JP2005532998A - 骨密度を増減させる方法 - Google Patents
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Abstract
Description
しかし骨の石灰化に至る事象のカスケードと、骨密度を制御する因子は、完全にはわかっていない。骨芽細胞の分化を調節し、骨の石灰化を促進し、骨密度を改善することのできる因子が求められている。
さらに本発明により、哺乳動物においてSOSTの発現を低下させるため、配列番号1、配列番号2、配列番号4、配列番号5、または配列番号7とハイブリダイズすることのできるアンチセンス核酸を治療に有効な量含む医薬組成物が提供される。
さらに本発明により、スクレロスチンのアンタゴニストを同定する方法であって、スクレロスチンとテスト・サンプルの両方を細胞と接触させ;そのテスト・サンプルがその細胞のアポトーシスを阻止するかどうかを検出する工程を含む方法が提供される。
本発明により、スクレロスチンに結合する分子を同定する方法であって、テスト・サンプルを、配列番号3、配列番号6、または配列番号8を含むスクレロスチン・ポリペプチドと接触させ;そのテスト・サンプル中の分子がそのポリペプチドと結合するかどうかを調べる工程を含む方法も提供される。
本発明により、哺乳動物において骨密度を調節する組成物と方法が提供される。本発明により、特に、SOSTの発現を低下させる因子と、SOST遺伝子の産物であるスクレロスチンのアンタゴニストが提供される。本発明によれば、スクレロスチンは、成熟骨細胞において、直接的にも間接的にも、骨の石灰化を減らし、コラーゲンの合成を少なくし、アルカリホスファターゼ(ALP)の活性を低下させる。スクレロスチンが骨密度と骨形成を調節する1つの方法は、骨形成因子(BMP)のアンタゴニストとして作用を及ぼす方法である。スクレロスチンが骨密度と骨形成を調節する別の方法は、骨の石灰化と骨形成に関与する細胞のアポトーシスを通じた方法である。
さらに本発明により、SOSTの発現を低下させる因子および/またはスクレロスチンの効果を打ち消すアンタゴニストを同定するためのアッセイも提供される。
(誘導可能骨芽前駆細胞と呼ばれる)多能性間葉細胞/ストロマ細胞の小さな集団の分化を誘導して骨芽細胞にすることができる(Pittenger, M.F.他、1999年)。誘導可能骨芽前駆細胞は、成長し、ある種の表現型マーカーを所定の順番で発現させる(Pockwinse他、1992年;Lian他、1999年)。骨芽前駆細胞はI型コラーゲンを発現するのに対し、運命づけられた前骨芽細胞と骨芽細胞は、一般に骨芽細胞系列の細胞で同定される多数の表現型マーカーを発現する。そのようなマーカーとしては、I型コラーゲン、アルカリホスファターゼ、副甲状腺ホルモン受容体(PTHr)、オステオポンチンなどが挙げられる。骨芽細胞の分化最終段階では、骨細胞がミネラル堆積物とマトリックス・タンパク質(例えばCD44やオステオカルシン)に取り囲まれる。したがって骨芽前躯体細胞が発生、増殖、分化して成熟骨芽細胞になるには、時間に依存した所定のやり方がある(Pockwinse他、1992年)。
骨形成因子のアンタゴニスト(例えばノギン、グレムリン、コーディン、Dan/cerberusファミリーのタンパク質)も同定されている。しかし骨形成因子のアンタゴニストが骨芽細胞において骨形成因子の調節と制御に関して果たしている役割はよくわかっていない。
ヒトSOST遺伝子配列は約22kbであり、NCBIヌクレオチド・データベースにGenbank登録番号AF326736として登録されている(配列番号1)。ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankOverviewというウェブサイトを参照のこと。譲受人に譲渡されて所有されているアメリカ合衆国特許第6,395,511号と第6,489,445号には、追加の配列情報と、SOST遺伝子およびその遺伝子産物(これらの文献の中ではbeerと呼ばれている)の性質に関する追加の記述がある。なおこれら特許文献の内容は、引用によりこの明細書に組み込まれているものとする。
1 AGAGCCTGTG CTACTGGAAG GTGGCGTGCC CTCCTCTGGC
41 TGGTACCATG CAGCTCCCAC TGGCCCTGTG TCTCGTCTGC
81 CTGCTGGTAC ACACAGCCTT CCGTGTAGTG GAGGGCCAGG
121 GGTGGCAGGC GTTCAAGAAT GATGCCACGG AAATCATCCC
161 CGAGCTCGGA GAGTACCCCG AGCCTCCACC GGAGCTGGAG
201 AACAACAAGA CCATGAACCG GGCGGAGAAC GGAGGGCGGC
241 CTCCCCACCA CCCCTTTGAG ACCAAAGACG TGTCCGAGTA
281 CAGCTGCCGC GAGCTGCACT TCACCCGCTA CGTGACCGAT
321 GGGCCGTGCC GCAGCGCCAA GCCGGTCACC GAGCTGGTGT
361 GCTCCGGCCA GTGCGGCCCG GCGCGCCTGC TGCCCAACGC
401 CATCGGCCGC GGCAAGTGGT GGCGACCTAG TGGGCCCGAC
441 TTCCGCTGCA TCCCCGACCG CTACCGCGCG CAGCGCGTGC
481 AGCTGCTGTG TCCCGGTGGT GAGGCGCCGC GCGCGCGCAA
521 GGTGCGCCTG GTGGCCTCGT GCAAGTGCAA GCGCCTCACC
561 CGCTTCCACA ACCAGTCGGA GCTCAAGGAC TTCGGGACCG
601 AGGCCGCTCG GCCGCAGAAG GGCCGGAAGC CGCGGCCCCG
641 CGCCCGGAGC GCCAAAGCCA ACCAGGCCGA GCTGGAGAAC
681 GCCTACTAGA GCCCGCCCGC GCCCCTCCCC ACCGGCGGGC
721 GCCCCGGCCC TGAACCCGCG CCCCACATTT CTGTCCTCTG
761 CGCGTGGTTT GATTGTTTAT ATTTCATTGT AAATGCCTGC
801 AACCCAGGGC AGGGGGCTGA GACCTTCCAG GCCCTGAGGA
841 ATCCCGGGCG CCGGCAAGGC CCCCCTCAGC CCGCCAGCTG
881 AGGGGTCCCA CGGGGCAGGG GAGGGAATTG AGAGTCACAG
921 ACACTGAGCC ACGCAGCCCC GCCTCTGGGG CCGCCTACCT
961 TTGCTGGTCC CACTTCAGAG GAGGCAGAAA TGGAAGCATT
1001 TTCACCGCCC TGGGGTTTTA AGGGAGCGGT GTGGGAGTGG
1041 GAAAGTCCAG GGACTGGTTA AGAAAGTTGG ATAAGATTCC
1081 CCCTTGCACC TCGCTGCCCA TCAGAAAGCC TGAGGCGTGC
1121 CCAGAGCACA AGACTGGGGG CAACTGTAGA TGTGGTTTCT
1161 AGTCCTGGCT CTGCCACTAA CTTGCTGTGT AACCTTGAAC
1201 TACACAATTC TCCTTCGGGA CCTCAATTTC CACTTTGTAA
1241 AATGAGGGTG GAGGTGGGAA TAGGATCTCG AGGAGACTAT
1281 TGGCATATGA TTCCAAGGAC TCCAGTGCCT TTTGAATGGG
1321 CAGAGGTGAG AGAGAGAGAG AGAAAGAGAG AGAATGAATG
1361 CAGTTGCATT GATTCAGTGC CAAGGTCACT TCCAGAATTC
1401 AGAGTTGTGA TGCTCTCTTC TGACAGCCAA AGATGAAAAA
1441 CAAACAGAAA AAAAAAAGTA AAGAGTCTAT TTATGGCTGA
1481 CATATTTACG GCTGACAAAC TCCTGGAAGA AGCTATGCTG
1521 CTTCCCAGCC TGGCTTCCCC GGATGTTTGG CTACCTCCAC
1561 CCCTCCATCT CAAAGAAATA ACATCATCCA TTGGGGTAGA
1601 AAAGGAGAGG GTCCGAGGGT GGTGGGAGGG ATAGAAATCA
1641 CATCCGCCCC AACTTCCCAA AGAGCAGCAT CCCTCCCCCG
1681 ACCCATAGCC ATGTTTTAAA GTCACCTTCC GAAGAGAAGT
1721 GAAAGGTTCA AGGACACTGG CCTTGCAGGC CCGAGGGAGC
1761 AGCCATCACA AACTCACAGA CCAGCACATC CCTTTTGAGA
1801 CACCGCCTTC TGCCCACCAC TCACGGACAC ATTTCTGCCT
1841 AGAAAACAGC TTCTTACTGC TCTTACATGT GATGGCATAT
1881 CTTACACTAA AAGAATATTA TTGGGGGAAA AACTACAAGT
1921 GCTGTACATA TGCTGAGAAA CTGCAGAGCA TAATAGCTGC
1961 CACCCAAAAA TCTTTTTGAA AATCATTTCC AGACAACCTC
2001 TTACTTTCTG TGTAGTTTTT AATTGTTAAA AAAAAAAAGT
2041 TTTAAACAGA AGCACATGAC ATATGAAAGC CTGCAGGACT
2081 GGTCGTTTTT TTGGCAATTC TTCCACGTGG GACTTGTCCA
2121 CAAGAATGAA AGTAGTGGTT TTTAAAGAGT TAAGTTACAT
2161 ATTTATTTTC TCACTTAAGT TATTTATGCA AAAGTTTTTC
2201 TTGTAGAGAA TGACAATGTT AATATTGCTT TATGAATTAA
2241 CAGTCTGTTC TTCCAGAGTC CAGAGACATT GTTAATAAAG
2281 ACAATGAATC ATGACCGAAA GAAAAAAAAA AAAAAAAAAA
2321 AAA
41 GEYPEPPPEL ENNKTMNRAE NGGRPPHHPF ETKDVSEYSC
81 RELHFTRYVT DGPCRSAKPV TELVCSGQCG PARLLPNAIG
121 RGKWWRPSGP DFRCIPDRYR AQRVQLLCPG GEAPRARKVR
161 LVASCKCKRL TRFHNQSELK DFGTEAARPQ KGRKPRPRAR
201 SAKANQAELE NAY
7961 GAATGCCACA GCTTGTCAGC AGCCAGCAGA AGGCAGGTAA
8001 AAGGCCTTCC TCACTGTCCT CGAAGGAACC AACTCTGCCA
8041 ATGTCTTGAA CTTGCACTCC TAACCTCCAG CTCTGTGAGA
8081 CGACTTCTGT TGTTTATGCC ACCCAATTTG TGGTACTTAG
8121 TTACGGCAGC CTCATCAAAG TACCACCTAT GGGAGCCTCT
8161 ATTTTGCAGG TGAGGGCGGG GACTGGGCTG AGTTTTCTGG
8201 AAAACAGCCC TGCAATACCC TCATCAGACC ACCAAACTCT
8241 TCACACTCCC TCAGACACAG CATTCACTTC CAGAAATAAC
8281 TCTAAAGTTT TGTTTTGTTT TTTTAAACTT TGTGGAATAC
8321 TACTCAGCCA AAAAAAAAAA AAAAGAAAAG AAAAAGGAAC
8361 ATGTTACTGA TATGTACAAC TTGGATAATG GAAATAATGC
8401 TGAGTGAAAA AAAAATCCCC AAAGGCTACA TACTAATTGA
8441 TTCCATTTAT ATAACCTTTT TTTTTTTTTT TTGAGACAGT
8481 CTCACTCTGT CACCCAGGCT GGAGCACAGT GGCGCGATCT
8521 CAGCTCACTG CAACTTCCGC CTCCTGAGTT CAAGCGATTC
8561 TCTTGCCTTA GCTTCCCAAG TAGCTGGGAT TACAGGTGCG
8601 TGCCACCATG CCCAGCTAAT TTTTGTATTT TTAGTAGAGA
8641 CAGGGTTTCG CCATGTTGGC CAGGCTGGTC TCGAACTCCT
8681 GACCTCAAGT GATCTGCCTG CCTTGGCTTC CCAAAGTGCT
8721 GGGATTACAT GAGTGAGCCA CCGCACCTGG TCGCATTTAT
8761 GTAACAATTT TGAAGTGAAA AAAAAAATGA CAGAAATGGA
8801 GATTAGATGA GTAGTTGCCA GGGGTTAGTT GTGGGAGGGA
8841 GGGAAAAGGA GGGAAGGAGG TGGGCAACAG GAGAAAGACT
8881 TGTGGTCACA GAGCTGTGCT TTATCTTGAC TGTGGTGGAT
8921 CCCCAAATTT ACCCGTGACA AGATTGCATA GAACTAAGTA
8961 TACACACACG TGAATGCGTG TGCACGCACA CAGTAGAGGT
9001 TAAGCCACGG GAGATGTGGG TAAGATTGGT AAATTGTGTC
9041 AATATCAATA TCCTAGTTGT GATATTGTCC TATAGTTTCG
9081 CAAGGTGTTA TTGTTGTGGG AAACTGGATA AAGGATACAC
9121 GGAGTCTGCA TTTTCTTTTT TTTATTTTTA TTTTTTGAGA
9161 CGGGGTCTCA CTCTGTCAAC CAGGCTGGAG TGCAGTGGCC
9201 CAAGTATGGC TCACTGCAGC CTCGACCTCA ACCTCAAGTG
9241 AACCTCCCAC CTCAGCCTCC CAAGTAGCTA AGACCACAGG
9281 CGTGCGACCC CATGCCCAGC TAATTTTTAA ATTTTTTGTA
9321 GAGACTAGGC CTCACCATGT TGCCCAGGCT TTTATTTCTT
9361 ATAAGTATAT TTAAATTTAT AATTATATCC ACATTTTAAA
9401 ATTTTAATTT AAAAAATTAC TCTGAGGCCG GGCATTGTGG
9441 CTCATGCCTC TAATCCCCAG CACCTTGGGA GGCCGAGTTG
9481 GGCAGATCAC CCGAGGTCAG AAGTTCGAGA CCAGCCTGAG
9521 TAACATGGAG AAACCCCCGT CTCTACTAAA AATACAAAAT
9561 TGGCCGGGCG TGGTGGTGCA TTCCTGTAAT CCCAGCTACT
9601 CGGGAGGCTG AGGCAGGAGA ATTGCTTGAA CCCAGGAGGT
9641 GGAGGTTGCA GTGAGCCAAG ATTGTGCCAC TGCACTGCAG
9681 CCTGGGCCAC AGAGAGAATC TGCCAAAAAA AGAAAAAAAA
9721 AAAAATTTCA GCCGTACAAG GATGTTCATA GCAACCCTGC
9761 TGGAAATAGG AAAAAAAATT GGAAATAACC TAAACTACTC
9801 ACAATAGGAA TCAGCTAAAA CCCTGGGGGT TTAATTCCAG
9841 GGAATACTGT GAACAATGAC AAGTTTGTGG ACTGAGTAAA
9881 AATAAACAGC TGTCAATGAC TTAACATTAA ATGAAACAGC
9921 AGAAGATGTC ACAGCAGGTT CTCGCTGAGC CATTCAGAGG
9961 GGTGTGGATC ATTTAGAGGT TCAAGTCCAC TGGATTCTTC
10001 TTTTTCCTTT TAATATTACT TCACTTCCAA ATAAGGAAAG
10041 GAAAGGAAAG GAAATCACGT CCAGTCCTGA GACTTGCCAT
10081 CCTGCAGTCA CCCCTCCTTT TGTCTCCAGC AGGTGGCAGA
10121 CGCGTTCCAG GGATGAATCC CACTGCCTCT GTTTAATGCA
10161 GACGGTCCAG CCGCTCCCAA CAGCAGGTGG GGCTATAAGC
10201 ATCCATCCTA CCTGCTCAAG GAACCCAGGC ATCAGAACTG
10241 CTCTCTCCCA AGTCCATTGC AAGAAGGCAG TCGTCTGGTC
10281 ATGAGAGGGT TAACAGTCCA CATTCCAGAG CAAGGGAAAA
10321 GGAGGCTGGA GGGTCATAGA CAAGGGGAGG TGGTGCGGAG
10361 GGCCAGCTTC TCACAACACT ACCGGCTCTG CTGGGAGAGA
10401 TAGATCACCC CCAACAATGG CCACAGCTGT TTTCATCTGC
10441 CCTGAAGGAA ACTGACTTAG GAAGCAGGTA TCAGAGAGGG
10481 CCCTTCCTGA GGGGGCTTCT GTCTGGCTTG TAAAACTGTC
10521 AGAGCAGCTG CATTCATGTG TCGGATGATG GATGATGGAA
10561 AGGACAGTCG GCTGCAGATG GACACAGCGA CTTGCAAGTT
10601 GAGGCAGGTG GCAAAGGACT TGCAGAGGCT CTGCAGGTGG
10641 GGCATGCTGA TTCATTGCCC AGTTAAAATA CCAGAGGATC
10681 TGGGCAGCCT CTTCACAGGA GCTGCTTGTC CTCAAACAAT
10721 CTGTCTTCAA TGAAAGATTC CTCTGGCCTT CCTTTCTCTT
10761 CTTGCACCTC AGGTGTGAAT CCTTCTCCCC CACGCCTCTA
10801 CCTGCGCCCC CGCCCCCCGC CCCGGCCCTG TGTGGCTCAT
10841 TATATGCAGG GCCAAGGCAG CATTTTCTCT TAGCTTCTTT
10881 GTGACCAGTT GGTCCTGGGA TGGCTTCATG GAACACATCC
10921 TGTGGTGTGC ACCAATGAAG CTTTCCATAC AGGACTCAAA
10961 ACTGTTTTTG AAAAATGTAA CCAGCTGGAA GACAAGAAAA
11001 TAAAATGTCA GCACTAAAAA CGCTGGCTGT GGCTTTTGCT
11041 AAGGAAAGGA ATTTGGTGTT GTCTTCTCAC ACACACAGAC
11081 TGGTTGGGGA AATGACTGTC TTCAGCACAT CACCCTGCGA
11121 GCCACAGTGA GTGCCCTGGC TCAGAAGTGC CTGTCACAGT
11161 GCACAGGATC CCTGAGGAGC ATGAGCTGGG ATTTCCTCTG
11201 TGCTGTCCAT CACAGGAGCC TGAGTGACCA GCGCATCCTC
11241 GATTTGTAAC CAGAATCCTG CCCTCTCTCC CAAGCGGGCA
11281 CCCTTGCTCT GACCCTCTAG TTCTCTCTCT TGCCTTCCAG
11321 AGAATACCAA GAGAGGCTTT CTTGGTTAGG ACAATGAATG
11361 CTGAGACTTG TGGAGTTGGG ACCAATGGGA TTTCTTTAAA
11401 AGCATCTTTT TGCCTCTGGC TGGGTCTATG GGGGTCAAAC
11441 AGAAACACCT TGGGCCATTT GTTGGTGGGG TGACAAATGA
11481 ACTTGGCCTG AGAAATGGAA TAGGCCGGGC TCAGCCCCGC
11521 GAAGCACTCA GAACTGCACA TTTTCTTTGT TGAGCGGGTC
11561 CACAGTTTGT TTTGAGAATG CCCGAGGGCC CAGGGAGACA
11601 GACAATTAAA AGCCGGAGCT CATTTTGATA TCTGAAAACC
11641 ACAGCCGCCA GCACGTGGGA GGTGCCGGAG AGCAGGCTTG
11681 GGCCTTGCCT CACACGCCCC CTCTCTCTGG GTCACCTGGG
11721 AGTGCCAGCA GCAATTTGGA AGTTTGCTGA GCTAGAGGAG
11761 AAGTCTTTGG GGAGGGTTTG CTCTGAGCAC ACCCCTTTCC
11801 CTCCCTCCGG GGCTGAGGGA AACATGGGAC CAGCCCTGCC
11841 CCAGCCTGTC CTCATTGGCT GGCATGAAGC AGAGAGGGGC
11881 TTTAAAAAGG CGACCGTGTC TCGGCTGGAG ACCAGAGCCT
11921 GTGCTACTGG AAGGTGGCGT GCCCTCCTCT GGCTGGTACC
11960 ATGCAGCTCC CACTGGCCCT GTGTCTCGTC TGCCTGCTG
41 TGCACGCTGC CTTCTGTGCT GTGGAGGGCC AGGGGTGGCA
81 AGCCTTCAGG AATGATGCCA CAGAGGTCAT CCCAGGGCTT
121 GGAGAGTACC CCGAGCCTCC TCCTGAGAAC AACCAGACCA
161 TGAACCGGGC GGAGAATGGA GGCAGACCTC CCCACCATCC
201 CTATGACGCC AAAGATGTGT CCGAGTACAG CTGCCGCGAG
241 CTGCACTACA CCCGCTTCCT GACAGACGGC CCATGCCGCA
281 GCGCCAAGCC GGTCACCGAG TTGGTGTGCT CCGGCCAGTG
321 CGGCCCCGCG CGGCTGCTGC CCAACGCCAT CGGGCGCGTG
361 AAGTGGTGGC GCCCGAACGG ACCGGATTTC CGCTGCATCC
401 CGGATCGCTA CCGCGCGCAG CGGGTGCAGC TGCTGTGCCC
441 CGGGGGCGCG GCGCCGCGCT CGCGCAAGGT GCGTCTGGTG
481 GCCTCGTGCA AGTGCAAGCG CCTCACCCGC TTCCACAACC
521 AGTCGGAGCT CAAGGACTTC GGGCCGGAGA CCGCGCGGCC
561 GCAGAAGGGT CGCAAGCCGC GGCCCGGCGC CCGGGGAGCC
601 AAAGCCAACC AGGCGGAGCT GGAGAACGCC TACTAG
41 GEYPEPPPEN NQTMNRAENG GRPPHHPYDA KDVSEYSCRE
81 LHYTRFLTDG PCRSAKPVTE LVCSGQCGPA RLLPNAIGRV
121 KWWRPNGPDF RCIPDRYRAQ RVQLLCPGGA APRSRKVRLV
161 ASCKCKRLTR FHNQSELKDF GPETARPQKG RKPRPGARGA
201 KANQAELENA Y
41 CTCACTAGCC CCTTGCCTTG CCTGCCTGCT TGTACATGCA
81 GCCTTCGTTG CTGTGGAGAG CCAGGGGTGG CAAGCCTTCA
121 AGAATGATGC CACAGAAATC ATCCCGGGAC TCAGAGAGTA
161 CCCAGAGCCT CCTCAGGAAC TAGAGAACAA CCAGACCATG
201 AACCGGGCCG AGAACGGAGG CAGACCCCCC CACCATCCTT
241 ATGACACCAA AGACGTGTCC GAGTACAGCT GCCGCGAGCT
281 GCACTACACC CGCTTCGTGA CCGACGGCCC GTGCCGCAGT
321 GCCAAGCCGG TCACCGAGTT GGTGTGCTCG GGCCAGTGCG
361 GCCCCGCGCG GCTGCTGCCC AACGCCATCG GGCGCGTGAA
401 GTGGTGGCGC CCGAACGGAC CCGACTTCCG CTGCATCCCG
441 GATCGCTACC GCGCGCAGCG GGTGCAGCTG CTGTGCCCCG
481 GCGGCGCGGC GCCGCGCTCG CGCAAGGTGC GTCTGGTGGC
521 CTCGTGCAAG TGCAAGCGCC TCACCCGCTT CCACAACCAG
561 TCGGAGCTCA AGGACTTCGG ACCTGAGACC GCGCGGCCGC
601 AGAAGGGTCG CAAGCCGCGG CCCCGCGCCC GGGGAGCCAA
641 AGCCAACCAG GCGGAGCTGG AGAACGCCTA CTAG
41 REYPEPPQEL ENNQTMNRAE NGGRPPHHPY DTKDVSEYSC
81 RELHYTRFVT DGPCRSAKPV TELVCSGQCG PARLLPNAIG
121 RVKWWRPNGP DFRCIPDRYR AQRVQLLCPG GAAPRSRKVR
161 LVASCKCKRL TRFHNQSELK DFGPETARPQ KGRKPRPRAR
201 GAKANQAELE NAY
本発明によれば、SOST遺伝子の発現は、骨芽細胞の成熟と分化、ならびに石灰化の開始とともに増大する。したがってSOSTの発現を骨芽細胞分化のマーカーとして利用することができる。
しかしSOSTの発現を増大させる因子は骨の石灰化を減らす。というのも、SOST遺伝子の産物であるスクレロスチンは骨形成因子のアンタゴニストであるため、骨芽細胞のアポトーシスを引き起こすからである。スクレロスチンは、分化しているhMSC細胞の培養物と骨芽細胞の初代培養物に添加したとき、前骨芽細胞/骨芽細胞に関する多数の表現型マーカー(ALP、I型コラーゲン、PTHr)の発現を減らした。さらに、スクレロスチンはBMP-6と相互作用してBMP-6の活性を阻害し、そのことによって骨芽細胞の分化を抑制した。
本発明によれば、スクレロスチンは、骨マトリックスの形成と骨の石灰化の調節において重要な役割を果たしている。いくつかのタンパク質(例えばノギン(noggin)、グレムリン(gremlin))が骨形成因子の作用に対するアンタゴニストとして機能すると考えられているが、スクレロスチンの機能が失われると、その機能は、ノギンによって置き換えることや、DANファミリーのアンタゴニストの他のどのメンバーで置き換えることもできないように見える。
逆に、SOSTの発現レベルは、デキサメタゾンがBMP-4またはBMP-6と同時に存在しているときに低下する。したがってデキサメタゾンは、BMP-4とBMP-6によるSOSTの発現促進効果を失わせる傾向がある。他の化学物質(例えばグルココルチコイド類似体、胆汁塩、プロスタグランジン)も、骨形成因子がSOSTの発現に及ぼす効果を変化させる。これについては以下に説明する。
本発明によれば、スクレロスチンが持つ骨芽細胞の活性低下能力を調節する任意の薬剤が、骨形成を増大させ、骨吸収を変化させ、骨の石灰化を増大させるのに役立つ。このような薬剤は、直接または間接にSOSTまたはスクレロスチンに作用を及ぼすことができる。このような薬剤は、転写レベル、翻訳レベル、またはタンパク質レベルで作用して、スクレロスチンが持つ骨芽細胞の活性低下能力を調節することができる。
“調節する”または“調節”という用語は、変わること、すなわち増加または減少することを意味する。したがって、SOSTの発現またはスクレロスチンの活性を低下させることのできる薬剤が本発明の組成物と方法でしばしば使用されるとはいえ、SOSTの発現またはスクレロスチンの活性を増大させる薬剤も本発明の範囲に含まれる。
SOSTの発現とスクレロスチンの活性を調節するのに役立つ薬剤としては、ステロイド、アルカロイド、テルペノイド、ペプトイド、ペプチド、核酸、アンチセンス核酸、合成化合物などが挙げられるが、これだけに限られるわけではない。いくつかの実施態様では、SOSTのアンタゴニストまたはアゴニストがグルココルチコイド受容体と結合できる。例えばデキサメタゾンは、BMP-4とBMP-6によるSOSTの発現促進効果を失わせる傾向がある。他の化学物質(例えばグルココルチコイド類似体、胆汁塩、プロスタグランジン)も、骨形成因子がSOSTの発現に及ぼす効果を調節する。
別の実施態様では、本発明により、SOSTの発現、および/またはスクレロスチンの翻訳、および/またはSOST転写物の分解を調節するアンチセンスRNAまたはアンチセンスDNAが提供される。例えば配列番号1、2、4、5、または7を有する核酸にハイブリダイズすることのできるアンチセンスRNAまたはアンチセンスDNAを、スクレロスチンの発現を低下させるアンチセンスRNAまたはアンチセンスDNAとして使用することができる。
SOSTのmRNAの分解を増大させるには、RNA干渉(siRNAまたはRNAi)技術(Scherr, M.他、2003年;Martinez, L.A.他、2002年)を利用して合成二本鎖RNAの小さな二本鎖に曝露してもよい。したがって、細胞内にある標的遺伝子の発現を抑制する方法が提供される。この方法は、一部または全部が二本鎖になったRNAを細胞または細胞外環境に導入する工程を含んでいる。抑制は、SOSTのRNAに対して特異的に起こる。というのも、SOST遺伝子の一部に由来するヌクレオチド配列を選択して抑制性RNAを産生させるからである。この方法は、遺伝子の発現を抑制するのに有効である。
siRNAは、アンビオン社(オースチン、テキサス州)から提供されたガイドラインを利用して設計した。簡単に述べると、AAジヌクレオチドを有する標的配列を探すためにSOSTのcDNA配列を走査した。G/C含有量が35〜55%のその標的(AA+3'に隣接する19個のヌクレオチド)に対するセンスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製した。次に、これらの配列をヒトゲノム・データベースの他の配列と比較し、他の既知のコード配列とのホモロジーを最少にした(ブラスト探索)。
設計した標的配列とsiRNA配列は以下の通りである。
遺伝子配列における位置:140
GC含有量:42.9%
センス鎖siRNA:GAAUGAUGCCACGGAAAUCtt(配列番号10)
アンチセンス鎖siRNA:GAUUUCCGUGGCAUCAUUCtt(配列番号11)
遺伝子配列における位置:143
GC含有量:42.9%
センス鎖siRNA:UGAUGCCACGGAAAUCAUCtt(配列番号13)
アンチセンス鎖siRNA:GAUGAUUUCCGUGGCAUCAtt(配列番号14)
遺伝子配列における位置:209
GC含有量:47.6%
センス鎖siRNA:CAACAAGACCAUGAACCGGtt(配列番号16)
アンチセンス鎖siRNA:CCGGUUCAUGGUCUUGUUGtt(配列番号17)
遺伝子配列における位置:950
GC含有量:42.9%
センス鎖siRNA:UUGAGAGUCACAGACACUGtt(配列番号19)
アンチセンス鎖siRNA:CAGUGUCUGUGACUCUCAAtt(配列番号20)
遺伝子配列における位置:1035
GC含有量:42.9%
センス鎖siRNA:AUGGAAGCAUUUUCACCGCtt(配列番号22)
アンチセンス鎖siRNA:GCGGUGAAAAUGCUUCCAUtt(配列番号23)
遺伝子配列における位置:1093
GC含有量:47.6%
センス鎖siRNA:AGUCCAGGGACUGGUUAAGtt(配列番号25)
アンチセンス鎖siRNA:CUUAACCAGUCCCUGGACUtt(配列番号26)
遺伝子配列における位置:1111
GC含有量:33.3%
センス鎖siRNA:GAAAGUUGGAUAAGAUUCCtt(配列番号28)
アンチセンス鎖siRNA:GGAAUCUUAUCCAACUUUCtt(配列番号29)
遺伝子配列における位置:1201
GC含有量:38.1%
センス鎖siRNA:CUGUAGAUGUGGUUUCUAGtt(配列番号31)
アンチセンス鎖siRNA:CUAGAAACCACAUCUACAGtt(配列番号32)
遺伝子配列における位置:1269
GC含有量:47.6%
センス鎖siRNA:UUCUCCUUCGGGACCUCAAtt(配列番号34)
アンチセンス鎖siRNA:UUGAGGUCCCGAAGGAGAAtt(配列番号35)
遺伝子配列における位置:1414
GC含有量:38.1%
センス鎖siRNA:AGAGAGAGAAUGAAUGCAGtt(配列番号37)
アンチセンス鎖siRNA:CUGCAUUCAUUCUCUCUCUtt(配列番号38)
遺伝子配列における位置:1590
GC含有量:47.6%
センス鎖siRNA:GAAGCUAUGCUGCUUCCCAtt(配列番号40)
アンチセンス鎖siRNA:UGGGAAGCAGCAUAGCUU(配列番号41)
遺伝子配列における位置:1726
GC含有量:47.6%
センス鎖siRNA:AUCACAUCCGCCCCAACUUtt(配列番号43)
アンチセンス鎖siRNA:AAGUUGGGGCGGAUGUGAUtt(配列番号44)
使用する個々の配列が何であるか、および、供給する二本鎖siRNA材料の量がどれだけであるかに応じ、本発明の組成物と方法により、標的遺伝子(SOST)の機能を部分的に失わせるか完全に失わせるかを決めることができる。少なくとも99%の標的細胞において遺伝子の発現が低下または消失することが、他の遺伝子で示されている。例えばアメリカ合衆国特許第6,506,559号を参照のこと。注入する材料をより少なくし、選択したsiRNAを投与してからの時間をより長くすると、抑制される細胞の割合をより少なくすることができる。
RNAの二本鎖領域に対応するヌクレオチド配列が遺伝子抑制の標的となるという意味で、抑制は配列特異的である。抑制には、標的遺伝子の一部と一致するヌクレオチド配列を含むsiRNAが好ましい。しかし標的配列に挿入、欠失、点突然変異があるsiRNA配列も、抑制効果を持つことがわかっている。例えば配列の一致は、従来技術で公知のアラインメント・アルゴリズムを用いてヌクレオチド配列間の違いの割合を計算することによって最適化できる。別の方法として、RNAの二本鎖領域を、標的遺伝子の転写物の一部とハイブリダイズできるヌクレオチド配列として機能的に定義することもできる。
siRNAは、従来技術で利用可能なトランスフェクション剤(例えばリポフェクトアミン)またはウイルス供給ベクター(例えばレンチウイルスからのもの)を用いてin vitroで培養細胞にデリバリーすることができる。このようなin vitroデリバリー、テストまたは治療を目的として行なうことができる。例えば患者からの細胞をin vitroで処理した後、その細胞を患者に再び投与することができる。
siRNAを用いることの利点としては、二本鎖siRNAを細胞に容易に導入できること、使用できるsiRNAの濃度が低いこと、二本鎖siRNAが安定であること、抑制が効果的であることなどが挙げられる。低濃度の天然核酸を使用できると、アンチセンス干渉のいくつかの欠点が避けられる。
逆に、骨の石灰化が増大すると、骨密度が過剰であることを特徴とする大理石骨病になる可能性がある。本発明によれば、スクレロスチンを用いて骨密度が過剰であることを特徴とする疾患を治療することができる。このタイプの最も一般的な疾患は、遺伝子の欠陥によって骨の重量が増大し、通常は数年のうちに生命が脅かされる大理石骨病である。好ましくは、大理石骨病はスクレロスチンの投与によって治療される。
過剰な骨密度などの骨疾患を治療または予防する方法には、その骨疾患を患っている哺乳動物に対し、治療に有効な量のスクレロスチンを投与することが含まれる。哺乳動物のスクレロスチン・ポリペプチド(例えばこの明細書に記載したもの)のうちで利用可能な任意のものを投与して過剰な骨密度を治療または予防することができる。
本発明により、骨疾患を治療するための治療薬を製造または同定するのに役立つスクリーニング法が提供される。特に、この明細書で同定されたSOST核酸とスクレロスチン・タンパク質を、SOSTおよび/またはスクレロスチンを検出するためのさまざまなアッセイや、SOST核酸またはスクレロスチン・タンパク質と相互作用する因子を同定するためのさまざまなアッセイで使用することができる。
一般に、スクレロスチンを同定するためのアッセイには、スクレロスチンがレポータ分子に結合できる条件下でテスト・サンプルをインキュベーションし、結合の程度を測定する工程が含まれる。レポータ分子としては、スクレロスチンに安定に結合し、しかも検出が可能な任意の分子が可能である。レポータ分子としては、例えば放射性同位元素(125I、32P、35S、3H)で標識した抗スクレロスチン抗体、蛍光染料(フルオレセイン、ローダミン)、酵素などが可能である。レポータ分子は、使用する検出システムに合わせて選択される。
結合アッセイはいくつかの形式で実行することができる。例えば、細胞をベースとした結合アッセイ、溶液相アッセイ、イムノアッセイなどがある。一般に、テストするサンプルまたは化合物をスクレロスチン・テスト・サンプルとともに所定の時間インキュベーションした後、顕微鏡、蛍光測定、シンチレーション・カウンタ、あるいは利用可能な任意のイムノアッセイを用いてレポータ分子を測定する。結合は、競合ラジオイムノアッセイにおいてスクレロスチンを標識することによって検出することもできる。別の方法として、スクレロスチンを標識していないエピトープ・タグ(例えばビオチン、ペプチド、His6、フラグ、mycなど)で修飾し、上記のような検出可能な標識を有するストレプトアビジン、抗ペプチド、抗タンパク質抗体などのタンパク質と結合させることもできる。エピトープ・タグを含むスクレロスチンの別の形態を溶液やイムノアッセイで利用することができる。
テスト・サンプル中の化合物または分子は、実質的に精製されていてもよいし、粗混合物中に存在していてもよい。結合する化合物または分子としては、核酸、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、小分子量の有機化合物などが可能である。化合物または分子についてはさらに、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用するかどうかを明らかにするため、スクレロスチンの活性を増大または低下させる能力を調べることもできる。
マーカー・タンパク質としては、当業者が入手できる任意のマーカー・タンパク質が可能である。マーカー・タンパク質は、例えばルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質(GFP)、CATにすることができる。
当業者にとって、この明細書に記載した方法に対する多くの変形例と変更例が存在することは明らかであろう。そのような変形例と変更例はすべて、本発明に含まれる。
本発明により、スクレロスチンに対する抗体調製物、例えば配列番号3、配列番号6、または配列番号8の配列を有するポリペプチドに結合することのできる抗体が提供される。
すべての抗体分子は、免疫グロブリンと呼ばれる血漿タンパク質のファミリーに属する。免疫グロブリンの基本的構成ブロック(免疫グロブリンの折り畳み構造またはドメイン)は、免疫系や他の生物学的認識系の多くの分子においてさまざまな形態で使用される。典型的な免疫グロブリンは4本のポリペプチド鎖を有し、可変領域として知られる抗原結合領域と、定常領域として知られる非可変領域とを含む。
(1)Fabは、抗体分子の1価の抗原結合フラグメントを含むフラグメントである。Fabフラグメントは、抗体全体をパパイン酵素で消化させ、インタクトな軽鎖と重鎖の一部を生じさせることによって得られる。
(2)Fab'は、抗体全体をペプシンで処理した後、還元してインタクトな軽鎖と重鎖の一部を生じさせることによって得られる抗体分子のフラグメントである。抗体分子1つにつきFab'フラグメントが2つ得られる。Fab'フラグメントは、抗体のヒンジ部からの1個以上のシステインを含む重鎖CH1ドメインのいくつかの残基がカルボキシル末端に付加されている点でFabフラグメントと異なる。
(3)F(ab)2は、抗体全体をペプシン酵素で処理した後、還元を行なわずに得られる抗体フラグメントである。F(ab')2は、2つのFab'フラグメントが2つのジスルフィド結合によって結合した二量体である。
(4)Fvは、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、1つの重鎖可変領域と1つの軽鎖可変領域が堅固な非共有結合で結合した二量体である(VH-VL二量体)。各可変領域の3つのCDRが相互作用してVH-VL二量体の表面に抗原結合部位を規定するのは、この配置になったときである。6つのCDRが一緒になって、抗体に対する抗原結合特異性を生じさせる。しかし可変領域が1つだけ(すなわち1つのFvの半分で、抗原に対して特異的な3つのCDRだけを含む場合)でも、抗原を認識して抗原に結合する能力を有する。もっとも、親和性は結合部位全体のときより小さくなる。
(5)単鎖抗体(“SCA”)は、遺伝子工学によって融合した単鎖分子であり、適切なポリペプチド・リンカーによって結合した軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含む、遺伝子工学による分子として定義される。このような単鎖抗体は、“単鎖Fv”抗体フラグメントまたは“sFv”抗体フラグメントとも呼ばれる。一般に、Fvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインの間に、抗原が結合する上で望ましい構造をsFvが形成するためのポリペプチド・リンカーをさらに備えている。sFvの概説に関しては、『モノクローナル抗体の薬理学』、第113巻、RosenburgとMoore編、シュプリンガー-フェアラーク社、ニューヨーク、1994年の中のPluckthunによる269〜315ページを参照のこと。
モノクローナル抗体の調製法も、同様に従来から知られている。例えばKohlerとMilstein、Nature、第256巻、495ページ、1975年;Coligan他、上記文献、セクション2.5.1〜2.6.7;『抗体:実験室マニュアル』(コールド・スプリング・ハーバー・パブリケーション、1988年)のHarlow他による726ページを参照のこと。なおこれらの文献は、参考としてこの明細書に組み込まれているものとする。モノクローナル抗体は、確立されたさまざまな方法によってハイブリドーマ培養物から単離して精製することができる。そのような単離技術としては、プロテインA・セファロースを用いたアフィニティ・クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィなどが挙げられる。例えばColigan他、上記文献、セクション2.7.1〜2.7.12とセクション2.9.1〜2.9.3;『分子生物学における方法』、第10巻のBarnes他、「免疫グロブリンG(IgG)」、79〜104ページ、(ヒューマナ・プレス社、1992年)を参照のこと。
抗体フラグメントの別の形態は、単一の相補性決定領域(CDR)をコードしているペプチドである。CDRペプチド(“最小認識単位”)は、興味の対象である抗体のCDRをコードする遺伝子を構成することによって得られる。そのような遺伝子は、例えばポリメラーゼ連鎖反応を利用して抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成することによって調製する。例えば『方法:酵素学における方法の手引き』、第2巻、1991年のLarrick他による106ページを参照のこと。
したがって本発明は、望ましい性質を有する抗体および/または抗体フラグメント、または抗体ポリペプチドを選択する方法に関する。望ましい性質としては、本発明のエピトープに対する結合親和性または選択性が増大していることが挙げられる。
本発明によるスクレロスチンのアンタゴニストとそれ以外の薬剤(例えばスクレロスチン・タンパク質やSOST核酸)を投与し、骨の異常、徴候、疾患に付随する少なくとも1つの症状を軽減する。なおスクレロスチンのアンタゴニストとそれ以外の薬剤には、その塩も含まれる。
望む効果を得るために、スクレロスチンのアンタゴニストとそれ以外の薬剤を、単一用量で、あるいは分割した用量で投与することができる。例えば体重1kgにつき、少なくとも約0.01mgから約500〜750mg、少なくとも約0.01mgから約300〜500mg、少なくとも約0.1mgから約100〜300mg、少なくとも約1mgから約50〜100mgを投与する。しかし他の投与量でも有効な結果が得られる可能性がある。投与量は、選択したスクレロスチンのアンタゴニストまたはそれ以外の薬剤が何であるか;哺乳動物の疾患、体重、身体の状態、健康状態、年齢;行なうのが予防なのか治療なのか;スクレロスチンのアンタゴニストとそれ以外の薬剤が修飾されているかどうかなど(これらに限定されない)、さまざまな因子に応じて変動するであろう。このような因子は、医師が、モデル動物または従来技術において公知の他のテスト・システムを利用して容易に明らかにすることができよう。
本組成物を調製するには、治療薬を合成し、あるいは他の方法で入手し、必要に応じて精製した後、凍結乾燥させて安定化させる。次にこの治療薬を適切な濃度に調節し、必要に応じて他の薬剤と組み合わせる。単位投与量に含まれる所定の治療薬の絶対重量はさまざまな値が可能である。本発明による少なくとも1つの治療薬、あるいは複数の治療薬を、例えば約0.01〜約2g、あるいは約0.1〜約500mg投与することができる。あるいは単位投与量は、約0.01g〜約50g、約0.01g〜約35g、約0.1g〜約25g、約0.5g〜約12g、約0.5g〜約8g、約0.5g〜約4g、約0.5g〜約2gの範囲にすることもできる。
本発明の治療薬を含む1つ以上の適切な単位投与量の形態は、さまざまな投与経路を通じて投与することができる。投与経路としては、経口、非経口(皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内など)、直腸、皮膚、経皮、胸腔内、肺内、鼻腔内(呼吸経路)などがある。この治療薬は、持続放出用製剤にすることもできる(例えばマイクロカプセル化する。WO 94/07529とアメリカ合衆国特許第4,962,091号を参照のこと)。製剤は、独立した単位投与量の形態にすると便利である。製剤は、薬理学においてよく知られている任意の方法で調製することができる。そのような方法には、治療薬を液体担体、固体マトリックス、半固体担体、細かく分割した固体担体、あるいはこれらの組み合わせと混合した後、必要に応じてそのでき上がった製品を望むデリバリー・システムに導入する、あるいは望むデリバリー・システム用に成形することが含まれる。
“製薬的に許容可能な”とは、製剤の他の成分と共存可能であり、この製剤を摂取する患者にとって害がない担体、希釈剤、添加剤および/または塩を意味する。
したがって治療薬は、非経口投与用(例えば注入による投与用。具体的には、ボーラス注射用または連続輸液用)に製剤化し、アンプル、あらかじめ充填した注射器、少量の輸液容器、多数回投与用の容器に入れた単位投与量の形態にすることができる。すでに指摘したように、保存剤を添加して投与形態の有効期間を維持することができる。治療薬と他の成分は、油性または水性のビヒクル中の懸濁液、溶液、エマルジョンの形態にすることと、懸濁剤、安定化剤、分散剤などの製剤化剤を含むことができる。あるいは治療薬と他の成分は、滅菌固体の無菌分離によって、あるいは溶液からの凍結乾燥によって得られる粉末の形態にし、使用前に適切なビヒクル(例えば滅菌した発熱物質を含まない水)と混合することもできる。
本発明による1種類以上の治療薬と、1種類以上の他の成分を含む組み合わせ製品も考えられる。この組成物は、例えばビタミン、ミネラル(例えばカルシウム)、抗炎症薬などを含むことができる。
さらに、本発明の治療薬は、持続放出投与形態などに製剤化するのに非常に適している。このように製剤化すると、治療薬が、おそらくある期間にわたって例えば腸または気道の特定の部分に放出される。例えばポリマー材料(ポリラクチド-グリコレートなど)、リポソーム、マイクロエマルジョン、微粒子、ナノ粒子、ろうを利用し、コーティング、エンベロープ、保護マトリックスを施すことができる。このようなコーティング、エンベロープ、保護マトリックスは、留置装置(例えば組織リモデリング装置、ピン、副子、関節代替装置など)を被覆するのに役立つ。
治療薬は、口または喉への局所投与用製剤にすることもできる。活性成分は、例えば、風味を付けたベース(通常はスクロースと、アラビアゴムまたはトラガカントゴム)を含むロゼンジの形態;不活性なベース(ゼラチンとグリセリン、あるいはスクロースとアラビアゴムなど)に本発明の組成物が含まれたトローチの形態;適切な液体担体に本発明の組成物が含まれたうがい液の形態に製剤化することができる。
さらに、活性成分は、上記の疾患に対してであれ、それ以外の何らかの疾患に対してであれ、他の治療薬(例えば痛み緩和剤、抗炎症薬、ビタミン、ミネラルなど)と組み合わせて使用することもできる。
本明細書で引用したすべての参考文献は、引用によりその全体がこの明細書に組み込まれているものとする。以下の実施例は、本発明のいくつかの特徴を例示するものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されると考えてはならない。
実施例では以下の材料を使用した。
初代ヒト間葉細胞、初代ヒト骨芽細胞、ならびに対応する培地をバイオホイッタッカー社(ウォーカーズヴィル、メリーランド州)から購入した。マウスの間葉C3H10T1/2細胞をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)(マナサス、ヴァージニア州)(ATCC寄託番号CCL-226)から入手した。腹部の脂肪細胞から調製した全RNAは、バイオチェーン・インスティチュート社(ヘイウォード、カリフォルニア州)から入手した。一般的な組織培養試薬、cDNA第1鎖合成キット、白金Taq DNAポリメラーゼは、インヴィトロジェン社(ロックヴィル、メリーランド州)から購入した。ノギン、グレムリン、コーディン、twisted gastrulation (Tsg)、骨形成因子2、4、6は、R&Dシステムズ社(ミネアポリス、ミネソタ州)から購入した。ストラタプレップ全RNAミニプレップ・キットは、ストラタジーン社(サンディエゴ、カリフォルニア州)から購入した。セファデックスG-25包装済みNAP-5カラムは、アマーシャム・バイオサイエンシーズ社(ピスカタウェイ、ニュージャージー州)から購入した。アルカリホスファターゼ(ALP)の活性を測定するための試薬は、ピアス-エンドジェン社(ロックフォード、イリノイ州)から入手した。プロラーゲンC ELISAキットは、キデル社(マウンテンヴュー、カリフォルニア州)から購入した。CellTiterGlo生存キットは、プロメガ社(マディソン、ウィスコンシン州)から入手した。均質カスパーゼELISAキット、細胞死アッセイ・キット(ヒストン関連DNAの断片化)、インサイチュ細胞死検出キットは、ロッシュ・ディアグノスティックス社(インディアナポリス、インディアナ州)から購入した。カスパーゼ阻害剤(カスパーゼ-1、阻害剤VIとカスパーゼ-3、阻害剤I)は、カルバイオケム社(サンディエゴ、カリフォルニア州)から入手した。他のすべての試薬と化学薬品は、シグマ社(セントルイス、ミズーリ州)から購入した。
この実施例では、SOSTの発現が細胞分化と関連づけられ、前躯体細胞が成長して骨芽細胞になるときにSOSTの発現が増大することが見いだされた。
ヒト間葉(hMSC)細胞を標準的な増殖培地(バイオホイッタッカー社のMSCGM)または骨芽細胞誘導培地(バイオホイッタッカー社のMSCGM培地に100nMのデキサメタゾン、50μg/mlのアスコルビン酸、10mMのβ-グリセロリン酸を補足したもの)の中で培養した。培地を1週間に2回交換した。増殖開始後、培養物を1日目、7日目、21日目に回収してRNAを単離し、SOSTをRT-PCRで分析した。SOSTの発現は、対応する培地(Pittenger他)の中で21日〜28日間培養した間葉細胞から生成された脂肪細胞と軟骨細胞でも測定した。ヒト骨芽細胞の初代培養物も骨芽細胞誘導培地の中で21日間にわたって増殖させた後に、RNAを単離してRT-PCRを行なった。SOSTの発現は、腹部の脂肪組織と長骨の軟骨端から単離した全RNA調製物においても分析した。
ヒト由来の間葉(hMSC)細胞が分化して骨芽細胞様細胞になるのに必要な細胞培養条件を開発した。間葉細胞は骨髄に由来する多能細胞の集団であり、多数の異なるタイプの組織(例えば骨、軟骨、脂肪、平滑筋、腱、骨髄支質、ニューロン)に分化することができる(Owen、1998年)。
図1Aは、一次ヒト骨芽細胞、未分化hMSC細胞、分化して骨芽細胞になるhMSC細胞、軟骨細胞、脂肪細胞から調製したRNAをRT-PCRで分析した結果である。これらの種類の細胞における特徴的な表現型マーカー(例えば脂肪細胞でのPPARγ2)の発現レベルを、SOSTの発現レベルと比較した。この図1Aからわかるように、未分化hMSC細胞と脂肪細胞ではSOSTの発現レベルは無視できるほど低かった。他方、石灰化を起こすことのできるタイプの細胞のうちで骨芽細胞の表現型に関係するマーカー(例えばI型コラーゲン、X型コラーゲン、副甲状腺ホルモン受容体(PTHr))を発現する細胞は、SOSTを発現した。そのような細胞としては、初代ヒト骨芽細胞、分化して骨芽細胞になるhMSC細胞、肥大性軟骨細胞の培養物が挙げられる。
これらの結果は、骨芽細胞への分化が運命づけられている細胞でSOSTの発現が増大することを示している。
この実施例では、hMSC細胞または初代ヒト骨芽細胞において成長因子とホルモンがSOSTの発現に及ぼす効果をRT-PCRを利用して観察した。SOSTの発現を測定する前に、これらの細胞を72時間にわたってBMP-2、BMP-4、BMP-6、インスリン様成長因子-1(IGF-1)、副甲状腺ホルモン(PTH)、トランスフォーミング成長因子-β(TGF-β)、デキサメタゾン(DEX)、レチノイン酸(RA)、1,25-ジヒドロキシビタミンD3(vit D)で処理した。未熟な骨芽細胞は、分化して石灰化が可能になるにつれ、骨芽細胞の表現型に関係するマーカー(I型コラーゲン、副甲状腺ホルモン受容体(PTHr))を発現する。成長因子とホルモンの影響を分化段階ならびにSOSTの発現レベルと関係づけられるようにするため、分化が起こったかどうかを確認するためにこれらのマーカーを用いた。
2%FCSを含む標準的な増殖培地の中に、ヒト間葉細胞と初代ヒト骨芽細胞を10,000細胞/cm2の密度になるように入れた。翌日、テスト試薬(10-7Mのデキサメタゾン、10-6Mのレチノイン酸、10ng/mlのTGF-β1、PTH(10-8M)、10または50ng/mlのIGF-1、10-7Mの1,25-ジヒドロキシビタミンD3、50〜300ng/mlの骨形成因子2、4、6)を単独で、あるいは組み合わせとして添加した。培養を24〜120時間継続した後、細胞を回収してRNAを単離した。
図2〜図6にこれらの実験結果が示してある。図2からわかるように、未処理hMSC細胞(“ビヒクル”)はI型コラーゲンを強く発現したのに対し、PTHrとSOST(ビヒクルと対照、21日目)のレベルは無視できる程度であった。これらの結果は、未処理hMSC細胞は骨芽細胞系になる初期段階にあるが、骨芽細胞の形成が運命づけられていることを示している。これら細胞をデキサメタゾン、骨形成因子、IGF-1(50ng/mlの濃度)、骨芽細胞誘導培地での長期培養物(21日間誘導)のいずれかで処理すると、分化の段階が進み、PTHrの発現が誘導された。
BMP-4、BMP-6、IGF-1を含むいくつかの因子もSOSTの発現を増大させた。興味深いことに、ビタミンD、PTH、TGF-β、デキサメタゾンといった因子はそれ自体ではSOSTの発現に影響を与えなかった。骨形成因子は、分化しているhMSC細胞とヒト骨芽細胞の初代培養物においてSOSTの発現を増大させた。
タンパク質、ノギンとグレムリンは、骨形成因子と結合して骨形成因子を不活化することにより、BMPのアンタゴニストとして機能すると考えられている(Yamaguchi他、2000年)。骨形成因子は、培養物中の骨芽細胞の中にあるノギンとグレムリンの発現を調節するとも考えられている。Gazzero他、1998年;Pereira他、2000年;NifujiとNoda、1999年を参照のこと。骨形成因子がSOSTの発現に及ぼす効果を、骨形成因子がノギンとグレムリンの発現に及ぼす効果と比較した。
図4は、未分化のhMSC細胞ではSOSTとノギンの基底レベルは無視できる程度であったが、BMP-2、4、6によってSOSTとノギンの発現が上方調節されたことを示している。他方、グレムリンは未分化のhMSC細胞で構成的に発現し、その発現は、骨形成因子によってほんのわずかしか増大しなかった。
レチノイドなどのステロイドは、間葉細胞と骨芽細胞の分化を調節することがわかっている(Gazit他、1999年;Weston他、2000年)。ステロイドに対する細胞応答は、ステロイド・ホルモンとTGF-βシグナル伝達経路の相互作用を通じて変化する(Yanagi他、1999年)。
ステロイドおよび/またはTGF-βシグナル伝達経路がBMPを媒介としたSOSTの発現調節に影響を与えているかどうかを調べるため、hMSC細胞と骨芽細胞を、ビタミンD、レチノイン酸、またはデキサメタゾンだけとともに、あるいはそれにBMP-4を組み合わせて72時間にわたってインキュベーションし、SOSTの発現をRT-PCRで分析した。
これとは対照的に、デキサメタゾンをBMP-4とともに添加したときには、SOSTの発現レベルが低下した。したがってデキサメタゾンは、BMPがSOSTの発現に及ぼす増大効果を明らかに阻害した(図5)。
BMP-4は、グレムリンとノギンの発現も増大させた(図6)。しかしステロイドは、BMP-4によって誘導されたSOSTの発現とはわずかに異なった形で、BMP-4によって誘導されたグレムリンとノギンの発現に影響を与えた(図6)。SOSTと同様、グレムリンの発現は、レチノイン酸またはビタミンDだけで処理した細胞においては変化しなかった。SOSTとは異なり、細胞をデキサメタゾンだけで処理した場合にはグレムリンの基底レベルが低下した。しかしレチノイン酸とデキサメタゾンをBMP-4とともに添加したときには、BMP-4がグレムリンの発現に及ぼす増大効果が低下した。ビタミンDは、BMP-4がグレムリンの発現に及ぼす効果を変化させなかった。
したがってステロイドとBMP-4がグレムリンとノギンに及ぼす効果は、SOSTに対する効果とは顕著に異なる(図6)。BMP-4は、SOSTの発現レベルを顕著に増大させた。この効果は、ビタミンDまたはレチノイン酸の存在によって大きくなったが、デキサメタゾンの存在によっては大きくならなかった。実際、デキサメタゾンはSOSTの発現を顕著に抑制した。
前の実施例は、SOSTの発現が骨形成因子によって増大し、デキサメタゾンなどのステロイドによって変化したことを示している。これから示す実施例では、ヒトMSC細胞をさまざまなテスト薬剤の存在下で骨形成因子とともにインキュベーションし、他のステロイドや化合物が、BMPによって誘導されるSOSTに影響を与えることができるかどうかを調べた。SOSTの発現は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)で調べた。
ヒト間葉細胞(hMSC)を、2%FCSを含む標準的な増殖培地の中で増殖させ、BMP-6のみを用いて、あるいはBMP-6とテスト化合物の組み合わせを用いて処理した。細胞を72時間後に回収し、RNAを調製してSOSTの発現をRT-PCRで分析した。
結果
テストした化合物およびその化合物で得られた結果を表1にまとめてある。
図8は、フルオシノロンアセトニド(Fluo)とプロスタグランジンE2(PGE2)を用いてhMSC細胞を処理した結果を示している。どちらの化合物もBMP-6によるSOSTの誘導を効果的に阻止したが、他の化合物(タウロウルソデオキシコール酸、ICI 182,780、エストロゲン、ロバスタチン)は最小限の効果しかもたらさなかった。
BMP-6によるSOSTの誘導を効果的に阻止した5つの化合物の構造を図9に示してある。
この結果は、異なった3つのタイプのグルココルチコイド類似体がBMPによるSOST発現の誘導を阻止できることを示している。SOSTの発現を阻止した他の化合物としては、胆汁塩(例えばウルソデオキシコール酸)とプロスタグランジンがある。
SOSTにヘテロ接合突然変異またはホモ接合突然変異を持つ人は、骨がより密でより重いことを特徴とする骨格表現型を有する(Beighton他、1976年)。この実施例では、スクレロスチンの遺伝子産物をin vtroで骨芽細胞培養物に添加した。骨芽細胞の表現型マーカーを用い、どの分化段階でスクレロスチンが骨芽細胞の機能に影響を与えるかを調べた。
骨芽細胞誘導培地を含む96ウエルの培養皿にhMSC細胞を10,000細胞/cm2の密度となるように入れた。NAP-5カラムを用い、バキュロウイルスで発現させたスクレロスチンの部分精製調製物を減菌PBSの中で調製した後、使用した。ヒトのスクレロスチン(0〜30μg/ml)または同じ量のSf9コンディションド培地(対照)を増殖開始後のさまざまな時期(1日目、8日目、15日目、21日目)にhMSC細胞培養物に添加した。スクレロスチンが骨芽細胞の分化に及ぼす効果を、アルカリホスファターゼの活性(ALP、0.5%のNP-40と10mMのp-ニトロフェニルリン酸塩を含むDEAA緩衝液(ピアス社)を用いて細胞層で測定)、I型コラーゲンの合成(プロラーゲンC ELISA)、石灰化によるカルシウムの堆積(細胞層の酸ライセートに関する比色アッセイ、シグマ社)を測定することによって調べた。
C3H10T1/2細胞(ATCC寄託番号CCL-226)をウエル1つにつき細胞が25,000個になる密度にして96ウエルの培養皿に入れ、完全増殖培地(10%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、0.1mMの非必須アミノ酸、0.1mMのピルビン酸ナトリウム、55μMのβ-メルカプトエタノール、20mMのHEPES、pH7.3を補足した高フルコース、高グルタミンのDMEM)の中で増殖させた。C3H10T1/2細胞を短時間(72時間)のアッセイで使用し、BMPによって誘導されたALPの活性にヒトのスクレロスチン・タンパク質が及ぼす効果を調べた。NAP-5カラムを用い、バキュロウイルスで発現させたスクレロスチンの部分精製調製物を減菌PBSの中で調製した後、使用した。スクレロスチン・タンパク質(0〜50μg/ml)または同じ量のSf9コンディションド培地(対照)を500ng/mlのBMP-6とともに1時間にわたって予備インキュベーションした後、細胞に添加した。比較のため、抗BMP-6抗体とノギンを用いて同様のインキュベーションを行なった。細胞を72時間後に回収し、ALPの活性を測定した。
スクレロスチンがもたらす効果の特異性を調べるため、FLAGタグ付きで合成したヒトのスクレロスチンを、アガロース・ビーズに結合させた抗FLAG抗体とともに4℃にて2時間にわたって予備インキュベーションした。次にこの混合物を4℃にて10,000xgで15分間にわたって遠心分離し、上清を上記アッセイにおける“スクレロスチン・タンパク質”として扱った。
図10は、分化しているhMSC細胞においてヒトのスクレロスチンとマウスのノギンがアルカリホスファターゼ(ALP)の活性に及ぼす効果を比較した図である。アルカリホスファターゼの活性は、骨芽細胞の表現型マーカーの1つである。処理を開始してから7日後、1μg/mlのノギンはALPの活性に影響を与えなかったのに対し、5μg/mlのノギンはALPの活性を顕著に増大させた(ビヒクルで処理した細胞との比較、p<0.001)。
これとは対照的に、同じ条件下において、部分精製したヒトのスクレロスチン調製物は、1μg/mlと5μg/mlのどちらを投与した場合でもアルカリホスファターゼの活性を確実に低下させた(図10)。
スクレロスチンは、ヒト骨芽細胞の初代培養物におけるアルカリホスファターゼの活性も低下させた(図11)。標準的な増殖培地の中で増殖させた骨芽細胞は、ALPの基底発現レベルが低かった(図11、右端)。このレベルは、細胞を誘導培地の中で増殖させたときに顕著に増大した(中央部の写真、濃い染色)。同様の細胞をヒトのスクレロスチンで処理すると、発現するアルカリホスファターゼの量が顕著に減少した。そのことは、染色が薄くなったことからわかる(図11、スクレロスチン+誘導培地)。
スクレロスチンは、hMSC細胞においてアルカリホスファターゼの活性と石灰化を投与量に依存した形で低下させた(図12)。アルカリホスファターゼの活性と(カルシウム・アッセイで測定される)ミネラルの堆積は、部分精製したヒトのスクレロスチン調製物の濃度を大きくしながら処理した細胞で顕著に低下したが、対照(Sf9コンディションド培地から調製したタンパク質)ではそうならなかった(図12)。アルカリホスファターゼの活性とミネラルの堆積は、約10〜15μg/mlのスクレロスチンで処理した細胞において約50%低下した(対照との比較、p<0.0001)。
分化しているhMSC細胞培養物の中でスクレロスチン・タンパク質が骨芽細胞マーカーの発現に及ぼす効果を明らかにするため、処理を開始してから40時間後にRNAを単離し、RT-PCRで分析した(図14)。図14からわかるように、脂肪細胞に関するRNAレベルのマーカー(PPARγ2)または未分化の間葉細胞に関するRNAレベルのマーカー(エンドグリン)は、部分精製したヒトのスクレロスチン調製物で処理したことの影響を受けなかった。他方、骨芽細胞表現型マーカー(例えばPTHr、I型コラーゲン、BMP-2、BMP-6)のRNAレベルは、部分精製したヒトのスクレロスチン調製物で処理した細胞において、Sf9コンディションド培地から精製したタンパク質(対照)で処理した細胞と比較して顕著に低下した。
図16には、hMSC細胞培養物においてBMP-6の濃度を大きくしていったとき、スクレロスチンがアルカリホスファターゼの活性に及ぼす抑制効果を部分的に逆転させたことが示してある。
これらの知見は、スクレロスチンがBMPと相互作用して骨芽細胞の機能を調節していることを示している。
スクレロスチンの応答の特異性を確認するため、FLAGタグがスクレロスチンのコード領域に融合したヒトのスクレロスチン融合タンパク質を調製した。マウスの間葉C3H10Y1/2細胞に添加する前に、抗FLAG M2抗体/アガロース複合体を用いてヒトのスクレロスチン-フラグ調製物の免疫を欠損させた。図17からわかるように、スクレロスチン-FLAG調製物を抗FLAG抗体/アガロース・ビーズ複合体とともに予備インキュベーションすると、C3H10T1/2細胞におけるBMP-6の拮抗作用が完全に消失した。これらのデータからわかるのは、BMP-6によって誘導されるアルカリホスファターゼの活性が部分精製したスクレロスチンを添加したときに低下することが観察されたのは、スクレロスチンのために特異的に起こったのであり、同時精製された同定されていない何らかの物質によるのではないということである。
アポトーシスは、カスパーゼとして知られる一連のシステイン・プロテアーゼが活性化することによって起こる(ThornberryとLazebnik、1998年)。カスパーゼは、アポトーシスを促進するBaxなどのタンパク質と、保護特性を示すタンパク質(例えばI-TRAFやサービビン)を活性化する。アポトーシス・カスケードの開始は、細胞表面死受容体(例えばFAS)のリクルート、細胞表面死受容体へのリガンドの結合を含む多数の異なるメカニズムによって起こり得る(Vaughan他、2002年;Budd、2002年)。この実施例では、hMSC細胞をスクレロスチンとともにインキュベーションし、カスパーゼとそれ以外のアポトーシス促進因子のレベルを測定することにより、スクレロスチンが骨芽細胞の生存において果たす役割を調べる。
骨芽細胞誘導培地(バイオホイッタッカー社のMSCGM培地に100nMのデキサメタゾン、50μg/mlのアスコルビン酸、10mMのβ-グリセロリン酸を補足したもの)を含む96ウエルの皿にヒトの間葉(hMSC)細胞を10,000細胞/cm2の密度となるように入れた。
細胞生存アッセイを行なうため、細胞をバキュロウイルスで発現させて部分精製したヒトのスクレロスチン調製物(0〜20μg/ml)またはSf9コンディションド培地から精製した同じ量のタンパク質調製物(対照)で1週間にわたって処理した。それぞれの培地を交換することによってスクレロスチンと対照を新鮮な状態にした。次に細胞を溶解させ、プロメガ社のCellTiterGloルミネセンス生存アッセイを利用して処理した。
アポトーシス・アッセイを行なうため、細胞をスクレロスチン、または市販されているBMPのアンタゴニスト調製物(ノギン、コーディン、グレムリン、twisted gastrulation(Tsg))で24時間にわたって処理した後、カスパーゼの活性を調べた。いくつかの実験では、細胞を、カルバイオケム社のカスパーゼ阻害剤の不在下または存在下で、バキュロウイルスで発現させて部分精製したヒトのスクレロスチン調製物(0〜30μg/ml)またはSf9コンディションド培地から精製した同じ量のタンパク質調製物(対照)で複数回処理した。細胞を回収し、処理し、均質カスパーゼELISA(ロッシュ社)または細胞死アッセイ(ヒストン関連DNAの断片化、ロッシュ社)を利用してアポトーシス・アッセイを行なった。
別の研究では、hMSC細胞をビヒクルまたはスクレロスチンで6時間または48時間にわたって処理した。細胞を回収し、RNAを調製し、市販されているアポトーシス遺伝子アレイ(スーパーアレイ社、ベセスダ、メリーランド州)の分析に使用した。
図20は、hMSC細胞を部分精製したヒトのスクレロスチン調製物で7日間処理した効果を示している。細胞を溶解し、プロメガ社のCellTiterGlo生存アッセイを利用して処理した。この時点でこの細胞は、骨芽細胞前躯体/前骨芽細胞となることが運命づけられている。この細胞は、I型コラーゲンを高レベルで発現し、アルカリホスファターゼを低レベルで発現する。処理するヒトのスクレロスチンの濃度を大きくしていくと、培養物の中に残っているhMSC細胞の数が、対照(Sf9コンディションド培地から精製したタンパク質)で処理した細胞と比べて顕著に減少した。
スクレロスチンでhMSC細胞を処理すると、カスパーゼの活性が顕著に増大した(図21)。スクレロスチンの不活化調製物(他の生物学的アッセイや生化学的アッセイにおいて効果がないことからわかる)は、カスパーゼの活性に顕著な効果を与えることはなかった。市販されているBMPのアンタゴニスト(ノギン、コーディン、グレムリン、Tsg)を同じ条件下でhMSC細胞に添加したところ、カスパーゼの活性増加は観察されなかった。これらの知見は、スクレロスチンがヒト骨細胞のアポトーシスを選択的に増大させることを示している。
hMSC細胞をスクレロスチンで処理するとカスパーゼの活性が72時間後まで増大していた(図24A)。ラットのスクレロスチンもhMSC細胞のアポトーシスを増大させたが、ヒトのスクレロスチンほどではなかった(図24B)。
hMSC細胞においてスクレロスチンによって誘導されるカスパーゼの活性は、市販されているカスパーゼ阻害剤を用いて効果的に低下させることができた(図25)。カスパーゼ-1阻害剤とカスパーゼ3阻害剤は、ヒト・スクレロスチンによるカスパーゼ活性の誘導を効果的に抑制した。これら2つの阻害剤を組み合わせると、いずれか一方の場合よりも強力であった。
スクレロスチンがhMSCのアポトーシスに及ぼす効果をさらに調べるため、スクレロスチンで処理した細胞とビヒクルからRNAを回収し、そのRNAを用いて、アポトーシス遺伝子を含むcDNA発現アレイをプロービングした。ビヒクル・サンプルとスクレロスチンで処理したサンプルでの結果を比較し、(バックグラウンドの補正をした)データをビヒクルに対するスクレロスチンの比として表わした。そのデータを以下の表にまとめてある。
図25では、市販されている2つのカスパーゼ阻害剤(カルバイオケム社の、カスパーゼ1と4を抑制するカスパーゼ-1、阻害剤VIと、カスパーゼ3、6、7、8、10を抑制するカスパーゼ-3、阻害剤I)が、hMSC培養物においてスクレロスチンによって誘導されるカスパーゼの活性を抑制した。この知見は、アポトーシス・アレイからの知見と合わせて考えると、スクレロスチンがFASを媒介とした経路を通じて骨芽細胞のアポトーシスを促進することを示唆している。
これらの実施例で示したデータから、スクレロスチンがBMPと相互作用して骨芽細胞の活性を調節していることがわかる。重要な成長因子と相互作用するというスクレロスチンのこの能力は、骨芽細胞の生存を調節する基礎にもなっているようである。細胞が機能するときに成長因子を利用できなくすることにより、スクレロスチンは骨細胞のアポトーシスを増やすことができる。したがって細胞の生存と骨芽細胞の活性を低下させるスクレロスチンの能力を阻害する薬剤は、失われた骨を回復するのに役立つ薬剤となる可能性がある。
アンビオン社(オースチン、テキサス州)から提供されたガイドラインに従ってsiRNAを設計した。簡単に述べると、AAジヌクレオチドを有する標的配列を探すためにSOSTのcDNA配列を走査した。G/C含有量が35〜55%のその標的(AA+3'に隣接する19このヌクレオチド)に対するセンスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製した。次に、これらの配列をヒトゲノム・データベースの他の配列と比較し、他の既知のコード配列とのホモロジーを最少にした(Blast探索)。
設計した標的配列とsiRNA配列を以下に示す。
遺伝子配列における位置:140
GC含有量:42.9%
センス鎖siRNA:GAAUGAUGCCACGGAAAUCtt(配列番号10)
アンチセンス鎖siRNA:GAUUUCCGUGGCAUCAUUCtt(配列番号11)
遺伝子配列における位置:143
GC含有量:42.9%
センス鎖siRNA:UGAUGCCACGGAAAUCAUCtt(配列番号13)
アンチセンス鎖siRNA:GAUGAUUUCCGUGGCAUCAtt(配列番号14)
遺伝子配列における位置:209
GC含有量:47.6%
センス鎖siRNA:CAACAAGACCAUGAACCGGtt(配列番号16)
アンチセンス鎖siRNA:CCGGUUCAUGGUCUUGUUGtt(配列番号17)
遺伝子配列における位置:950
GC含有量:42.9%
センス鎖siRNA:UUGAGAGUCACAGACACUGtt(配列番号19)
アンチセンス鎖siRNA:CAGUGUCUGUGACUCUCAAtt(配列番号20)
遺伝子配列における位置:1035
GC含有量:42.9%
センス鎖siRNA:AUGGAAGCAUUUUCACCGCtt(配列番号22)
アンチセンス鎖siRNA:GCGGUGAAAAUGCUUCCAUtt(配列番号23)
遺伝子配列における位置:1093
GC含有量:47.6%
センス鎖siRNA:AGUCCAGGGACUGGUUAAGtt(配列番号25)
アンチセンス鎖siRNA:CUUAACCAGUCCCUGGACUtt(配列番号26)
遺伝子配列における位置:1111
GC含有量:33.3%
センス鎖siRNA:GAAAGUUGGAUAAGAUUCCtt(配列番号28)
アンチセンス鎖siRNA:GGAAUCUUAUCCAACUUUCtt(配列番号29)
遺伝子配列における位置:1201
GC含有量:38.1%
センス鎖siRNA:CUGUAGAUGUGGUUUCUAGtt(配列番号31)
アンチセンス鎖siRNA:CUAGAAACCACAUCUACAGtt(配列番号32)
遺伝子配列における位置:1269
GC含有量:47.6%
センス鎖siRNA:UUCUCCUUCGGGACCUCAAtt(配列番号34)
アンチセンス鎖siRNA:UUGAGGUCCCGAAGGAGAAtt(配列番号35)
遺伝子配列における位置:1414
GC含有量:38.1%
センス鎖siRNA:AGAGAGAGAAUGAAUGCAGtt(配列番号37)
アンチセンス鎖siRNA:CUGCAUUCAUUCUCUCUCUtt(配列番号38)
遺伝子配列における位置:1590
GC含有量:47.6%
センス鎖siRNA:GAAGCUAUGCUGCUUCCCAtt(配列番号40)
アンチセンス鎖siRNA:UGGGAAGCAGCAUAGCUU(配列番号41)
遺伝子配列における位置:1726
GC含有量:47.6%
センス鎖siRNA:AUCACAUCCGCCCCAACUUtt(配列番号43)
アンチセンス鎖siRNA:AAGUUGGGGCGGAUGUGAUtt(配列番号44)
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この明細書で引用したすべての特許および参考文献は、参考のためその全体がこの明細書に組み込まれているものとする。
Claims (51)
- R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8が、それぞれ独立に、カルボニル、ヒドロキシ、水素、または低級ヒドロキシアルキルである、請求項1に記載の医薬組成物。
- R1がカルボニルまたはヒドロキシである、請求項1に記載の医薬組成物。
- R8が、フッ素、水素、またはハロである、請求項1に記載の医薬組成物。
- 哺乳動物におけるSOSTの発現を低下させるため、治療に有効な量のグルココルチコイドを含む医薬組成物。
- グルココルチコイドがグルココルチコイド受容体と結合できる、請求項5に記載の医薬組成物。
- グルココルチコイドが、フルオシノロンアセトニド、トリアムシノロン、またはデキサメタゾンである、請求項5に記載の医薬組成物。
- R1とR4が、それぞれ独立に、カルボニル、ヒドロキシ、水素、または低級ヒドロキシアルキルである、請求項8に記載の医薬組成物。
- プロスタグランジンがプロスタグランジンE2である、請求項8に記載の医薬組成物。
- R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R9が、それぞれ独立に、カルボニル、ヒドロキシ、水素、または低級ヒドロキシアルキルである、請求項11に記載の医薬組成物。
- 上記胆汁塩がウルソデオキシコール酸である、請求項11に記載の医薬組成物。
- 担体と、配列番号11、配列番号14、配列番号17、配列番号20、配列番号23、配列番号26、配列番号29、配列番号32、配列番号35、配列番号38、配列番号41、または配列番号44を含むsiRNAとを含有し、前記siRNAがSOSTの発現を調節することができることを特徴とする、医薬組成物。
- 担体と、配列番号9、配列番号12、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号24、配列番号27、配列番号30、配列番号33、配列番号36、配列番号39、または配列番号42を含むDNAに由来するRNAにストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズするsiRNAとを含有し、前記siRNAがSOSTの発現を調節することができることを特徴とする、医薬組成物。
- ウルソデオキシコール酸、フルオシノロンアセトニド、トリアムシノロン、プロスタグランジンE2、またはデキサメタゾンを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物においてSOSTの発現を調節する方法。
- 哺乳動物にグルココルチコイドを投与することを含む、哺乳動物においてSOSTの発現を調節する方法。
- グルココルチコイドがコルチゾールまたはデキサメタゾンである、請求項20に記載の方法。
- 哺乳動物においてSOSTの発現を調節する方法であって、配列番号11、配列番号14、配列番号17、配列番号20、配列番号23、配列番号26、配列番号29、配列番号32、配列番号35、配列番号38、配列番号41、または配列番号44を含むsiRNAを哺乳動物に投与することを含み、前記siRNAがSOSTの発現を調節することができる前記方法。
- 哺乳動物においてSOSTの発現を調節する方法であって、配列番号9、配列番号12、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号24、配列番号27、配列番号30、配列番号33、配列番号36、配列番号39、または配列番号42を含むDNAに由来するRNAにストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズすることのできるsiRNAを哺乳動物に投与することを含み、前記siRNAがSOSTの発現を調節することができる前記方法。
- ウルソデオキシコール酸、フルオシノロンアセトニド、トリアムシノロン、プロスタグランジンE2、またはデキサメタゾンを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において骨密度を増大させる方法。
- 哺乳動物にグルココルチコイドを投与することを含む、哺乳動物において骨密度を増大させる方法であって、前記グルココルチコイドがSOSTの発現を調節する、前記方法。
- グルココルチコイドがコルチゾールまたはデキサメタゾンである、請求項28に記載の方法。
- 哺乳動物において骨密度を増大させる方法であって、配列番号11、配列番号14、配列番号17、配列番号20、配列番号23、配列番号26、配列番号29、配列番号32、配列番号35、配列番号38、配列番号41、または配列番号44を含むsiRNAを哺乳動物に投与することを含み、前記siRNAがSOSTの発現を調節することができる前記方法。
- 哺乳動物において骨密度を増大させる方法であって、配列番号9、配列番号12、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号24、配列番号27、配列番号30、配列番号33、配列番号36、配列番号39、または配列番号42を含むDNAに由来するRNAにストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズすることのできるsiRNAを哺乳動物に投与することを含み、前記siRNAがSOSTの発現を調節することができる前記方法。
- ウルソデオキシコール酸、フルオシノロンアセトニド、トリアムシノロン、プロスタグランジンE2、またはデキサメタゾンを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において骨細胞のアポトーシスを低減する方法。
- 哺乳動物にグルココルチコイドを投与することを含む、哺乳動物において骨細胞のアポトーシスを低減する方法であって、前記グルココルチコイドがSOSTの発現を調節する、前記方法。
- グルココルチコイドがコルチゾールまたはデキサメタゾンである、請求項36に記載の方法。
- 哺乳動物において骨細胞のアポトーシスを低減する方法であって、配列番号11、配列番号14、配列番号17、配列番号20、配列番号23、配列番号26、配列番号29、配列番号32、配列番号35、配列番号38、配列番号41、または配列番号44を含むsiRNAを哺乳動物に投与することを含み、前記siRNAがSOSTの発現を調節することができる前記方法。
- 哺乳動物において骨細胞のアポトーシスを低減する方法であって、配列番号9、配列番号12、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号24、配列番号27、配列番号30、配列番号33、配列番号36、配列番号39、または配列番号42を含むDNAに由来するRNAにストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズすることのできるsiRNAを哺乳動物に投与することを含み、前記siRNAがSOSTの発現を調節することができる前記方法。
- SOSTの発現を低下させる因子の同定方法であって、
(1)検出可能なマーカーをコードする核酸と機能的に連結した、配列番号4を含むSOSTプロモータが含まれる核酸構築物を含有する細胞を用意すること;
(2)前記細胞をテスト薬剤と接触させること;
(3)前記テスト薬剤が、前記テスト薬剤と接触させていない細胞を含む対照と比べて前記検出可能なマーカーの発現を低下させるかどうかを検出すること、
を含む、前記方法。 - 細胞が骨形成因子に応答応答性である、請求項40に記載の方法。
- 細胞が、ATCC受託番号CRL-1772の細胞株に由来するC2C12細胞、あるいはATCC受託番号CCL-226の細胞株に由来するC3H10T1/2細胞である、請求項40に記載の方法。
- 細胞が、ヒト間葉(hMSC)細胞である、請求項40に記載の方法。
- 核酸構築物が、骨芽細胞特異的ステロイド応答エレメントをコードする核酸エレメントをさらに含む、請求項40に記載の方法。
- 核酸構築物が、グルココルチコイド応答エレメントをコードする核酸エレメントをさらに含む、請求項40に記載の方法。
- SOSTの発現を低下させる因子の同定方法であって、
(1)配列番号3、配列番号6、または配列番号8を含むタンパク質をコードしている核酸を含有する細胞を、テスト薬剤と接触させること;および、
(2)内在性SOSTの発現が低下するかどうかを検出すること、
を含む前記方法。 - 核酸が、配列番号1、配列番号2、配列番号5、または配列番号7を含む、請求項46に記載の方法。
- スクレロスチンのアンタゴニストを同定する方法であって、
(1)スクレロスチンとテスト薬剤を細胞と接触させること;および、
(2)前記テスト薬剤が前記細胞のアポトーシスを阻止するかどうかを検出すること、
を含む前記方法。 - スクレロスチンに結合する分子を同定する方法であって、
(1)テスト薬剤を、配列番号3、配列番号6、または配列番号8を含むスクレロスチン・ポリペプチドと接触させること;および、
(2)前記テスト薬剤が前記ポリペプチドと結合するかどうかを調べること、
を含む前記方法。 - 配列番号3、配列番号6、または配列番号8を含む、スクレロスチン・ポリペプチドを含有する、骨芽細胞分化マーカー。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号5、または配列番号7を含む核酸を含有する、骨芽細胞分化マーカー。
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