JP2005533668A - ナノ粒子の分別およびサイズ決定 - Google Patents

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Abstract

安定化された水溶性ナノ粒子をナノ粒子のサイズに基づいて分別する新規な方法を見いだした。安定化された荷電した水溶性ナノ粒子の場合、本方法は、実質的に水混和性の有機溶媒をナノ粒子水溶液に電解質の存在下で添加することを含む。さらに、安定化された荷電した水溶性ナノ粒子の平均粒子サイズをゲル電気泳動を用いて決定する方法を見いだした。

Description

関連出願の相互参照
本願は、米国仮出願第６０／３９７，８１９号（２００２年７月２３日出願）による特典を請求する。
本発明は、ナノスケール材料の分野に関する。より特定的には、本発明は、ナノ粒子のサイズ分別およびサイズ決定を行う方法を提供する。
ナノ粒子は、最近、ナノスケール材料の分野で広範にわたる研究の対象になっているナノメートルサイズの金属性および半導電性の粒子である。ナノ粒子は、多種多様な分野の用途に利用できる可能性がある。これらの用途としては、ナノスケール電子デバイス、多機能性触媒、化学センサー、および多くの生物学的用途、たとえば、バイオセンサー、生物学的アッセイ、遺伝子銃技術を用いる生物のトランスフェクション、およびドラッグデリバリー非特許文献１が挙げられる。
ナノ粒子は、比較的簡単な方法によって大量かつ容易に調製可能であり、対応するバルク材料と非常に異なる特性を有する。粒子凝結を防止したり、種々の溶媒に粒子を溶解させたりするために、種々の有機コーティングなどのスタビライザーが必要とされる。最近、チオプロニンまたは補酵素Ａの単層により安定化された水溶性金ナノ粒子が報告された非特許文献２。反応に使用されるテトラクロロ金酸に対するチオプロニンまたは補酵素Ａのモル比を変化させることにより、これらの粒子の平均粒子サイズを系統的に制御することが可能である。さらに、比較的簡単な化学を用いて多種多様な構造単位によりナノ粒子に機能を付与しうることが実証された非特許文献３。
ナノ粒子の物理特性および化学特性は、そのサイズに大きく依存する。多くの用途では、規定の粒子サイズを有する単分散ナノ粒子（すなわち、均一なサイズの粒子）が必要とされる。しかしながら、化学合成では、通常、広い粒子サイズ分布を有するナノ粒子（すなわち、多分散ナノ粒子）が得られる。ナノ粒子のサイズを決定したり、そのサイズに基づいてナノ粒子を分離したりする方法は、当技術分野で公知である。
ナノ粒子の粒子サイズ分布および平均粒子サイズを決定するために、一般的には、透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）が利用される。しかしながら、この方法では、時間がかかるうえに、高価な装置が必要になる。さらに、ＴＥＭには、分離処理の機能が備わっていない。ナノ粒子の平均粒子サイズを決定するために、より簡単かつより迅速な方法が必要である。
金ナノ粒子の特性決定および分離のために、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）が使用されてきた。たとえば、非特許文献４には、１００ｎｍ細孔サイズのポリマー系カラムを備えたＳＥＣを用いる５〜３８ｎｍのサイズの金ナノ粒子の分離についての記載がある。その研究では、充填材料による粒子の収着（ナノ粒子のＳＥＣ分離に共通した問題）を減少させるために、界面活性剤ナトリウムドデシルスルフェートが移動相に添加された。ＳＥＣを用いる金ナノ粒子の形状分離についての記載もある非特許文献５。ＳＥＣを用いると、分別捕集により、多分散サンプルから狭いサイズ分布を有するナノ粒子を生成できる可能性がある。しかしながら、ＳＥＣは、比較的少量のナノ粒子の分別に適用可能できるにすぎず、しかも時間がかかる。
ゲル電気泳動やキャピラリー電気泳動もまた、ナノ粒子の分離に適用されてきた。非特許文献６には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いる金クラスター化合物の単離についての記載がある。分離された画分を捕集するために、バンドをゲルから切り出して、ナノ粒子を取り出さなければならなかった。コロイド金粒子は、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＥ）を用いてサイズに基づいて特性決定がなされてきた非特許文献７。しかしながら、ＣＥを用いる画分捕集には問題があり、技術的性質上、ごく小さい体積に限られる。これらの開示のいずれにも、安定化された水溶性ナノ粒子の平均粒子サイズを決定するために電気泳動を使用することについての教示はなされていない。
非特許文献８には、非溶媒を漸増的に添加することにより有機溶媒から金ナノ粒子を分別する簡単な方法が記載されている。しかしながら、この方法を安定化された水溶性ナノ粒子にいかに適用しうるかについての提案はなされていない。
スブラマニアム（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ）らは、特許文献１に有機溶媒からナノ粒子を分離する方法および装置を記載した。この方法では、超臨界二酸化炭素のような超臨界逆溶媒を添加することにより有機溶媒から沈澱した粒子を分離するために、フィルターまたはセパレーターが利用される。この方法を安定化された水溶性ナノ粒子の分離に適用することについての教示は、なされなかった。
米国特許第６，１１３，７９５号明細書 ニーマイヤー（Ｎｉｅｍｅｙｅｒ）、応用化学国際版（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．）、第４０巻、ｐ．４１２８−４１５８（２００１年） テンプレトン（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ）ら、ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）、第１５巻、ｐ．６６−７６（１９９９年） テンプレトン（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ）ら、米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、第１２１巻、ｐ．７０８１−７０８９（１９９９年） ウェイ（Ｗｅｉ）ら、クロマトグラフィー誌Ａ（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ）、第８３６巻、ｐ．２５３-２６０（１９９９年） ウェイ（Ｗｅｉ）ら、分析化学（Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．）、第７１巻、ｐ．２０８５−２０９１（１９９９年） シャーフ（Ｓｃｈａａｆｆ）ら、物理化学誌（Ｊ．Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ．）、第１０２巻、ｐ．１０６４３−１０６４６（１９９８年） シュネイベル（Ｓｃｈｎａｂｅｌ）ら、マイクロカラム分離誌（Ｊ．Ｍｉｃｒｏｃｏｌｕｍｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）、第９巻、ｐ．５２９−５３４（１９９７年） ウェッテン（Ｗｈｅｔｔｅｎ）ら、先端材料（Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．）、第８巻、ｐ．４２８−４３３（１９９６年）
安定化された水溶性ナノ粒子をサイズに基づいて分別する簡単で迅速で低価格の方法が必要とされている。さらに、安定化された水溶性ナノ粒子の平均粒子サイズを決定する簡単で低価格の手段が必要とされている。
出願人は、広いサイズ分布を有する安定化されたナノ粒子の水溶液に有機溶媒を添加すると、狭いサイズ分布を有するナノ粒子の集団の沈澱および分別が起こるという発見により、記載の問題を解決した。
本発明は、電解質を含有する水溶液に溶解されたナノ粒子の集団に、実質的に水混和性の有機溶媒を添加することにより、安定化された荷電した水溶性ナノ粒子のサイズ分別を行う方法に関する。さらに、本発明は、安定化された荷電した水溶性ナノ粒子のサイズ決定をゲル電気泳動により行う方法に関する。
したがって、本発明は、
ａ）広いサイズ分布を有する安定化された荷電した水溶性ナノ粒子の集団を準備し、
ｂ）電解質を含有する水溶液に該安定化された荷電した水溶性ナノ粒子を溶解させ、
ｃ）（ｂ）の溶解されたナノ粒子に実質的に水混和性の有機溶媒を添加し、それにより、該ナノ粒子の特定のサイズ画分を沈澱させ、そして、
ｄ）狭いサイズ分布を有するステップ（ｃ）のナノ粒子沈殿を捕集する、
ことを含んでなる狭いサイズ分布を有するナノ粒子の集団を生成せしめる方法を提供する。
さらに、本発明は、
ａ）緻密化剤と組み合わせて水溶液中に未知サイズの荷電した水溶性ナノ粒子の集団を準備し、
ｂ）緻密化剤と組み合わせて既知サイズの安定化された荷電した水溶性ナノ粒子サイズ標準品の溶液を準備し、
ｃ）（ａ）および（ｂ）のナノ粒子を電気泳動ゲル上に負荷し、
ｄ）該ゲルに電界を印加することにより（ｃ）の負荷されたナノ粒子を分離し、そして、
ｅ）該ゲル中におけるそれらの移動度を該ナノ粒子サイズ標準品の移動度と比較することにより、該未知ナノ粒子の平均サイズを決定する、
ことを含んでなる安定化された荷電した水溶性ナノ粒子の平均サイズの決定方法を提供する。
他の好ましい実施形態では、本発明は、
（ａ）該安定化された荷電した水溶性ナノ粒子を本発明の方法に従って分別し、そして、
（ｂ）画分の平均粒子サイズを本発明の方法に従って決定する、
ことを含んでなる安定化された荷電した水溶性ナノ粒子をナノ粒子のサイズに基づいて分別し、得られた画分の平均粒子サイズを決定する方法を提供する。
さらに、本発明は、
（ａ）該安定化された荷電した水溶性ナノ粒子を本発明の方法に従って分別し、そして、
（ｂ）画分の平均粒子サイズを透過電子顕微鏡法を用いて決定する、
ことを含んでなる安定化された荷電した水溶性ナノ粒子をナノ粒子のサイズに基づいて分別し、得られた画分の平均粒子サイズを決定する方法を提供する。
本発明は、有機溶媒を制御下で添加することにより、溶液中の広いサイズ分布を有する荷電した水溶性ナノ粒子を分別しうるという発見に依拠する。本発明は、水溶性をさらに向上させる安定性付与性単層でコーティングされたナノ粒子に関する。さらに、本発明は、ゲル電気泳動で分離することにより、分別されたナノ粒子のサイズを決定する方法を提供する。
ナノ粒子は、ナノスケール電子デバイス、多機能性触媒、化学センサー、および多くの生物学的用途、たとえば、バイオセンサーおよび生物学的アッセイの分野で有用である。これらのナノ材料の多くは、それらを構築するうえで、ナノ粒子のサイズが相対的に均一でありかつサイズが既知であることが必要とされる。本発明は、ナノ粒子を狭いサイズ分布を有する画分に分別するための簡便な方法、およびそれらの画分中のナノ粒子のサイズを決定する方法を提供する。
本開示全体にわたり、いくつかの略号および定義を使用する。これらは、特許請求の範囲および明細書を理解するために使用しうる。
「Ａ５２０」は、５２０ｎｍで測定された光学濃度を意味する。
「ＣＥ」は、キャピラリー電気泳動を意味する。
「ｇ」は、グラムを意味する。
「ＧＳＨ」は、化合物グルタチオンを意味する。
「ｈ」は、時間を意味する。
「ｋＶ」は、キロボルトを意味する。
「ｍｉｎ」は、分を意味する。
「ｍｇ」は、ミリグラムを意味する。
「ｍＭ」は、１リットルあたりのミリモルを意味する。
「ｍＬ」は、ミリリットルを意味する。
「ｎｍ」は、ナノメートルを意味する。
「ＰＡＧＥ」は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を意味する。
「ｒｐｍ」は、毎分回転数を意味する。
「ＳＥＣ」は、サイズ排除クロマトグラフィーを意味する。
「ＴＥＭ」は、透過電子顕微鏡法を意味する。
「μＬ」は、マイクロリットルを意味する。
「μＭ」は、１リットルあたりマイクロモルを意味する。
「Ｖ」は、ボルトを意味する。
「ナノ粒子」とは、本明細書中では、１〜１００ｎｍの平均粒子直径を有する金属性粒子または半導体粒子として定義される。好ましくは、粒子の平均粒子直径は約１〜４０ｎｍである。本明細書中で使用する場合、「粒子サイズ」および「粒子直径」は、同一の意味を有する。金属性ナノ粒子としては、金、銀、白金、パラジウム、イリジウム、ロジウム、オスミウム、鉄、銅、コバルト、およびこれらの金属から構成された合金の粒子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。「合金」とは、本明細書中では、２種以上の金属の均一混合物として定義される。「半導体ナノ粒子」としては、セレン化カドミウム、硫化カドミウム、硫化銀、硫化カドミウム、硫化亜鉛、セレン化亜鉛、硫化鉛、ヒ化ガリウム、シリコン、酸化スズ、酸化鉄、およびリン化インジウムの粒子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ナノ粒子は、好適な有機コーティングまたは単層を用いて安定化され、水溶性が付与される。本明細書中で使用する場合、単層で保護されたナノ粒子は、１つのタイプの安定化されたナノ粒子である。安定化された水溶性の金属および半導体のナノ粒子の調製方法については、当技術分野で公知である。これらの粒子は、有機コーティングの特質に応じて、荷電していることもあれば、中性のこともある。たとえば、テンプレトン（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ）ら（ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ），第１５巻，ｐ．６６−７６（１９９９年））（参照により本明細書に組み入れられるものとする）は、チオプロニンまたは補酵素Ａの単層により保護された安定化された荷電した水溶性金ナノ粒子の調製方法を記載している。チオプロニンで保護された金ナノ粒子を調製するために、テトラクロロ金酸およびＮ−（２−メルカプトプロピオニル）グリシン（チオプロニン）を、メタノールと酢酸との混合物中に共溶解させた。迅速攪拌しながら、水素化ホウ素ナトリウムを添加した。反応時にテトラクロロ金酸に対するチオプロニンのモル比を変化させることにより、これらの粒子の平均粒子サイズを制御することが可能である。反応時にチオプロニンの代わりに補酵素Ａを用いることにより、補酵素Ａで保護された金ナノ粒子を同様に調製した。
金属（金、銀、白金、パラジウム、コバルト、およびニッケル）の安定化された水溶性ナノ粒子を調製する類似の方法について、ヒース（Ｈｅａｔｈ）らは、米国特許第６，１０３，８６８号明細書（参照により本明細書に組み入れられるものとする）中に記載している。この方法では、１種もしくはそれ以上の金属塩の溶液または分散液が、チオール、ホスフィン、ジスルフィド、アミン、オキシド、またはアミドのような官能基を有する有機表面不動態化剤の溶液と混合された。次に、金属塩を遊離金属に還元するために、還元剤が添加された。
安定化された水溶性白金ナノ粒子を調製する方法については、チェン（Ｃｈｅｎ）ら（コロイドおよび表面Ａ（Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ａ），第１６９巻，ｐ．１０７−１１６（２０００年））（参照により本明細書に組み入れられるものとする）により記載されている。これらのナノ粒子は、ポリ（Ｎ−ビニルイソブチルアミド）の存在下でエタノールによりクロロ白金酸を還元することにより、エタノール−水混合物中で調製された。
ハゲマイヤー（Ｈａｇｅｍｅｙｅｒ）らは、米国特許第６，０７４，９７９号明細書（参照により本明細書に組み入れられるものとする）中に、ポリベタインの存在下でパラジウムアセテートのようなパラジウム塩を水素化ホウ素ナトリウムのような還元剤と反応させることによりポリベタインで安定化されたパラジウムナノ粒子を調製する方法を記載した。
安定化された中性水溶性金属ナノ粒子は、非イオン性安定性付与性有機コーティングまたは単層を用いて以上に記載した方法により調製される。たとえば、ウェルフィング（Ｗｕｅｌｆｉｎｇ）ら（米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．），第１２０巻，ｐ．１２６９６−１２６９７（１９９８年））（参照により本明細書に組み入れられるものとする）は、チオール化ポリ（エチレングリコール）の単層により保護された中性水溶性金ナノ粒子の調製について記載した。
安定化された荷電した水溶性半導体ナノ粒子も、種々の公知の方法により作製することができる。たとえば、参照により本明細書に組み入れられるものとするチャン（Ｃｈａｎ）ら（科学（Ｓｃｉｅｎｃｅ），第２８１巻，ｐ．２０１６−２０１８（１９９８年））は、クロロホルム中でナノ粒子をメルカプト酢酸と反応させることにより硫化亜鉛でキャッピングされたヒ化カドミウムナノ粒子を調製する方法を記載した。安定化された荷電した水溶性半導体ナノ粒子を調製する他の方法は、ミッチェル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）ら（米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．），第１２１巻，ｐ．８１２２−８１２３（１９９９年））（参照により本明細書に組み入れられるものとする）により記載されている。この方法では、セレン化カドミウム／硫化亜鉛ナノ粒子が、トリオクチルホスフィンオキシドとトリオクチルホスフィンとの混合物でコーティングされた。次に、これらのナノ粒子は、ジメチルホルムアミド中で過剰の３−メルカプトプロピオン酸と反応させると、プロピオン酸で官能化されたナノ粒子を生成した。
安定化された中性水溶性半導体ナノ粒子は、ナッパー（Ｎａｐｐｅｒ）（コロイド界面科学誌（Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．Ｓｃｉ），第５８巻，ｐ．３９０−４０７（１９７７年））により記載されているように、ポリ（エチレンオキシド）またはポリ（ビニルアルコール）のような非イオン性有機安定性付与性化合物を粒子にコーティングすることにより調製することができる。
安定化された水溶性の半導体および金属のナノ粒子の場合、いずれにおいても、種々の安定性付与性コーティングまたは単層の混合体（たとえばポリ（エチレングリコール）とグルタチオン、またはポリ（エチレングリコール）とチオプロニン）を使用することが可能である。
本発明の一実施形態では、実質的に水混和性の有機溶媒を電解質の存在下で添加することにより、広いサイズ分布を有する安定化された荷電した水溶性ナノ粒子をナノ粒子のサイズに基づいて分別する。本明細書中で使用する場合、ナノ粒子の集団に関して、「広いサイズ分布」とは、サイズが約１ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲にありナノ粒子の大部分が広範囲の粒子サイズにわたって分布するナノ粒子を意味するものとする。「狭いサイズ分布」を有するナノ粒子の画分は、平均粒子サイズ範囲内のナノ粒子が集団の少なくとも約３０％を構成する画分であり、この場合、集団の少なくとも約４０％であることが好ましく、集団の少なくとも約５０％であることがより好ましく、集団の少なくとも約６０％〜約１００％であることが最も好ましい。
実質的に水混和性の有機溶媒は、本明細書中では、少なくとも８０体積％の濃度まで水に完全に溶解する有機溶媒として定義される。好適な有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、およびアセトンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好適な有機溶媒としては、このほかに、互いに完全に混和可能であり実質的に水混和性の有機溶媒である混合物を生じる有機溶媒の混合物が挙げられる。混合溶媒の例としては、酢酸エチルとメタノール；酢酸エチルとエタノール；酢酸エチルとイソプロパノール；酢酸エチルとアセトン；酢酸エチルとジメチルホルムアミドとジメチルスルホキシド；および酢酸エチルとテトラヒドロフランとジオキサンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい有機溶媒は、メタノールまたはエタノールである。使用することのできる電解質としては、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、塩化アンモニウム、および硫酸アンモニウムが挙げられるが、これらに限定されるものではない。二価金属イオン塩は、単一成分コーティングで安定化されたナノ粒子と併用した場合よりも、ポリ（エチレングリコール）とグルタチオンのような混合コーティングで安定化されたナノ粒子と併用した場合のほうが、良好に機能するようにみえる。好ましい電解質は、塩化ナトリウムである。
安定化された荷電した水溶性ナノ粒子を分別するために、最初に、約１０〜５００ｍＭの電解質濃度を有する電解質水溶液に粒子を溶解させる。次に、実質的に水混和性の有機溶媒の添加を行う。添加される実質的に水混和性の有機溶媒の量は、所望の平均粒子サイズに依存する。適正量は、通常の実験により決定することができる。典型的には、実質的に水混和性の有機溶媒は、最大粒子を沈澱させるべく、約５〜１０体積％の濃度になるように添加される。ナノ粒子を遠心分離または濾過により捕集する。遠心分離は、典型的には、ケンドロ・ラボラトリー・プロダクツ（Ｋｅｎｄｒｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（コネチカット州ニュータウン（Ｎｅｗｔｏｗｎ，ＣＴ））から入手可能なソルバール（Ｓｏｒｖａｌｌ）（登録商標）ＲＴ７ ＰＬＵＳ遠心分離機のような遠心分離機を用いて、約４，０００ｒｐｍで約１分間行われる。濾過では、対象となるナノ粒子サイズを捕集するのに十分な程度に小さい細孔サイズを有する多孔性膜を使用することができる。
場合により、溶液の溶媒含有率を増大させるために、したがって、より小さいサイズのナノ粒子を沈澱させるために、ナノ粒子溶液に実質的に水混和性の有機溶媒の逐次添加を行ってもよい。添加の回数および添加の体積は、ナノ粒子の所望のサイズ分布に依存し、通常の実験により決定することができる。典型的には、実質的に水混和性の有機溶媒の添加は、最小粒子を沈澱させるのに十分である約７０体積％の溶媒濃度まで、各添加ごとにナノ粒子溶液の溶媒含有率が約５〜１５体積％ずつ増大するように、行われる。ナノ粒子は、各添加の後、先に記載したように捕集され、続いて、上澄みに対して、実質的に水混和性の有機溶媒の添加が行われる。捕集されたナノ粒子は、水に再溶解され、そしてテンプレトン（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ）ら（ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ），第１５号，ｐ．６６−７６（１９９９年））により記載されているように、画分の粒子サイズ分布は、透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を用いて決定することができる。画分の平均粒子サイズは、以下に記載のゲル電気泳動方法を用いて決定することができる。
本発明の他の実施形態では、安定化された荷電した水溶性ナノ粒子の平均粒子サイズは、ゲル電気泳動を用いて決定される。この方法はまた、安定化された中性水溶性ナノ粒子の平均粒子サイズの測定に適用することもできる。この場合、粒子をイオン性基で官能化して荷電した状態にした後で適用される。ゲル電気泳動は、タンパク質や核酸のような巨大分子を分離させるために、生化学や分子生物学でよく使用される方法である。ゲルは、サイズに基づいて巨大分子を分離する篩分け媒質として機能する。本発明では、アガロースまたはポリアクリルアミドからゲルを作製することができる。好適なゲルを調製する方法は、周知であり、サムブルック・ジェイ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．），フリッチュ・イー・エフ（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス・ティー（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．），分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），第二版，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）（１９８９年）、特に第６章（参照により本明細書に完全に組み入れられるものとする）中に例示されている。好適なアガロースゲルは、０．６〜６％（重量対体積）のアガロース濃度を有し、一方、好適なポリアクリルアミドゲルは、３．５〜２０％（重量対体積）のアクリルアミド濃度を有する。使用されるゲルの濃度が、分離される分子のサイズに依存することは、当技術分野で周知である。特に、ゲル濃度を高くするほど、より小さい分子がより良好に分離されるようになる。一方、より大きい分子を分離させるためには、より低いゲル濃度が使用される。所与のナノ粒子分別に使用されるゲル濃度は、通常の実験により決定することができる。本発明の好ましいゲルは、４％アガロースゲルである。
安定化された荷電した水溶性ナノ粒子の平均粒子サイズを決定するために、ナノ粒子の水溶液に緻密化剤が添加される。緻密化剤の目的は、ゲル中への溶液の負荷を容易に行えるようにナノ粒子溶液の比重を増大させることである。好適な緻密化剤は、周知であり、たとえば、グリセロール、スクロース、およびフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）（登録商標）（スクロースの非イオン性合成ポリマー、分子量約４００，０００、ミズーリ州セントルイスのシグマ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。次に、安定化された荷電した水溶性ナノ粒子溶液をウェルのゲル中に添加する。安定化された荷電した水溶性ナノ粒子の平均粒子サイズをゲル電気泳動を用いて決定するために、ナノ粒子サイズ標準品が必要である。安定化された荷電した水溶性ナノ粒子サイズ標準品は、多くの方法により調製することが可能である。たとえば、一方法では、安定化された荷電した水溶性ナノ粒子を調製し、分別し、そしてＴＥＭを用いて先に記載したように画分の平均粒子サイズを決定する。次に、これらの画分をサイズ標準品として利用することができる。他の方法では、異なる既知の平均粒子サイズを有する市販の単分散コロイド金ナノ粒子に、先に記載したように、安定性付与性有機層をコーティングし、サイズ標準品として使用する。安定化された荷電した水溶性ナノ粒子サイズ標準品を、少なくとも１つのウェル中のゲル上に負荷し、そしてゲルを横切って電界を印加することにより電気泳動分離を行う。使用する電圧およびナノ粒子を分離するのに必要な分離時間は、通常の実験により決定することができる。実施例５に示されるように、９０分間の分離時間で９０Ｖの電圧を印加したところ、グルタチオン単層で保護された金ナノ粒子画分の良好な分離が行われた。未知の安定化された荷電した水溶性ナノ粒子の平均粒子サイズは、これらの粒子の移動度を安定化された荷電した水溶性ナノ粒子サイズ標準品の移動度と比較することにより決定される。比較は、視覚的に行うことができるか、またはアギレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（デラウェア州ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））から入手可能なエイチピー・スキャンジェット（ＨＰ ＳｃａｎＪｅｔ）６３００Ｃスキャナーもしくはゲル・ドック１０００システム（Ｇｅｌ Ｄｏｃ １０００ Ｓｙｓｔｅｍ）のような市販のゲル画像化システムを、マルチ・アナリスト（Ｍｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｓｔ）のような画像解析ソフトウェアと組み合わせて（両方ともバイオ・ラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（カリフォルニア州ハーキュレス（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））から入手可能）、行うことができる。
本発明を以下の実施例でさらに明確にする。当然のことながら、これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、実例として与えられているにすぎない。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の本質的特性を確認することが可能であり、その精神および範囲から逸脱することなく、本発明に種々の変更および修正を加えることにより、それを種々の使用および条件に適合させることが可能である。
実施例１
グルタチオン単層で保護された金ナノ粒子の粒子サイズ分別
この実施例の目的は、グルタチオン（ＧＳＨ）単層で保護された金ナノ粒子を水溶液からサイズ分別することについて具体的に示すことであった。本方法は、電解質の存在下で実質的に水混和性の有機溶媒を添加することにより、安定化された荷電した水溶性ナノ粒子を分別沈殿させることを含む。
グルタチオン単層で保護された金ナノ粒子の調製
別段の記載がないかぎり、試薬はすべて、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））から購入し、さらなる精製を行うことなく使用した。典型的な反応では、２〜５分間攪拌することにより、６０ｍＬのメタノール（ＨＰＬＣグレード）および１０ｍＬの酢酸（ＨＰＬＣグレード）をエルレンマイヤーフラスコ中で混合した。テトラクロロ金酸（ＨＡｕＣｌ４・ｘＨ２Ｏ、９９．９９％）（０．３７ｇ）および６１．４ｍｇのグルタチオン（ＧＳＨ）（最小値９９％、ミズーリ州セントルイスのシグマ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手）を上記の混合溶媒に添加し、５分間攪拌しながら溶解させ、透明な黄色溶液を得た。０．６ｇのＮａＢＨ４（９９％）を３０ｇのナノピュア（Ｎａｎｏｐｕｒｅ）（登録商標）水に溶解させることにより、水素化ホウ素ナトリウム溶液を調製した。迅速攪拌しながら上記の溶液中にＮａＢＨ４溶液を滴下した。ＮａＢＨ４溶液の最初の１滴を添加した時、ＨＡｕＣｌ４溶液は、ただちに黄色から暗褐色に変化した。この反応は発熱的であり、溶液は約１５分間にわたり加温された。反応中に、溶液のｐＨは１．２から約５．０に変化した。反応溶液を迅速に２時間攪拌した。グルタチオン単層で保護された金ナノ粒子は、水に可溶であり、希釈時、溶液は透明な紫色になった。
この調製方法により、広いサイズ分布を有するナノ粒子が得られる。
グルタチオン単層で保護された金ナノ粒子の分別
ＧＳＨ単層で保護された金ナノ粒子（０．３ｇ）を５０ｍＬの１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液に溶解させた。１４体積％の最終含有率になるようにナノ粒子溶液にメタノールを添加することにより、ナノ粒子の第１の画分を沈澱させた。ソルバール（Ｓｏｒｖａｌｌ）（登録商標）ＲＴ７ ＰＬＵＳ遠心分離機（コネチカット州ニュータウンのケンドロ・ラボラトリー・プロダクツ（Ｋｅｎｄｒｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｎｅｗｔｏｗｎ，ＣＴ））を用いて４０００ｒｐｍで１分間遠心分離することにより、ナノ粒子を捕集した。次に、１８体積％の最終含有率になるようにより多くのメタノールを上澄みに添加し、沈澱したナノ粒子を第２の画分として先に記載したように捕集した。メタノールのこの段階的添加を継続し、２２、２６、３０、３４、および３８体積％のメタノール濃度でそれぞれナノ粒子画分３〜７を捕集した。
実施例２
チオプロニン単層で保護された金ナノ粒子の粒子サイズ分別
この実施例の目的は、チオプロニン単層で保護されたナノ粒子を水溶液からサイズ分別することについて具体的に示すことであった。本方法は、電解質の存在下で実質的に水混和性の有機溶媒を添加することにより、安定化された荷電した水溶性ナノ粒子を分別沈殿させることを含む。
ＧＳＨの代わりに１６．３２ｍｇのＮ−（２−メルカプトプロピオニル）グリシン（チオプロニン）を用いたこと以外は実施例１に記載されているように、チオプロニン単層で保護された金ナノ粒子を調製した。実施例１に記載されているように、メタノールを添加することによりナノ粒子を分別した。１０および２０体積％のメタノールを添加した後、それぞれ、画分１および２を捕集した。
実施例３
他の溶媒および電解質を用いる、グルタチオン単層で保護された金ナノ粒子の粒子サイズ分別
この実施例の目的は、ＧＳＨ単層で保護された金ナノ粒子を分別するときの他の実質的に水混和性の有機溶媒および電解質の有効性を具体的に示すことであった。
他の実質的に水混和性の有機溶媒および電解質を使用したこと以外は実施例１に記載されているように、ＧＳＨ単層で保護された金ナノ粒子を調製し分別した。試験された実質的に水混和性の有機溶媒は、エタノール、イソプロパノール、およびアセトンを包含していた。試験した電解質は、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化アンモニウム、および硫酸アンモニウムを包含していた。
実質的に水混和性の有機溶媒および電解質は、試験したすべてが、ＧＳＨ単層で保護された金ナノ粒子の分別で良好に機能した。
実施例４
ゲル電気泳動を用いる、グルタチオン単層で保護された金ナノ粒子の粒子サイズ決定
この実施例の目的は、グルタチオン単層で保護された金ナノ粒子を分別してからゲル電気泳動によりその平均粒子サイズを決定することについて具体的に示すことであった。
グルタチオン単層で保護された金ナノ粒子サイズ標準品の調製
５、１０、および２０ｎｍのサイズを有する単分散コロイド金ナノ粒子（約０．７５ Ａ520単位／ｍＬの濃度）を、シグマ（Ｓｉｇｍａ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から購入した。２００μＬの各コロイド金サンプルを１０μＬの１０ｍＭ ＧＳＨ溶液（ｐＨ＝７．４）と混合し、室温で一晩インキュベートすることにより、ＧＳＨ単層で保護された金ナノ粒子サイズ標準品を調製した。
ゲル電気泳動を用いる平均粒子サイズの測定
グルタチオン単層で保護された金ナノ粒子（実施例１）を分別して得た約１０μＭの濃度の１０マイクロリットルの画分６を、２μＬの５０％グリセロールと混合し、４％アガロース／トリス（Ｔｒｉｓ）−ボレート−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）ゲル（メイン州ロックランドのバイオウィットテイカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ））上に負荷した。サイズ標準品を同じようにゲル上に負荷した。１×ＴＢＥ実験緩衝液（８９ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．３）中にゲルを浸漬し、ホリゾン（Ｈｏｒｉｚｏｎ）５８ゲルボックス（メリーランド州ロックビルのライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））中において９０Ｖの定電圧で９０分間かけて電気泳動を行った。エイチピー・スキャンジェット（ＨＰ ＳｃａｎＪｅｔ）６３００Ｃスキャナー（デラウェア州ウィルミントンのアギレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））を用いてゲル画像を記録した。
この実験から得られたゲル画像を図１に示す。図中、レーン１、２、および３は、それぞれ、５、１０、および２０ｎｍの粒子サイズを有するＧＳＨ単層で保護された金ナノ粒子標準である。レーン４は、実施例１でＧＳＨ単層で保護された金ナノ粒子から得られた画分６である。標準と比較されたその移動度に基づいて、サンプルの平均粒子サイズは３〜４ｎｍであると推定された。また、ＪＥＯＬ−２０１１透過電子顕微鏡を用いて２００ｋＶの電子電圧および５００Ｋの倍率で透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）により画分６のナノ粒子の平均粒子サイズを決定した。平均粒子サイズは、３．５ｎｍであることが判明した。これは、電気泳動の結果ときわめてよく一致した。
実施例５
グルタチオン単層で保護された金ナノ粒子を分別して行った分析
この実施例の目的は、実施例１で調製されたＧＳＨ単層で保護された金ナノ粒子の画分をゲル電気泳動およびＴＥＭにより分析することであった。
ＧＳＨ単層で保護された金ナノ粒子（実施例１）を分別して、実施例４に記載されている電気泳動法により分析した。ＧＳＨ単層で保護された金ナノ粒子サンプルの最初の分別されていないもの（これは比較として利用した）と一緒にナノ粒子画分１〜７をゲル上に負荷した。
得られたゲルの画像を図２に示す。図中、「Ｓ」は、最初の分別されていないサンプルを表し、数値は、画分番号を意味する。捕集したすべての画分のゲル電気泳動から、混合溶媒のメタノール含有率を徐々に増大させることにより、画分１〜７で観察された移動度の増大からわかるようにサイズの減少したナノ粒子が沈澱することが実証された。我々はまた、画分が変化するにつれて漸進的に色が変化することを観察した。これは、表面プラズモン共鳴吸収に及ぼす粒子サイズの周知の効果と一致する。最初の生成物（図３Ａ）および画分６（図３Ｂ）の定量的ＴＥＭ分析を行って、実施例１に記載されている分別方法によりサイズ分布が非常に狭くなることを確認した。
実施例６
チオプロニン単層で保護された金ナノ粒子を分別して行った分析
この実施例の目的は、実施例２で調製されたチオプロニン単層で保護された金ナノ粒子の画分をゲル電気泳動により分析することであった。
実施例４に記載されているように、チオプロニン単層で保護された金ナノ粒子画分（実施例２）をゲル電気泳動により分析し、図４に示されるように、類似の結果を得た。図４中、レーン１は、最初の分別されていないサンプルであり、レーン２は、１０体積％のメタノールで捕集された第１の画分であり、そしてレーン３は、２０体積％のメタノールで捕集された第２の画分である。
グルタチオン単層で保護された金ナノ粒子の粒子サイズ決定を示す電気泳動ゲル画像である。 グルタチオン単層で保護された金ナノ粒子を分別して行った分析を示す電気泳動ゲル画像である。 グルタチオン単層で保護された金ナノ粒子の初期の分別されていないときのサイズ分布の透過電子顕微鏡法結果を示している。 グルタチオン単層で保護された金ナノ粒子を分別したときの画分６のサイズ分布の透過電子顕微鏡法結果を示している。 チオプロニン単層で保護された金ナノ粒子を分別して行った分析を示す電気泳動ゲル画像である。

Claims (30)

  1. ａ）広いサイズ分布を有する安定化された荷電した水溶性ナノ粒子の集団を準備し、
    ｂ）電解質を含有する水溶液に該安定化された荷電した水溶性ナノ粒子を溶解させ、
    ｃ）（ｂ）の溶解されたナノ粒子に実質的に水混和性の有機溶媒を添加し、それにより該ナノ粒子の特定のサイズ画分を沈澱させ、そして
    ｄ）狭いサイズ分布を有するステップ（ｃ）のナノ粒子沈殿を捕集する、
    ことを含んでなる狭いサイズ分布を有するナノ粒子の集団を生成せしめる方法。
  2. ステップ（ｃ）および（ｄ）を場合により少なくとも１回繰り返して、ナノ粒子溶液中の実質的に水混和性の有機溶媒の含有率を増大させ且つ異なる狭いサイズ分布を有するナノ粒子画分を捕集する請求項１に記載の方法。
  3. ナノ粒子が単層でコーティングされている請求項１に記載の方法。
  4. 単層コーティングが、チオプロニン、グルタチオン、補酵素Ａ、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、およびポリ（ビニルアルコール）よりなる群から選択される請求項３に記載の方法。
  5. ナノ粒子が金属ナノ粒子である請求項１に記載の方法。
  6. 金属ナノ粒子が、金、銀、白金、パラジウム、および銅ナノ粒子、ならびにその合金よりなる群から選択される金属で構成されている請求項５に記載の方法。
  7. ナノ粒子が金で構成されている請求項６に記載の方法。
  8. ナノ粒子が半導体ナノ粒子である請求項１に記載の方法。
  9. 半導体ナノ粒子が、セレン化カドミウム、硫化カドミウム、硫化銀、硫化カドミウム、硫化亜鉛、セレン化亜鉛、硫化鉛、ヒ化ガリウム、シリコン、酸化スズ、酸化鉄、およびリン化インジウムよりなる群から選択される材料で構成されている請求項８に記載の方法。
  10. ナノ粒子が約１００ｎｍもしくはそれ以下の直径である請求項１に記載の方法。
  11. ナノ粒子が約４０ｎｍもしくはそれ以下の直径である請求項１に記載の方法。
  12. 電解質が、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、塩化アンモニウム、および硫酸アンモニウムよりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
  13. 電解質が塩化ナトリウムである請求項１２に記載の方法。
  14. 実質的に水混和性の有機溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、およびアセトンよりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
  15. 実質的に水混和性の有機溶媒がメタノールまたはエタノールである請求項１４に記載の方法。
  16. 実質的に水混和性の有機溶媒が有機溶媒の混合物である請求項１に記載の方法。
  17. 有機溶媒の混合物が、酢酸エチルとメタノール；酢酸エチルとエタノール；酢酸エチルとイソプロパノール；酢酸エチルとアセトン；酢酸エチルとジメチルホルムアミドとジメチルスルホキシド；および酢酸エチルとテトラヒドロフランとジオキサンよりなる群から選択される組合せである請求項１６に記載の方法。
  18. ナノ粒子を遠心分離または濾過により捕集する請求項１に記載の方法。
  19. ａ）緻密化剤と組み合わせて水溶液中に未知サイズの荷電した水溶性ナノ粒子の集団を準備し、
    ｂ）緻密化剤と組み合わせて既知サイズの安定化された荷電した水溶性ナノ粒子サイズ標準品の溶液を準備し、
    ｃ）（ａ）および（ｂ）のナノ粒子を電気泳動ゲル上に負荷し、
    ｄ）該ゲルに電界を印加することにより（ｃ）の負荷されたナノ粒子を分離し、そして
    ｅ）該ゲル中におけるそれらの移動度を該ナノ粒子サイズ標準品の移動度と比較することにより、該未知ナノ粒子の平均サイズを決定する、
    ことを含んでなる安定化された荷電した水溶性ナノ粒子の平均サイズの決定方法。
  20. 緻密化剤が、グリセロール、スクロース、およびフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）（登録商標）よりなる群から選択される請求項１９に記載の方法。
  21. ゲルがアガロースまたはポリアクリルアミドで構成されている請求項１９に記載の方法。
  22. ゲルが約０．６％〜約７％のアガロース濃度を有するアガロースゲルである請求項１９に記載の方法。
  23. ゲルが４％アガロースゲルである請求項２２に記載の方法。
  24. ゲルが約３．５％〜約２１％のアクリルアミド濃度を有するポリアクリルアミドゲルである請求項１９に記載の方法。
  25. ナノ粒子が金属ナノ粒子である請求項１９に記載の方法。
  26. ナノ粒子が約１００ｎｍもしくはそれ以下の直径である請求項１９に記載の方法。
  27. （ａ）安定化された荷電した水溶性ナノ粒子を請求項１に記載の方法に従って分別し、そして
    （ｂ）画分の平均粒子サイズを請求項１９に記載の方法に従って決定する、
    ことを含んでなる特定のサイズの安定化された荷電した水溶性ナノ粒子の分別方法。
  28. （ａ）安定化された荷電した水溶性ナノ粒子を請求項１に記載の方法に従って分別し、そして
    （ｂ）画分の平均粒子サイズを透過電子顕微鏡法を用いて決定する、
    ことを含んでなる特定のサイズの安定化された荷電した水溶性ナノ粒子の分別方法。
  29. 請求項１に記載の方法により分別されたナノ粒子の集団。
  30. 狭いサイズ分布を有するナノ粒子の集団。
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