JP2005534655A - メタロプロテイナーゼ阻害因子 - Google Patents

Abstract

本発明は、乳や初乳などの乳汁分泌物から抽出することのできるメタロプロテイナーゼの阻害因子を提供する。この阻害因子は、消化管の障害、心臓血管系の状態、及び創傷治癒など、ある範囲の疾患の治療に用途を有する。この阻害因子の精製方法も開示する。

Description

本発明は、抗プロテイナーゼ活性を有する、乳及び初乳を含む乳汁分泌物由来の組成物に関する。より詳細には、メタロプロテイナーゼに対して活性があり、創傷及び消化管の障害の治療に有用な組成物に関する。

本明細書に引用する参照文献は、いずれも従来技術を構成することを認めるものではない。参照文献についての議論では、その著者が主張することを述べることとし、出願人は、引用した文書の正確さ及び妥当性について吟味する。本明細書ではいくつかの従来技術の刊行物を参照するが、このような参照は、それら文書がオーストラリア又は他の国において当技術分野の一般常識の一部をなすことを認めるものではないことは明確に理解される。

プロテイナーゼは、身体の多くの組織に存在する天然の酵素である。この酵素は通常、タンパク質を特異的に分解する働きをする。標的タンパク質が制御なく破壊されるのを防ぐため、酵素活性は、阻害物質によって調節される。すなわち、プロテイナーゼと阻害因子が協同でバランスよく作用して、生物活性や構造として重要な生体タンパク質のレベルを制御する働きをし、それによって多くの重要な生理的過程が調節される。

プロテイナーゼの重要な一群が、メタロプロテイナーゼである。この酵素は、タンパク質分解を触媒するのに金属イオンの存在を必要とすることを特徴とする。およそ１７種の異なるメタロプロテイナーゼが同定及び／又はクローン化されており、それらは顕著な配列相同性を共有する。メタロプロテイナーゼファミリーは、その構造及び機能の特性に従って次の５群、すなわち（ｉ）コラゲナーゼ（メタロプロテイナーゼ１、８、及び１３）、（ｉｉ）ゼラチナーゼＡ及びＢ（メタロプロテイナーゼ２及びメタロプロテイナーゼ９）、（ｉｉｉ）ストロメライシン１及び２（メタロプロテイナーゼ３及び１０）、（ｉｖ）マトリリシン（ＭＭＰ−７）、エナメリシン（ＭＭＰ−２０）、マクロファージメタロエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）、及び（古典的なメタロプロテイナーゼを構成する）ＭＭＰ−１９、並びに（ｖ）膜型メタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ−１〜４及びストロメリシン３、ＭＭＰ−１１）（Ｗ．Ｂｏｄｅら、Ａｎｎ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．第８７８巻、７３ページ、１９９９年）に細分することができる。これらのメタロプロテイナーゼは、共通の多ドメイン構造をもつ仲間であるが、異なる範囲及び異なる部位でグリコシル化されている。配列アラインメントによれば、そのようなドメインの集合は、初期の進化事象であり、その後多様化したようである。共同で、メタロプロテイナーゼは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の主要な構成成分をすべて分解することができる。

ＥＣＭの恒常性は、ＥＣＭタンパク質の合成、ＥＣＭ分解性細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の産生、及びメタロプロテイナーゼ阻害因子の存在の微妙なバランスによって制御される。

メタロプロテイナーゼの一ファミリーは、メタロプロテイナーゼ組織阻害因子（ＴＩＭＰ）である。ＴＩＭＰファミリーは、少なくとも４種の異なるメンバー（ＴＩＭＰ−１〜４）からなり、１２個の保存システイン残基を有し、メタロプロテイナーゼと非共有結合性の複合体を形成してメタロプロテイナーゼ阻害活性を示す。具体的には、ＴＩＭＰは、メタロプロテイナーゼの保存性の高い活性な亜鉛結合部位に１：１の化学量論比で結合するが、メタロプロテイナーゼ２及びメタロプロテイナーゼ９の他のドメインにも結合することができる。ＴＩＭＰは、その阻害性の役割の他、増殖因子様活性、抗血管形成活性、及び抗アポトーシス活性を含む、直接にはプロテイナーゼ阻害のためでないと思われる他の機能も有するようである。

ＴＩＭＰは、骨、羊水、軟骨、大動脈内皮細胞、及び皮膚線維芽細胞など、多様な範囲の生体組織で確認されている。メタロプロテイナーゼ阻害因子を単離するために、これらの組織は十分に精製する必要があり、これらの組織は、ヒトへの使用に向けたバイオセーフティー問題に関わる。その上、これらの供給源では、ＴＩＭＰを限られた量しか得ることができない。

本発明の一側面は、メタロプロテイナーゼ阻害因子の豊富な供給源、並びにこの阻害因子の精製方法を提供して、従来技術に関連する１つ又は複数の問題点又は不備を克服し、又は少なくとも軽減することである。さらには、阻害因子を含む組成物、並びに本明細書に記載の組成物を使用する様々な状態及び疾患の治療方法を開示することである。

第１の態様では、本発明は、哺乳動物の乳汁分泌物から直接的又は間接的に得られる、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物を提供する。出願人らは、乳及び初乳、特にウシの乳又は初乳が、有用な量のメタロプロテイナーゼ阻害因子を含有していることを発見した。

第２の態様では、本発明は、望ましくないメタロプロテイナーゼ活性が関係する障害を治療し、予防し、又は寛解させる方法であって、その必要のある動物に、乳汁分泌物由来のメタロプロテイナーゼ阻害因子を含む有効量の組成物を投与することを含む方法を提供する。この方法は、例えば、創傷治療、消化管障害、及び心臓血管障害の分野で有用である。

第３の態様では、本発明は、メタロプロテイナーゼ阻害因子を少なくとも部分的に精製又は濃縮する方法であって、
乳汁分泌物又はその派生物を準備するステップと、
乳汁分泌物又はその派生物を、遠心分離、精密濾過、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、及び一過性の酸性化からなる群から選択された１種又は複数の処理ステップにかけるステップと
を含む方法を提供する。

第１の態様では、本発明は、哺乳動物の乳汁分泌物から直接的又は間接的に得られる、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物を提供する。出願人らは、有蹄動物の乳及び初乳が、メタロプロテイナーゼ阻害因子の供給源として有用であることを証明した。この阻害因子が有蹄類動物の乳及び初乳中にあるという思いがけない知見によって、メタロプロテイナーゼ阻害因子を豊富に生じる供給源が継続可能にもたらされる。本明細書では、用語「メタロプロテイナーゼ」は、細胞外マトリックスの構成成分をタンパク質分解によって分解するプロテアーゼを含む。用語メタロプロテイナーゼには、（ｉ）コラゲナーゼ（メタロプロテイナーゼ１、８、及び１３）、（ｉｉ）ゼラチナーゼＡ及びＢ（メタロプロテイナーゼ２及びメタロプロテイナーゼ９）、（ｉｉｉ）ストロメライシン１及び２（メタロプロテイナーゼ３及び１０）、（ｉｖ）マトリリシン（ＭＭＰ−７）、エナメリシン（ＭＭＰ−２０）、マクロファージメタロエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）、及び（古典的なメタロプロテイナーゼを構成する）ＭＭＰ−１９、及び（ｖ）膜型メタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ−１〜４及びストロメリシン３、ＭＭＰ−１１）が含まれるがこれだけに限らない。

本発明においては、用語「乳汁分泌物」は、哺乳動物の乳腺からのどんな分泌物も含む（乳及び初乳を含むがこれに限らない）。哺乳動物は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、又はウマでよい。

本発明は、乳汁分泌物の派生物の使用も含む。乳汁分泌物の有用な派生物としては、チーズホエー、脱脂乳、酸（カゼイン）ホエー、乾燥乳粉末、初乳ホエー、及び脱脂初乳を含むがこれらに限らない。またそのような派生物には、その脂肪及び／又はタンパク質構成成分の割合が変更されている任意の製品が含まれる。派生物には、クロマトグラフィー溶出物、濾液、保持液などの中間加工品も含まれる。

哺乳動物は、有蹄動物であることが好ましい。有蹄動物はウシであることが好ましい。他の有蹄動物と比べ、ウシは常に大量の乳を生産し、メタロプロテイナーゼ阻害因子の比較的安定且つ継続的な供給が保証される。出産したばかりのウシは、大量の初乳を出す。

メタロプロテイナーゼ阻害因子は、組成物中に約０．０１μｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在することが好ましい。メタロプロテイナーゼ阻害因子は、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１０００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在することがより好ましい。メタロプロテイナーゼ阻害因子は、約１μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在することがさらに好ましい。非常に好ましい実施形態では、メタロプロテイナーゼ阻害因子は、実施例３で記載する蛍光消光基質アッセイによって定量化した場合、約１１μｇ／ｍｌ、約４５μｇ／ｍｌ、又は約５０μｇ／ｍｌの濃度で存在する。

本発明の好ましい形態では、阻害因子は、メタロプロテイナーゼ組織阻害因子（ＴＩＭＰ）である。本明細書では、用語「メタロプロテイナーゼ組織阻害因子」は、それだけに限らないが、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３、及びＴＩＭＰ−４を含む、メタロプロテイナーゼの活性を調節するポリペプチドが含まれる。ＴＩＭＰファミリーは、少なくとも４種の異なるメンバー（ＴＩＭＰ−１〜４）からなり、１２個の保存システイン残基を有し、メタロプロテイナーゼと非共有結合性の複合体を形成してメタロプロテイナーゼ阻害活性を示す。詳細には、ＴＩＭＰは、メタロプロテイナーゼの高度に保存された活性亜鉛結合部位に１：１の化学量論比で結合するが、メタロプロテイナーゼ２及びメタロプロテイナーゼ９の他のドメインにも結合することができる。ＴＩＭＰは、その阻害因子としての役割の他、増殖因子様活性、抗血管形成活性、及び抗アポトーシス活性を含む、直接にはプロテアーゼ阻害によらないと思われる他の機能も有するようである。ＴＩＭＰは、様々な細胞型によって発現され、ほとんどの組織に存在する。ＴＩＭＰがある種の体液中にあることは記載されているが、有蹄動物乳汁分泌物中にメタロプロテアーゼ阻害因子が存在することを述べた報告はない。

ＴＩＭＰ−１は、当初はウサギの骨から単離され、コラゲナーゼ阻害因子として特徴付けられた（Ａ．Ｓｅｌｌｅｒｓ及びＪ．Ｊ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第１６７巻、３５３ページ、１９７７年）。その後、ヒトＴＩＭＰ−１が羊水（Ｇ．Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第１９５巻、１６７ページ、１９８１年）及び皮膚線維芽細胞から精製され、それ以来、他のいくつかの供給源から精製されている（総説については、Ｊ．Ｗｏｅｓｓｎｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１５１巻、１ページ、２００１年を参照のこと）。ヒトＴＩＭＰ−１は、ジスルフフィド結合及び特徴的な６ループ構造を形成する１２個のシステイン残基を含む１８４個のアミノ酸からなる。ヒトＴＩＭＰ−１は、大規模なグリコシル化を受ており、分子質量は約２８．５ｋＤａであるが、グリコシル化の程度に応じて、３０〜３４ｋＤａの範囲になることもある。

ヒトＴＩＭＰ−２は、グリコシル化を受けていない２１ｋＤａのタンパク質であり、当初は、ヒト黒色腫細胞及び線維芽細胞の上清（Ｇ．Ｉ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）第８６巻、８２０７ページ、１９８９年；Ｗ．Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６４巻、３７４ページ、１９８９年）及び肺胞マクロファージの条件培地（Ｓ．Ｄ．Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６７巻、１９９２年）中で７２ｋＤａのプロゼラスチナーゼ（ｐｒｏｇｅｌａｓｔｉｎａｓｅ）（ＭＭＰ−２）と同時に精製されたタンパク質として同定された。ヒトＴＩＭＰ−２は、アミノ酸のレベルでヒトＴＩＭＰ−１と４０％は同一であり、保存された６ジスルフィド結合構造を含む。

ウシＴＩＭＰ−２は、当初はウシ軟骨から単離され、コラゲナーゼ阻害因子として特徴付けられた（Ｊ．Ｍｕｒｒａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６１巻、４１５４ページ、１９８６年）。その後、ウシ大動脈内皮細胞の条件培地からＴＩＭＰ−２が単離され（Ｙ．Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６４巻、１７４４５ページ、１９８９年）、それによって、この細胞に由来するウシＴＩＭＰ−２のｃＤＮＡ配列がクローン化され、特徴付けられるようになった（Ｔ．Ｂｏｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）第８７巻、２８００ページ、１９９０年）。ウシＴＩＭＰ−２のｃＤＮＡは、アミノ酸２６個のリーダー配列とアミノ酸１９４個の成熟タンパク質配列をコードしている。ウシＴＩＭＰ−２は、アミノ酸のレベルでヒトＴＩＭＰ−２と９４％は同一であり、ウシＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−３とそれぞれ４１％及び４２％が同一である。ウシＴＩＭＰ−２とヒトＴＩＭＰ１、２、３及び４のアミノ酸配列については表１を参照されたい。

ＴＩＭＰ−３は、当初はニワトリ胚線維芽細胞から、グリコシル化を受けていない２１ｋＤａのタンパク質として同定され、精製された（Ｎ．Ｐａｖｌｏｆｆら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６７巻、１７３２１ページ、１９９２年）。ヒトの相同体は、後にＷＩ−３８線維芽細胞中で血清誘導型タンパク質として検出された（Ｍ．Ｗｉｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６９巻、１８９５３ページ、１９９４年）。ヒトＴＩＭＰ−３は、ヒトＴＩＭＰ−１及びヒトＴＩＭＰ−２とそれぞれ３０％及び３８％同一である。より最近では、分子クローニングによってＴＩＭＰファミリーの第４のメンバーであるＴＩＭＰ−４が同定されている（Ｊ．Ｇｒｅｅｎｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７１巻、３０３７５ページ、１９９６年）。ヒトＴＩＭＰ−４は、分子量が２２ｋＤａであると予想され、このタンパク質の組換え型の分子質量は２４ｋＤａである。

本発明のより好ましい形態では、阻害因子は、ウシＴＩＭＰ−２ポリペプチド又はその機能上同等物である。本明細書では、用語「機能上同等物」は、メタロプロテアーゼ活性阻害能がＴＩＭＰ−２と実質的に類似している分子を含む。機能上同等物は、核酸配列の少なくとも１種の突然変異の結果として生じるＴＩＭＰ−２の対立形質変異体が含まれ、その突然変異によってｍＲＮＡが変更されてもよく、或いはポリペプチドの構造又は機能が、変更されても、されなくてもよい。対立遺伝子は、ヌクレオチドが自然に欠失、置換、転位、又は付加を受ける結果として生じるものでよい。

「対立形質変異体（ａｌｌｅｌｉｃ ｖａｒｉａｎｔ）」において、用語「変異体」とは、１個又は複数のアミノ酸が変更されているアミノ酸配列を指す。変異体は、置換されたアミノ酸の構造上の特性又は化学的特性が類似している保存的な変更を有することができ、例えば、イソロイシンがロイシンで置換されていてよい。変異体は、置換されたアミノ酸の構造上の特性又は化学的特性が異なる、非保存的な変更を有してもよく、例えば、アラニンがグリシンで置換されていてよい。用語「変異体」はまた、グリコシル化の点での変更形態、並びに対立形質変異を含む他の変異も含む。かくして、このようなアミノ酸配列を含む改変タンパク質は、通常は機能又は構造がこれらのタンパク質と実質的に同等であり、そのようなものは類似体として定義される。メタロプロテイナーゼ阻害因子の変異体は、そのポリペプチドがメタロプロテイナーゼと非共有結合性の複合体を形成できるように、未変性アミノ酸配列の１２個のシスチン残基が保存されていることが好ましい。メタロプロテイナーゼ阻害因子の変異体は、そのポリペプチドがメタロプロテイナーゼと非共有結合性の複合体を形成できるように、未変性アミノ酸配列の１２個のシスチン残基が保存されているＴＩＭＰ−２であることがより好ましい。

ＴＩＭＰ−２は、分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって定量した場合２１，０００Ｄａであることが好ましい。さらに好ましい形態では、ＴＩＭＰ−２は、等電点が約７．０である。

ＴＩＭＰ−２は、Ｎ末端側配列のＮＨ２−ＣＳＣＳＰＶＨＰを含むことが好ましい。非常に好ましい形態では、ＴＩＭＰ−２は、次の配列を有する。

阻害因子は、メタロプロテイナーゼ２及び／又はメタロプロテイナーゼ９を阻害できることが好ましい。メタロプロテイナーゼ２は、ゼラチナーゼＡとしても知られている。メタロプロテイナーゼ２は、ペプチド結合に作用してＩＶ型コラーゲンの分解を触媒する、分子量が７２ｋＤａのタンパク質分解酵素である。メタロプロテイナーゼ９は、ゼラチナーゼＢとしても知られている。メタロプロテイナーゼ２は、ペプチド結合に作用してＩＶ型コラーゲンの分解を触媒する、分子量が９２ｋＤａのタンパク質分解酵素である。

阻害因子は、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼを阻害することができ、腫瘍壊死因子α変換酵素は阻害できないことが好ましい。

ＴＩＭＰ同士の配列相同性が低いことを考慮すると、これまでに同定されている４メンバーが異なる生物学的機能を備えていても意外ではない。重要なのは、ＴＩＭＰ−２及びＴＩＭＰ−３は、ＴＩＭＰ−１と異なり膜型ＭＭＰ（ＭＴ−ＭＭＰ）の有効な阻害因子であり、ＴＩＭＰ−３は腫瘍壊死因子α変換酵素（ＴＡＣＥ）の活性を阻害しても、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、又はＴＩＭＰ−４は阻害しない（Ａｍｏｕｒら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．第４３５巻３９〜４４ページ、１９９８年）ことである。

阻害因子は、増殖因子でなく、且つ／又はラットＬ６筋芽細胞の増殖を刺激できないことが好ましい。

さらに好ましい形態では、組成物は、中性〜塩基性付近の等電点を有する１種又は複数の細胞増殖刺激因子を含み、且つ／又はラットＬ６筋芽細胞を刺激することができる。

増殖因子は、トランスフォーミング増殖因子β、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子ＩＩ、ベータセルリン；当業界で記載のある線維芽細胞増殖因子の任意のメンバー、例えば線維芽細胞増殖因子Ｉ又は線維芽細胞増殖因子ＩＩ；インスリン様増殖因子結合タンパク質１、２、３、４、５、若しくは６；及び血小板由来増殖因子を含む群から選択されることが好ましい。

本発明の好ましい形態では、乳汁分泌物は、まずチーズホエーに加工してから組成物中に使用する。

チーズホエーは、チーズ製造の際に脂肪及びカゼインが本質的にすべて除去された、チーズ産業の副産物である。この業界の現状では、チーズホエーは、本質的に無価値であり、実際に、潜在的な汚染物質であるため製造上の純費用で取り扱われることがある。チーズホエーは、大量に入手できる低タンパク質高塩分の産物である。チーズホエー中に存在する主なタンパク質構成成分は、αラクトアルブミンン（αＬＡ）及びβラクトグロブリン（βＬＧ）であり、これらは通常、存在するタンパク質の９０％以上を占める。血清アルブミン、免疫グロブリン、及び残存カゼインもかなりの量で存在することもある。

組成物は、１種又は複数の担体及び／又は賦形剤を含んでよい。本発明の好ましい形態では、担体及び／又は賦形剤は、動物用薬剤として、栄養剤として、薬剤として、又は化粧品として許容されるものである。本発明による薬剤組成物及び化粧品組成物は、適切などんな方式の投与にも適合させることができる。組成物は、内服用、又は局所投与用に適合させることができる。組成物は、経口、注射用、局所、又は座剤の形態にすることができる。好ましい送達経路には、経皮、腟内、静脈内、呼吸器、及び消化管送達が含まれる。本明細書に記載の組成物は、ヒトでの使用に限らず、組成物から恩恵を得ることのできるどんな動物にも使用できることを理解されたい。

局所投与用組成物を含む薬剤組成物を調製するための方法及び薬剤用担体は、当業界でよく知られており、「レミントンの薬剤学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、米国ペンシルヴェニア州Ｅａｓｔｏｎなどの教本に記載されている。

本発明の組成物は、経口投与に適するように製剤することもできる。組成物は、それぞれが所定の量の活性成分を含有するカプセル、子袋（ｓａｃｈｅｔ）、錠剤などの別々の単位；粉末若しくは顆粒；水性若しくは非水性液体の溶液若しくは懸濁液；口腔洗浄液；又は水中油液体エマルジョン若しくは油中水液体エマルジョンとして提供することができる。活性成分は、巨丸剤、舐剤、又はパスタ剤として提供してもよい。

本発明の組成物は、上で詳細に述べた成分に加え、問題の組成物の種類に関連して当業界で通常用いられる他の物質を含んでもよいことが理解されるべきであり、例えば、経口投与に適する組成物には、更に甘味剤、増粘剤、及び着香剤など物質がある。

本発明の好ましい形態では、本発明の組成物は、合成若しくは生体ポリマー、グリコサミノグリカン；又はフィブリン、コラーゲン、ゼラチンを含む細胞外マトリックス分子；合成ポリマー、アガロース、アルギン酸塩、メチルセルロース、ヒアルロン酸、親水コロイド、アルギン酸塩、生理食塩水、粉末、軟膏、膏薬、又は浣腸剤からなる群から選択された担体を含み、それらは包帯剤（吸収性及び非吸収性）；経皮パッチ若しくはガーゼ付き放出性包帯剤；包帯（ｂａｎｄａｇｅ）、縫合糸、硬膏剤、ステープル；補綴用デバイス、スクリュー、若しくはプレート（生分解性又は非生分解性）；歯磨き粉、噛むためのゴム若しくは樹脂、口腔洗浄剤若しくは口腔用ゲルに組み込まれ、又は含浸させてある。当業者ならば、投与の経路若しくは手段に応じた使用すべき適切な担体を熟知されていよう。

別の好ましい形態では、組成物は、更に、抗生物質、抗炎症剤、消毒剤、他の増殖促進因子及び麻酔剤を含む群から選択される少なくとも１種の活性成分を有する。本明細書に記載の組成物は、放出性、安定性、溶解性、活性の助けとするためのそれに付随する他の分子、及び／又は創傷をサポーターする関連物を含んでよく、それらには、補助的薬剤、担体、溶解補助剤、及び上述のような増殖因子が含まれる。さらに、乳汁分泌物若しくはその派生物又は本発明の組成物は、相乗的、作動薬的、及び／又は相加的に働く他の化合物又は分子と併用してもよい。投与が薬理学的にも生理学的にも許容されるべきであること、並びに活性を弱めたり、活性成分に有害な毒性を与えたりすべきでないことを除き、このような成分の性質に対する制限はない。

本発明の組成物は、既知の治療剤と併用することが有用な場合がある。固定用量として製剤する場合、そのような合剤製品は、適切な投与量範囲の阻害因子と、その認可された投与量範囲の薬剤活性のある他の薬剤とを使用することができる。合剤製剤が不適当であるときには、組成物と既知の治療剤とを継時的に使用すればよい。

本発明の組成物は、栄養剤又は化粧品としての適用にも有用であり、そのような組成物では、これらの適用に向けられる製品に一般に使用される他の成分と組合せることができる。用語「栄養剤として」とは、一般に、一般消費者向け食品又は規定食に対する補助として使用する食品として、臨床的な特定の目的のために設計された栄養補助食品を意味するものとする。

本発明の好ましい形態では、抗炎症剤は、腫瘍壊死因子αの活性を少なくとも部分的に阻害することができる。より好ましい形態では、抗炎症剤は、レミケイド（ＲＥＭＩＣＡＤＥ）（商標）など、可溶性腫瘍壊死因子αに結合することのできる抗体、又はエンブレル（商標）などの可溶性受容体である。

好ましい実施形態では、組成物は、ラットＬ６筋芽細胞の増殖を刺激する性質を備えた複数の基本的な細胞増殖刺激因子を含む。組成物は、トランスフォーミング成長因子β、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子ＩＩ、ベータセルリン；当業界で記載のある線維芽細胞増殖因子の任意のメンバー、例えば線維芽細胞増殖因子Ｉや線維芽細胞増殖因子ＩＩ；インスリン様増殖因子結合タンパク質１、２、３、４、５、若しくは６；及び血小板由来増殖因子を含む群から選択された増殖因子を含むことがさらに好ましい。

さらに好ましい実施形態では、組成物は、メタロプロテイナーゼ阻害因子が強化されている。本明細書では、用語「強化された」とは、所与の成分の割合が組成物の根源である乳汁分泌物と比べて高くなっていることを意味する。

ＴＩＭＰ−２は、乳、初乳、又は乳製品中に０．０１〜１０％の範囲の純度で存在することが好ましい。さらに好ましい形態では、ＴＩＭＰ−２は、乳、初乳、又は乳製品中に１０〜３０％の範囲の純度で存在する。さらにまた好ましい形態では、ＴＩＭＰ−２は、乳、初乳、又は乳製品中に３０〜７０％の範囲の純度で存在する。さらにまた好ましい形態では、ＴＩＭＰ−２は、７０〜９９．９％の範囲の純度で存在する。

組成物は、中性〜塩基性のｐＨであることが好ましい。

本発明の好ましい態様では、組成物は、αラクトアルブミン、βラクトグロブリン、及びカゼインの量が乳製品と比べて減っていること；乳製品中に存在する塩分が約１ｗ／ｗ未満であり、乳製品中のカゼイン、αラクトアルブミン、βラクトグロブリン、免疫グロブリン、及び／又はアルブミンが５％未満であることのうちの１点又は複数の特性を備えている。

第２の態様では、本発明は、望ましくないメタロプロテイナーゼ活性に関連する障害を治療し、予防し、又は寛解させる方法であって、その必要のある動物に、本明細書に記載の乳汁分泌物由来のメタロプロテイナーゼ阻害因子を含有する有効量の組成物を投与することを含む方法を提供する。

本発明の方法は、創傷を治療する方法であることが好ましい。治療することのできる表面創傷のタイプに対する制限はなく、潰瘍、手術により生じた状態、治療によって引き起こされた創傷、中枢神経系の障害に伴う創傷、皮膚の剥脱性疾患、局所若しくは全身の感染に伴う創傷、先天的な創傷、病的な創傷、外傷及び事故による創傷、並びに火傷が含まれるがこれらに限らない。好ましい形態では、表面は、望ましくないメタロプロテイナーゼ活性を示す。好ましい形態では、創傷皮膚は健全な状態ではない。

創傷治療のための上記方法では、乳汁分泌物若しくはその派生物又は本発明の組成物を、生物学的に許容される担体に含ませて創傷に直接適用して、創傷周囲での十分な濃度の持続的な放出が確実になされるようにすることができる。創傷を治療する際には、メタロプロテイナーゼ阻害因子を創傷サポーターに付けてよい。本明細書では、用語「創傷サポーター」は、創傷を支持し、又固定するのに使用する任意の手段を含み、それには、外科用固定手段が含まれる。この用語には、硬膏剤、包帯剤、縫合糸、ステープルなどが含まれる。サポートされる創傷は、手術によってできた創傷でもよく、事故又は他の危害により生じたものでもよい。乳汁分泌物若しくはその派生物又は組成物は、創傷サポーターの表面に存在しても、又は創傷サポーター中に含浸させてあってもよく、それらから放出可能である。

創傷は、圧力、血管疾患、糖尿病、自己免疫疾患、鎌状赤血球病、又は血友病によって引き起こされた潰瘍；手術の結果；治療によって引き起こされたもの；中枢神経系の障害に伴うもの及び皮膚の剥脱性疾患のために生じるもの；フランベジア、ＨＩＶ、水痘、ヘルペス感染などの局所若しくは全身の感染に関連するもの；先天的なもの；眼の角膜の傷害；病的な創傷；外傷若しくは事故による創傷；又は火傷であることが好ましい。

好ましい方法では、メタロプロテイナーゼ阻害因子の濃度は、創傷部位の局所周囲の流体１ｍｌあたり約０．１ｎｇ〜約１０μｇである。メタロプロテイナーゼ阻害因子の濃度は、創傷部位の局所周囲の流体１ｍｌあたり約１ｎｇ〜約１μｇであることがさらに好ましい。

本発明はまた、消化管の傷害、疾患、又は潰瘍に関連する状態を予防し、寛解させ、又は治療するための方法であって、その必要のある動物に、本明細書に記載の組成物を有効量投与することを含む方法を提供する。好ましい方法では、メタロプロテイナーゼ阻害因子の濃度は、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１０００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約１μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌである。

本明細書では、用語「消化管の傷害、疾患、又は潰瘍」は、次の種類の消化管の損傷又は疾患、すなわち、
（ａ）歯周病に関連するものを含む歯科及び口腔の創傷、
（ｂ）放射線、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）療法、ヘリコバクターピロリ菌、又は化学療法によって引き起こされる胃潰瘍を含む、十二指腸、胃、又は食道の消化性潰瘍、
（ｃ）潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症性腸疾患、
（ｄ）ストレス状態、例えば、火傷、外傷、敗血症、ショック、頭蓋内の手術、又は頭部の手術に伴う潰瘍、
（ｅ）放射線療法、及び／又はメクロレタミン、メルファラン、ブスルファン、シタラビン、フロキシウリジン、５−フルオロウラシル、メルカプトプリン、メトトレキサート、チオグアニン、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤ、ダウノルビシン、エトポシド、マイトマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ヒドロキシ尿素、プロカルバジンなどの薬品による化学療法により生じる、粘膜炎を含む消化管内側の損傷、
（ｆ）壊死性の全腸炎や腸の運動性の弱さなど、早産に関連した不十分な腸機能又は腸の損傷、
（ｇ）ＡＩＤＳを含む、細菌、ウイルス、真菌、若しくは原生動物への感染などに伴う、下痢状態、
（ｈ）小児脂肪便症などの食物不耐性、
（ｉ）頬側口腔、食道、胃、又は腸を含む消化管の癌、
（ｊ）腸の部分的な摘除、短腸症侯群、空腸造瘻術、回腸造瘻術、結腸造瘻術後などの、外科手術を誘因とする損傷、
（ｋ）食道逆流による損傷、
（ｌ）外部の火傷、外傷、敗血症、ショックなど、腸のバリア機能喪失に関連した状態、
（ｍ）腸捻転や嚢胞性線維症など、消化管の不十分な機能又は損傷をもたらす先天的な状態、並びに
（ｎ）シェーグレン症候群など、腸に影響を及ぼす自己免疫疾患
を含む。

本発明に関し、本明細書で使用する用語「有効量」とは、９５％の信頼度水準で統計的に有意な応答を引き起こすのに十分な量を意味する（効果が偶然のみによる確率ｐ＜０．０５）。有効量は、メタロプロテイナーゼ活性が低下する所望の応答を少なくとも部分的に得るための量であることが好ましい。

組成物は、治療有効量投与することができる。治療有効量とは、所望の効果を少なくとも部分的に得るのに必要な量、すなわち、望ましくないメタロプロテイナーゼ活性の症状を軽減又は予防し、或いは望ましくないメタロプロテイナーゼ活性の発現を遅らせ、その進行を阻止し、又はその発現若しくは進行を完全に停止させ、又はメタロプロテイナーゼ活性を低下させるのに必要な量を意味する。用語「治療有効量」とは、本明細書では、９５％の信頼度水準で統計的に有意な応答を誘発するのに十分な量を意味することが好ましい（効果が偶然のみによる確率ｐ＜０．０５）。

当然、そのような量は、治療する特定の症状、症状の重症度、並びに年齢、円体的な状態、サイズ、体重、及び同時に受けている他の治療を含む個々の患者のパラメーターに応じて変わり、それは、担当医の裁量に委ねられる。これらの要因は、当業者によく知られており、日常的な実験で扱うことができる。一般に、堅実な医学的判断に従って最小有効量を決定することが好ましい。しかし、当業者ならば、医学的、生理的、又は他の理由のためにより多い用量を投与する場合があることを理解されよう。

症状のある患者は、上記の傷害、潰瘍疾患症状の病歴に注意し、一群の調査によってメタロプロテイナーゼ活性を試験した後に同定することができる。

治療することのできる消化管の傷害、疾患、又は潰瘍に制限はなく、それには、歯科的及び口腔の創傷、消化性潰瘍、炎症性腸疾患、ストレス状態に伴う潰瘍、放射線療法及び／若しくは化学療法によって引き起こされる損傷、早産に伴う腸の不十分な機能若しくは損傷、下痢状態、食物不耐性によって引き起こされる損傷、消化管の癌、外科手術によって誘導される損傷、食道逆流によって引き起こされる損傷、腸のバリア機能の喪失に伴う症状、消化管の不適切な機能又は損傷をもたらす先天的な症状、及び腸に影響を及ぼす自己免疫疾患が含まれるがこれらに限らない。

組成物は、消化管の傷害、疾患、又は潰瘍が明らかになる前、その際、又はその後を含む適切などの時期に投与してもよい。

好ましい方法では、症状は、歯科的な若しくは口腔の創傷；十二指腸、胃、若しくは食道の消化性潰瘍；炎症性腸疾患、ストレス状態に伴う潰瘍、消化管内側の損傷、早産に伴う不適切な腸機能若しくは腸の損傷、下痢状態、食物不耐性、消化管の癌、外科手術で誘導される腸の損傷、食道逆流による損傷、腸のバリア機能喪失に伴う症状、消化管の不適切な機能若しくは損傷をもたらす先天的な状態、又は腸に影響を及ぼす自己免疫疾患である。

第５の態様では、本発明は、望ましくないメタロプロテイナーゼ活性に関連する疾患を予防し、寛解させ、且つ／又は治療する方法であって、その必要のある動物に、乳汁分泌物若しくはその派生物又は本明細書に記載の組成物を有効量投与することを含む方法を提供する。本明細書において、用語「メタロプロテイナーゼ活性に関連する傷害」は、次のものを含む：
（ｉ）拡張した心筋症、うっ血性心不全、アテローム性動脈硬化症、プラーク破裂、再灌流傷害、虚血、慢性閉塞性肺疾患、血管形成術後再狭窄、及び大動脈瘤を含む、望ましくないメタロプロテイナーゼ活性が心臓血管系の再構築に影響を及ぼす心臓血管系障害、
（ｉｉ）骨硬化症や骨粗鬆症などの骨障害、肝硬変や肺線維症など、他の組織の障害、多発性硬化症などの神経組織の障害を含む、メタロプロテイナーゼが異常な再構築に関与する他の組織障害、
（ｉｉｉ）サイトメガロウイルス、網膜炎、ＨＩＶ及びそれによるＡＩＤＳ症候群など、メタロプロテイナーゼ活性がそれによって変更される、ウイルス感染に関係する障害、
（ｉｖ）炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、膵炎、憩室炎、喘息及び関連する肺疾患、リウマチ様関節炎、痛風、ライター症候群、紅斑性狼蒼、強直性脊椎炎、自己免疫性角膜炎、肺疾患、気管支炎、肺気腫、嚢胞性線維症、急性呼吸困難症候群など、メタロプロテイナーゼが関与する炎症に関連した障害、
（ｖ）乾癬、強皮症、及びアトピー性皮膚炎、又は皮膚の外観に老化及び／若しくはしわをもたらす紫外線による皮膚損傷に関連した障害を含む、メタロプロテイナーゼが関与する皮膚に関連した障害。

症状のある患者は、患部組織の上記症状に注意し、一群の調査によってメタロプロテイナーゼ活性を試験した後に同定される。

好ましい方法では、症状は、それだけに限らないが、拡張型心筋症、うっ血性心不全、アテローム性動脈硬化症、プラーク破裂、再灌流傷害、虚血、慢性閉塞性肺疾患、血管形成術後再狭窄、大動脈瘤を含むがこれに限らない心臓血管系の障害；骨、肝臓、肺、及び神経組織の障害を含む、メタロプロテイナーゼが異常な再構築に関与する組織障害；メタロプロテイナーゼ活性がそれによって変更されるウイルス感染に関連した障害；メタロプロテイナーゼが関与する炎症に関連した障害；乾癬、強皮症、及びアトピー性皮膚炎、又は皮膚の外観に老化及び／若しくはしわをもたらす紫外線による皮膚損傷を含むがこれに限らない、メタロプロテイナーゼが関与する皮膚に関連した障害である。

本明細書に記載のどの治療方法でも、１日投与量は、担当の医師又は獣医師によって日常的に決定することができる。一般に、投与量は、個々の患者の年齢、体重、及び応答、並びに患者の症状の重症度に応じて変化する。一般に、本発明の阻害因子の適切な用量は、受容者の体重１ｋｇあたり１日約０．１μｇ〜約１００ｍｇの範囲、好ましくは体重１キログラムあたり１日約１μｇ〜約５０ｍｇの範囲となる。しかし、用量は、配合及び使用する乳汁分泌物又はその派生物の純度に応じても変わる。

第３の態様では、本発明は、メタロプロテイナーゼ阻害因子を少なくとも部分的に精製又は強化する方法であって、
乳汁分泌物若しくはその派生物を準備するステップと、
乳汁分泌物若しくはその派生物を、遠心分離、精密濾過、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、及び一過性の酸性化からなる群から選択される１種又は複数の処理ステップにかけるステップと
を含む方法を提供する。

出発材料は、不溶性物質をほとんど含まない乳製品の濾液でよい。脱脂乳は通常、チーズホエーよりもタンパク質及び脂肪の濃度が高く、塩分濃度が低い。脱脂乳は、不溶性タンパク質、特に粒状のカゼインも多量に含有している。脱脂乳から適切な組成物を得るには、選択した陽イオン交換樹脂が、その流動特性及び吸着特性によって脂肪含有流体及び粒子含有流体との使用に適するようになっていない限り、脱脂乳と陽イオン交換樹脂とを接触させる前に通常は濾過ステップが必要である。

乳汁分泌物又はその派生物は、遠心分離又は適切なふるいによる濾過などの濾過によって清澄化することができる。乳汁分泌物又はその派生物は、規定された多孔度の中空繊維カートリッジで濾過することができる。

初乳は、授乳期の最初の数日間に産生される流体である。初乳は、脱脂乳又はチーズホエーよりタンパク質の濃度が非常に高い。初乳は、タンパク質濃度がこのようにより高く、陽イオン交換樹脂にかけるのにはるかに少ない体積で済むので、メタロプロテイナーゼ阻害因子の単離を容易にすることができる。しかし、初乳は、脂肪含有量が高く、多くの哺乳動物種で高濃度の免疫グロブリンを含む。これら２点の側面によって、メタロプロテイナーゼ阻害因子を大規模に単離することが技術的により難しくなっている。というのは、第１に、この方法の予備的な濾過ステップを特に効率的にする必要があり、第２に、免疫グロブリンが樹脂に吸着することができるので、それに応じてより多くの陽イオン交換樹脂が必要となることがあるからである。

メタロプロテイナーゼ阻害因子を精製し、強化し、又は活性化するために、いくつかの処理ステップを使用することができる。処理ステップの適性は、乳汁分泌物又はその派生物を吸着又は分離するのに有利な精製ステップにかけ、メタロプロテイナーゼ阻害因子の割合を測定することによって評価することができる。

好ましい実施形態では、処理ステップは、その後に限外濾過を行う陽イオン交換クロマトグラフィー含む。陽イオン交換樹脂の適性は、中性のｐＨ、又は吸着若しくは分離に有利な別の所定ｐＨで、試験する樹脂のカラムに乳製品を通し、メタロプロテイナーゼ阻害因子、特にＴＩＭＰ−２の割合を、ゼラチナーゼ活性アッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の約２１，０００Ｄａの単一のバンドとしての泳動、Ｎ末端側配列分析、若しくは質量分析、又は従来技術で利用可能な同様のアッセイを使用して測定することによって評価できる。陽イオン交換樹脂は、メタロプロテイナーゼ阻害因子を選択的に吸着するのに適する孔径及び官能基を有することが好ましい。

セファロースを骨格とした陽イオン交換ゲルを使用することができる。セファロースは、アガロースを骨格とした陽イオン交換樹脂のファミリーの商品名である。

イオン交換樹脂からメタロプロテイナーゼ阻害因子を脱着させると、メタロプロテイナーゼ阻害特性が強化された調製物が得られる。適切な任意の技術を利用して、溶出物の濃縮及び濾過を行う。溶出物を、例えば従来の限外濾過又は別のクロマトグラフィー方法、或いは他の手順によって濃縮すると、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物を得ることができる。

この方法は、例えば、順次、乳製品を不溶性物質をそれから除去する清澄化ステップにかけ；清澄化された製品のｐＨを約６．５〜８．０の間に整え；清澄化された乳製品を適切な陽イオン交換樹脂と接触させ；高いイオン強度又は高いｐＨのもと、陽イオン交換樹脂から適切な緩衝液で溶離して溶出物を得；溶出物をそれから塩を除去する濃縮ステップ及びダイアフィルトレーションステップにかけることにより、乳汁分泌物又はその派生物を処理するなどといった、追加のステップを含んでよい。

陽イオン交換樹脂からの溶離は、メタロプロテイナーゼ阻害因子が回収されるような高いイオン強度のもとで実施する。例えば、アガロースを骨格とする樹脂に吸着されたメタロプロテイナーゼ阻害因子は、０．２５ＭのＮＨ_４ＯＨを含有する１ＭのＮａＣｌで溶離することができる。

濃縮ステップは、限外濾過を含ませることができる。例えば、３０００Ｄａの排除膜を使用することができる。溶出物からの塩の除去に使用されるダイアフィルトレーションステップは、１５０ｍＭのＮａＣｌ又は揮発性の塩、例えば炭酸水素アンモニウムに対するダイアフィルトレーションを含ませることができる。

例えば、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物の調製方法は、順次、乳汁分泌物又は派生物を濾過ステップにかけてそれから不溶性物質を除去し；濾液のｐＨを約６．５〜８．０の間に整え；濾液を、塩基性〜中性の等電点を持つメタロプロテイナーゼ阻害因子がそこに吸着されるような適切な陽イオン交換樹脂と接触させ；その陽イオン交換樹脂から緩衝液で溶離して溶出物を得；その溶出物を処理してそれから塩を除去することによる、乳汁分泌物又はその派生物の処理を含んでよい。

７．０の等電点を持つＴＩＭＰ−２は、そのメタロプロテイナーゼ阻害因子の活性が、ゼラチナーゼ活性アッセイを使用して検出されるメタロプロテイナーゼ２及びメタロプロテイナーゼ９のメタロプロテイナーゼ阻害活性を利用して検出される程十分な量で吸着され、乳汁分泌物又はその派生物中の酸性の等電点を持つ主要タンパク質は吸着されず；陽イオン交換樹脂から適切な緩衝液で溶離され；溶出液を、濃縮ステップ及びダイアフィルトレーションステップにかけてそれから塩を除去して、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物を得ることが好ましい。

限外濾過ステップによって、メタロプロテイナーゼ阻害因子が濃縮されることが好ましい。

限外濾過ステップによって得られる、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む透過水又は保持液は、一過性の酸性化にかけることが好ましい。

この方法は、例えば酸性化ステップをさらに含んでもよい。酸性化は、ｐＨ３．０よりやや低いｐＨで実施することが好ましい。メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物を２．０〜３．０の範囲のｐＨに酸性化することがより好ましい。約２．５の酸性化ｐＨが特に好ましい。

酸性化は、無機酸、例えばＨＣｌを使用して実施することが好ましい。酸性化は、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物を水に溶解させ、５ＭのＨＣｌなど、無機の強酸で酸性化し、乾燥させることにより実施できる。

本発明の方法は、酸性化を行った後、不活性なタンパク質を除去する更なるステップを含んでもよい。不活性なタンパク質の除去は、酸性条件下での分子ふるいクロマトグラフィー又は限外濾過を使用して実施することができる。例えば、分子ふるいクロマトグラフィーの方法を使用すると、分子量が２１，０００Ｄａのメタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物を得ることができる。

例えば、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物の調製方法は、順次、乳製品を濾過ステップにかけてそこから不溶性物質を除去し；濾液のｐＨを約６．５〜８．０の間に整え；等電点が塩基性〜中性のメタロプロテイナーゼ阻害因子、さらに好ましくは等電点が７．０であるＴＩＭＰ−２が、そのメタロプロテイナーゼ阻害因子の活性が、ゼラチナーゼ活性アッセイを使用して検出されるメタロプロテイナーゼ２及びメタロプロテイナーゼ９のメタロプロテイナーゼ阻害活性を利用して検出される程十分な量で吸着され、乳製品中の等電点が酸性の主要タンパク質が吸着されないように、濾液を適切な陽イオン交換樹脂と接触させ；適切な緩衝液で陽イオン交換体から溶離し；溶出物を濃縮ステップ及びダイアフィルトレーションステップにかけてそれから塩を除去し；酸の供給源を用意し；メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物を一過性の酸性化にかけることによる、乳製品の処理を含んでよい。

本発明の好ましい形態では、酸性化された透過水又は保持液をゲル濾過クロマトグラフィーにかける。不活性なタンパク質の除去は、酸性条件下での分子ふるいクロマトグラフィー又は限外濾過を使用して実施する。例えば、分子ふるいクロマトグラフィーの方法を使用して、分子量が２１，０００Ｄａのメタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物を得る。好ましい形態では、分子ふるいクロマトグラフィー樹脂は、１０ｋＤａ〜５００ｋＤａの分子量の範囲を有する。分子ふるいクロマトグラフィー樹脂は、１０ｋＤａ〜５００ｋＤａの分子量範囲を有するＣｅｌｌｕｆｉｎｅ１０００−Ｍ樹脂であることがさらに好ましい。

分子ふるいクロマトグラフィー樹脂の適性は、中性のｐＨ、又は分離に有利な別の所定ｐＨで、試験する樹脂のカラムに乳汁分泌物又はその派生物を通し、ゼラチナーゼ活性アッセイ又は従来技術で利用可能な同様のアッセイを使用して、メタロプロテイナーゼ阻害因子、特にＴＩＭＰ−２の割合を測定することによって評価できる。

メタロプロテイナーゼ阻害因子は、従来技術に記載があるような適切な溶離緩衝液によってカラムから溶離することができる。適切な溶離緩衝液には、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨＣｌ、ｐＨ２．０が含まれる。

本発明の非常に好ましい形態では、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物の調製方法は、順次、まず濾過ステップを使用してそれから不溶性物質を除去し；濾液のｐＨを約６．５〜８．０に調整し；等電点が塩基性〜中性のメタロプロテイナーゼ阻害因子、さらに好ましくは等電点が７．０のＴＩＭＰ−２が、そのメタロプロテイナーゼ阻害因子が、ゼラチナーゼ活性アッセイを使用して検出されるメタロプロテイナーゼ２及びメタロプロテイナーゼ９のメタロプロテイナーゼ阻害活性を利用して検出される程十分な量で吸着されるように濾液と陽イオン交換樹脂とを接触させる、乳汁分泌物又はその派生物の処理を含む。乳製品中の等電点が酸性の主要タンパク質は吸着させず；陽イオン交換から適切な緩衝液で溶離し；溶出物を濃縮ステップ及びダイアフィルトレーションステップにかけてそれから塩を除去し；酸の供給源を用意し；メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物を一過性の酸性化にかけ；等電点が塩基性〜中性のメタロプロテイナーゼ阻害因子、さらに好ましくは等電点が７．０のＴＩＭＰ−２が、そのメタロプロテイナーゼ阻害因子の活性が、ゼラチナーゼ活性アッセイを使用して検出されるメタロプロテイナーゼ２及びメタロプロテイナーゼ９のメタロプロテイナーゼ阻害活性を使用して検出される程十分な量に濃縮されるように、組成物を適切な分子ふるいクロマトグラフィー樹脂と接触させ；適切な緩衝液でその分子ふるいクロマトグラフィー樹脂からの溶離を行って、メタロプロテイナーゼ阻害因子をさらに多く含む組成物を得る。

好ましい方法では、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含有するゲル濾過クロマトグラフィーステップからの画分を陰イオン交換クロマトグラフィーにかける。適切な陰イオン交換樹脂は、メタロプロテイナーゼ阻害因子、好ましくは等電点が塩基性〜中性のメタロプロテイナーゼ阻害因子、さらに好ましくは等電点が７．０のＴＩＭＰ−２を、そのメタロプロテイナーゼ阻害因子の活性が、ゼラチナーゼ活性アッセイを使用して検出されるメタロプロテイナーゼ２及びメタロプロテイナーゼ９のメタロプロテイナーゼ阻害活性を利用して検出される程十分な量で吸着できる能力をもつことになる。陰イオン交換樹脂は、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂であることが好ましい。

陰イオン交換樹脂の適性は、中性のｐＨ、又は吸着又は分離に有利な別の所定ｐＨで、乳汁分泌物又はその派生物を試験する樹脂のカラムに通し、ゼラチナーゼ活性アッセイ又は従来技術で利用可能な同様のアッセイを使用して、メタロプロテイナーゼ阻害因子、特にＴＩＭＰ−２の割合を測定することによって評価できる。

メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物は、適切な溶離緩衝液で樹脂から溶離することができる。例えば、２０ｍＭのトリスＨＣｌ中の直接的な塩勾配を有する０〜０．５ＭのＮａＣｌを使用することができる。

別の例として、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物の調製方法は、順次、まず濾過ステップを使用してそこから不溶性物質を除去し；濾液のｐＨを約６．５〜８．０に調整し；等電点が塩基性〜中性のメタロプロテイナーゼ阻害因子、さらに好ましくは等電点が７．０のＴＩＭＰ−２が、そのメタロプロテイナーゼ阻害因子の活性が、ゼラチナーゼ活性アッセイを使用して検出されるメタロプロテイナーゼ２及びメタロプロテイナーゼ９のメタロプロテイナーゼ阻害因子活性を利用して検出される程の十分な量で吸着され、乳製品中の等電点が酸性の主要タンパク質は吸着されないように、濾液を陽イオン交換樹脂と接触させ；陽イオン交換から適切な緩衝液で溶離し；溶出物を濃縮ステップ及びダイアフィルトレーションステップにかけてそれから塩を除去し；酸の供給源を用意し；メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物を一過性の酸性化にかけ；等電点が塩基性〜中性のメタロプロテイナーゼ阻害因子、さらに好ましくは等電点が７．０のＴＩＭＰ−２が、メタロプロテイナーゼ阻害因子が、ゼラチナーゼ活性アッセイを使用して検出されるメタロプロテイナーゼ２及びメタロプロテイナーゼ９のメタロプロテイナーゼ阻害活性を使用して検出される程十分な量に濃縮されるように、組成物を適切な分子ふるいクロマトグラフィー樹脂と接触させ；分子ふるいクロマトグラフィー樹脂から適切な緩衝液で溶離して、メタロプロテイナーゼ阻害因子をさらに多く含む組成物を得；等電点が塩基性〜中性のメタロプロテイナーゼ阻害因子、さらに好ましくは等電点が７．０のＴＩＭＰ−２が、メタロプロテイナーゼ阻害因子の活性が、ゼラチナーゼ活性アッセイを使用して検出されるメタロプロテイナーゼ２及びメタロプロテイナーゼ９のメタロプロテイナーゼ阻害活性を利用して検出されるような十分な量で吸着されるように、組成物を適切な陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂と接触させて、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂から適切な緩衝液で溶離して、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物を得る、乳汁分泌物又はその派生物の処理を含む。

好ましい実施形態では、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含有する陰イオン交換クロマトグラフィーステップからの画分をアフィニティークロマトグラフィーにかける。アフィニティー交換カラムは、ヘパリンを主体としたアフィニティーカラムであることが好ましい。

適切なアフィニティークロマトグラフィー樹脂は、メタロプロテイナーゼ阻害因子、好ましくは等電点が塩基性〜中性のメタロプロテイナーゼ阻害因子、より好ましくは等電点が７．０のＴＩＭＰ−２を、そのメタロプロテイナーゼ阻害因子の活性が、ゼラチナーゼ活性アッセイを使用して検出されるメタロプロテイナーゼ２及びメタロプロテイナーゼ９のメタロプロテイナーゼ阻害活性を利用して検出される程十分な量で吸着できる能力をもつことになる。アフィニティークロマトグラフィー樹脂は、ヘパリンアフィニティー樹脂であることが好ましく、Ｈｉ−Ｔｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）であることがさらに好ましい。

アフィニティークロマトグラフィー樹脂の適性は、中性のｐＨ、又は吸着若しくは分離に有利な別の所定ｐＨで、試験する樹脂のカラムに乳製品を通し、ゼラチナーゼ阻害活アッセイ又は従来技術で利用可能な同様のアッセイを使用して、メタロプロテイナーゼ阻害因子、特にＴＩＭＰ−２の割合を測定することによって評価できる。

メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物は、樹脂から適切な溶離緩衝液で溶離することができる。例えば、２０ｍＭのトリスＨＣｌ中において０．１〜１．０ＭのＮａＣｌを線形の塩勾配をかけて使用することができる。例えば、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物の調製方法は、順次、乳製品を濾過ステップにかけてそれから不溶性物質を除去し；濾液のｐＨを約６．５〜８．０に整え；塩基性〜中性の等電点を持つメタロプロテイナーゼ阻害因子、さらに好ましくは７．０の等電点を持つＴＩＭＰ−２が、そのメタロプロテイナーゼ阻害因子の活性が、ゼラチナーゼ活性アッセイを使用して検出されるメタロプロテイナーゼ２及びメタロプロテイナーゼ９のメタロプロテイナーゼ阻害活性を使用して検出される程の十分な量で吸着され、乳製品中の等電点が酸性の主要タンパク質は吸着されないように、濾液を陽イオン交換樹脂と接触させ；陽イオン交換樹脂から適切な緩衝液で溶離し；溶出物を濃縮ステップ及びダイアフィルトレーションステップにかけてそれから塩を除去し；酸の供給源を用意し；メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物を一過性の酸性化にかけ；塩基性〜中性の等電点を持つメタロプロテイナーゼ阻害因子、より好ましくは７．０の等電点を持つＴＩＭＰ−２が、そのメタロプロテイナーゼ阻害因子の活性が、ゼラチナーゼ活性アッセイを使用して検出されるメタロプロテイナーゼ２及びメタロプロテイナーゼ９のメタロプロテイナーゼ阻害活性を利用して検出される程十分な量に濃縮されるように、組成物を適切な分子ふるいクロマトグラフィー樹脂と接触させ；分子ふるいクロマトグラフィー樹脂から適切な緩衝液で溶離して、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物を得；塩基性〜中性の等電点を持つメタロプロテイナーゼ阻害因子、さらに好ましくは７．０の等電点を持つＴＩＭＰ−２が、そのメタロプロテイナーゼ阻害因子の活性が、ゼラチナーゼ活性アッセイを使用して検出されるメタロプロテイナーゼ２及びメタロプロテイナーゼ９のメタロプロテイナーゼ阻害活性を利用して検出される程十分な量で吸着されるように、組成物を適切な陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂と接触させ；陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂から適切な緩衝液で溶離して、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物を得；塩基性〜中性の等電点を持つメタロプロテイナーゼ阻害因子、さらに好ましくは７．０の等電点を持つＴＩＭＰ−２が、そのメタロプロテイナーゼ阻害因子の活性が、ゼラチナーゼ活性アッセイを使用して検出されるメタロプロテイナーゼ２及びメタロプロテイナーゼ９のメタロプロテイナーゼ阻害活性を利用して検出される程十分な量で吸着されるように、組成物を適切なアフィニティークロマトグラフィー樹脂と接触させ；アフィニティークロマトグラフィー樹脂から適切な緩衝液で溶離して、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物を得る、乳製品の処理を含んでよい。

アフィニティークロマトグラフィーステップからの画分は、逆相高速液体クロマトグラフィーにかけることが好ましい。適切な逆相高速液体クロマトグラフィー樹脂は、メタロプロテイナーゼ阻害因子、好ましくは等電点が塩基性〜中性のメタロプロテイナーゼ阻害因子、さらに好ましくは等電点が７．０のＴＩＭＰ−２を、そのメタロプロテイナーゼ阻害因子の活性が、ゼラチナーゼ活性アッセイを使用して検出されるメタロプロテイナーゼ２及びメタロプロテイナーゼ９のメタロプロテイナーゼ阻害活性を利用して検出されるような十分な量で吸着することができる。逆相高速液体クロマトグラフィー樹脂は、Ｃ４、Ｃ８、又はＣ１８基材を含む群から選択されることが好ましい。逆相高速液体クロマトグラフィー樹脂は、Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣカラムであることがさらに好ましい。

逆相高速液体クロマトグラフィー樹脂の適性は、試験する樹脂のカラムに乳製品を通し、ゼラチナーゼ活性アッセイ、又は従来技術で利用可能な同様のアッセイを使用して、メタロプロテイナーゼ阻害因子、特にＴＩＭＰ−２の割合を測定することによって評価できる。

メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物は、樹脂から適切な溶離緩衝液で溶離することができる。例えば、ＣＨ_３ＣＮの０〜２８％の勾配を使用することができる。

メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物の調製方法は、順次、乳製品を濾過ステップにかけてそれから不溶性物質を除去し；濾液のｐＨを約６．５〜８．０の間に整え；塩基性〜中性の等電点を持つメタロプロテイナーゼ阻害因子、さらに好ましくは７．０の等電点を持つＴＩＭＰ−２が、当該メタロプロテイナーゼ阻害因子の活性が、ゼラチナーゼ活性アッセイを使用して検出されるメタロプロテイナーゼ２及びメタロプロテイナーゼ９のメタロプロテイナーゼ阻害活性を利用して検出される程十分な量で吸着され、乳製品中の等電点が酸性の主要タンパク質が吸着されないように、濾液を陽イオン交換樹脂と接触させ；陽イオン交換から適切な緩衝液で溶離し；溶出物を濃縮ステップ及びダイアフィルトレーションステップにかけてそれから塩を除去し；酸の供給源を用意し；メタロプロテイナーゼの阻害因子を含む組成物を一過性の酸性化にかけ；塩基性〜中性の等電点を持つメタロプロテイナーゼ阻害因子、さらに好ましくは７．０の等電点を持つＴＩＭＰ−２が、当該メタロプロテイナーゼ阻害因子の活性が、ゼラチナーゼ活性アッセイを使用して検出されるメタロプロテイナーゼ２及びメタロプロテイナーゼ９のメタロプロテイナーゼ阻害活性を利用して検出される程十分な量に濃縮されるように、組成物を適切な分子ふるいクロマトグラフィー樹脂と接触させ；分子ふるいクロマトグラフィー樹脂から適切な緩衝液で溶離して、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物を得；塩基性〜中性の等電点を持つメタロプロテイナーゼ阻害因子、さらに好ましくは７．０の等電点を持つＴＩＭＰ−２が、当該メタロプロテイナーゼ阻害因子の活性が、ゼラチナーゼ活性を使用して検出されるメタロプロテイナーゼ２及びメタロプロテイナーゼ９のメタロプロテイナーゼ阻害活性を利用して検出される程十分な量で吸着されるように、組成物を適切な陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂と接触させ；陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂から適切な緩衝液で溶離して、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物を得；塩基性〜中性の等電点を持つメタロプロテイナーゼ阻害因子、さらに好ましくは７．０の等電点を持つＴＩＭＰ−２が、そのメタロプロテイナーゼ阻害因子の活性が、ゼラチナーゼ活性アッセイを使用して検出されるメタロプロテイナーゼ２及びメタロプロテイナーゼ９のメタロプロテイナーゼ阻害活性を利用して検出される程十分な量で吸着されるように、組成物を適切なアフィニティークロマトグラフィー樹脂と接触させ；アフィニティークロマトグラフィー樹脂から適切な緩衝液で溶離して、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物を得；塩基性〜中性の等電点を持つメタロプロテイナーゼ阻害因子、さらに好ましくは７．０の等電点を持つＴＩＭＰ−２が、そのメタロプロテイナーゼ阻害因子の活性が、ゼラチナーゼ活性アッセイを使用して検出されるメタロプロテイナーゼ２及びメタロプロテイナーゼ９のメタロプロテイナーゼ阻害活性を使用して検出される程十分な量で吸着されるように、組成物を適切な逆相高速液体クロマトグラフィー樹脂と接触させ；適切な逆相高速液体クロマトグラフィー樹脂から適切な緩衝液で溶離して、メタロプロテイナーゼ阻害因子をさらに多く含む組成物を得る、乳製品の処理を含んでよい。

処理ステップは、限外濾過であることが好ましい。メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物を調製するための代替方法は、例えば、乳製品の供給源、適切な限外濾過膜を準備するステップと、乳製品を適切な限外濾過膜と接触させて、メタロプロテイナーゼ阻害性を持つ濾液を選択的に強化するステップとを含む。

発明者らは、驚くべきことに、ＴＩＭＰ−２ポリペプチド活性が実質的に高められた乳製品中にメタロプロテイナーゼ阻害因子の存在を確認した。ＴＩＭＰ−２の生物学的属性及び構造上の属性は科学の分野で広く発表されているので、本明細書の教示に基づき、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物を得るために、適切な限外濾過膜を選択し、適切な限外濾過を使用するには、ごく日常的な実験しか必要としないはずである。実施例１Ａ、１Ｂ、２、及び３は、ＴＩＭＰ−２の物理的特性及び様々な周囲条件下にあるＴＩＭＰ−２の挙動特性といったパラメーターを、当業者に示すものである。重要な点は、本明細書の教示が、ＴＩＭＰ−２の様々な緩衝液及び溶媒への溶解性、ＴＩＭＰ−２の電荷及び等電点、及びタンパク質サイズを提示することである。本明細書が提示するこれらの教示、及び当業界の高水準の知識のもと、当業者ならば、成功に対する高い予測の下、容易に様々な組合せの適切な限外濾過膜を選択し、使用して、ＴＩＭＰ−２を精製するはずである。

適切な限外濾過膜は、乳製品のメタロプロテイナーゼ阻害因子、好ましくは塩基性〜中性の等電点を持つメタロプロテイナーゼ阻害因子、さらに好ましくは７．０の等電点を持つＴＩＭＰ−２を、当該メタロプロテイナーゼ阻害因子の活性が、ゼラチナーゼ活性アッセイを使用して検出されるメタロプロテイナーゼ２及びメタロプロテイナーゼ９のメタロプロテイナーゼ阻害活性を使用して検出される程十分な量に濃縮できる能力をもつことになる。

限外濾過膜の適性は、分離に有利な所定ｐＨで、限外濾過膜に乳製品を通し、ゼラチナーゼ活性アッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の約２１，０００Ｄａの単一のバンドとしての泳動、Ｎ末端側配列分析、若しくは質量分析、又は従来技術で利用可能な同様のアッセイを使用して、メタロプロテイナーゼ阻害因子、特にＴＩＭＰ−２の割合を測定することによって評価できる。限外濾過膜は、ＴＩＭＰ−２を分離するのに適する分子量範囲を有することが好ましい。

好ましい実施形態では、処理ステップは、乳汁分泌物又はその派生物を、遠心分離によって清澄化するステップと、得られる不定物（ｉｎｆｉｎｉｔｅ）をヘパリンアフィニティー樹脂などの適切なアフィニティークロマトグラフィー樹脂に曝すステップとを含み、樹脂は、Ｈｉ−Ｔｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）であることがさらに好ましい。メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物は、適切な溶離緩衝液で樹脂から溶離することができる。例えば、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ中の直線的な塩勾配を持つ０．１〜１．０ＭのＮａＣｌを使用することができる。溶出物を濃縮ステップ及びダイアフィルトレーションステップにかけてそれから塩を除去し、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物を得ることができる。

本明細書では、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、「非制限的に含むこと」を意味し、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、対応する意味を有する。

ここで、本発明を以下の実施例に即してより詳細に説明する。実施例６〜９は、推測実施例である。但し、以下の記述は単に例示的なものに過ぎないことを理解すべきであり、如何なる場合であっても上述の本発明の一般性を制限するように解釈すべきではない。

（実施例１Ａ）
メタロプロテイナーゼ阻害活性を強化された組成物の調製方法
ステップ１：陽イオン交換クロマトグラフィー
チーズ製造の最終産物として得た、低温殺菌されたホエーを、１０ミクロンのふるい及び０．２ミクロンのＳａｒｔｏｒｉｕｓ Ｍｉｃｒｏｓａｒｔ Ｓａｒｔｏｃｏｎ ＩＩモジュールで濾過して、固体を除去した。限外濾過濾液のｐＨを６．５に整え、ｐＨ６．５の５０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液で平衡にしておいた、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｓ 陽イオン交換樹脂（ファルマシア）のカラムにかけた。カラムを同じ緩衝液で洗浄した後、吸収された材料を、０．２５ＭのＮＨ_４ＯＨを含有するＮａＣｌの１Ｍ溶液によって溶離した。この溶出物を、伝導率が０Ｔｇに達するまで水に対するダイアフィルトレーションにかけ、次いで、限外濾過によって濃縮した：どちらの方法でも３ｋＤａ排除膜を使用した。得られる調製物を貯蔵すべく凍結乾燥した。

ステップ２：一過性の酸性化及びゲル濾過クロマトグラフィー（分子ふるいクロマトグラフィー）
上で調製した、メタロプロテイナーゼ阻害特性が強化された組成物（総タンパク質濃度＝４０ｍｇ．ｍＬ^−１）１Ｌを、ＨＣｌを用いて一晩かけてｐＨ２．０に酸性化し、１μｍの膜で濾過し、流速６０ｍＬ．分^−１で、連結された２本の１０Ｌ容Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ１０００−Ｍカラム（分子量範囲は１０〜５００ｋＤａ）（Ａｍｉｃｏｎ）にかける。１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨＣｌ、ｐＨ２．０を用い、流速６０ｍＬ．分^−１でタンパク質を溶離する。画分４５０ｍＬを収集し、タンパク質濃度（ＢＣＡアッセイ）の分析及び酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）（以下を参照のこと）によるメタロプロテイナーゼ阻害活性の分析を行う（図１ａ）。メタロプロテイナーゼ阻害特性が強化された各画分の一定分量（２０μｇ）については、４〜２０％の還元性トリス−グリシンゲル上を泳動させ、ニトロセルロースに移し、モノクローナル抗ＴＩＭＰ−２抗体を用いてメタロプロテイナーゼ阻害活性についてブロッティングし、ＥＩＡ陽性の画分中にウシＴＩＭＰ−２が正しい分子量で存在することを確認する（図１ａ、挿入図）。

ステップ３：陰イオン交換クロマトグラフィー
プールされたＣｅｌｌｕｆｉｎｅ画分を、固体ベースのトリスを用い、５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０にし、５ＭのＨＣｌを用いｐＨを８．０に整え、１μｍの膜で濾過し、流速５ｍｌ．分^−１で、ＦＰＬＣシステム（ファルマシア、スウェーデン）に取り付けたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（５×１５ｃｍ、ファルマシア、スウェーデン）にかける。次いで、カラムを２０ｍＭのトリス−ＨＣｌで洗浄し、（メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む）カラムに結合したままのタンパク質を、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ中の直線的塩勾配を有する０〜０．５ＭのＮａＣｌ ２．１Ｌを用い、流速１５ｍＬ分^−１で溶離する。画分３０ｍＬを収集し、タンパク質濃度及びメタロプロテイナーゼ阻害因子の分析を行う（図１ｂ）。次いで、メタロプロテイナーゼ阻害活性を含む画分をプールする。

ステップ４：アフィニティークロマトグラフィー
プールされたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ画分を、流速２ｍＬ．分^−１で、ＦＰＬＣシステム（ファルマシア、スウェーデン）に取り付けたＨｉ−Ｔｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（２本の５ｍＬカラムの連なり、ファルマシア、スウェーデン）にかける。次いで、カラムを０．１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄し、（メタロプロテイナーゼを阻害する画分を含む）カラムに結合したままのタンパク質を、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ中の直線的塩勾配を有する０．１〜１．０ＭのＮａＣｌ ７５ｍＬを用い、流速１５ｍＬ．分^−１で溶離する。画分１．０ｍＬを収集し、タンパク質濃度及びメタロプロテイナーゼ阻害活性の分析を行う（図１ｃ）。次いで、メタロプロテイナーゼ阻害活性を含む画分をプールする。

ステップ５：Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣ
プールされたＨｉ−Ｔｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ画分を０．１％のＴＦＡで２倍に希釈し、０．１％のＴＦＡで平衡にしたＤｅｌｔａ−Ｐａｃｋ Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（１５μｍ、３００Å、２５×１００ｍｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｗａｔｅｒｓ、Ｌａｎｅ Ｃｏｖｅ、オーストラリアＮｅｗ Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ）にかける。カラムを０．１％のＴＦＡで広範囲に洗浄し、次いで結合されたタンパク質を、流速５ｍＬ．分^−１で、０〜２８％のＣＨ_３ＣＮ勾配で２５分間、次いで０．０８％のＴＦＡ中２８〜３６％のＣＨ_３ＣＮ勾配で９０分間、連続的に溶離する。画分５ｍＬを収集し、メタロプロテイナーゼ阻害活性があるか検定する（図１ｄ）。メタロプロテイナーゼ阻害活性を含む画分をプールし、凍結乾燥する。

メタロプロテイナーゼ阻害活性は、最後のＲＰ−ＨＰＬＣステップからの陽性画分中に存在する。この画分は、純度が最高で９９％のウシＴＩＭＰ−２であり、約２１ｋＤａの分子量を有する形態のものである。これらの判断基準は、１０〜２０％勾配の還元性トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをクーマシー染色したもの（図２を参照のこと）、分析ＲＰ−ＨＰＬＣ（図３）、質量分析（図４）、及びＮ末端側配列分析により評価する。

ＴＩＭＰ−２酵素免疫アッセイ
９６穴イムノプレート（Ｎｕｎｃ）の個々のウェルを、１５ｍＭのＮａ_２ＣＯ_３、３５ｍＭのＮａＨＣＯ_３、ｐＨ９．６中の各サンプル（カラム画分）９０μＬで、４℃で、一晩かけてコートする。次いで、プレートをＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０ １００μｌで４回洗浄し、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡの中で、３７℃で１時間かけてブロックする。プレートをＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄し、１μｇ．ｍＬ^−１のマウス抗ヒトＴＩＭＰ−２モノクローナルＩｇＧと共に３７℃で１時間インキュベートする（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）。プレートをＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０ １００μｌで再度４回洗浄し、ヒツジ抗マウスＨＲＰ結合ＩｇＧ（１００００倍希釈）と共に３７℃で１時間インキュベートする。次いで、プレートをＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で再度４回洗浄し、１ウェルあたり２００μＬの２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）基質を用い３７℃で１時間かけて発色させ、４０５ｎｍの吸光度を測定した。いくつかのケースでは、ＥＩＡを２００μＬのｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）を用いて発色させ、４９０ｎｍの吸光度を測定した。

（実施例１Ｂ）
メタロプロテイナーゼ阻害活性が強化された組成物の代替調製方法
脱脂粉乳を水で戻したもの、又は脱脂した初乳を、４℃で３０分間、４１，０００×ｇで遠心分離にかけて清澄化する。清澄化した供給原料を、流速５ｍＬ．分^−１で、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣシステム（ファルマシア、スウェーデン）に取り付けたＨｉＰｒｅｐ １６／１０ Ｈｅｐａｒｉｎ ＦＦカラム（１６×１００ｍｍ、ファルマシア、スウェーデン）に装填する。カラムを１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０で洗浄し、（メタロプロテイナーゼを阻害する画分を含む）カラムに結合したままのタンパク質を、２ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０を用い、流速５ｍＬ．分^−１で溶離する。溶出した材料をＨｉＰｒｅｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（ファルマシア、スウェーデン）に装填し、公称分子量５，０００のＢｉｏｍａｘ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国マサチュセッツ州Ｂｅｄｆｏｒｄ）を使用して、Ａｍｉｃｏｎ限外濾過セル中で濃縮することによって、結合した材料から塩を除去する。組成物のタンパク質濃度を分析し、メタロプロテイナーゼ阻害活性を実施例３の方法によって定量化する（表２（ｂ））。

（実施例２）
メタロプロテイナーゼ阻害因子のＮ末端配列分析
アミノ酸配列、すなわちメタロプロテイナーゼ阻害因子のアイデンティティーをＮ末端側配列分析によって決定した。２０μｇの精製されたメタロプロテイナーゼ阻害因子を、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．５、６Ｍのグアニジン−ＨＣｌ、１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）中に再懸濁させ、６５℃で３０分間インキュベートした。次いで、変性し、縮小したサンプルを室温に冷却し、４０ｍＭのヨードアセトアミドを加え、３０分間インキュベートしてアルキル化した。次いで、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えてサンプルを酸性にし、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｇ１０００Ａタンパク質配列決定装置を製造者の指示に従って使用するエドマン分解によって、Ｎ末端側から配列を決定した。Ｎ末端側配列（８サイクル）は、次の通りであった。
ＣＳＣＳＰＶＨＰ

（実施例３）
組成物のメタロプロテイナーゼ阻害活性
メタロプロテイナーゼＧｅｌａｔｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を使用して、メタロプロテイナーゼ阻害因子の活性を調べた。このアッセイでは、活性なＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９（ゼラチナーゼ）酵素によって切断されるビオチン標識されたゼラチナーゼ基質を利用する。ビオチン標識されたゼラチナーゼ基質が切断されると、基質に特異的な専用の（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）９６穴プレートに結合することのできる、ビオチン標識のより少ない断片を生じる。次いで、結合した断片は、酵素の基質が加えられると着色された産物を生じる（４０５ｎｍで検出可能）ストレプトアビジン−酵素複合体により検出することができる。したがって、ゼラチナーゼ活性が高いほど、光学密度が低くなり（図５）、ゼラチナーゼ活性が阻害されると、吸高度がより高くなる。ＴＮＣ緩衝液（５０ｍＭのトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．５、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０５％のＢｒｉｊ−３５）中の酢酸ｐ−アミノフェニル水銀（ｐ−ＡＰＭＡ）活性化ＭＭＰ−２（６．７ｎｇ）を、単独で、又は各精製ステップからプールした画分（１０μｌ）と共に３７℃で３０分間プレインキュベートする。その後、ビオチン標識されたゼラチナーゼ基質を各サンプルに加え、３７℃でさらに３０分間インキュベートし、次いで、製造者の指示に従ってＭＭＰ活性を決定する。図６に示すように、ＭＭＰ−２なしでは、ゼラチナーゼ基質は、切断されないままであるが（高い吸高度）、ＭＭＰ−２存在下では、基質が切断され、低い吸高度が認められる。ＭＭＰ−２を各精製ステップからのメタロプロテイナーゼ阻害因子陽性の画分と共にプレインキュベートすると、メタロプロテイナーゼ活性に対するメタロプロテイナーゼ阻害因子の阻害活性が明らかに示される。予想どおり、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含有しないＣｅｌｌｕｆｉｎｅカラムからの画分３３は（図１を参照のこと）、メタロプロテイナーゼ活性を阻害しなかったが、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含有する画分３０は好結果であった。

実施例１Ａ及び１Ｂで概略を述べる精製方法の様々な画分プールからの乳抽出物組成物のメタロプロテイナーゼ阻害活性も、メタロプロテイナーゼ（ペプチド研究所、大阪府）による蛍光消光基質を使用して定量化した。この基質がメタロプロテイナーゼによって切断されると、蛍光タグの付近から消光剤分子が放出され、蛍光が増大する。したがって、メタロプロテイナーゼ阻害因子の量が増えると、蛍光が減少することになる。１ｍＭのｐ−アミノフェニル水銀酸（ｐ−ＡＰＭＡ）を使用して、１．５μｇ／ｍＬの組換え型ヒトＭＭＰ−２を３７℃で１時間かけて活性化した。アッセイにかけるプールされた画分は、一般的に、ＢｕｆｆｅｒＥ（０．１Ｍのトリス、０．１ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＣａＣｌ２、０．０％のＢｒｉｊ−３５）で３００倍に希釈し、検量線を、ＢｕｆｆｅｒＥ中の０〜０．１５μｇ／ｍＬの組換え型ヒトＴＩＭＰ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ミネアポリス）を使用して作成した。４０μＬの活性化ＭＭＰ−２及び４０μＬの各サンプルを９６穴トレーの個々のウェルに播き、ＢｕｆｆｅｒＥで総体積を２７０μＬ／ウェルとした。次いで、これらサンプルを室温で１時間インキュベートし、その後、１６μＭの蛍光基質を３０μＬ／ウェルで加え、室温で３０〜４５分間インキュベートした。２００ｍＭのＥＤＴＡ ３０μＬで反応を停止し、Ｗａｌｌａｃ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、フィンランド）を用いて蛍光を測定した（励起／発光λ＝３４０〜３９０ｎｍ）。この実験の結果を以下の表２に示す（「ＭＭＩ」は、後にＴＩＭＰ−２であると確認されたメタロプロテイナーゼ阻害因子を指す）。

（実施例４）
メタロプロテイナーゼ阻害活性の強化された適切な薬剤組成物又は動物用組成物
組成物の成分の単位はすべて「部」として測定する。
本明細書で特定する乳製品抽出物の量を「ｑｓ」と称した。

（ｉ）生理食塩水
活性物質メタロプロテイナーゼ阻害因子 ｑｓ
塩化ナトリウム ０．９
蒸留水を加えて １００とする
成分を十分に混合した後、１０ｍＭのＨＣｌを加えてｐＨを３．８〜４．２の間に調整する。

（ｉｉ）セトマクロゴールクリーム
活性物質メタロプロテイナーゼ阻害因子 ｑｓ
セトマクロゴール乳化ワックス １５
液体パラフィン（重量） １０
クロロクレゾール ０．１
プロピレングリコール ５
蒸留水 １００
セトマクロゴール乳化ワックスをパラフィンと共に約７０℃で融解させる。クロロクレゾール及びプロピレングリコールを、ほぼ同じ温度に温めた約５０部の蒸留水に溶解させる。混合した後、組成物の重量を調整し、冷めるまで攪拌する。次いで、乳製品抽出物を適切な濃度になるまで加え、十分に混合する。

（ｉｉｉ）水性クリームＡＰＦ
活性物質メタロプロテイナーゼ阻害因子 ｑｓ
乳化軟膏 ３０
グリセロール ５
フェノキシエタノール １
蒸留水 １００
乳化軟膏を約７０℃で融解させる。フェノキシエタノールをほぼ同じ温度に温めた蒸留水に溶解させる。組成物を混合し、重量を調整し、冷めるまで攪拌する。次いで、十分に攪拌しながら乳製品抽出物を加える。

（ｉｖ）緩衝クリームＢＰＣ７３
活性物質メタロプロテイナーゼ阻害因子 ｑｓ
クエン酸 ５
リン酸ナトリウム ２５
クロロクレゾール １
乳化軟膏 ３００
蒸留水 ６６９
乳化軟膏を穏やかに加熱しながら融解させた後、同じ温度の蒸留水中に予め溶解させてあるリン酸ナトリウム、クエン酸、及びクロロクレゾールを加える。組成物を冷めるまで穏やかに攪拌する。次いで、乳製品抽出物を加え、十分に混合する。

（ｖ）乳化軟膏ＡＰＦ
活性物質メタロプロテイナーゼ阻害因子 ｑｓ
乳化ワックス ３０
白色軟パラフィン ５０
液体パラフィン（重量） ２０
ワックスとパラフィンを一緒に融解させ、冷めるまで攪拌する。次いで、乳製品抽出物を適切な濃度になるまで基剤（ｂａｓｅ）の一部分に加え、残りを徐々に混ぜ込んだ後、十分に混合する。

（ｖｉ）ペプチド軟膏（ネオマイシン及びバシトラシン軟膏ＢＰＣ ７３）
活性物質メタロプロテイナーゼ阻害因子 ｑｓ
液体パラフィン １０
白色軟パラフィン １００とする
白色軟パラフィンを融解させ、液体パラフィンを混合する。混合物を冷めるまで攪拌する。乳製品抽出物を基剤（ｂａｓｅ）の一部分と共に滴定し、基剤の残りに徐々に混ぜ込む。

（ｖｉｉ）ゲル（リグノカイン及びクロロヘキシジンゲルＡＰＦでの使用）
活性物質メタロプロテイナーゼ阻害因子 ｑｓ
トラガカント ２．５
グリセロール ２５
蒸留水 １００
トラガカントをグリセロール及びほとんどの蒸留水と混合する。沸騰させた後、混合物を冷却し、乳製品抽出物を加える。組成物の重量を調整し、よく混合する。完成品は光から保護する。

（ｖｉｉｉ）スプレー（アドレナリン及びアトロピンスプレーＢＰＣ７３に使用）
活性物質メタロプロテイナーゼ阻害因子 ｑｓ
メタ亜硫酸水素ナトリウム １
クロルブトール（Ｃｈｌｏｒｂｕｔｏｌ） ５
プロピレングリコール ５０
蒸留水 １０００

（ｉｘ）スプレー（Ｉｎｄｏｓｐｒａｙに使用される）
活性物質メタロプロテイナーゼ阻害因子 ｑｓ
アルコール ９５％

（ｘ）ローション（アミノ安息香酸ローションＢＰＣ７３に使用される）
活性物質メタロプロテイナーゼ阻害因子 ｑｓ
グリセロール ２０
アルコール９５％ ６０
蒸留水 １００

（ｘｉ）セトマクロゴールローションＡＰＦ
活性物質メタロプロテイナーゼ阻害剤 ｑｓ
セトマクロゴール乳化ワックス ３
液体パラフィン １０
グリセロール １０
グルコン酸クロルヘキシジン溶液 ０．１
蒸留水 １００
セトマクロゴール乳化ワックスを液体パラフィンと共に約６０℃で融解させる。この混合物に、同じ温度の蒸留水で予め５０部に希釈しておいたクロルヘキシジン溶液をすばやく攪拌しながら加える。混合した後、組成物の体積を調整し、冷めるまで攪拌する。

（ｘｉｉ）口腔洗浄剤
活性物質メタロプロテイナーゼ阻害因子 ｑｓ
ポリエチレングリコール（７）−グリセロールココアート ２
グリセリン（８６％） １８
ペパーミント油 １０
エタノール ５５
蒸留水 １３
活性成分を蒸留水に溶解させる。溶液にポリエチレングリコール（７）−グリセロールココアート及びグリセリンを加え、溶解させる。ペパーミント油をエタノールに溶解させ、２種の溶液を攪拌しながら混合する。使用前に溶液を最高で１０倍に希釈する。

（ｘｉｉｉ）歯磨き粉
活性物質メタロプロテイナーゼ阻害因子 ｑｓ
メチルセルロース ０．８
炭酸カルシウム ３０
コロイド状シリカ ３
軽液体パラフィン ２
グリセリン ２０
蒸留水 １００
粉末類を、活性物質及びメチルセルロースを１部の蒸留水、パラフィン、及びグリセリン中に混ぜた混合物で湿らせる。残りの水で完全なものにした後、ペーストをホモジナイズする。

（ｘｉｖ）非経口溶液の成分
活性物質メタロプロテイナーゼ阻害剤 ｑｓ
＋／−ヒト血清アルブミン ２
アルギニン又はグリシン ４０
＋／−炭水化物 ４０
炭水化物は、グルコース、マンノース、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、又はこれらの混合物である。ｐＨを、リン酸塩、コハク酸塩、アミノ酸、又はこれらの混合物で整える。

（実施例５）
メタロプロテイナーゼ阻害性が強化された乳製品由来組成物の慢性創傷の治療法としての有効性
本発明を使用して、表面の創傷に関連した傷害を予防し、治療することができる。

メタロプロテイナーゼは、通常は正常組織では発現されないが、組織の修復又は再構築が必要なときや、潰瘍及び慢性的に炎症を起こしている組織でアップレギュレートされる。慢性の創傷とは、長期間持続する、組織の損失を伴う開放性創傷である。火傷は、慢性の創傷であるとされ、圧力によって引き起こされた真皮若しくは皮膚の潰瘍、並びに不十分な血流や組織の死を引き起こす内部循環の問題も同様である。このような創傷は、有効な創傷の治癒及び閉鎖を妨げる過剰のマトリックスメタロプロテイナーゼを特徴とする。メタロプロテイナーゼ阻害因子、特にＴＩＭＰ−２は、そのようなマトリックスメタロプロテイナーゼを阻害する。創傷治癒の補助におけるＴＩＭＰ−２の有効性をうまく試験するために、ヒトの患者で見られる慢性の創傷の特徴を反映する適切な動物モデルが必要である。典型的な特徴は、次のとおりである。
１）ザイモグラム分析によって測定すると、慢性の創傷は、正常な創傷よりもＭＭＰ−９のレベルが高く、それほどではないにせよＭＭＰ−２のレベルも高い（Ｔｒｅｎｇｒｏｖｅら、Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｒｅｇｅｎ．１９９９年１１〜１２月、第７巻（６）：４４２〜５２ページ）、
２）受傷後すぐにＭＭＰ−１（コラゲナーゼ１）及びＭＭＰ−９のｍＲＮＡレベルが上昇し、その後ＭＭＰ−２のｍＲＮＡの発現が増大する（Ｓｏｏら、Ｐｌａｓｔ Ｒｅｃｏｎｓｔｒ Ｓｕｒｇ．２０００年２月、第１０５巻（２）：６３８〜４７ページ）、
３）慢性の脚の潰瘍からの体液中でＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９のレベルが５〜１０倍に増大する（Ｗｙｓｏｃｋｉら、Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９３年７月第１０１巻（１）：６４〜８ページ）、
４）慢性の創傷では、ザイモグラムが、活性化又は超活性化したゼラチナーゼ断片を提示することがある分子量のより小さいプロテイナーゼ種を含むゼラチナーゼ活性（ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９）の増大を示す（Ｂｕｌｌｅｎら、Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９５年２月、第１０４巻（２）：２３６〜４０ページ）。

Ｃｈｅｎら（１９９９年）によって開発されたラットの慢性創傷モデルを使用して、メタロプロテイナーゼ阻害特性が強化された乳製品の慢性創傷の治療法としての有効性を判定した。このモデルでは、オスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの背中に、電動ドリルにはめた６ｍｍの皮膚生検パンチを使用して、十分な深さの創傷をつくった（正常創傷）。創傷の対を近位、中間位、及び遠位につくった。虚血性の創傷をつくるために、創傷の側に沿って２本の平行な切込みを入れ、皮膚片を持ち上げ、位置を変え、縫合した。中間位の虚血性創傷の治癒は、正常創傷よりもかなり緩慢であった（図７ｂ）。対照的に、近位及び遠位の治癒速度は、中間位で見られるものよりかなり速く、虚血性への効果は、遠位で最もはっきりしなかった（図７ａ及び７ｃ）。治癒速度の差は、種々の創傷部位への血流の差の表れであり、ＭＭＰレベルの全体としての上昇によって、主としてプロＭＭＰ−９及び不確定な他のゼラチン分解性プロテイナーゼの増加が示された。

各創傷部位の正常創傷（ｎ＝３〜５）及び虚血性創傷（Ｎ＝５〜６）のサンプルをプールしたものについて、ウェスタン免疫ブロット分析を実施した（図８）。ＭＭＰ−９レベルは、創傷治癒速度で見られたパターンを反映して、近位及び中間位の虚血性創傷で劇的に増大したが、遠位では増大しなかった。虚血性創傷は、正常創傷よりもかなり緩慢な治癒速度を示し、近位及び中間位の虚血性創傷では、ＭＭＰ−９が上向き調節された。この証拠は、ラットの虚血性創傷が、ヒトの患者に見られる慢性創傷の典型的な特性を示すことを示唆している。

実施例１Ａで概略を示したステップ１及び２にかけたホエーから、メタロプロテイナーゼ阻害活性の強化された組成物Ａを得た。実施例１Ａで概略を示した蛍光発光ＭＭＰの阻害での、精製ＴＩＭＰ−２の検量腺を使用して、組成物Ａの対生物活性成分ＴＩＭＰ−２を定量化した。組成物Ａは、１０．８２μｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−２を含有していた。組成物Ａのウェスタン免疫ブロット分析によって、ＴＩＭＰ−２の反応性がＴＩＭＰ−２タンパク質の２２ｋＤａ形態によることが確認された（図９）。

ラット慢性創傷モデルにおいて、虚血性創傷治癒を促進する能力があるか組成物Ａを試験した。１治療群あたり８匹のラットを用い、１０日間の試験を実施した。手術後、創傷をＯＨＴに透写して日ごとに創傷の大きさを測定した。ラットに、組成物Ａを希釈せずにアルギン酸塩包帯剤にして送達して１用量（１５０μｌ／創傷）を投与した。虚血性対照ラットには無菌生理食塩水を投与した。１０日後、組成物Ａで処置したラットは、生理食塩水で処理した対照と比べて治癒状態が有意に向上した（図１０）。

ＴＩＭＰ−２を含むメタロプロテイナーゼ阻害因子の使用が慢性創傷の創傷治癒を高めることを示す実施例５で示した結果から、発明者らは、この特定のモデルで使用した発明が、ＭＭＰ−９（９２ｋＤａ）活性のザイモグラム分析によって測定されるＭＭＰ−９活性を低下させ、その結果創傷が縮小する速度を増大し、皮膚機能の回復時間を短縮することを予測する。

（実施例６）
メタロプロテイナーゼ阻害性が強化された組成物の口腔粘膜炎の治療法としての有効性を試験するための方法を示す推測実施例
本発明を使用すると、粘膜炎に関連した損傷を予防及び治療することもできる。当業者ならば、特許を請求する発明が粘膜炎の治療になるかどうか容易に調査することができよう。

例えば、メタロプロテイナーゼ阻害性が強化された組成物をオスのゴールデンシリアンハムスターの化学療法誘発型粘膜炎に対して局所投与した効果の調査を利用することができる。通常、試験は、５−フルオロウラシルで処理した１０匹のハムスターの頬袋に、メタロプロテイナーゼ阻害性が強化された組成物を継続的に適用するものとなるはずである。

平均体重の似通ったハムスターを５匹からなる２群に分ける。すべてのハムスターに、１日目に９０ｍｇ／ｋｇ、３日目に６０ｍｇ／ｋｇの５−フルオロウラシルを腹腔内注射する。１日、２日、及び３日目に、ある方向へ６回、他の垂直方向へ６回、針金ブラシで頬袋にかき傷を付けて、むらのない創傷を得る。

各群を、賦形剤としての市販の口腔洗浄剤、又はメタロプロテイナーゼを阻害する性質が強化された、所定のタンパク質濃度の組成物０．３ｍｌで処理する。頬袋の液体処置剤を毎日１分間かけて塗布し、その間、イソフルラン麻酔剤を使用してハムスターに麻酔をかける。５日、７日、８日、１１日、１３日、及び１５日目に頬袋を評価する。モニタリングは、全体としての病変の重症度、あざ、はれ、及び傷跡の程度に注意を払いながら、頬袋の視覚による評価（１〜１０の尺度で評点をつける）を基にして行う。体重は０日目の値に対する百分率として記録する。

メタロプロテイナーゼ阻害因子の使用が創傷の治療になることを示す、実施例１Ａ、１Ｂ、２、３で示した結果、及び特に実施例５で示した結果から、発明者らは、この特定のモデルで使用された本発明が全体としての視覚評点、総潰瘍面積、及び体重減少による測定で、賦形剤処置群に比べ粘膜炎を軽減するだろうと予測する。

（実施例７）
メタロプロテイナーゼを阻害する性質が強化された組成物が、細菌の腸壁移動を低減する効力を試験する方法を示す推測実施例
本発明を使用すると、細菌の腸壁移動を弱めることができる。当業者ならば、特許を請求する発明が細菌の腸壁移動を弱めるかどうか容易に調査することができよう。

細菌の侵入に対するバリアを設ける腸上皮細胞の能力は、粘膜の修復、ひいては腸機能の適切な尺度となる。

例えば、オスのＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに高用量の化学療法剤、メトトレキサートを注射して、消化管内側の損傷の実験モデルとして使用する。対照ラットには、メタロプロテイナーゼを阻害する性質が強化された組成物を与えず、実験ラットは、メタロプロテイナーゼを阻害する性質が強化された組成物で５日間処置する。処置ラットには、同等量のカゼインの代わりに、所定の量の、メタロプロテイナーゼを阻害する性質が強化された組成物からなる変更食を与える。さらに、処置ラットには、実験期間の３日、４日、及び５日目に組成物を胃管栄養法によって与える。対照ラットには、非変更食を与え、３日、４日、及び５日目に同一のプロトコルによって同等量のウシ血清アルブミンの胃管栄養を施して、同じく窒素を含む食餌を実現する。

対照ラット及び処置ラットの一群には、１日、２日、及び３日目の最初に２．５ｍｇ／ｋｇのメトトレキサートを皮下注射する。追加の対照群には、偽のメトトレキサート注射を施し、メトトレキサート注射対照群と同時飼育する。

５日、８日、及び１２日目に全採血するまで、ラットを代謝ケージに入れておく。腹部の皮膚を７０％のエタノールに浸した後、無菌条件下で腸を除去する。目に見える腸間膜リンパ節を無菌の秤量済みの容器に入れ、次いで、サンプルを秤量し、注入溶液を加えて、最終濃度を１００ｍｇ／ｍｌとする。無菌のガラス強化グラインダーを用い、この溶液中で組織をホモジナイズする。グラム陰性細菌の腸間膜リンパ節への移動を測定するために、４０ｍｇ又は６０ｍｇの各組織ホモジネートをＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天又は血液寒天プレートに載せ、３５℃で４８時間好気的にインキュベートする。次いで、ＡＰＩ ２０Ｅストリップを使用して、グラム陰性腸内細菌コロニーの同定を行い、次いでカウントする。発生率（検出可能な細菌移動を示す動物の割合）及び組織１グラムあたりの平均細菌コロニー数を処置群ごとに算出する。

メタロプロテイナーゼ阻害因子の使用が創傷の治療になることを示す実施例１Ａ、１Ｂ、２、３で示した結果、及び特に実施例５で示した結果から、発明者らは、この特定のモデルで使用された発明が、移動の発生率をより低くすると推測する。発明者らは、処置群では腸間膜リンパ節１グラムあたりのコロニー数が有意に低くなると推測する。

（実施例８）
メタロプロテイナーゼを阻害する性質が強化された組成物がメトトレキサート誘発型小腸粘膜炎ラットの小腸陰窩及び絨毛の損失を防ぐ効能を試験する方法を示す推測実施例
本発明を使用すると、メトトレキサート誘発型小腸粘膜炎ラットの小腸陰窩及び絨毛の損失を妨げることができる。当業者ならば、特許を請求する発明が、メトトレキサート誘発型小腸粘膜炎ラットの小腸陰窩及び絨毛の損失を妨げるかどうか容易に調査することができよう。

例えば、オスのＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに、腸粘膜炎の実験モデルとして高用量の化学療法剤、メトトレキサートを注射する。ラットは、メトトレキサートによって小腸に損傷を受けるが、口腔若しくは結腸粘膜には受けない。（Ｖａｎｄｅｒｈｏｏｆ ＪＡ、Ｐａｒｋ ＪＨＹ、Ｍｏｈａｍｍａｐｏｕｒ Ｈ、Ｂｌａｃｋｗｏｏｄ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９９０年、第９８巻：１２２６〜１２３１ページ）。

重さが平均１４０ｇのラットを代謝ケージに入れておき、高炭水化物食を与える。対照ラットには、メタロプロテイナーゼ活性を有する組成物を与えず、処置ラットは、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物で５日間処置する。さらに、処置ラットには、実験期間の３日、４日、及び５日目に胃管栄養を施して、メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む組成物を与える。対照ラットには、非変更食を与え、３日、４日、及び５日目に同一のプロトコルによって同等量のウシ血清アルブミンの胃管栄養を施して、同じく窒素を含む食餌を実現する。

対照ラット及び試験ラットの一群には、１日、２日、及び３日目の最初に２．５ｍｇ／ｋｇのメトトレキサートを皮下注射する。追加の対照群には、偽のメトトレキサート注射を施し、メトトレキサート注射群と同時飼育した。ラットを５日間代謝ケージに入れておき、５日後に屠殺して、消化管を収集する。次いで、近位小腸及び遠位小腸から組織サンプルを収集する。組織サンプルを固定し、開示の全体を参照により本明細書に援用するＲｅａｄら、Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９９２年、第１３３巻：４２１〜４３１ページに記載の方法を使用して染色し、組織像分析を行う。

メタロプロテイナーゼ阻害因子の使用が創傷の治療になることを示す、実施例１Ａ、１Ｂ、２、３で示した結果、及び特に実施例５で示した結果から、発明者らは、本発明をこの特定のモデルで使用すれば、粘膜全体の単位面積あたりの無傷陰窩面積によって検出される、近位小腸及び遠位小腸の粘膜陰窩の損失が対照群よりも低減されるはずであると推測する。発明者らは、本発明をこの特定のモデルで使用すれば、絨毛長さの短縮が対照群よりも弱まるはずであると推測する。つまり、発明者らは、ある程度成功を見込んで、本発明が、化学療法による小腸内の損傷を予防し、又はその修復を促進するはずであると推測する。

（実施例９）
メタロプロテイナーゼを阻害する性質が強化された組成物の胃潰瘍の治療法としての有効性を試験する方法を示す推測実施例
本発明を使用すると、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）療法によって引き起こされる胃潰瘍に関連した損傷を予防又は治療することができる。当業者ならば、特許を請求する本発明がＮＳＡＩＤ療法誘発型の胃潰瘍の予防又は治療になるか容易に調査することができよう。

例えば、高用量のＮＳＡＩＤ、インドメタシンの胃管栄養を施した成体Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを実験用のＮＳＡＩＤ誘発型胃炎モデルとして使用する。対照ラットには、メタロプロテイナーゼ阻害性が強化された組成物を与えず、実験ラットには、メタロプロテイナーゼ阻害性が強化された組成物をインドメタシン処置の７２時間、４８時間、２４時間、又は３０分前に予防のために投与する。処置ラットには、非変更食を与え、またメタロプロテイナーゼ阻害性が強化された組成物を１日２回胃管栄養によって与える。対照ラットには、非変更食を与え、同等体積の生理食塩水の胃管栄養を行う。処置ラット及び対照ラットを一晩絶食させ、１ｍｌのインドメタシン（１００ｍｇ／ｋｇ）の胃管栄養を施して、胃潰瘍を引き起こす。インドメタシンの胃管栄養を行ってから５時間後に処置ラット及び対照ラットを屠殺し、消化性潰瘍の評価を行う。

インドメタシン処置によって引き起こされた胃粘膜損傷の数、大きさ、及び単位粘膜表面積あたりの面積、並びに胃上皮細胞中の細胞増殖又は細胞のアポトーシスを、当業者によく知られている技術を使用して測定し、対照群と処置群とで比較して、メタロプロテイナーゼ阻害性が強化された組成物を使用したために胃粘膜の損傷が低減し、予防され、又はその修復が促進されたかどうかを判定する。実施例１Ａ、１Ｂ、２、３、及び５で示した結果から、発明者らは、ある程度成功を見込んで、本発明が胃粘膜の損傷を低減させ、予防し、又はその修復を促進するはすであると推測する。

最後に、本明細書で概略を述べた本発明の意図から逸脱しない限り、様々な変更、加減、及び／又は追加を行ってよいことを理解されたい。

牛チーズホエーを実施例１Ａによって例示される一連の精製ステップにかけた。各クロマトグラフィーステップ後のＥＩＡにおけるタンパク質及びメタロプロテイナーゼ阻害因子の溶離プロフィールを示すグラフである。タンパク質（−）は、ＢＣＡアッセイ（図１ａ〜ｃ）又は２１４ｎｍの吸光度（図１ｄ）（●）によって評価した。各画分のメタロプロテイナーゼ阻害因子は、実施例１Ａに記載のＥＩＡによって定量した。 精製メタロプロテイナーゼ阻害因子のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（左のパネル）、及びその後の抗ＴＩＭＰ−２抗体でのウェスタンブロット（右のパネル）分析を示す図である。精製メタロプロテイナーゼ阻害因子のサンプルを、２．８μｇ、１．４μｇ、又は０．７μｇの量で１０〜２０％のトリス−トリシンゲル上に載せて還元条件下で泳動させ、クーマシーブリリアントブルーで染色した。精製メタロプロテイナーゼのサンプルを、０．３μｇの量で１０〜２０％のトリス−トリシンゲルにも載せて還元条件下で泳動させ、ニトロセルロースに移し、モノクローナル抗ＴＩＭＰ−２抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、次いでＨＲＰ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｌｅｎｕｓ Ｌａｂｓ）をプローブとして探索した。次いで、ＨＲＰで標識されたタンパク質を強化化学発光（ＥＣＬ）によって可視化した。この図から、メタロプロテイナーゼ阻害因子がウシＴＩＭＰ−２であることが確認される。 分析ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製メタロプロテイナーゼ阻害因子の分析結果を示すグラフである。一定分量（１０μｇ）の精製メタロプロテイナーゼ阻害因子調製物をｍｉｃｒｏｂｏｒｅ Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（２．１×１００ｍｍ、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ Ｌａｂｓ）による分析にかけた。タンパク質は、０．０８％のＴＦＡ中１５〜４５％のＣＨ_３ＣＮで２５分間、次いで４５〜８０％のＣＨ_３ＣＮで５分間線形勾配をかけて溶離した。 メタロプロテイナーゼ阻害因子の質量分析の分析結果を示すグラフである。メタロプロテイナーゼ阻害因子の純度及び分子量を、ＶＧ Ｑｕａｔｔｒｏ ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄｒａｐｏｌｅ質量分析計を製造者の指示に従って使用し、質量分析によって評価した。この図から、メタロプロテイナーゼ阻害因子がウシＴＩＭＰ−２であることが確認される。 メタロプロテイナーゼ阻害因子の活性を試験するのに使用するメタロプロテイナーゼ活性アッセイの概略図である。この図では、ＭＭＩが、メタロプロテイナーゼ阻害因子を指す。このアッセイは、活性ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９（ゼラチナーゼ）酵素によって切断されるビオチン標識されたゼラチナーゼ基質を利用するものである。ビオチン標識されたゼラチナーゼ基質が切断されると、基質に特異的な専用の９６穴プレートに結合することのできる、ビオチン標識のより少ない断片が生じる。次いで、結合した断片を、酵素の基質が加えられると着色産物を生じるストレプトアビジン−酵素複合体を用いて検出する（４０５ｎｍで検出可能）。したがって、ゼラチナーゼ活性が高いほど、ＯＤが低くなる結果となり、ゼラチナーゼ活性が阻害されると、吸光度がより高くなる。 メタロプロテイナーゼ阻害因子のメタロプロテイナーゼ阻害活性を示すグラフである。上述のＧｅｌａｔｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用して、メタロプロテイナーゼ阻害活性があるかどうか、精製の各ステップからのプールされた一定分量の画分、並びにＣｅｌｌｕｆｉｎｅカラムからの画分３０及び３３の分析を行った。 正常創傷及び虚血性創傷の近位（ａ）、中間位（ｂ）、及び遠位（ｃ）での治癒速度を示すグラフである。 正常創傷及び虚血性創傷部位のタンパク質のウェスタンブロッティングを示す図である。ＭＭＰ−９は、近位（Ｐ）及び中間位（Ｍ）の虚血性創傷で上向き調節されたが、遠位（Ｄ）では上向き調節されなかった。 Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ画分中のＴＩＭＰ−２のウェスタンブロッティング分析を示す図である。 生理食塩水又は組成物Ａで１０日間処置した後の虚血性創傷及び正常創傷の大きさ（０時間の中間位創傷の直径に対する％）を示すグラフである。値は、平均±ＳＥである。^＊は、生理食塩水で処置した虚血性創傷に対するＡＮＯＶＡによる有意差を示す（Ｐ＜０．０５）。

Claims (26)

1. メタロプロテイナーゼ阻害因子を含む、哺乳動物の乳汁分泌物から直接的又は間接的に得られる組成物。
2. 前記メタロプロテイナーゼが、（ｉ）コラゲナーゼ（メタロプロテイナーゼ１、８、及び１３）、（ｉｉ）ゼラチナーゼＡ及びＢ（メタロプロテイナーゼ２及びメタロプロテイナーゼ９）、（ｉｉｉ）ストロメライシン１及び２（メタロプロテイナーゼ３及び１０）、（ｉｖ）マトリリシン（ＭＭＰ−７）、エナメリシン（ＭＭＰ−２０）、マクロファージメタロエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）、及びＭＭＰ−１９、並びに（ｖ）膜型メタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ−１〜４及びストロメリシン３、ＭＭＰ−１１）からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
3. 前記阻害因子がメタロプロテイナーゼ組織阻害因子（ＴＩＭＰ）である、請求項１又は２に記載の組成物。
4. 前記ＴＩＭＰが、ＴＩＭＰ−２ポリペプチド、その機能上の同等物又は断片である、請求項３に記載の組成物。
5. 前記ＴＩＭＰ−２が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定して約２１，０００Ｄａの分子量を有し、且つ／又は約７．０の等電点を持つ、請求項４に記載の組成物。
6. 前記ＴＩＭＰ−２が、ＮＨ２−ＣＳＣＳＰＶＨＰのＮ末端配列を含む、請求項５に記載の組成物。
7. 前記ＴＩＭＰ−２が次の配列：
   

   

   
   又はその機能上の同等物若しくは断片を含む、請求項６に記載の組成物。
8. 前記乳汁分泌物が乳又は初乳である、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記哺乳動物が、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、及びウマからなる群から選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
10. 前記哺乳動物が有蹄動物である、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
11. 前記組成物が乳汁分泌物から間接的に得られる場合、中間製品が、チーズホエー、脱脂乳、酸（カゼイン）ホエー、初乳ホエー、脱脂初乳、及び乾燥乳粉末からなる群から選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
12. 薬剤として、動物用薬剤として、栄養剤として、又は化粧品として許容される担体及び／又は賦形剤を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
13. 前記メタロプロテイナーゼ阻害因子が、前記組成物の総タンパク質含有量に対して約７０％〜約９９％の純度で存在する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
14. 望ましくないメタロプロテイナーゼ活性と関係のある障害を治療し、予防し、又は改善する方法であって、その必要のある動物に請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物を治療有効量投与することを含む方法。
15. 前記障害が、圧力、血管疾患、糖尿病、自己免疫疾患、鎌状赤血球病、又は血友病によって引き起こされた創傷；手術の結果；治療によって引き起こされたもの；中枢神経系の障害に関連するもの及び皮膚の剥脱性疾患のために生じるもの；フランベジア、ＨＩＶ、水痘、ヘルペス感染などの局所若しくは全身の感染に関連するもの；先天的なもの；眼の角膜の傷害；病的な創傷；外傷若しくは事故による創傷；又は火傷によって引き起こされた創傷である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記障害が、歯科的な若しくは口腔の創傷；十二指腸、胃、若しくは食道の消化性潰瘍；炎症性腸疾患、ストレス状態に伴う潰瘍、消化管内側の損傷、早産に伴う不十分な腸機能若しくは腸の損傷、下痢状態、食物不耐性、消化管の癌、外科手術を誘因とする腸の損傷、食道逆流による損傷、腸のバリア機能喪失に伴う症状、消化管の不十分な機能若しくは損傷をもたらす先天的な症状、又は腸に影響を及ぼす自己免疫疾患である、請求項１４に記載の方法。
17. 前記阻害因子の濃度が、望ましくないメタロプロテイナーゼ活性の部位に約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの濃度で存在するように前記組成物を投与する、請求項１４から１６までのいずれか一項に記載の方法。
18. 前記障害が、拡張型心筋症、うっ血性心不全、アテローム性動脈硬化症、プラーク破裂、再灌流傷害、虚血、慢性閉塞性肺疾患、血管形成術後再狭窄、大動脈瘤を含む心臓血管系の障害；骨、肝臓、肺、及び神経組織の障害を含む、メタロプロテイナーゼが異常な再構築に関与する組織障害；メタロプロテイナーゼ活性を変化させるウイルス感染に伴う障害；メタロプロテイナーゼが関与する炎症に伴う障害；乾癬、強皮症、及びアトピー性皮膚炎、又は皮膚の外観に老化及び／若しくはしわをもたらす紫外線による皮膚損傷を非制限的に含む、メタロプロテイナーゼが関与する皮膚関連障害である、請求項１４に記載の方法。
19. メタロプロテイナーゼ阻害因子を少なくとも部分的に精製又は濃縮する方法であって、
    乳汁分泌物若しくはその派生物を準備するステップと、
    乳汁分泌物若しくはその派生物を、遠心分離、精密濾過、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、及び一過性の酸性化からなる群から選択される１種又は複数の処理ステップにかけるステップと
    を含む方法。
20. 陽イオン交換クロマトグラフィーと、その後の限外濾過ステップとを含む、請求項１９に記載の方法。
21. 前記限外濾過ステップと、その後の酸性化ステップを含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記の一過性の酸性化ステップと、その後のゲル濾過クロマトグラフィーステップとを含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記のゲル濾過ステップと、その後の陰イオン交換クロマトグラフィーステップとを含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記陰イオン交換クロマトグラフィーステップと、その後のアフィニティークロマトグラフィーステップとを含む、請求項２３に記載の方法。
25. 前記アフィニティークロマトグラフィーステップと、その後の逆相高速液体クロマトグラフィーステップとを含む、請求項２４に記載の方法。
26. 遠心分離ステップと、その後のアフィニティークロマトグラフィーステップとを含む、請求項１９に記載の方法。

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