JP2005535906A - 膜体上で電気的測定を実行するための装置および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
に関する。
イオンチャネルおよびレセプターの電気活性を研究するための様々な方法が当業者に知られている。
前世紀の50年代、生体細胞の膜内のイオンチャネルおよびレセプターの活性を定量するための正確で信頼性のある方法として、電圧クランプ法が確立された[1、2]。この場合、研究すべき細胞を2つのマイクロ電極、すなわち、一気に引き延ばされ、塩溶液で満たされたガラスキャピラリーに接触させる。ひとつの電極は細胞内部の電位、すなわち、細胞膜を横断する電圧降下を測定する。もうひとつの電極は細胞膜と通過する電気的に調整された電流フローを発生させるために用いられる。電圧クランプ装置では、この電流フローを調整して、細胞膜全体で電位が一定になるようにする(それゆえ、「電圧クランプ」という)。それで、膜を通って流れる電流のサイズは、細胞膜内のレセプターによって直接的または間接的に活性化される細胞膜にあるイオンチャネルの活動に対する直接的であり非常に正確かつ適切な指標である。
あるいは、「電流クランプ」法において、電流をしばしばゼロの固定値に設定し、次いで任意に設定した膜電圧を測定する(無電流測定の場合には、たった一つのマイクロ電極しか必要ない)。そのため、電圧の値は細胞内にあるレセプターおよびチャネルの活性を反映するが、この装置は電圧クランプ法ほど情報量がなく、正確でもない。なぜならば、電流クランプ装置においてはレセプターの活性と実測電圧信号との関係は通常線形でなく、一方、電圧クランプ装置において、実測電流信号と開放イオンチャネルの数とは正比例するからである。
従来の電気生理学的電圧クランプ法および電流クランプ法の欠点は、それらが非常に大きな細胞、例えば、イカの神経突起、筋肉細胞またはカエル卵細胞にしか適さないことである。電気生理学的実験の対象となり得る全ての細胞(例えば、神経細胞、内分泌細胞、ある種の培養細胞)のうちほとんどが非常に小さくて、この方法には使用できない。もうひとつの欠点は、全ての電気生理学的測定と同様に、この方法は非常に複雑であり、経験のある技術者によって手動で行わなければならず、そのため、一日にわずかな実験しか行えず、工業的有効物質調査(「高スループットスクリーニング(high throughput screening)」またはHTS)が排除されてしまう。
パッチクランプ法の欠点は、測定のための複雑な準備であり、経験のある電気生理学者でも一日に約20測定しかできない。これは、現代の高スループット法の要求からするとかなり少ない。さらに、従来のパッチクランプ技術は相当な経験とかなりの手先の器用さを要求し、この理由により、自動化できる程度が限定される。
生存細胞間のコミュニケーションに特別な役割を演じる生体タンパク分子、いわゆるコネキシンが当業者に知られている。いまでは、約15種の異なるコネキシンをそれらのアミノ酸配列に基づき単離し得る[15、16]。コネキシンは全ての脊椎動物に発生し、通常、略号、例えば、Cx26と呼ばれる。ここに、この数字はコネキシンのクロマトグラフィックサイズをkDで示す。現在まで、約26kDと56kDの間の分子量を有するコネキシンが知られている。これの代りとして、二番目に一般的な命名法があり、それは構造的特徴を補助として、コネキシンを少なくとも3つのクラスa、bおよびcに分類し、次いで、個々のクラスで対応するコネキシンに番号を付ける。
脊椎動物は、機能的に同じ分類の膜タンパク質を有していることも知られおり、それらはイネキシンとして知られている[19]。しかしながら、それらで形成されたチャネルは2000ダルトンまでの分子量の分子を通過させてしまうかなり大きな孔を有している。
ギャップジャンクションと同じ特性を有する連結が植物の細胞間でも同様に発生し、それらは、細胞間連結と呼ばれている。それらも近隣の細胞の中間細胞壁に広がり、同様に、細胞から細胞への限定数のイオンや小分子を通過させる。しかしながら、生体動物組織内のチャネルとは対象的に、細胞間連結は形質膜によって制限される。
機能的ギャップジャンクションの検出は、電気的測定(二重電圧クランプ)または低分子量の染料(例えば、ルシファーイエロー)の移動の光学的観察により実施することができる。後者は、画像加工法により細胞全体の連結を評価することを可能にする。
堆積膜体の膜全体の電荷移動および/または電位差は、今や、好ましく誘導され、2つの電極により定量され得る。
本発明は、本発明の方法によって同定された有効物質ならびにそれらの製造方法にも関する。
「膜電位」とは、膜の反対側との間の電位差である。
1.電気的測定機器(1)、電極(2)、コネキシンまたはイネキシン(4)を含有する膜(3)、および同様にコネキシンまたはイネキシン(6)を含有する膜体(5)を含有し、膜体上の電気信号を測定するための測定器具であって、膜体から離れて対向する膜側から膜体の内部までの電気的導通アクセス(conducting access)が、ギャップジャンクションチャネル(7)によって作られていることを特徴とする測定器具。
2.生体の膜体上の電気信号を測定する方法であって、項目1に記載の測定器具を用いることを特徴とする方法。
3.測定される電気信号が、
(i) 膜体の膜電位;
(ii) 膜全体に流れる電流;および/または
(iii) 膜の電気容量
である項目2に記載の方法。
4.レセプターおよび/またはイオンチャネル(8)の特性に影響する有効物質を同定する方法であって、
(i) 上記レセプターおよび/またはイオンチャネルを含有する少なくとも1の膜体(5)を少なくとも1の試験物質に接触させ;次いで、
(ii) 項目1に記載の測定器具を用いて、少なくとも1の電気信号を膜体または複数の膜体上で測定する
ことを特徴とする方法。
5.膜体内へまたは膜体から物質を移動させる方法であって、前記物質がギャップジャンクションチャネルを通って膜体に進入するか、または膜体を退出することを特徴とする方法。この場合、移動すべき物質は、本発明の器具の膜を通る電気的電位勾配、濃度勾配または圧力勾配に沿う。
6.膜が支持二重層として構成される項目1に記載の測定器具。
7.前記膜が脂質適合ポリマー中間膜を備えたシリカゲル基板上の支持二重層、すなわち、「束縛二重層」として構成される項目6に記載の測定器具。
8.キャピラリーの末端を覆う膜を備えた項目1に記載の測定器具。
9.物質の検出用のバイオセンサーとしての項目1に記載の測定器具の使用。
10.細胞培養中の生きている細胞の成長のための、前記細胞の電気的活性をモニターする設備を備えた基板としてのコネキシン−ドープ膜の使用。
11.膜が生きている細胞の形態であることを特徴とする項目1に記載の測定器具。
膜体上で電気信号を測定するための測定器具を図1に示す。それは、小チャンバー、例えば、マイクロ滴定プレートの底部に電極(例えば、金電極)を含む。電気的に緊密な合成膜(3)を電極の上方にはめ込み、膜と電極との間の中間スペースにはイオン貯蔵庫としての電解溶液を入れる。測定器具は第2の電極も有し、それは合成膜の上方に配置する。機能的半チャネル(コネクソン)を合成膜に結合して、それらが膜内を自由に拡散し得るようにし、それらの通常の細胞外ドメインは膜の上方(トランス)にある。意図する目的に合わせて適当なコネキシン型を用いる。所望により、コネクソンは1を超えるコネキシン(異種コネキシン)で構成することができる。研究する有効物質を添加していないときに最低電気信号を測定し、有効物質と研究するイオンチャネルおよび/またはレセプター(8)との間に相互作用があるとき、観察信号において最大の増大が発生する。
基板に適用された細胞がギャップジャンクションを形成することによってイオン貯蔵庫との電気的連結を獲得する目的の最初の構成の発生は、同様に、電気的測定によってモニターし得る。特に、当業者に知られている適当な電気的測定法によって、膜およびギャップジャンクションを介してそれと連結している膜体の電気容量を測定することが可能である。この方法は、系の総膜面積を調べ、そして、ギャップジャンクションを介して膜と連結している堆積細胞数を定量する。この信号を用いて、この器具に対する試験物質の効果を決定することもできる。特に、堆積膜体におけるエキソサイトーシスの発生がこのようにして確かめられる。
代わりとして、適当な染料をイオン貯蔵庫または細胞に付加することによって、イオン貯蔵庫との導通にすでに参入している細胞の数を光学的に検出する。ギャップジャンクション通って拡散し得る定分子量の染料、例えば、ルシファーイエローがこれにふさわしい。
実施例1に記載のレイアウトを変更して、複数または相当数の記載されたチャンバーを互いに隣り合わせて配置する。例えば、マイクロ滴定プレートの各チャンバーが実施例1の測定器具を構成するようにする。個々の測定チャンバーを連続的に、まとめて、または同時に読み出す。なかでも、MEA(多重電極アレイ)技術から知られているような多重チャネル増幅システムまたは高エネルギー物理学における検出器をこれに用いることができる。
用いるマイクロ滴定プレートは、例えば、9個、384個、1536個またはいずれかの個数のチャンバーを持つものである。かくして、測定器具は、HTSシステムおよび有効物質調査ですでに確立されている設置に機械的および位置的に適合するように、実際の有効物質調査につき、本発明の技術的使用に対する障害がないように、好ましく構成される。そのため、計量し分注するための現行の道具を引き続き用いることができる。単に、マイクロ滴定プレートから電気信号を読み出すことができる適当なリーディングヘッドを検出装置に取り付けるだけである。
2 電極
3 膜
4 コネキシンまたはインネキシン
5 膜体
6 コネキシンまたはインネキシン
7 ギャップジャンクションチャネル
8 標的
Claims (10)
- 電気的測定機器(1)、電極(2)、コネキシンまたはイネキシン(4)を含有する膜(3)、および同様にコネキシンまたはイネキシン(6)を含有する膜体(5)を含有し、膜体上の電気信号を測定するための測定器具であって、膜体から離れて対向する膜側から膜体の内部までの電気的導通アクセス(conducting access)が、ギャップジャンクションチャネル(7)によって作られていることを特徴とする測定器具。
- 生体の膜体上で電気信号を測定する方法であって、請求項1に記載の測定器具を用いることを特徴とする方法。
- 測定される電気信号が、
(i) 膜体の膜電位;
(ii) 膜全体に流れる電流;および/または
(iii) 膜の電気容量
である請求項2に記載の方法。 - レセプターおよび/またはイオンチャネル(8)の特性に影響する有効物質を同定する方法であって、
(i) 上記レセプターおよび/またはイオンチャネルを含有する少なくとも1の膜体(5)を少なくとも1の試験物質に接触させ;次いで、
(ii) 請求項1に記載の測定器具を用いて、少なくとも1の電気信号を膜体または複数の膜体上で測定する
ことを特徴とする方法。 - 膜体内へまたは膜体から物質を移動させる方法であって、前記物質がギャップジャンクションチャネルを通って膜体に進入するか、または膜体を退出し、前記物質の移動が濃度勾配、電圧差または圧力差によって駆動されることを特徴とする方法。
- 膜が支持二重層として構成される請求項1に記載の測定器具。
- 前記膜が脂質適合ポリマー中間膜を備えたシリカゲル基板上の支持二重層、すなわち、「束縛二重層」として構成される請求項6に記載の測定器具。
- 物質の検出用のバイオセンサーとしての請求項1に記載の測定器具の使用。
- 細胞培養中の生きている細胞の成長のための、前記細胞の電気的活性をモニターする設備を備えた基板としてのコネキシン−ドープ膜の使用。
- 膜が生きている細胞の形態であることを特徴とする請求項1に記載の測定器具。
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