CN102618620B - 一种细胞水平筛选金属基质蛋白酶抑制剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种细胞水平筛选金属基质蛋白酶抑制剂的方法，包括：(1)设计引物，PCR扩增金属基质蛋白酶的全长cDNA；(2)构建以Retro‑X Tet‑Off为载体的表达体系；(3)将上述构建完成的载体对细胞系进行转染，并筛选阳性克隆，当细胞铺满皿底后，将培养基换为不含DOX的培养基，诱导MMPs的表达；(4)筛选出金属基质蛋白酶抑制剂。本发明建立了一个基于Tet‑off表达系统的，能最大程度模拟MMP的作用环境的方法，用于MMP抑制剂的筛选，相对一般金属基质蛋白酶抑制剂体外筛选更准确。

Description

一种细胞水平筛选金属基质蛋白酶抑制剂的方法

技术领域

本发明属于筛选药物领域，特别涉及一种细胞水平筛选金属基质蛋白酶抑制剂的方法。

背景技术

细胞外基质的降解是肿瘤细胞迁移、浸润基质的前提，也是瘤细胞与基质黏附以后发生的重大变化。金属基质蛋白酶(MMP)是调节细胞外基质动态平衡最重要的酶系。所以MMP是治疗癌症及肿瘤的重要靶点。但是现有体外的金属基质蛋白酶抑制剂的筛选方法不能模拟MMP在体内的作用方式，很多研究证明可溶性的MMP(比如：-1.-13，-2，-9)不能介导肿瘤细胞的侵袭能力。

1992年Gossen等成功地利用原核基因调控元件构建了四环素(tetracycline，Tet)真核细胞基因调控表达系统，它利用Tet及其衍生物对所感兴趣的基因进行诱导表达。随着人们对该系统的不断改进，使这种诱导表达具有严密、高效、可控性强、表达泄露小等优点。目前真核细胞可诱导的基因表达系统已被广泛应用于基因功能研究及基因治疗研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种细胞水平筛选金属基质蛋白酶抑制剂的方法，该方法建立了一个基于Retro-X Tet-Off表达系统的筛选MMP抑制剂的方法，该方法在体外最大程度模拟了MMP的作用环境，从而对候选药物对MMP的作用做出更准确的评估。

本发明的一种细胞水平筛选金属基质蛋白酶抑制剂的方法，包括：

(1)设计引物，PCR完成扩增金属基质蛋白酶的全长cDNA；

(2)将上述扩增的cDNA插入pRetroX-Tight-Pur的多克隆位点，构建以Retro-X Tet-Off为载体的表达体系；

(3)将上述构建完成的载体对细胞系进行转染，并筛选阳性克隆，当细胞铺满皿底后，将培养基换成不含DOX的培养基，诱导MMP的表达；

(4)设空白对照组、阳性对照组、阴性对照组和不同药物浓度处理组，用细胞膜探针对细胞膜进行染色观察，利用对细胞形态学的分析评估候选待评价药物对MMP的作用。

所述步骤(1)中的引物为上游引物：TGAGGATCCATGCATCCAGGGTCCTGGC；下游引物：AGCTCGCGACTTAACACCACAAAATGG。

所述步骤(3)中的细胞系为PCS-100-011细胞系，人的大动脉原代细胞，体外培养的内皮细胞可以分泌大量细胞外基质，可以形成一个类似与体内细胞及基质的环境。

所述步骤(4)中的细胞膜探针为DiI细胞膜探针，在荧光显微镜下可更方便的观察分析。

本发明利用Retro-X Tet-Off表达系统在细胞表达，并发生作用，从而引起细胞形态变化，以细胞形态的变化作为筛选金属基质蛋白酶的标志，培养过程中加入四环素抑制金属基质蛋白酶的表达，使细胞正常贴壁生长，呈正常的细胞形态。等细胞贴壁后，换成不含四环素的培养基，诱导金属基质蛋白酶的表达，使细胞发生形态变化。细胞水平筛选抑制剂，细胞表达的蛋白酶的作用方式更加接近体内。

有益效果

本发明建立了一个基于Retro-X Tet-Off表达系统的，能最大程度模拟MMP在体内的作用的方法，可用于MMP抑制剂的筛选，能对蛋白酶抑制剂有更准确的判断，细胞形态作为筛选标志更为直观和灵敏，利用细胞膜荧光探针，使检测更为方便快速，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明工艺流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

实施例以MMP-13为例，但是本专利不仅限于MMP-13，也可用于其他金属基质蛋白酶。本实施例采用Clontech公司Retro-X Tet-Off Advanced Inducible Expression System，包含：pRetroX Tet-Off质粒，pRetroX-Tight-Pur质粒以及pRetroX-Tight-Pur-luc对照质粒。采用GP293细胞为包装细胞。采用PCS-100-011作为靶细胞。

(1)MMP-13表达质粒的构建：

①总RNA提取：从经TNF-α处理的UT-SCC-7细胞，用Trizol抽提总RNA。然后利用M-MuLV反转录酶，oligo(dT)作为引物。反转录得到cDNA第一条链。

②MMP-13全长cDNA的扩增：上游引物：TGAGGATCCATGCATCCAGGGTCCTGGC；下游引物：AGCTCGCGACTTAACACCACAAAATGG。退火温度为65℃-55℃降落PCR，72摄氏度延伸2min，40个循环。PCR产物长度为1.4kb。将PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，胶回收PCR产物。

(2)将上述扩增的PCR产物及pRetroX-Tight-Pur经BamH I和Nurl均双酶切过夜，回收。插将酶切过的PCR产物和酶切过pRetroX-Tight-Pur用T4DNA连接酶，16摄氏度连接过夜，转化到DH5α菌种，用100ug/ml的氨苄青霉素筛选阳性质粒克隆，抽提质粒，命名为pRetroX-MMP；

(3)稳转RetroX-Tet-Off advanced细胞系的建立：

采用商品化的Retro X universal Packing System(clontech)。按照说明进行操作建立RetroX-Tet-Offadvanced稳定细胞系。简要的步骤如下：包装质粒和pRetroX Tet-Off质粒混合后，共转染GP293细胞，培养48小时候，收获病毒。利用qRT-PCR检测滴度。将病毒感染PCS-100-011细胞。用500μg/ml的G418筛选稳定的细胞系。TetR单抗(购自clontech)选择出高表达的细胞系，从而获得pRetroX Tet-Off稳转的细胞系。该细胞系命名为Tet-Off-PCS细胞系。

(3)pRetroX-MMP质粒的转染。

①将上述构建完成的载体pRetroX-MMP同样利用Retro X universal Packing System包装，收获病毒后对细胞系Tet-Off-PCS进行转染，并用5μg/ml的Puromycin筛选阳性克隆。再利用RT-PCR的方法筛选(引物及PCR条件同MMP cDNA的扩增)出含四环素时MMP低表达，不含四环素时高表达的克隆。从而获得双质粒稳转的细胞系，命名为pRetro-MMP细胞系。

②将pRetroX-Tight-Pur-luc以同(3)步骤中①的方法转染Tet-Off-PCS细胞系，筛选阳性克隆。将获得的双质粒稳转的细胞系命名为：pRetro-con。

(4)将筛选得到的阳性细胞种入培养皿中。培养基为DMEM(含10％小牛血清及1μg/ml的四环素)。当细胞生长直到铺满70％的皿底后，大约48h-72h，将培养基换为不含四环素的培养基，诱导MMP的表达；

(5)各处理组的设置：下面所有处理组都需要在pRetro-MMP细胞系和pRetro-con细胞系中平行进行。

各处理组设置方法：

空白对照1：用候选药物的溶剂作为对照，比如所用药物溶于乙醇，则用乙醇作为对照。将溶剂按照候选药物组使用的浓度溶解于培养基中，该培养基为DMEM，不含四环素，不含小牛血清。

空白对照2：用含1μg/ml的四环素的DMEM培养基继续培养。

阴性对照组：用不含四环素和血清的DMEM培养基培养。

阳性对照组：因该方法为首创方法，尚未有合适的阳性对照，所以采用四环素作为抑制剂，抑制MMP的表达，作为阳性对照。使用浓度推荐为50ng/ml。即用含50ng/ml的四环素，不含血清的DMEM培养细胞。

不同药物浓度组：将候选药物稀释成各梯度浓度，可以按1∶10作倍比稀释。即用不含四环素及血清的DMEM培养液将候选待评价药物稀释到特定浓度。

设立各处理组的目的：

空白对照1：确定候选药物的溶剂的对实验的影响。

空白对照2：确定MMP基本不表达时的对细胞状态的影响。

阴性对照：MMP高表达对细胞状态的影响。

阳性对照：MMP活性或表达被抑制时对细胞状态的影响。

不同药物浓度组：不同浓度筛选药物的对细胞状态的影响。

(6)pRetro-con细胞系报告基因检测：

采用商品化的luciferase检测试剂盒进行。简要步骤为：去除培养基，加入试剂盒提供的裂解液，3000rpm离心5分钟收集上清液，加入荧光素酶底物，用化学发光仪检测荧光RLU。

(7)细胞形态的观察：

在显微镜下观察到细胞空白对照2和阴性对照有较为明显的差异时，向各个样品中加入用PBS配制的4％多聚甲醛固定细胞。然后加入含10mM DiI的无血清的DMEM培养基，37℃孵育20分钟，然后在荧光显微镜下观察红色荧光。

本实施例最大程度模拟了肿瘤细胞的MMP开始异常表达的情况，同时细胞外的基质也非常类似正常的基质，当MMP开始异常表达之后，过表达的MMP开始降解细胞外基质，这一过程模拟了肿瘤细胞如何降解细胞外基质。MMP异常表达的细胞通常会表现出较强的伸展能力，其在形态学上更加不规则。在此过程中可加入药物，观察细胞形态变化，从而判断药物对MMP有没有抑制作用。如果经处理后细胞的形态相对规则，则认为该药物对MMP有一定抑制作用。

MMP异常表达还可能出现另一种情况：即MMP作用相对较强，会使细胞部分脱离培养基质，从而出现细胞形态变的圆润，而且细胞周边变得光亮。也有些MMP可能对细胞不能引起比较明显的形态变化。

需要对细胞进行报告基因检测，确定候选药物对表达质粒表达效率的影响，排除药物是抑制了MMP的表达而不是作用于MMP本身起抑制作用。利用pRetroX-Tight-Pur-luc对照质粒可以检测候选药物对pRetroX-MMP表达效率的影响。

Claims (4)

1.一种细胞水平筛选金属基质蛋白酶抑制剂的方法，包括：

(1)设计引物，PCR完成扩增金属基质蛋白酶的全长cDNA；

(2)将上述扩增的cDNA插入pRetroX-Tight-Pur的多克隆位点，构建以Retro-X Tet-Off为载体的表达体系；

(3)将上述构建完成的表达体系对细胞系进行转染，并筛选阳性克隆，当细胞铺满皿底后，将培养基换成不含四环素的培养基，诱导MMP的表达；

(4)设空白对照组、阳性对照组、阴性对照组和不同药物浓度处理组，用细胞膜探针对细胞膜进行染色观察，利用对细胞形态学的分析评估候选待评价药物对MMP的作用。

2.根据权利要求1所述的一种细胞水平筛选金属基质蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的引物为上游引物：TGAGGATCCATGCATCCAGGGTCCTGGC；下游引物：AGCTCGCGACTTAACACCACAAAATGG。

3.根据权利要求1所述的一种细胞水平筛选金属基质蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的细胞系为PCS-100-011细胞系。

4.根据权利要求1所述的一种细胞水平筛选金属基质蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的细胞膜探针为DiI细胞膜探针。