ましい。例えば、組織中での表皮剥脱毒素の同定は、伝統的な免疫組織学的方法（ウェスタンブロットアッセイまたはドットブロットアッセイを含む）を用いて研究され得る。これらの場合、特異的認識は一次抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）によって提供されるが、二次検出系は、蛍光、酵素、または他の結合された二次抗体を利用し得る。結果として、病理検査のための組織切片の免疫組織学的染色が得られる。

切断されたヒトＤｓｇ１ポリペプチドと特異的に結合する本発明に係る抗体に適切な標識は、以下に提供される。適切な酵素標識の例としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。より適切な酵素標識としては、例えば、基質との反応による過酸化水素の生成を触媒するオキシダーゼ群由来のものが挙げられる。グルコースオキシダーゼは、それが良好な安定性を有し、そしてその基質（グルコース）が容易に入手できるために、特に好ましい。オキシダーゼ標識の活性は、酵素−標識抗体／基質反応によって形成される過酸化水素の濃度を測定することによってアッセイされ得る。

切断されたヒトＤｓｇ１ポリペプチドと特異的に結合する本発明に係る抗体に適切な放射性同位体標識の例としては、³Ｈ、¹¹¹Ｉｎ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、¹⁴Ｃ、⁵¹Ｃｒ、⁵⁷Ｔｏ、⁵⁸Ｃｏ、⁵⁹Ｆｅ、⁷⁵Ｓｅ、¹⁵²Ｅｕ、⁹⁰Ｙ、⁶⁷Ｃｕ、²¹⁷Ｃｉ、²¹¹Ａｔ、²¹²Ｐｂ、⁴⁷Ｓｃ、¹⁰⁹Ｐｄなどが挙げられる。

適切な非放射性同位体標識の例としては、¹⁵⁷Ｇｄ、⁵⁵Ｍｎ、¹⁶²Ｄｙ、⁵²Ｔｒ、および⁵⁶Ｆｅが挙げられる。

適切な蛍光標識の例としては、¹⁵²Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、ｏ−フタルアルデヒド標識、およびフルオレサミン標識が挙げられる。

適切な毒素標識の例としては、ジフテリア毒素、リシン、およびコレラ毒素が挙げられる。

化学発光標識の例としては、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、およびエクオリン標識が挙げられる。

上記の標識を抗体に結合するための代表的な技術は、Ｋｅｎｎｅｄｙら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７０：１−３１（１９７６））およびＳｃｈｕｒｓら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８１：１−４０（１９７７））（これらは、本明細書中に参考として援用される）により提供される。後者において言及されるカップリング技術は、グルタルアルデヒド方法、過ヨウ素酸方法、ジマレイミド方法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル方法であり、これらの方法は全て本明細書中に参考として援用される。

このように、本発明に係る表皮剥脱毒素の測定方法または伝染性膿痂疹の診断方法は、少なくとも、本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドを用いればよいといえる。また、本発明に係る表皮剥脱毒素の測定方法または伝染性膿痂疹の診断方法は、切断されたヒトＤｓｇ１ポリペプチドと特異的に結合する本発明に係る抗体を用いればよいといえる。すなわち、本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドと、切断されたヒトＤｓｇ１ポリペプチドと特異的に結合する本発明に係る抗体とを用いる表皮剥脱毒素の測定方法または伝染性膿痂疹の診断方法もまた本発明に含まれることに留意すべきである。

つまり、本発明の目的は、表皮剥脱毒素の測定方法または伝染性膿痂疹の診断方法を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したサンプル種およびサンプル採取方法、個々の標識の種類、標識方法、インキュベートの温度および時間等の条件に存するのではない。したがって、上記ポリペプチドまたは抗体を用いる各工程以外の工程を包含する測定方法または診断方法も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。

（３）表皮剥脱毒素の測定キットおよび伝染性膿痂疹の診断キット
本発明に係る表皮剥脱毒素の測定キットおよび伝染性膿痂疹の診断キットは、判定対象となる切断されているヒトＤｓｇ１ポリペプチドを検出するものである。本発明に係るキットは、疾患（特に、伝染性膿痂疹）の診断方法、疾患の病原因子（特に、表皮剥脱毒素）の検出方法および測定方法に使用され得るか、あるいは新規病原因子（特に、新規表皮剥脱毒素）を同定するためのスクリーニング方法に使用され得る。

上述したように、本明細書中で使用される場合、用語「表皮剥脱毒素の測定」は、「表皮剥脱毒素の検出」を包含することが意図される。当業者は、本発明に係る表皮剥脱毒素の測定方法が、表皮剥脱毒素を検出するとともに存在する表皮剥脱毒素の量を定量的に測定することができることを、容易に理解する。

１つの局面において、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４０〜３８５位を含むポリペプチドを備える、切断されたヒトＤｓｇ１ポリペプチドを検出して表皮剥脱毒素を測定するためのキットを提供する。

１つの実施形態において、本発明に係る表皮剥脱毒素の測定キットまたは伝染性膿痂疹の診断キットは、必要に応じて以下の１つ以上を備え得る：（１）本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドに対する、標識された結合パートナー；（２）結合パートナーを検出するための試薬；（３）キットを使用するための指導書。ヒトＤｓｇ１ポリペプチドは、タグ標識されていても他の標識物質（例えば、アビジン）などで標識されていてもよい。

好ましいタグ標識としては、ＨＡおよびヘキサヒスチジンが挙げられるが、これらに限定されず、当業者は、種々のタグ標識を容易に選択して使用することができる。好ましい結合パートナーとしては、ヒトＤｓｇ１ポリペプチドに対する抗体（例えば、既知の抗Ｄｓｇ１抗体など）、タグ標識に対する抗体（例えば、抗ＨＡ抗体などの二次抗体）、およびヒトＤｓｇ１ポリペプチドに結合した標識と特異的に結合する物質（例えば、ビオチン）が挙げられる。好ましくは、上記二次抗体は標識されている。本発明に係るキットを用いれば、被験体（特に、水疱形成を生じる患者）が黄色ブドウ球菌を保有するか否かを簡便に同定し得る。

上記標識された結合パートナーは、支持体上に固定化されていても固定化されていなくてもよい。好ましい支持体としては、ビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ）、固相（例えば、ガラスチューブ、試薬ストリップ、ポリスチレン製のマイクロタイタープレートまたはアミノ基結合型のマイクロタイタープレート）などが挙げられるが、これらに限定されない。固定方法は、当業者に周知であり、例えばＮａｔｕｒｅ ３５７：５１９−５２０（１９９２）（本明細書中に参考として援用される）に記載される。

別の局面において、本発明に係るキットは、切断されたヒトＤｓｇ１ポリペプチドと特異的に結合する抗体を備える、切断されたヒトＤｓｇ１ポリペプチドを検出して表皮剥脱毒素を測定するためのキットを提供する。

１つの実施形態において、本発明に係る表皮剥脱毒素の測定キットまたは伝染性膿痂疹の診断キットは、必要に応じて以下の１つ以上を備え得る：（１）本発明に係る抗体に対する、標識された結合パートナー；（２）結合パートナーを検出するための試薬；（３）キットを使用するための指導書。本発明に係る抗体は、タグ標識されていても他の標識物質（例えば、アビジン）などで標識されていてもよい。

好ましいタグ標識としては、ＨＡおよびヘキサヒスチジンが挙げられるが、これらに限定されず、当業者は、種々のタグ標識を容易に選択して使用することができる。好ましい結合パートナーとしては、本発明に係る抗体に対する抗体（例えば、抗ウサギＩｇＧなどの二次抗体）、タグ標識に対する抗体（例えば、抗ＨＡ抗体などの二次抗体）、および本発明に係る抗体に結合した標識と特異的に結合する物質（例えば、ビオチン）が挙げられる。好ましくは、上記二次抗体は標識されている。本発明に係るキットを用いれば、被験体（特に、水疱形成を生じる患者）が黄色ブドウ球菌を保有するか否かを簡便に同定し得る。

上記標識された結合パートナーは、支持体上に固定化されていても固定化されていなくてもよい。好ましい支持体としては、ビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ）、固相（例えば、ガラスチューブ、試薬ストリップ、ポリスチレン製のマイクロタイタープレートまたはアミノ基結合型のマイクロタイタープレート）などが挙げられるが、これらに限定されない。固定方法は、当業者に周知であり、例えばＮａｔｕｒｅ ３５７：５１９−５２０（１９９２）（本明細書中に参考として援用される）に記載される。

本発明に係る表皮剥脱毒素の測定キットおよび伝染性膿痂疹の診断キットは、上述した表皮剥脱毒素の測定方法および伝染性膿痂疹の診断方法において使用される種々の試薬、標識などを共に備え得る。また、本発明に係るキットは、梱包されていても梱包されていなくてもよい。梱包されている場合の本発明に係るキットは、臨床検査および基礎研究において用いるための試薬キットであり得る。

本発明に係るキットを用いれば、複数の被験体をスクリーニングして表皮剥脱毒素を産生する黄色ブドウ球菌を保有する被験体を同定することができる。

このように、本発明に係る表皮剥脱毒素の測定キットまたは伝染性膿痂疹の診断キットは、少なくとも、本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドを備えればよいといえる。また、本発明に係る表皮剥脱毒素の測定キットまたは伝染性膿痂疹の診断キットは、切断されたヒトＤｓｇ１ポリペプチドと特異的に結合する本発明に係る抗体を備えればよいといえる。すなわち、本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドと、切断されたヒトＤｓｇ１ポリペプチドと特異的に結合する本発明に係る抗体とを共に備える表皮剥脱毒素の測定キットまたは伝染性膿痂疹の診断キットもまた本発明に含まれることに留意すべきである。

つまり、本発明の目的は、表皮剥脱毒素の測定キットまたは伝染性膿痂疹の診断キットを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の試薬および標識の種類、標識方法、試薬とサンプルとのインキュベートの温度および時間等の条件に存するのではない。したがって、上記ポリペプチドまたは抗体以外の試薬を包含する測定キットまたは診断キットも本発明の範囲に属することに留意しなければならない。

（４）表皮剥脱毒素を産生する黄色ブドウ球菌の検出器具
本発明に係る細菌検出器具は、サンプル中の細菌を検出および／または同定するための器具であって、本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドが支持体上に固定化されていることを特徴とし、当該ポリペプチドとサンプル中に存在する表皮剥脱毒素との反応によりサンプル中の細菌を検出および／または同定するものである。表皮剥脱毒素を産生する黄色ブドウ球菌の検出に用いる場合、上記ポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４０〜３８５位を含む。本発明に係る細菌検出器具を用いれば、複数の被験体をスクリーニングして表皮剥脱毒素を産生する黄色ブドウ球菌を保有する被験体を同定することができる。

さらに他種の細菌を網羅的に検査する場合は、当該他種の細菌（複数であってもよい）または細菌由来の酵素と特異的に反応するポリペプチドも固定化されていることが好ましい。このように、複数種の細菌を含むサンプルを使用するアッセイに供することによって、表皮剥脱毒素を産生する黄色ブドウ球菌がどのような細菌種と共存する傾向があるかを知ることができる。

１つの実施形態において、本発明に係る細菌検出器具は、本発明に係るポリペプチドを固定化した支持体であることを特徴とする。好ましい支持体としては、ビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ）、固相（例えば、ガラスチューブ、試薬ストリップ、ポリスチレン製のマイクロタイタープレートまたはアミノ基結合型のマイクロタイタープレート）などが挙げられるが、これらに限定されない。固定方法は、当業者に周知であり、例えばＮａｔｕｒｅ ３５７：５１９−５２０（１９９２）（本明細書中に参考として援用される）に記載される。

別の実施形態において、本発明に係る細菌検出器具は、ポリペプチドを固定化した支持体としての基板を備える。本実施形態に係る細菌検出器具に用いる基板の材質としては、ポリペプチドを安定して固定化することができるものであればよい。例えば、ポリカーボネートやプラスティックなどの合成樹脂、ガラス等を挙げることができるが、これらに限定されない。基板の形態も特に限定されないが、例えば、板状、フィルム状等の基板を好適に用いることができる。

操作の簡便性および検査の迅速性の観点から、サンプル中から検出可能な細菌を１つの基板で網羅的に検出できることが好ましい。したがって、本発明に係る細菌検出器具も、１つの基板上に目的の細菌種または属に対応するポリペプチドを複数固定化した、いわゆるタンパク質チップと称されるマイクロアレイ型の器具とすることが好ましい。当業者は、ポリペプチドの基板表面への固定化法は特に限定されるものではなく、公知の方法を適宜選択して用いればよいことを理解する。

このように、本発明に係る細菌検出器具は、少なくとも、本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドが支持体上に固定化されていればよいといえる。また、本発明に係る細菌検出器具は、本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドが固定化されている基板を備えていればよいといえる。すなわち、これらの支持体（基板を含む）以外の構成部材を備える場合も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。

つまり、本発明の目的は、黄色ブドウ球菌の検出器具を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の支持体の種類、固定化方法に存するのではない。したがって、上記支持体以外の構成部材を包含する細菌検出器具も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。

（５）新規表皮剥脱毒素のスクリーニング
本発明は、本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドを用いることを特徴とする新規表皮剥脱毒素のスクリーニング方法を提供する。本発明はまた、本発明に係る抗体を用いることを特徴とする新規表皮剥脱毒素のスクリーニング方法を提供する。

本発明者らは、従来知られていた血清型ＡおよびＢの表皮剥脱毒素以外に新たな血清型Ｄの表皮剥脱毒素を見出した。このことは、未知の表皮剥脱毒素が存在することを示唆する。本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドまたは本発明に係る抗体を用いて被験体サンプルをスクリーニングすることによって表皮剥脱毒素の存在を検出するとともに、既知の表皮剥脱毒素と比較することによって新たな表皮剥脱毒素を見出すことができる。

本発明に係るスクリーニング方法は、被験体サンプルを本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドまたは本発明に係る抗体とインキュベートする工程を包含する。被験体サンプルは、体液であっても組織であってもよく、好ましくは、被験体から得た皮膚病変部、喀痰、咽頭粘液、鼻腔粘液、膿または分泌物であり、最も好ましくは、皮膚病変部である。

好ましい実施形態において、表皮剥脱毒素が検出された被験体サンプルにおいて、既知の表皮剥脱毒素に対する抗体を用いて当該表皮剥脱毒素の血清型を同定する。血清型不定の表皮剥脱毒素を見出した場合、その被験体サンプルから黄色ブドウ球菌を単離、培養した後、表皮剥脱毒素を精製する。精製した表皮剥脱毒素の配列決定を行なうことによって、新規表皮剥脱毒素を同定することができる。

このように、本発明に係るスクリーニング方法は、上述の表皮剥脱毒素の測定方法または伝染性膿痂疹の診断方法を用いればよいといえる。すなわち、本発明に係るスクリーニング方法は、少なくとも、本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドを用いればよいといえる。また、本発明に係るスクリーニング方法は、切断されたヒトＤｓｇ１ポリペプチドと特異的に結合する本発明に係る抗体を用いればよいといえる。よって、本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドと、切断されたヒトＤｓｇ１ポリペプチドと特異的に結合する本発明に係る抗体とを用いるスクリーニング方法もまた本発明に含まれることに留意すべきである。

つまり、本発明の目的は、新規表皮剥脱毒素のスクリーニング方法を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したサンプル種およびサンプル採取方法、個々の標識の種類、標識方法、インキュベートの温度および時間等の条件に存するのではない。したがって、上記ポリペプチドまたは抗体を用いる各工程以外の工程を包含するスクリーニング方法も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。

本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これに限定されるべきではない。

〔実施例１：ヒトケラチノサイト総ＲＮＡの抽出〕
１０ｃｍディッシュ中にて３７℃で６日間培養してコンフルエントな状態になった正常皮膚ケラチノサイトＫ４２細胞をディッシュから掻き取り、ｉｓｏｇｅｎ（株式会社ニッポンジーン）を用いて細胞を溶解した。溶解した細胞を室温で５分間静置した後、この細胞にクロロホルムを加えて撹拌した。次いで、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清に対してイソプロパノール沈殿処理を行ってＤＮＡおよびＲＮＡの粗抽出を行った。この粗抽出サンプルからＤＮＡおよびタンパク質を除去するために、ＤＮａｓｅ処理（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を３７℃で３０分間行い、続いてフェノール／クロロホルム処理を３回行った後にエタノール沈殿処理を行って、ＲＮＡ抽出サンプルを得た。ＲＮＡ量の測定を、Ｇｅｎｅｑｕａｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行なった。

〔実施例２：ＲＴ−ＰＣＲによるｈＤｓｇ１ ｃＤＮＡの調製〕
逆転写反応を、１ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ Ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｋ．Ｋ．）を用いて行なった。具体的には、６．２μｌの滅菌イオン交換水に、実施例１で得たＲＮＡ抽出サンプル（０．５μｇ／ｕｌ）を２μｌ、１０×Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを２μｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂を４μｌ、Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｘを２μｌ、Ｏｌｉｇｏ−ｐ（ｄＴ）１５ ｐｒｉｍｅｒ（０．０４Ａ₂₆₀ ｕｎｉｔｓ）を２μｌ、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを１μｌ、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（≧２０ｕｎｉｔｓ）を０．８μｌ加え、反応を、２５℃で１０分間、４２℃で６０秒間、９９℃で５分間、４℃で５分間で行った。逆転写されたｃＤＮＡの量をＧｅｎｅｑｕａｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。

ＰＣＲ反応を、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行なった。具体的には、得られたｃＤＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）を１μｌ、１０μＭ プライマーを１μｌ、２５ｍＭ ｄＮＴＰを１μｌ、ｅｘｐａｎｄ ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（３．５ｕｎｉｔ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｋ．Ｋ．）を０．５μｌ、滅菌イオン交換水を４０．５μｌを混合して、ＰＣＲ反応液を調製し、反応を、９４℃で２分間の後、９４℃で１５秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で３分間を２５サイクル、次いで７２℃で７分間行い、最後に４℃で保持した。本実施形態におけるＰＣＲに用いたプライマーを、表１に示す。なお、ｈＤｓｇ１上流に設計したプライマーの５'側には全てＢａｍＨＩ制限酵素部位を連結してある。ＴＹ２４９６のみ下流に設計したプライマーの５’側にＥｃｏＲＩ制限酵素部位を連結してある。

〔実施例３：ｈＤｓｇ１ ＰＣＲ産物のｐＧＥＭベクターへの挿入、および配列決定によるＤＮＡ配列確認〕
実施例２で得たｈＤｓｇ１ ＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結した後、Ｃｏｍｐｔｅｎｔ ｃｅｌｌ Ｅ． ｃｏｌｉ ＸＬＩＩ−ｂｌｕｅにＥｌｅｃｔｒｏ ｃｅｌｌ ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ ６００（ＢＴＸ）を用いて２００Ω、２５μＦ、２．０ｋＶの条件下でエレクトロポレーションを行った。得られた形質転換株からＭｉｎｉ−ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。配列決定を、ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびｐＧＥＭベクター配列決定用プラスミド（ｐＧＥＭ−Ｆ：ＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ（配列番号３３）、ｐＧＥＭ−Ｒ：ＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ（配列番号３４））を用い、９６℃で２分間の後、９６℃で１０秒間、５６℃で５秒間、６０℃で４分間を３０サイクル、次いで４℃で５分間の条件下で行った。反応後のサンプルを、ＡＢＩ３１００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にアプライして配列決定した。得られた種々の長さのｈＤｓｇ１ ＰＣＲ増幅産物が、正しい塩基配列であることをＧｅｎｅｂａｎｋに登録されてあるＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ １（アクセッション番号：ＮＭ００１９４２）と比較することによって確認した。

〔実施例４：ｈＤｓｇ１ポリヌクレオチドのｐＥＴ３２ａベクターまたはｐＥＴ３２ｂベクターへの挿入〕
ｐＧＥＭ Ｔ−ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒに挿入したｈＤｓｇ１ポリヌクレオチドを、制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩを用いて消化した後、１％アガロースゲルを用いて電気泳動を行ない、アガロースゲルから所望のバンドを切り出した後、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ ＩＩＩ ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いて回収した。ｈＤｓｇ１ポリヌクレオチドのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩによる断片を、Ｔａｋａｒａ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造株式会社）を用いて、クローニング部位をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩによって予め消化したｐＥＴ３２ａベクター（ＴＹ２４９６のみｐＥＴ３２ｂベクター：メルク株式会社）（図５）に連結した。このベクターは、（１）Ｔ７プロモーター、（２）ｌａｃオペロン、（３）Ｔｒｘタグ、（４）Ｈｉｓタグ、（５）Ｔｈｒｏｍｂｉｎ切断部位、（６）Ｓタグ、（７）エンテロキナーゼ切断部位、および（８）制限酵素部位（ＢａｍＨＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位）を含む。この連結構築物をエレクトロポレーションによってコンピテント細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬＩＩ−ｂｌｕｅ）に導入した。続いて、この形質転換細胞からＭｉｎｉ−ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した後、この連結構築物を高タンパク質発現株であるＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１株にエレクトロポレーションによって導入した。本実施形態において取得したポリペプチドを、表２に示す。

〔実施例５：ｈＤｓｇ１ポリペプチドの精製〕
Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＹ２５６８株、ＴＹ２５７１株、ＴＹ２５７２株、ＴＹ２５２１株、ＴＹ２５２０株、ＴＹ２５９２株、ＴＹ２６１２株、ＴＹ２５９３株、およびＴＹ２５９４株（それぞれｈＤｓｇ１ポリペプチドのアミノ酸５３〜５４５位、７４〜５４５位、１１２〜５４５位、１６０〜５４５位、１６０〜３８５位、１９０〜５４５位、２２１〜５４５位、２４０〜５４５位、および２７２〜５４５位を発現する）を、５００ｍｌのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（１０ｇ／ｌのＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｐｅｐｔｏｎｅ（ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）、５ｇ／ｌのＢａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）、１０ｇ／ｌのＮａＣｌ（和光純薬株式会社）を含有する）中にて２５℃の恒温槽で培養した。

次いで、これらの培養物が対数増殖期中期にある時点で、これらの培養培地に、最終濃度０．１ｍＭ ＩＰＴＧ（和光純薬株式会社）を添加した。添加５時間後、８，０００×ｇで２０分間遠心分離を行って集菌し、得られた菌体を、５ｍｌのＴＢＳ−Ｃａ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）（シグマ株式会社）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（和光純薬株式会社）、１ｍＭ ＣａＣｌ₂（和光純薬株式会社）、１０ｍＭＤＴＴ（シグマ株式会社）を含有する）中に懸濁した。

菌体をＦｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓ（セントラル貿易株式会社）で破砕した後、８，０００×ｇで２０分間、次いで１９，０００×ｇで６０分間遠心分離を行い、得られた上清をＴＢＳ−Ｃａ緩衝液で平衡化したＮｉ−ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ（５００μｌ）（キアゲン株式会社）にアプライした。マイクロチューブローテーター（アズワン株式会社）を用いて４℃で１時間撹拌した後、３，０００×ｇで１０分間遠心分離を行ってＮｉ−ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅを回収した。

回収したＮｉ−ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅを、１０ｍｌのＴＢＳ−Ｃａ緩衝液で２回洗浄した後、２０ｕｎｉｔのＴｈｒｏｍｂｉｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加したＴＢＳ−Ｃａ緩衝液１ｍｌ中に懸濁した。マイクロチューブローテーター（アズワン株式会社）を用いて４℃で１２時間撹拌した後、３，０００×ｇで１０分間遠心分離を行なって上清を回収した。

得られた上清にＴＢＳ−Ｃａ緩衝液で平衡化したＢｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^TM ４Ｂ（１００μｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加した後、マイクロチューブローテーター（アズワン株式会社）を用いて４℃で１時間撹拌し、次いで３，０００×ｇで１０分間遠心分離を行なって上清を回収した。この上清を、Ａｍｉｃｏｍ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ＹＭ−３（ミリポア株式会社）を用いて濃縮してｈＤｓｇ１ポリペプチドの最終精製産物を得た。

タンパク質量の測定を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）を用いて行った。ｈＤｓｇ１ポリペプチドのうち、ＴＹ２５６８（アミノ酸５３〜５４５位）およびＴＹ２５７１（アミノ酸７４〜５４５位）については、検出可能なポリペプチドの産生は見られなかった。しかし、ＴＹ２５７２（アミノ酸１１２〜５４５位）、ＴＹ２５２１（アミノ酸１６０〜５４５位）、ＴＹ２５２０（アミノ酸１６０〜３８５位）、ＴＹ２５９２（アミノ酸１９０〜５４５位）、ＴＹ２６１２（アミノ酸２２１〜５４５位）、ＴＹ２５９３（アミノ酸２４０〜５４５位）およびＴＹ２５９４（アミノ酸２７２〜５４５位）においては、純度のよいポリペプチドが高収率（≧１００μｇ／ｌ）で得られた。特に、ＴＹ２５９３（アミノ酸２４０〜５４５位）においては、その収率が３００μｇ／ｌであった（表３）。

以上の結果より、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるヒトＤｓｇ１ポリペプチドの発現には、ヒトＤｓｇ１タンパク質のＥＣ２領域が重要であること、およびＥＣ１領域を欠失することがより好ましいことが示された。また、ヒトＤｓｇ１タンパク質のアミノ酸１１２〜３８５を含むポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて大量生産できることがわかった。

〔実施例６：表皮剥脱毒素によるヒトＤｓｇ１ポリペプチド切断〕
実施例５で精製した種々の長さのｈＤｓｇ１ポリペプチド（１０ｎｇ／μｌ）１０μｌに、２μｌの表皮剥脱毒素（ＥＴＡ：１００ｎｇ／μｌ）、および８μｌのＴＢＳ−Ｃａ緩衝液を加えて２５℃で１時間反応させた後、この反応混合液と等量のサンプル緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）、２％ ＳＤＳ、２％ ２−メルカプトエタノール（片山化学工業）、１０％ グリセリン（和光純薬株式会社）、０．１％ Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ Ｂｌｕｅ溶液（和光純薬株式会社）を含有する）を加えて、反応を停止させた。

ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動をＬａｅｍｍｌｉの方法に従い、縦型電気泳動装置（Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて行った。分離ゲルとして、１２％ポリアクリルアミドゲルを用いた。６．１６ｍｌの３０％アクリルアミド−Ｂｉｓ溶液（３０％アクリルアミド（第一化学株式会社）および０．８％ Ｎ，Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ−Ｂｉｓ−ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（シグマ株式会社）を含有する）、３．９６ｍｌの１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．１６ｍｌの１０％ ＳＤＳ、１６μｌのＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−Ｔｅｔｒａｎｅｔｈｙｌｅｔｈｅｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＴＥＭＥＤ、シグマ株式会社）、および４．９４ｍｌのイオン交換水を混合し、さらに１０％ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｐｅｒｏｘｏｄｉｓｕｌｆａｔｅ（ＡＰＳ、シグマ株式会社）を１６０μｌ添加して、この混合液を重合させた。濃縮ゲル（３枚分）を、３０％アクリルアミド−Ｂｉｓ溶液を０．６５２ｍｌ、０．５５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）を１．２４ｍｌ、１０％ ＳＤＳを５２μｌ、ＴＥＭＥＤを５．３μｌ、イオン交換水を２．９８ｍｌを混合し、１０％ ＡＰＳを５２μｌ添加して重合させて作製した。作製したゲルを電極アッセンブリに取り付け、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）、１９２ｍＭグリシン（和光純薬株式会社）、０．１％ ＳＤＳを含有する）で満たした泳動槽内に静置した。ｈＤｓｇ１ポリペプチドサンプルを沸騰水中で５分間加熱処理し、各々２５ｎｇ／ｗｅｌｌのサンプルをゲルにアプライした。電気泳動の条件は、濃縮ゲルにおいて２０ｍＡ、分離ゲルにおいて３０ｍＡの一定電流とした。泳動後のゲルの染色には、０．０４％クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色液（０．０４％ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ（片山化学工業）、１０％ 酢酸、２５％イソプロパノール）を用いた。１〜２時間染色した後、１０％酢酸を用いて脱色した。

ウエスタンブロッティング法を、Ｔｏｗｂｉｎらの方法に従って行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）へのタンパク質の転写を、ｍｉｎｉ−ｔｒａｎｓｂｌｏｔ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて行なった。タンパク質を転写した膜を、０．５％脱脂粉乳を用いて、３７℃で１時間ブロッキング処理した後、ＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて洗浄した。

Ｓ−ｐｒｏｔｅｉｎ ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（メルク株式会社）を脱脂粉乳で５０００倍希釈して、ブロッキング処理後の膜状にアプライし、３７℃で１時間反応させた。続いて、目的のタンパク質を、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いる化学発色によって検出した。

用いたｈＤｓｇ１ポリペプチドのうち、ＴＹ２５２１（アミノ酸１６０〜５４５位）、ＴＹ２５２０（アミノ酸１６０〜３８５位）、ＴＹ２５９２（アミノ酸１９０〜５４５位）、ＴＹ２６１２（アミノ酸２２１〜５４５位）、およびＴＹ２５９３（アミノ酸２４０〜５４５位）が、表皮剥脱毒素（ＥＴＡ）によって顕著に切断された。これに対して、ＴＹ２５６８（アミノ酸５３〜５４５位）、ＴＹ２５７１（アミノ酸７４〜５４５位）、ＴＹ２５７２（アミノ酸１１２〜５４５位）、およびＴＹ２５９４（アミノ酸２７２〜５４５位）は、表皮剥脱毒素によってほとんど切断されなかった（図２および表４）。

以上の結果より、表皮剥脱毒素によるヒトＤｓｇ１ポリペプチドの切断には、ヒトＤｓｇ１タンパク質のＥＣ２領域が重要であること、およびＥＣ１領域を欠失することによって表皮剥脱毒素に対する感受性が有意に増加することが示された。また、ヒトＤｓｇ１タンパク質のアミノ酸１６０〜３８５を含むポリペプチドは、表皮剥脱毒素に対する感受性が高く、酵素アッセイにおいて良好な基質となることがわかった。

また、高収率（３００μｇ／ｌ）であったＴＹ２５９３（アミノ酸２４０〜５４５位）を用いて行なった表皮剥脱毒素処理サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＣＢＢ染色したゲルを、図３に示す。表皮剥脱毒素として血清型Ａ、ＢおよびＤを用いたが、いずれの血清型の表皮剥脱毒素に対してもヒトＤｓｇ１ポリペプチドが効率よく切断された。

〔実施例７：ヒトＤｓｇ１ポリペプチドの切断部位を特異的に認識する抗血清の作製〕
ｈＤｓｇ１の表皮剥脱毒素による切断部位は３８１番目のグルタミン酸であるので、ｈＤｓｇ１のアミノ酸３７６〜３８１位（ＣＬＮＶＩＥ）に対応するペプチドを合成した。合成したペプチドを、ＴＳＫ ｇｅｌ ＯＤＳ−１２０Ｔカラム（４．６ｍｍ（Ｉ．Ｄ）×１５０ｍｍ：Ｔｏｓｏｈ）を用いたＨＰＬＣによって精製した。Ｉｍｊｅｃｔ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ピアス社）を、キャリアータンパク質として上記ペプチドへ結合させた。Ｒｉｂｉ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＡＳ、ＲＩＢＩ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）を用いて、キャリアータンパク質を結合させたペプチドを含む抗原液を作製した。この抗原液（０．２５ｍｇ／ｍｌ）５００μｌを、日本白色種ウサギ（北山ラベス、２ｋｇ、オス）に２週間おきに４回皮下注射した。続いて、異なる抗原液を調製した。具体的には、キャリアータンパク質を結合させたペプチド５００μｌ（１００μｇ）とフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）５００μｌとを混濁させた抗原液を調製した。この抗原液を２週間おきに６回目皮下注射した。続いて、ｈＤｓｇ１タンパク質精製標品５００μｌ（１００μｇ）をウサギに静脈内投与し、投与２日後に２２Ｇサーフロー留置針（テルモ株式会社）を用いて耳下静脈より静脈血（２０ｍｌまたは１００ｍｌ）を採取した。採取した静脈血は３７℃、一時間静置した後に３，０００ｒｐｍで３０分間（４℃）で遠心分離を行なって、血清画分を抽出して目的の抗体（抗Ｄｓｇ１切断抗体）を含む抗血清を得た。

〔実施例８：表皮剥脱毒素によって切断された組換えヒトＤｓｇ１ポリペプチドの検出〕
実施例７で取得した抗血清（抗Ｄｓｇ１切断抗体）の結合特異性を検討した。具体的には、実施例５で取得したＴＹ２５９３（アミノ酸２４０〜５４５位）ポリペプチドと活性型または不活性型の表皮剥脱毒素とをインキュベートして、ＴＹ２５９３ポリペプチドのＮ末端側の切断フラグメントに対する上記抗血清の特異性を調べた。

ウエスタンブロッティング法における検出に用いる抗体が異なることを除いて、実施例６と同様に行なった。

実施例７で取得した抗Ｄｓｇ１切断抗体を脱脂粉乳で１０００倍に希釈して、ブロッキング処理後の膜上にアプライし、３７℃で１時間反応させた。続いて、ＴＢＳを用いて洗浄した後、二次抗体として脱脂粉乳で１０００倍に希釈したｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、洗浄後の膜上にアプライし、３７℃で１時間反応させた。ＴＢＳを用いて洗浄した後、発色を行なった。目的のタンパク質を、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いる化学発色によって検出した。検出にはＦｕｊｉ ＲＸ−Ｕ ｆｉｌｍ（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ ｃｏ．）を使用した。

抗Ｅタグ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を脱脂粉乳で５００倍希釈して、ブロッキング処理後の膜状にアプライし、３７℃で１時間反応させた。続いて、ＴＢＳを用いて洗浄した後、二次抗血清として脱脂粉乳で１０００倍に希釈したｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、洗浄後の膜上にアプライし、３７℃で１時間反応させた。二次抗体反応終了後の工程を、上記の抗Ｄｓｇ１切断抗体の場合と同様に行なった。

作製した抗血清（抗Ｄｓｇ１切断抗体）は、表皮剥脱毒素によって切断されたヒトＤｓｇ１ポリペプチドを認識するが、切断されていないヒトＤｓｇ１ポリペプチドを全く認識しなかった（図４）。また、表皮剥脱毒素の酵素活性のない変異体を用いた場合には、ヒトＤｓｇ１ポリペプチドの切断は生じなかった。

以上の結果より、取得した抗血清は、表皮剥脱毒素によって切断されたヒトＤｓｇ１ポリペプチドと特異的に結合することが示された。

本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

本発明を用いることによって、被験体が黄色ブドウ球菌を保有するか否かを簡便に同定し得る。特に、被験体が伝染性膿痂疹に罹患しているか否かを簡便に同定し得る。

図１は、作製した種々のヒトＤｓｇ１ポリペプチド変異体の構造ダイアグラムを示す図である。 図２は、ヒトＤｓｇ１ポリペプチド変異体の表皮剥脱毒素感受性を示すウエスタンブロッティング分析の結果を示す図である。 図３は、ヒトＤｓｇ１ポリペプチドを基質として表皮剥脱毒素（ＥＴＡ、ＥＴＢまたはＥＴＤ）による切断実験の結果を示す図である。 図４は、表皮剥脱毒素によって切断されたヒトＤｓｇ１ポリペプチドと特異的に結合する抗血清を用いたウエスタンブロッティング解析の結果を示す図である。 図５は、本発明に係るヒトＤｓｇ１ポリペプチドをＥ．ｃｏｌｉにおいて発現するために好ましい発現ベクターの概略図を示す。

Claims (33)

1. 配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４０〜３８５位を含むことを特徴とするポリペプチド。
2. Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現し得るポリペプチドであって、
   （Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０〜５４５位；または
   （Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０〜５４５位において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、
   からなるポリペプチドあるいはそのフラグメントでありかつ配列番号１に示されるアミノ酸配列の２４０〜３８５位を含むことを特徴とするポリペプチド。
3. 配列番号９、１１、１３、１５または１７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
4. Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現し得るポリペプチドであって、配列番号２に示される塩基配列の５５５〜１７１２位を含むポリヌクレオチドによってコードされることを特徴とするポリペプチド。
5. Ｅ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現し得るポリペプチドであって、
   （Ａ）配列番号２に示される塩基配列の５５５〜１７１２位；または
   （Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の５５５〜１７１２位において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、
   からなるポリヌクレオチドあるいはそのフラグメントでありかつ配列番号２に示される塩基配列の７９５〜１２３２位を含むポリヌクレオチド
   によってコードされることを特徴とするポリペプチド。
6. 配列番号１０、１２、１４、１６または１８のいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることを特徴とするポリペプチド。
7. 請求項１〜６の何れか１項に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド、あるいは
   請求項１〜６の何れか１項に記載のポリペプチドをコードする特徴とするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＥ．ｃｏｌｉ組換え発現系において発現し得るポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
8. 配列番号１０、１２、１４、１６または１８のいずれか１つに示される塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
9. 配列番号２３〜３４のいずれか１つに示される塩基配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
10. 請求項７または８に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
11. 発現ベクターであることを特徴とする請求項１０に記載のベクター。
12. Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターであることを特徴とする請求項１１に記載のベクター。
13. 請求項１０に記載のベクターを含有することを特徴とする細胞。
14. Ｅ．ｃｏｌｉであることを特徴とする請求項１３に記載の細胞。
15. 請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のベクターを用いることを特徴とするポリペプチド生成方法。
16. 上記ベクターが、ヒスチジンタグおよびチオレドキシンタグを付加させることを特徴とする請求項１５に記載のポリペプチド生成方法。
17. Ｈｉｓタグとの親和性樹脂を用いて精製する工程をさらに包含し、当該工程においてイミダゾールを使用しないことを特徴とする請求項１６に記載のポリペプチド生成方法。
18. インビトロ翻訳に必要な酵素をさらに用いることを特徴とする請求項１５に記載のポリペプチド生成方法。
19. 請求項１〜６の何れか１項に記載のポリペプチドを備えることを特徴とする表皮剥脱毒素の測定キット。
20. 上記ポリペプチドに対する抗体または上記ポリペプチドに連結した標識に対する抗体をさらに備えることを特徴とする請求項１９に記載の測定キット。
21. 表皮剥脱毒素の測定方法であって、
    （１）被験体サンプルを請求項１〜６の何れか１項に記載のポリペプチドとインキュベートする工程；および
    （２）当該インキュベートする工程において切断された当該ポリペプチドを検出する工程、
    を包含することを特徴とする測定方法。
22. 上記検出する工程が、上記ポリペプチドに対する抗体または上記ポリペプチドに連結した標識に対する抗体を用いることを特徴とする請求項２１に記載の測定方法。
23. 請求項１〜６の何れか１項に記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体。
24. 追加免疫を５回以上行なうことを特徴とする請求項２３に記載の抗体を生成する方法。
25. 請求項２３に記載の抗体を備えることを特徴とする表皮剥脱毒素の測定キット。
26. 上記抗体に対する抗体または上記抗体に連結した標識に対する抗体をさらに備えることを特徴とする請求項２５に記載の測定キット。
27. 表皮剥脱毒素の測定方法であって、
    （１）被験体サンプルを請求項２３に記載の抗体とインキュベートする工程；および
    （２）上記抗体と結合した物質を検出する工程、
    を包含することを特徴とする測定方法。
28. 上記検出する工程が、上記抗体に対する抗体または上記抗体に連結した標識に対する抗体を用いることを特徴とする請求項２７に記載の測定方法。
29. 請求項１〜６の何れか１項に記載のポリペプチドが支持体上に固定化されていることを特徴とする細菌検出器具。
30. 表皮剥脱毒素のスクリーニング方法であって、
    （１）被験体サンプルを請求項１〜６の何れか１項に記載のポリペプチドとインキュベートする工程；および
    （２）当該インキュベートする工程において切断された当該ポリペプチドを検出する工程、
    を包含することを特徴とするスクリーニング方法。
31. 表皮剥脱毒素のスクリーニング方法であって、
    （１）被験体サンプルを請求項２３に記載の抗体とインキュベートする工程；および
    （２）上記抗体と結合した物質を検出する工程、
    を包含することを特徴とするスクリーニング方法。
32. 切断されたポリペプチドが検出された被験体サンプルを表皮剥脱毒素に対する抗体とインキュベートする工程をさらに包含することを特徴とする請求項３０または３１に記載のスクリーニング方法。
33. 被験体サンプルから単離した表皮剥脱毒素を配列決定して既知の表皮剥脱毒素の配列と比較する工程をさらに包含することを特徴とする請求項３０〜３２の何れか１項に記載のスクリーニング方法。