JP2005532260A - 器官保護剤としてのカッパ−pviia−関連コノトキシン - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はκ−PVIIA−関連コノトキシンおよびその医薬上許容される塩、ならびに器官を保護する剤、すなわち、器官保護剤としてのその使用に関する。これらのコノトキシンは循環器系器官、呼吸器系器官、泌尿器系器官、消化器系器官、生殖器系器官、内分泌系器官または神経系器官のごとき器官を阻止し、保護しまたは維持するのに用いることができる。また、これらのコノトキシンは体細胞を阻止し、保護しまたは維持するのに用いることができる。
本発明は、κ−PVIIA−関連コノトキシンおよびその医薬上許容される塩、ならびに器官を保護する剤、すなわち、器官保護剤としてのその使用に関する。これらのコノトキシンは循環器系器官、呼吸器系器官、泌尿器系器官、消化器系器官、生殖系器官、内分泌系器官または神経系器官のごとき器官を阻止し、保護しまたは維持するのに用いることができる。また、これらのコノトキシンは体細胞を阻止し、保護しまたは維持するのに用いることもできる。
本発明は、κ−PVIIA−関連コノトキシンおよびその医薬上許容される塩または器官を保護する剤、すなわち、器官保護剤としてのその使用に関する。これらのコノトキシンは循環器系器官、呼吸器系器官、泌尿器系器官、消化器系器官、生殖系器官、内分泌系器官または神経系器官を阻止、保護、維持するのに用いる。これらのコノトキシンは体細胞を阻止し、保護し、または維持するのに用いることもできる。
配列
(配列番号1)
(式中Xaa1およびXaa3は独立してArg、ホモアルギニン、オルニチン、Lys、N−メチル−Lys、N,N−ジメチル−Lys、N,N,N−トリメチル−Lys、いずれかの合成塩基性アミノ酸、Hisまたはハロ−Hisであり;Xaa2はProまたはヒドロキシ−Pro(Hyp)であり;Xaa4はPhe、Tyr、メタ−Tyr、オルト−Tyr、ノル−Tyr、モノ−ハロ−Tyr、ジ−ハロ−Tyr、O−スルホ−Tyr、O−ホスホ−Tyr,ニトロ−Tyr、Trp(DまたはL),ネオ−Tip,ハロ−Trp(DまたはL)またはいずれかの合成芳香族アミノ酸であり;およびXaa5はHisまたはハロ−Hisである)を有するペプチドを言う。C−末端は遊離カルボキシル基またはアミド基を含むことができる。該ハロは好ましくは臭素、塩素またはヨウ素である。Xaa1がArgであり、Xaa5がHisであるのが好ましい。Xaa1がArgであり、Xaa3がLysであり、Xaa4がPheであって、Xaa5がHisであるのがより好ましい。C−末端が遊離カルボキシル基を含有するのがさらに好ましい。
Xaa2-Cys-Xaa3-Xaa2-Xaa3-Gly-Xaa,-Xaa3-Cys-Xaa4-Xaa,-Xaas-Gln-Xaa3-Asp-Cys-Cys-Asn-Xaa3-Thr-Cys-Thr-Xaal-Ser-Xaa3-Cys-Xaa2(配列番号:26)
(式中、Xaa1,Xaa2,Xaa3、Xaa4およびXaa5は前記定義の通りである。)を有するペプチドを言う。C−末端は遊離カルボキシル基またはアミノ基、好ましくは遊離カルボキシルを含むことができる。XaaがArgであり、Xaa3がLysであり、Xaa4がPheであって、Xaa5がHisであるのが好ましい。Xaa1がArgであり、Xaa2がProであり、Xaa3がLysであり、Xaa4がPheであって、Xaa5がHisであるのがより好ましい。
Xaa2-Cys-Xaa3-Thr-Xaa2-Gly-Xaa,-Xaa3-Cys-Xaa4-Xaa2-Xaas-Gln-Xaa3-Asp-Cys-Cys-Gly-Xaal-Ala-Cys-Ile-Ile-Tllr-Ile-Cys-Xaa2(配列番号:27)
(式中、Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4およびXaa5は前記定義の通りである)を有するペプチドを言う。C−末端は遊離カルボキシル基またはアミド基、好ましくは遊離カルボキシルを含むことができる。Xaa1がArgであり、Xaa3がLysであり、Xaa4がPheであって、Xaa5がHisであるのが好ましい。Xaa1がArgであり、ProであるC−末端を例外としてXaa2がHypでありXaa3がLysであり、Xaa4がPheであってXaa5がHisであるのがより好ましい。
Xaa2-Cys-Xaa3-Xaa3-Thr-Gly-Xaa,-Xaa3-Cys-Xaa4-Xaa2,-Xaa5-Gln-Xaa3-Asp-Cys-Cys-Gly-Xaal-Ala-Cys-Ile-Ile-Thr-Ile-Cys-Xaa2(配列番号:28)(式中、Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4およびXaa5は前記定義の通りである)を有するペプチドを言う。C−末端は遊離カルボキシル基またはアミド基、好ましくは遊離カルボキシル基を含むことができる。Xaa1がArgであり、Xaa3がLysであり、Xaa4がPheであって、Xaa5がHisであるのが好ましい。Xaa1がArgであり、Xaa2がProであり、Xaa3がLysであり、Xaa4がPheであって、Xaa5がHisであるのがより好ましい。
κ−PVIIA[R18A]:Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Ala-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 2);
κ-PVIIA [R22A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Ala-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 3);
κ-PVIIA [I3A]: Cys-Arg-Ala-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 4);
κ−PVIIA[K19A]:Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Ala-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 :5) ;
κ-PVIIA [R2A]:Cys-Ala-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 6);
κ-PVIIA [F9A]:Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Ala-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 7);
κ-PVIIA[K25A] : Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Ala-Cys-Val (配列番号 : 8);
κ-PVIIA [R2K] :Cys-Lys-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 9);
κ-PVIIA [K7A] :Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Ala-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 :10) ;
κ-PVIIA [F9M]:Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Met-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 :11) ;
κ-PVIIA [F9Y]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Tyr-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 12);
κ-PVIIA[R2Q]: Cys-Gln-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 13);
κ-PVIIA[H11A] :Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-Ala-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 14);
κ-PVIIA[D14A] :Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Ala-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 15);
κ-PVIIA[Q6A]:Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Ala-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 16);
κ-PVIIA[N21A] :Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Ala-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 17);
κ-PVIIA[S17A] :Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ala-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 18);
κ-PVIIA[N24A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Ala-Lys-Cys-Val (配列番号 :19) ;
κ-PVIIA[L12A]:Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Ala-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 20);
κ-PVIIA[D13A]:Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Ala-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 21);
κ-PVIIA[Q10A]:Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Ala-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 22);
κ-PVIIA [V27A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Ala (配列番号 : 23);
κ-PVIIA[04A]:Cys-Arg-Ile-Ala-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 24); および
κ-PVIIA[N5A]:Cys-Arg-Ile-Hyp-Ala-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 25)
C−末端は遊離カルボキシル基を含むのが好ましい。
(a)ポンプ(例えば、Lauer & Hatton (1993), Zimmら(1984), Ettingerら(1978)およびMedtronic, Inc.の心停止法システム参照);
(b)マイクロカプセル化(例えば、米国特許第4,352,883号;第4,353,888号;および第5,084,350号参照);
(c)連続的放出ポリマーインプラント(例えば、米国特許第4,883,666号参照);
(d)マクロカプセル化(例えば、米国特許第5,284,761号、第5,158,881号、第4,976,859号および第4,968,733号ならびに公開されたPCT特許出願WO 92/19195、WO 95/05452参照);
(e)CNSへの裸のまたはカプセル化されていない細胞移植片(例えば、米国特許第5,082,670号および第5,618,531号参照);
(f)注射(皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、または他の適切な部位);または
(g)カプセル、液体、錠剤、丸剤、または延長放出処方の経口投与;
を含めたいずれかの適当な送達手段を用いて達成することができる。
実験方法
1.細胞培養プロトコル
ラット新生児皮質細胞、心室筋肉細胞、気管平滑筋細胞および海馬細胞の初代培養を調製した。皮質半球から骨髄膜を除去し、海馬を摘出し、20U/mlパパインを用いて別々に解離した。細胞は37℃にて45分間一定に撹拌しつつ解離した。10ml培地(DMEM/F12±10%胎児ウシ血清±B27ニューロン補足物;Life Technologies)中の画分V bsa(1.5mg/ml)およびトリプシン阻害剤(1.5mg/ml)で消化を停止した。細胞を軽くトリチュレートして、周囲の結合組織から細胞を分離した。流体を取り扱うロボット(Quadra96, Tomtec)を用い、細胞をプリマリア−処理96ウェルプレート(Becton-Dickinson)に沈降させた。各ウェルにほぼ25,000細胞を負荷した。プレートを37℃の湿潤5%CO2インキュベーターに入れ、蛍光スクリーニング前に少なくとも5日間保持した。脳室を2mm角ピースにダイシングし、20U/mlパパインおよびトリプシン/EDTA 1×(Life Technologies)の存在下で消化した。気管の表面の平滑筋細胞は、同消化酵素を用いて培養した。培養技術は前記方法に従った。
フルオリメトリーアッセイで用いた生理食塩水は[mM単位で]137 NaCl、5 KCl、10 HEPES、25グルコース、3CaCl2および1MgCl2を含有した。
フルオリメトリー測定は、96ウエルプレートのウエル当たりほぼ25,000細胞からの細胞応答の平均である。皮質からの細胞の培養は少なくとも錐体ニューロン、二極性ニューロン、インターニューロンおよび神経膠星状細胞を含む。膜ポテンシャル(ジー8−ANEPP)、細胞損傷(エチジウムホモダイマー−1)、細胞内K+(PBFI)および細胞内Ca2+(Fluo−3)の変化を、κ−PVIIA単独で、あるいは特異的受容体/イオンチャネルアゴニストまたはアンタゴニスト存在下でのκ−PVIIAで誘導された応答の尺度として用いた。濃度−応答をκ−PVIIAに関して収集して、効果的な範囲を決定した。ウエル間の変動を最小化するために、予備処理における蛍光の程度を処理後におけるそれと比較することによって各ウエルをそれ自身の対照として作用させた。この正規化プロセスは、プレート間および培養間の相対的応答の比較を可能とする。各ウエルにおける混合細胞集団をフルオリメーターで測定し、個々の細胞シグナリング応答を平均化した。8つのウエルからの平均、および該平均の標準誤差を含めた統計処理は、処理の間の有意な差の比較を可能とした。結果を蛍光のパーセント変化として表した。プレートの初期の読みは生理食塩溶液にて採取した。ジ−8−ANEPP、Fluo−3またはPBFI色素を用いる測定は15秒、2分、5分、10分、20分および30分間隔で、化合物の存在下で行った。エチジウムホモダイマー−1での読み取りは1時間間隔で行った。
頸部脱臼によってモルモットを犠牲とし、気管を切り出し、結合組織を除去した。気管を4または5のセクションに切断し、気管筋肉と反対側の軟骨のリングを通じての切断によって切開した。各セグメントを、(nm)NaCl 118.2; KCl 4.7; MgSO4 1.2; KH2PO4 1.2; グルコース、11.7; CaCl2 1.9およびNaHCO3 25.0を含有する器官浴中に設置した。該浴を37℃で維持し、95%O2および5%CO2を通気した。調製物を1gの張力下に維持し、実験を開始する前に平衡化した。Grassポリグラフに連結した力−変位変換器を用い、収縮を等尺的に測定した。60分の平衡期間の後に、気管を最大下濃度のヒスタミンに暴露した。スパスモーゲンに対する収縮応答が一定となるまでこの工程を反復した。κ−PVIIAの増大する濃度の弛緩効果を、ヒスタミンの不存在下および存在下で測定した。
全細胞パッチクランプ記録は、ポリオルニチン/ポリ−D−リシンで被覆した。カバーグラス上の皮質ニューロンから(培養5ないし28日)および未被覆カバーグラス上の筋肉細胞から行った。パッチピペットを薄壁ホウケイ酸ガラスから引き出し、それは、4Mないし6Mの抵抗性を有した。電流をEPC9増幅器(HEKA)で記録し、MacintoshパワーPCで作動させるソフトウエア(Pulse, HEKA)によって制御した。全細胞電流を10kHzで低通過濾過し、VR−10bデジタルデータレコーダを介してデジタル化して、94kHzのサンプリング速度にてビデオテープに貯蔵した。細胞内ピペットは(mM単位):107KCl、33KOH、10EGTA、1MgCl2、1CaCl2および10HEPESを含有した。溶液をNaOHでpH7.2とし、0.1ないし0.5mM Na2ATPおよび0.1mM NaADPを実験直前に添加した。細胞該溶液は、(mM単位):60KCl,80NaCl,1MgCl2、0.1CaCl2および10HEPESを含有した。外部溶液のpHをNaOHでph7.4とした。高濃度のカリウムの結果、−20mvのカリウムについての逆転ポテンシャルが計算された。その結果、もし保持ポテンシャルが−20mvよりも負であれば、K+チャネルの開口の結果K+イオンの内向きフラックスおよび全細胞電流の下向き偏向がもたらされる。KATPチャネルは弱い内向き整流特性を有し、それ自体、より大きな内向き電流が予測されるので、これらの溶液を選択した。進行中の実験は、低いカリウムレベルの溶液中でのκ−PVIIAの降下を探るものである。
2つの細胞外溶液を異なるK+イオンおよびNa+イオン濃度で用いた。溶液1は5mMKClを含有し、−84mVのカリウム平衡ポテンシャル(Ek)を有し、溶液2は60mMを含有し、−20mVの対応するEkを有する。細胞外溶液1は(mM単位):5 KCl,135NaCl,1MgCl2,0.1CaCl2および10HEPESを含有した。外部溶液のpHはNaOHでpH7.4に修正した。細胞外溶液2は(mM単位):60KCl,80NaCl,1MgC,0.1CaCl2および10HEPESを含有した。外部溶液のpHをNaOhでpH7.4に修正した。細胞内ピペットは(mM単位):107KLCl,3KOH,10EGTA,1MgCl2,1CaCl2および10HEPESを含有した。溶液をNaOHでpH7.2とし、実験直前に0.1ないし0.5mM Na2ATPおよび0.1mM NaADPを添加した。
低濃度の外部K+イオン(溶液1)の存在下にて、かつ−84mVよりも脱分極した保持ポテンシャルにて、K+チャネルの開口の結果、K+イオンの外向き流れが生じる。高濃度のK+(溶液2)の存在にて、K+イオンの外向き移動が観察されるためには、膜ポテンシャルは−20mVよりも負でなければならないであろう。もし2つの異なる細胞外溶液においてκ−PVIIAによって誘起された電流の現実の逆転ポテンシャルが計算された値と同一であるならば、κ−PVIIA−誘導電流はK+イオンのフラックスの結果である。電流の逆転ポテンシャルは、細胞を計算されたEkに保持し、増大させる濃度のκ−PVIIAの存在下および不存在下双方にて、−100mVないし+80mVの500ミリ秒の電圧ランプを実行することによって計算した。4つの対照ランプの平均を、κ−PVIIAの存在下で誘起された4つのランプの平均から差し引いた。得られた追跡は当該化合物の存在によって誘導された現実の電流であった。これは多項式機能および計算された逆転ポテンシャルと合致した。
皮質細胞培養に、イメージング実験から40分前に、蛍光Ca2+インジケーターFluo3−AM (Molecular Probes, Eugene OR; 0.1%プルロン酸を含む2mM最終濃度)を負荷した。細胞を含むカバーグラスを層流灌流チャンバー(Cornell-Bell設計;Warner Instruments, Hamden, CT)に設置し、少なくとも5分間生理食塩水(137mM NaCl、5mM KCl、3mM CaCl2、1mM MgCl2、10mM HEPES、および20mMソルビトール、pH7.3)中ですすいで、過剰のFluo−3AMを除去した。微速度イメージを、Zeiss Axiovert135倒立顕微鏡(Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY)を備えたNikon PCM200(Melville, NY)共焦点走査レーザー顕微鏡で収集し、1.8秒毎に平均しつつフレームなくして光学メモリーディスクレコーダー(Panasonic TQ3031F, Secaucus NJ)(Kimら, 1994にさらに記載された方法参照)にダウンロードした。イメージ分析を、視野中の各神経膠星状細胞における細胞質の標準化された5×5画素領域で行って、データ解析における偏りを防止した。強度測定(蛍光の%変化)の時間プロットは、H.Sontheimer(Birmingham, AL)によって書かれたプログラムを用いて得られ、Origin(MicroCal Northampton, MA)を用いてプロットした。ルーチン分析は、少なくとも5回のトライアルで、視野当たり200までの細胞についての時間プロットよりなり、かくして、しばしば、実験当たり数千の細胞からのデータ解析を得た。
κ−PVIIAへの暴露は細胞内K+の用量−依存性減少を生じる。
κ−PVIIAは元来紫色イモ貝(Conus purpurascens)から単離され、ショウジョウバエH4 shaker K+チャネルをブロックすることが判明している(ら, 1998)。同一実験において、ペプチドの効果は、哺乳動物shaker−様電圧−感受性K+チャネルKv1.1およびKv1.3を発現する卵母細胞では観察されなかった。皮質の初代培養に存在する他の電圧−ゲーテッドK+チャネルをブロックするペプチドの能力を本実験でテストした。96−ウェルのフルオリメトリーアッセイを用いて、電圧−ゲーテッドカリウムチャネル(Kv)が活性化される脱分極条件下でカリウムレベルの変化を調べた。細胞にカリウムインジケーター式をPBFLを予め負荷した。もし化合物が脱分極環境中でKvチャネルをブロックするように活動すれば、細胞内K+の増加が得られるであろう。しかしながら、該結果は、100nMまでの濃度において、未処理静止調製物において細胞内K+濃度の減少があり(図1)、ならびにそれらの調製物が10ないし100uMアコニチンで脱分極したことを示唆した。κ−PVIIAで誘起されたPBFI色素での蛍光の変化は小さいが、それらは重要であり、反復可能であることを強調するのは重要である。
κ−PVIIAへの暴露は用量−依存性過剰分極を生じさせる。
電圧−感受性ジ−8−ANEPPの存在下でフルオリメトリー実験を反復し、細胞内K+レベルの降下が(蛍光の正のシフトによって表される、図2A−2B)調製物の有意な過剰分極が伴って観察された。κ−PVIIAはこのアッセイにおいて極端に優れており、皮質において8×10−16M、筋肉細胞培養物において9×10−16M、および気管筋肉細胞の初代培養において9×10−18MのEC50を示した。
κ−PVIIA−誘導過剰分極はKATPアンタゴニストへの暴露によってブロックされる。
κ−PVIIA−誘導過剰分極における異なるK+チャネルサブタイプの関与を決定するために、5つのよく記載されているK+チャネルアンタゴニスト(4−アミノピリジン(4−AP)、イベリオトキシン(IBTX)、アパミン、トルブタミドおよびグリベングラミド)の効果をテストした。皮質調製物においては、4−AP、IBTXおよびアパミンの適用は100nM κ−PVIIAで観察された過剰分極に対して検出可能な効果がなかった。しかしながら、KATPチャネルのアンタゴニストであるトルブタミド(1ないし100uM)およびグルベンクラミド(10nM)双方は、κ−PVIIA誘導過剰分極において有意な減少を生じさせた(図3B)。また、グリベングラミドは、筋肉細胞の培養においてκ−PVIIA−誘導過剰分極の有意な減少を生じさせた(図3A)。
κ−PVIIAはトルブタミドまたはグリベンクラミド−感受性電流を誘導する。
KATPアンタゴニストに対する応答の感度は、全細胞パッチクランプ技術を用いて確認した。これらの実験において、細胞カリウム濃度を60mMまで増加させ、カリウムに対する逆転ポテンシャル(Ek)が−20mVとなるように溶液を計算した。かくして、膜ポテンシャルが−20mVよりも負である場合のK+チャネルの開口の結果、K+イオンの流入が起こる。皮質および心筋細胞の双方の初代培養において、100nM κ−PVIIAの注入は、−20mV近くで逆転した正のイオンの内向き流れを誘導し、これはK+イオンの関与を示す。−80mVの保持ポテンシャルにて、κ−PVIIAによって誘導された電流は、皮質調製物(26.2±6.2pA、n=4)と比較して、筋肉細胞調製物(87.7±5.9pA、n=8)よりも有意に大きかった。電流を細胞キャパシタンスについての補正した場合でさえ、筋肉細胞によって生じた応答は皮質調製物で観察されたものよりも大きかった(各々、4.6±0.4pA/pfおよび2.4±0.7pA/pf)。
κ−PVIIAは細胞内カルシウムのゆっくりと発生する低下を生じる。
細胞内カルシウムレベルに対するκ−PVIIAの効果は、96−ウェルフルオリメトリーアッセイプレートを用い、細胞にCa2+インジケーター色素Fluo−3を負荷することによって測定した。皮質ニューロンの初代培養において、κ−PVIIAは細胞内カルシウムの有利な低下を生じた。経時的を除き、15秒においては1nM κ−PVIIAではほとんど効果は認められず(−2.15±0.95%、2回のトライアル)、カルシウム濃度の降下はより顕著になった(30分、−8.8±3.9%)。
κ−PVIIAは低酸素症−誘導脱分極に対して保護する。
N2−誘導低酸素症の脱分極効果を、96ウェルフルオリメトリーアッセイプレートにおいて電圧感受性色素ジ−8−ANEPPを用いて心臓心室筋肉細胞でモニターした。N2ガスを一定に通気することによって溶液から酸素を欠乏させ、対照未処理生理食塩水での結果と比較した。これらの条件下で、低酸素症は調製物の有意な脱分極を生じさせ(蛍光降下として反映される)、10nMのκ−PVIIAと共に調製物をインキュベートすると、膜ポテンシャルにおけるいずれの低酸素症−誘導変化も妨げた(図5)。
κ−PVIIAはグルタミン酸−誘導興奮傷害性に対して保護する。
96−ウェルフルオリメトリーアッセイおよびエチジウムホモダイマー−1死滅細胞色素を用い、グルタミン酸−誘導興奮傷害性に対するκ−PVIIAの保護効果をテストした。96−ウェルプレートの5つのレーンを100pMのκ−PVIIAに予め暴露し、さらに5つを対照生理食塩水に暴露した。次いで、グルタミン酸を30分間適用し、その時点で、全プレートを徹底的に洗浄して、全てのκ−PVIIAおよびグルタミン酸を除去した。エチジウム色素を負荷し、初期の読みを採取し、遅延した細胞傷害性の量を6時間モニターした。蛍光の増加は増大した細胞の破壊を表す。図6から分かるように、κ−PVIIAにおける皮質細胞のプレ−インキュベーションの結果、100uMグルタミン酸の遅延した(6時間)細胞傷害効果に対して非常に効果的な保護がもたらされた。この保護は100uMトルブタミドによってブロックされた(KATPアンタゴニスト)。
κ−PVIIAの細胞傷害性
200nM κ−PVIIAと共に初代皮質培養を20分間インキュベーションすると、検出可能なプロテアーゼ活性を誘導しなかった(3回のトライアル)。比較として5%トリトンでの20分間インキュベーションは、Enzchekプロテアーゼ−感受性色素によって検出されるごとく、蛍光の〜14%を増加を生じさせた。
低酸素症のイン・ビトロモデルにおけるκ−PVIIAの保護能力の評価
96−ウェルフルオリメトリーアッセイ、電気生理学、および共焦点顕微鏡の組合せを用いて、初代培養において酸素を一過的に欠乏させる急性効果に対して保護するκ−PVIIAの能力を評価する。多チャンバー生理食塩水貯蔵器は、送達プレートの下半分が、N2を通気する生理食塩水で満たされるように構築した。個々のチャンバーは、酸素を減少させる効果が、異なる濃度のκ−PVIIAの存在下および不存在下でモニターできるようにする。電位差色素ジ−8−ANEPPを用いての心室筋肉細胞の初代培養における初期スクリーニングは、低酸素症誘導脱分極に対するκ−PVIIAの強力な保護効果を示す。同様の結果が皮質および気管で観察される。カルシウム−感受性色素fluo-3を用いて、低酸素症攻撃によって誘導された細胞内カルシウムレベルの変化を観察すると、κ−PVIIAは、全ての3つの組織調製物において低酸素症に対する保護を供することができるのが観察される。同様の結果が、低酸素症電気生理学によって誘導された膜ポテンシャルの変化をモニターするための全細胞パッチクランプ技術の電流−クランプモードを用いて得られる。この技術は非常に感度が良好で、単一の気管、ニューロンまたは筋肉細胞に対するκ−PVIIAの効果の調査を可能とする。
興奮傷害性のイン・ビトロモデルにおけるκ−PVIIAの保護能力の評価
高濃度のグルタミン酸に対する攻撃後に生じた遅延細胞死滅の程度をモニタリングする予備的フルオリメトリー実験を皮質の初代培養で行った。結果は、κ−PVIIAの存在が、用量−依存的にグルタミン酸−誘導興奮傷害性の程度を効果的に低下させることを示す。全−細胞パッチクランプ技術の電流−クランプモードを用い、膜ポテンシャルの現実の変化に対するフルオリメトリー結果の相関を調べる。κ−PVIIAの存在は初期グルタミン酸−誘導脱分極を妨げ、それにより、グルタミン酸−誘導カルシウム流入に対して保護を付与することが観察される。
梗塞サイズに対するκ−PVIIAの効果
最初に、摘出されたウサギ心臓における梗塞サイズに対するκ−PVIIAの効果を分析した。このモデルにおいては、梗塞は、冠動脈の30分間の閉塞、続いての2時間の再灌流によって摘出された心臓で誘導される。10nMおよび100nM κ−PVIIAでの10分間の灌流は梗塞のサイズを低下させることが判明した。また、1nM κ−PVIIAでの10分間の灌流は梗塞サイズに対して効果を有しないことも判明した。これらの結果を考慮して、イン・ビボモデルをさらなる分析で用いた。
AMIのイヌモデルにおけるκ−PVIIAの効果
第2の種における活性を確認するために、κ−PVIIAの心臓保護効果をAMIの開胸バルビタール麻酔イヌモデルで評価した。このモデルについての一般的な参照のためには、Mizumuraら(1995)を参照されたし。
Claims (32)
- κ−PVIIA−結合部位に結合する化合物の有効量を、それを必要とする対象哺乳動物または器官に投与することを必要とする対象の哺乳動物の器官を阻止し、保護し、および/または維持する方法。
- 該化合物がκ−PVIIA−関連コノトキシンである請求項1記載の方法。
- 該κ−PVIIA−関連コノトキシンがκ−PVIIA、E6.2,P6.1、P6.3、その同族体、そのアナログおよびその誘導体よりなる群から選択される請求項2記載の方法。
- 該器官が対象の体内で無傷であるか、あるいは摘出されたものである請求項1、2または3記載の方法。
- 該器官が循環器系器官、呼吸器系器官、泌尿器系器官、消化器系器官、生殖系器官、内分泌系器官、神経系器官、または体細胞よりなる群から選択される請求項1、2または3記載の方法。
- 該循環器系器官が心臓である請求項5記載の方法。
- 心臓切開手術、心停止法、血管形成術、弁手術、移植、狭心症または心血管病の間に、心血管介入の前、間または後に心臓損傷を低下させ、または正常な血流、栄養物および/または酸素が欠乏した心臓の部分を保護するように、心臓が阻止され、保護されまたは維持される請求項6記載の方法。
- 該器官が、循環器系器官、呼吸器系器官、泌尿器系器官、消化器系器官、生殖系器官、内分泌系器官、神経系器官、または体細胞よりなる群から選択される請求項4記載の方法。
- 該循環器系器官が心臓である請求項8記載の方法。
- 心臓切開手術、心停止法、血管形成術、弁手術、移植、狭心症または心血管病の間に、心血管介入の前、間または後に心臓損傷を低下させ、または正常な血流、栄養物および/または酸素が欠乏した心臓の部分を保護するように、心臓が阻止され、保護されまたは維持される請求項9記載の方法。
- アデノシン受容体アゴニストが該対象に投与される請求項1ないし10いずれか1記載の方法。
- アデノシン受容体アゴニストがCPA、NECA、CGC−21680、AB−MECA、AMP579、qAPNEA、CHA、ENBA、R−PIA、DPMA、CGS−21680、ATA146e、CCPA、CI−IB−MECA、IB−MECAよりなる群から選択される請求項11記載の方法。
- 局所麻酔剤が該対象に投与される請求項1ないし12いずれか1記載の方法。
- 該局所麻酔剤がメキシリチン(mexilitine)、ジフェニルヒダントイン、プリロカイン、プロカイン、ミピビカイン(mipivicaine)、ブピビカイン(bupivicaine)、リドカイン、クラス1B抗−不整脈剤よりなる群から選択される請求項13記載の方法。
- 該クラス1B抗−不整脈剤がリグノカインである請求項14記載の方法。
- カリウムチャネルオープナーまたはアゴニストが該対象に投与される請求項1ないし15いずれか1記載の方法。
- カリウムチャネルオープナーまたはアゴニストがクロマカイン(cromakalin)、ピナシジル(pinancidil)、ニコランジル(nicorandil)、MS−1619,ジアゾキシドおよびミノキシジルよりなる群から選択される請求項16記載の方法。
- 止血剤も対象に投与される請求項1ないし17いずれか1記載の方法。
- 該止血剤が血餅破壊剤、血栓溶解剤、抗凝固剤、抗血小板凝集剤およびその組合せよりなる群から選択される請求項18記載の方法。
- 該血餅破壊剤がストレプトキナーゼ、ウロキナーゼおよびACTIVASEよりなる群から選択される請求項19記載の方法。
- 該血栓溶解剤が、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、アルテプラーゼ(alteplase)、レテプラーゼ(reteplase)およびテネクテプラーゼ(tenecteplase)よりなる群から選択される請求項19記載の方法。
- 該抗凝固剤がヘパリン、エノキサパリンおよびダルテパリンよりなる群から選択される請求項19記載の方法。
- 該抗−血小板凝集剤がアスピリン、クロピドグレル(clopidogrel)、アビキシマブ(abciximab)、エピティフィバチド(eptifibatide)およびティロフィバン(tirofiban)よりなる群から選択される請求項19記載の方法。
- AVブロッカーも対象に投与される請求項1ないし12いずれか1記載の方法。
- 該AVブロッカーがベラパミルである請求項24記載の方法。
- 各剤または剤の組合せが経口、直腸、大脳室内、鞘内、硬膜外、静脈内、筋肉内、皮下、鼻孔内、経皮、経粘膜、舌下、灌漑、徐放ポンプまたは注入よりなる群から選択される経路によって投与される請求項1ないし25いずれか1記載の方法。
- 該経路が静脈内であって、各剤または剤の組合せが連続的にまたは間欠的に投与される請求項26記載の方法。
- 各剤または剤の組合せが剤の到達に先立ってドナーの血液と混合され、ただし、該ドナーの血液は対象の血液と適合するものとする請求項27記載の方法。
- κ−PVIIA−関連コノトキシンと同一の機能性部位における、または部分的に同一の機能性部位におけるその作用、および該コノトキシンとしての同様の機能的応答を誘導するその能力につき、薬物候補をスクリーニングすることを特徴とする、器官の阻止、保護または維持剤として用いる薬物候補を同定する方法。
- 候補薬物剤によるその受容体または他の複合体からの標識されたκ−PVIIA−関連コノトキシンの置き換えを用いて、適当な候補薬物を同定する請求項29記載の方法。
- 治療活性を特定するためのテスト化合物の生物学的アッセイを行い、κ−PVIIA−関連コノトキシンの生物学的アッセイから得られた結果と比較する請求項29記載の方法。
- κ−PVIIA−関連コノトキシンの受容体に対する小分子結合親和性を測定し、κ−PVIIA−関連コノトキシンのその受容体への結合親和性と比較する請求項29記載の方法。
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