JP2005531297A

JP2005531297A - タバコ由来シトクロムｐ４５０遺伝子のクローニング

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Publication number: JP2005531297A
Application number: JP2003576572A
Authority: JP
Inventors: ドンメイシュー
Original assignee: ユーエススモークレスタバコカンパニー
Priority date: 2002-03-12
Filing date: 2003-03-12
Publication date: 2005-10-20
Also published as: EP1572911A4; MXPA04008785A; WO2003078577A8; AU2003220165A8; CN101166824A; WO2003078577A9; EP1572911A2; AP2004003122A0; BR0308351A; JP2010131027A; WO2003078577A2; KR20040091124A; AU2003220165A1; CA2477452A1

Abstract

本発明は、タバコ中のＰ４５０酵素およびＰ４５０酵素をコードする核酸配列、ならびに植物表現型を改変するためにそれらの酵素および核酸配列の使用する方法に関する。

Description

本発明は、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）植物中のシトクロムＰ４５０酵素（以後Ｐ４５０およびＰ４５０酵素と称する）をコードする核酸配列、およびこの核酸配列を使用して植物の表現型を改変する方法に関する。

シトクロムＰ４５０は、内在性基質および生体異物基質の酸化的、過酸化的、および還元的代謝を含む多様な範囲の化学的に異なる基質の酵素反応を触媒する。植物では、Ｐ４５０は、フェニルプロパノイド、アルカロイド、テルペノイド、脂質、シアン発生性配糖体、グルコシノラートのような、植物生成物の合成を含む生化学的経路に関与する（非特許文献１）。Ｐ４５０ヘム−チオラート蛋白質としても知られているシトクロムＰ４５０は、通常、Ｐ４５０−含有モノオキシゲナーゼ系と称される多成分電子移動連鎖において最終酸化酵素として作用する。触媒される特異的反応には、脱メチル化、水酸化、エポキシ化、Ｎ−酸化、スルホオキシデーション；Ｎ−、Ｓ−、およびＯ−脱アルキル化、脱硫酸化、脱アミノ化、ならびにアゾ、ニトロ、およびＮ−オキシド群の還元が含まれる。

タバコ植物のＰ４５０酵素の多様な役割は、フェニルプロパノイド、アルカロイド、テルペノイド、脂質、シアン発生性配糖体、グルコシノラート、および他の化学的存在物の親物質（ｈｏｓｔ）のような様々な植物の代謝産物を生じさせることに関与してきた。近年、一部のＰ４５０酵素が、植物中で植物の代謝産物組成に影響を及ぼしうることが明らかになりつつある。例えば、品種改良により選択した脂肪酸のプロファイルを改変することによってある種の植物の香味および芳香を改善することが長い間望まれてきた。しかし、こうした葉の成分のレベルの制御に関与する機構については、ほとんど明らかになっていない。脂肪酸の改変に関連するＰ４５０酵素の下方制御によって、より好ましい葉表現型特性を提供する所望の脂肪酸の蓄積を促進することができる。植物成分におけるＰ４５０酵素の機能および幅広いその役割は依然として発見されつつある。例えば、特定のクラスのＰ４５０酵素が、脂肪酸の、果物および野菜の「青葉の」香りの主因である揮発性Ｃ６−およびＣ９−のアルデヒドおよびアルコールへの分解を触媒することが判明した。他の新規な標的Ｐ４５０のレベルを変え、タバコ葉中の脂質の組成および関連分解代謝産物を修飾することにより葉成分の特性を強化することができる。葉中のいくつかのこうした成分は、葉の品質特性の成熟を刺激する老化による影響を受ける。さらに、Ｐ４５０酵素が、植物−病原体相互作用および耐病性に関与する脂肪酸の改変に機能的役割を果たすことが諸報告に示されてきた。

例えば、Ｐ４５０酵素がアルカロイド生合成に関与することが示唆されてきた。ノルニコチンは、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｃｕｍ）中に見出される少量のアルカロイドである。Ｎ位置でのＰ４５０媒介ニコチン脱メチル化、それに続くアシル化反応およびニトロソ化、それにより一連のＮ−アシルノニコチン（ａｃｙｌｎｏｎｉｃｏｔｉｎｅ）およびＮ−ニトロソノルニコチンを生成することよってノルニコチンが産生されることが前提とされてきた。推定上のＰ４５０脱メチル化酵素により触媒されるＮ−脱メチル化は、タバコ中のノルニコチン生合成の主要な供給源であると考えられている。酵素はミクロソームであると考えられているが、今までのところ、ニコチン脱メチル化酵素は首尾よく単離されていないだけでなく、関与する遺伝子も単離されていない。

さらに、Ｐ４５０酵素活性は遺伝的に制御され、環境因子にも強く影響を受けるとの仮説が立てられているが証明されていない。例えば、タバコ中のニコチンの脱メチル化は、植物が成熟期に達するときにかなり増加すると考えられる。さらに、脱メチル化酵素遺伝子は転移因子を含み、これは、存在するとＲＮＡの翻訳を阻害し得ると考えられている。

Ｐ４５０酵素形の多様性、その異なる構造および機能は、この出願に含まれる発明以前のタバコＰ４５０酵素についての研究を非常に困難なものにしてきた。さらに、Ｐ４５０酵素のクローニングは、少なくとも部分的に阻止されてきた。というのは、これらの膜局在化蛋白質は通常低量で存在し、精製するにはしばしば不安定であるからである。

米国特許第４，９４５，０５０号明細書米国特許第５，１４１，１３１号明細書米国特許第５，１７７，０１０号明細書米国特許第５，１０４，３１０号明細書欧州特許出願第０１３１６２４Ｂ１号明細書欧州特許出願公開第１２０５１６号明細書欧州特許第１５９４１８Ｂ１号明細書欧州特許出願公開第１２０５１６号明細書欧州特許第１５９４１８Ｂ１号明細書欧州特許出願公開第１７６，１１２号明細書米国特許第５，１４９，６４５号明細書米国特許第５，４６９，９７６号明細書米国特許第５，４６４，７６３号明細書米国特許第４，９４０，８３８号明細書米国特許第４，６９３，９７６号明細書欧州特許出願公開第１１６７１８号明細書欧州特許出願公開第２９０７９９号明細書欧州特許出願公開第第３２０５００号明細書欧州特許出願公開第６０４６６２号明細書欧州特許出願公開第６２７７５２号明細書欧州特許出願公開第０２６７１５９号明細書欧州特許出願公開第０２９２４３５号明細書米国特許第５，２３１，０１９号明細書米国特許第５，４６３，１７４号明細書米国特許第４，７６２，７８５号明細書米国特許第５，００４，８６３号明細書米国特許第５，１５９，１３５号明細書米国特許第５，３０２，５２３号明細書米国特許第５，４６４，７６５号明細書国際公開第８７／０６６１４号パンフレット第５，４７２，８６９号明細書第５，３８４，２５３号明細書国際公開第９２０９６９６号パンフレット国際公開第９３２１３３５号パンフレット米国特許第５，５８３，０２１号明細書欧州特許出願公開８８８１０３０９．０号明細書 Chappel, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 198, 49: 311-343 Singleton et al., (1994), Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, second edition, John Wiley and Sons (New York) Caruthers, Methodology of DNA and RNA Sequencing, (1983), Weissman (ed.), Praeger Publishers, New York Chapter 1) Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981) Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970) Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444 (1988) Darnell et al. (1990), Molecular Cell Biology, Second Edition Scientific American Books, W. H. Freeman and Company New York for an explanation of codon degeneracy and the genetic code VIGS, Baulcombe, Current Opinions in Plant Biology, 1999, 2: 109-113頁 Smith et al., Nature, 2000, 407: 319-320 Fire et al., Nature, 1998, 391: 306-311 Waterhouse et al., PNAS, 1998, 95: 13959-13964 Stalberg et al., Plant Molecular Biology, 1993, 23: 671-683 Baulcombe, Current Opinions in Plant Biology, 1999, 2: 109-113 Brigneti et al., EMBO Journal, 1998, 17 (22): 6739-6746 K. Weising et al., Ann. Rev. Genetics, 22, 421 (1988)

したがって、植物中のＰ４５０酵素、およびこれらのＰ４５０酵素に関連する核酸配列を同定することが必要とされている。特に、タバコではほんの数種のシトクロムタバコＰ４５０蛋白質しか報告されていない。本明細書に記載の本発明は、その配列同一性に基づき数群のＰ４５０種に対応する、実質的な数のシトクロムＰ４５０断片の発見を伴っている。

本発明は、植物のＰ４５０酵素を対象とする。さらに、本発明は、タバコ由来の植物Ｐ４５０酵素を対象とする。さらに、本発明は、その発現がエチレンおよび／または植物の老化によって誘発される、植物中のＰ４５０酵素も対象とする。さらに、本発明は、植物中で例えば酸素添加酵素や脱メチル化酵素などの酵素活性を有する核酸配列、およびこれらの酵素の発現を低減またはサイレンスするためにこれらの配列を使用することを対象とする。さらに、本発明は、低レベルのノルニコチンを示す植物よりも高いレベルのノルニコチンを含む植物中に見出されるＰ４５０酵素に関する。

一態様では、本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５および１４７で示される核酸配列を対象とする。

関連する第２の態様では、核酸配列で７５％を超える同一性を含むこれらの断片を、シトクロムＰ４５０のモチーフＧＸＲＸＣＸ（Ｇ／Ａ）に続く第１の核酸から終止コドンまでに対応する領域中の同一性に依って群分けした。その代表的な核酸群およびそれぞれの種を表Ｉに示す。

第３の態様では、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６および１４８で示されるアミノ酸配列を対象とする。

関連する第４の態様では、アミノ酸配列で７１％を超える同一性を含むこれらの断片を、シトクロムＰ４５０のモチーフＧＸＲＸＣＸ（Ｇ／Ａ）に続く第１のアミノ酸から終止コドンまでに対応する領域中の互いの同一性に依って群分けした。その代表的なアミノ酸群およびそれぞれの種を表ＩＩに示す。

本発明の第５の態様は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５および１４７で示される核酸配列の使用である。

関連する第６の態様では、タバコ植物中のＰ４５０酵素の低減または除去を、ＲＮＡウイルス系を使用して一過的に実現することができる。得られた形質転換植物または感染植物を、当業者に通常利用可能な技術を使用して内在性のＰ４５０ＲＮＡ転写物、Ｐ４５０を発現したペプチド、および植物の代謝産物の濃度を分析すること（これらに限定されない）を含めて、表現型の変化について評価する。

重要な第７の態様では、本発明は、Ｐ４５０酵素活性レベルを改変したトランスジェニックタバコ系統の生成も対象とする。本発明に従って、これらのトランスジェニック系統は、ある種の酵素の発現を低減またはサイレンシングし、それによってタバコ内で表現型に影響を与えるのに効果的な核酸配列を含む。このような核酸配列には、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５および１４７が含まれる。

本発明の非常に重要な第８の態様では、下方制御能で本発明の核酸を含む植物栽培品種は、対照植物に比べて、改変された代謝産物プロファイルを有するであろう。

第９の態様では、本発明は、教示されている核酸配列に実質的に核酸同一性を有する遺伝子を含む植物、より好ましくはタバコのスクリーニングを対象とする。本発明の使用は、完全なまたは実質的な同一性を有する核酸配列を含む植物の同定および選択に有利なはずであり、その場合、そのような植物は従来品種またはトランスジェニック品種の品種改良プログラム、突然変異誘発プログラム、または天然に存在する多様な植物集団の一部である。実質的な核酸同一性について植物をスクリーニングすることは、核酸のハイブリッド形成およびＰＣＲ分析（そらに限定されない）を含めた核酸検出プロトコールと併せて、核酸プローブを使用して植物核酸材料を評価することによって実現することができる。核酸プローブは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５および１４７に対応する、教示されている核酸配列またはその断片から構成されうる。

第１０の態様では、本発明は、教示されている核酸配列に対応するアミノ酸に実質的な同一性を有する植物遺伝子、より好ましくはタバコの遺伝子の同定を対象とする。ｃＤＮＡおよびそれらのｃＤＮＡゲノム群、ならびにゲノムクローンを含む植物遺伝子、好ましくはタバコ由来のもの、の同定は、核酸ハイブリッド形成およびＰＣＲ分析（これらに限定されない）を含めた核酸検出プロトコールと併せて、核酸プローブを使用し植物ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって実現することができる。核酸プローブは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５および１４７に対応する核酸配列またはその断片から構成されてよい。

別の第１１の態様では、ペプチドを発現するｃＤＮＡ発現ライブラリーは、教示されているアミノ酸配列の一部またはすべてを対象とする抗体を使用してスクリーニングすることができる。このようなアミノ酸配列には配列番号２、４、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６および１４８が含まれる。

定義
定義されていない場合は、本明細書で使用される技術的および科学的用語はすべて、本発明が属する当技術分野の通常の技術者によって一般に理解されている意味と同じ意味を持つ。当業者に本発明で使用する多くの用語の一般的な辞書も提供されている（非特許文献２）。本明細書で言及した特許および刊行物はすべて、参照により本明細書に組み込む。本発明の目的のために以下の用語を以下のように定義する。

「酵素活性」は、脱メチル化、水酸化、エポキシ化、Ｎ酸化、スルホオキシデーション；Ｎ−、Ｓ−、およびＯ−脱アルキル化、脱硫酸化、脱アミノ化、およびアゾ、ニトロ、およびＮ−オキシド基の還元を含むものとする。「核酸」の語は、１本鎖または２本鎖形の、あるいはセンスまたはアンチセンスのデオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーをさし、特に限定しない場合は、天然に存在するヌクレオチドに類似する方式で核酸にハイブリッド形成される、既知の天然ヌクレオチド類似体を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列はその相補的配列を含む。「動作可能に結合」、「動作可能な組合せで」かつ「動作可能な順序で」の語は、核酸発現制御配列（プロモータ、シグナル配列、または転写因子結合部位のアレイなど）と第２核酸配列間の機能的な結合であって、発現制御配列が第２の配列に対応する核酸の転写および／または翻訳に作用するものをさす。

「組換え」の語は、細胞に関して使用さる場合、細胞が異種核酸を複製し、前記核酸を発現し、あるいは異種核酸によってコードされているペプチド、異種ペプチド、または蛋白質を発現することを示唆する。組換え細胞は、天然（非組換え）形細胞では見いだされないセンス形またはアンチセンス形で遺伝子または遺伝子断片を発現することができる。組換え細胞は、天然形細胞で見出される遺伝子を発現することもできるが、その際遺伝子は人工的手段によって修飾され、細胞中に再導入される。

「構造遺伝子」は、蛋白質、ポリペプチド、またはその部分をコードするＤＮＡセグメントを含み、かつ転写を開始させる５’配列を除いた遺伝子部分である。構造遺伝子は、代わりに翻訳不能な生成物をコードすることができる。構造遺伝子は、細胞中に通常見出される遺伝子、または細胞中には通常見出されない遺伝子であってよく、あるいは遺伝子を導入した細胞位置でよく、その場合それを「異種遺伝子」と称する。異種遺伝子は、細菌ゲノムまたはエピソーム、真核生物、核またはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、あるいは化学合成ＤＮＡを含む当技術分野で公知の任意の供給源から、全体的にまたは部分的に、誘導することができる。構造遺伝子には、生物活性またはその特徴、発現生成物の生体活性またはその化学構造、発現の割合、あるいは発現制御方式に作用できるはずの１つまたは複数の改変を含んでよい。そのような改変には、１つまたは複数のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失および置換が含まれるが、これらに限定されない。構造遺伝子は、連続したコード配列を構成することができ、または適したスプライス連結部によって結合された１つまたは複数のイントロン含むことができる。構造遺伝子は、アンチセンス方向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）中を含め、翻訳可能または翻訳不能であってよい。構造遺伝子は、複数の供給源および複数の遺伝子配列（天然に存在するまたは合成したものであり、合成とは化学合成ＤＮＡをさす）に由来する断片の複合体でよい。

「由来する」とは、（化学的および／または生物学的）供給源から取る、得る、受ける、たどる、複製する、または伝わることを意味するために使用される。誘導体は、本来の供給源の（置換、付加、挿入、欠失、抽出、単離、突然変異、および複製を含むがそれだけには限らない）化学的または生物学的操作によって生成することができる。

ＤＮＡ配列に関連して「化学合成」は、ヌクレオチド成分の一部をｉｎｖｉｔｒｏで組み立てたことをを意味する。手作業によるＤＮＡの化学合成は、首尾よく確立した手順（非特許文献３）を使用して実現することができ、自動化学合成は、いくつかの市販の機器の１つを使用して実施することができる。

比較のための最適な配列のアライメントは、局所的相同性アルゴリズム（非特許文献４）、相同性配列アルゴリズム（非特許文献５）、類似法のための調査（非特許文献６）、これらのアルゴリズムのコンピュータ化［ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（米国ウィスコンシン州マディソンサイエンス通り５７５所在）社製米国ウィスコンシン州Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ］の実施、または精査によって実施することができる。

ＮＣＢＩＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年）は、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、米国メリーランド州ベセスダ）を含むいくつかの供給源、および配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘと併せて使用するためにインターネット上から入手することができる。ＮＣＢＩには、htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/からアクセスすることができる。このプログラムを使用する配列同一性の決定の仕方についての説明は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast help.htmlから利用することができる。

アミノ酸配列に適用され、本明細書で使用される「実質的なアミノ酸同一性」または「実質的なアミノ酸配列同一性」の語は、ポリペプチドの特徴を示し、その際、翻訳されたペプチドのシトクロムＰ４５０のモチーフＧＸＲＸＣＸ（Ｇ／Ａ）に続く第１のアミノ酸から終止コドンまでに対応する領域にわたる参照グループと比較して、ペプチドが、少なくとも７０パーセントの配列同一性を有する配列を含み、アミノ酸配列同一性は８０パーセントが好ましく、アミノ酸配列同一性は９０パーセントがより好ましく、配列同一性は少なくとも９９から１００パーセントが最も好ましい。

核酸配列に適用され、本明細書で使用される「実質的な核酸同一性」または「実質的な核酸配列同一性」の語は、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、その際、翻訳されたペプチドのシトクロムＰ４５０のモチーフＧＸＲＸＣＸ（Ｇ／Ａ）に続く第１の核酸から終止コドンに対応する領域にわたる参照グループと比べて、ポリヌクレオチドは、少なくとも７５パーセントの配列同一性を有する配列を含み、アミノ酸配列同一性は８１パーセントが好ましく、配列同一性は少なくとも９１から９９パーセントがより好ましく、配列同一性は少なくとも９９から１００パーセントが最も好ましい。

ヌクレオチド配列が実質的に同一であるという別の兆候は、ストリンジェントな条件下で互いに２個の分子がハイブリッド形成するかどうかである。ストリンジェントな条件とは配列に依存し、異なる状況では違いが生じる。一般に、ストリンジェントな条件は、特異的配列の所定のイオン強度およびｐＨでの融点温度（Ｔｍ）よりも約５℃から約２０℃低い、通常約１０℃から約１５℃低いように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が、適合するプローブとハイブリッド形成する（所定のイオン強度およびｐＨ下での）温度である。通常、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７で塩濃度が約０．０２モル、温度が少なくとも約６０℃であるような条件であろう。例えば、標準的なサザンハイブリッド形成法の手順では、ストリンジェントな条件は、４２℃での６倍のＳＳＣによる最初の洗浄と、それに続く少なくとも約５５℃、通常約６０℃、しばしば約６５℃の温度での０．２倍のＳＳＣによる１回または複数回の追加の洗浄を含む。

ヌクレオチド配列がコードするポリペプチドおよび／または蛋白質が実質的に同一である場合、本発明の目的のためのヌクレオチド配列も実質的に同一である。すなわち、１つの核酸配列が第２の核酸配列と本質的に同じポリペプチドをコードする場合、たとえこれらが遺伝暗号により許される縮退の結果としてストリンジェントな条件下でハイブリッドを形成しなくてもこの２つの核酸配列は実質的に同一である（非特許文献７参照）。蛋白質の純度または均一性は、蛋白質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動とそれに続く染色による可視化のような当技術分野で周知のいくつかの手段によって示すことができる。ある種の目的のためには高分解能が求められる可能性がありＨＰＬＣまたは同様の精製手段を使用することができる。

本明細書では、「ベクター」の語は、ＤＮＡセグメントを細胞中に送り込む核酸分子に関して使用される。ベクターは、ＤＮＡを複製する働きをすることができ、独立して宿主細胞中で再生することができる。「ビヒクル」の語を「ベクター」と互いに取り替えて使用する場合もある。本明細書では、「発現ベクター」の語は、所望のコード配列、および動作可能に結合されたコード配列を特定の宿主生物中で発現するのに必要な適当な核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子をさす。通常、原核生物中での発現に必要な核酸配列は、プロモータ、オペレータ（任意選択）、およびリボソーム結合部位を、しばしば他の配列と共に含む。真核生物細胞は、プロモータ、エンハンサ、ならびに停止シグナルおよびポリアデニル化シグナルを使用することが知られている。

根を持った完全な遺伝子操作植物を再生する目的で、例えば、ｉｎｖｉｖｏ接種などのどんな技術によって、または周知のｉｎｖｉｔｒｏ組織培養技術のいずれかによって核酸を植物細胞中に挿入して完全な植物に再生できる形質転換植物細胞を産生することができる。すなわち、例えば、植物細胞中への挿入は病原性または非病原性アグロバクテリウムチュメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）でｉｎｖｉｔｒｏ接種することによって行うことができる。他のこのような組織培養技術も利用することができる。

「植物組織」は、根、新芽、葉、花粉、種子、腫瘍組織、および、培地中の様々な形の細胞、例えば単細胞、プロトプラスト、胚およびカルス組織を含む（但し、これらに限定されない）分化および未分化植物組織を含む。植物組織は、インプランタ（ｉｎｐｌａｎｔａ）、あるいは器官、組織、または細胞培養物中に存在することができる。

本明細書で使用する「植物細胞」は、植物体中の植物細胞、培地中の植物細胞、プロトプラストを含む。一般に、「ｃＤＮＡ」または「相補ＤＮＡ」は、ＲＮＡ分子に相補的なヌクレオチド配列を有する１本鎖ＤＮＡ分子をさす。ｃＤＮＡは、ＲＮＡ鋳型に対して酵素、すなわち逆転写酵素の作用によって形成される。

核酸配列を得るための戦略
本発明に従って、転化体（ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ）および非転化体（ｎｏｎ−ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ）タバコ系統のタバコ組織からＲＮＡを抽出した。次いで、抽出ＲＮＡを使用してｃＤＮＡを作り出した。次いで、２つの戦略を使用して本発明の核酸配列を生成した。

第１の戦略では、ポリＡが豊富なＲＮＡを植物組織から抽出し、逆転写ＰＣＲによってｃＤＮＡを製造した。次いで、１本鎖ｃＤＮＡを使用して、デジェネレートプライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｐｒｉｍｅｒ）にオリゴｄ（Ｔ）リバースプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ）を加えたものを使用しＰ４５０特異的ＰＣＲ集団を作り出した。プライマーの設計は、Ｐ４５０の高度に保存的なモチーフに基づいた。特異的デジェネレートプライマーの例を図１に記載する。適当なサイズの挿入物を含むプラスミド由来の配列断片をさらに分析した。通常、これらのサイズの挿入物は、どのプライマーを使用したかに応じて約３００から約８００ヌクレオチドの範囲にあった。

第２の戦略では、最初にｃＤＮＡライブラリーを構築した。プラスミド中のｃＤＮＡを使用して、プラスミド上のデジェネレートプライマーにＴ７プライマーを加えたものをリバースプライマーとして使用し、ｐ４５０特異的ＰＣＲ集団を作り出した。第１の戦略と同様に、適当なサイズの挿入物を含むプラスミド由来の配列断片をさらに分析した。

高レベルのノルニコチン（転化体）、および検出不可能なレベルのノルニコチンを有する植物系統を産生することが知られているタバコ植物系統を出発物質として使用することができる。

次いで、葉を植物から取って、エチレンで処理して本明細書で定義したＰ４５０酵素活性を活性化することができる。全ＲＮＡを当技術分野で知られている技術を使用し抽出する。次いで、図１に記載したオリゴｄ（Ｔ）プライマーと共にＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用してｃＤＮＡ断片を生成することができる。次いで、ｃＤＮＡライブラリーを構築することができ、本明細書の実施例により完全に記載した。

Ｐ４５０型酵素の保存領域をデジェネレートプライマー（図７５）の鋳型として使用することができる。デジェネレートプライマーを使用し、Ｐ４５０特異的バンドをＰＣＲによって増幅することができる。Ｐ４５０様酵素を示すバンドは、ＤＮＡ配列決定によって同定することができる。適当な候補を同定するためにＢＬＡＳＴサーチ、アライメント、または他のツールを使用してＰＣＲ断片を特徴付けることができる。

同定された断片からの配列情報を使用してＰＣＲプライマーを開発することができる。これらのプライマーを使用して、エチレン処理された転化体および非転化体植物組織のＲＮＡ’ｓから定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施する。転化体系統に由来する適当なサイズのＤＮＡバンド（３００〜８００ｂｐ）、または転化体系統中でより高い発現を示すより高密度のバンドのみを、さらなる特等付けに使用した。得られたクローンすべてについて差分発現（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を検査するために大規模サザンリバース分析を行った。本発明のこの態様では、クローン化挿入物すべてをスクリーニングするために、異なる組織由来の標識全ｃＤＮＡ’ｓをプローブとして使用し、こうした大規模リバースサザン検定を実施してクローン化ＤＮＡ断片とハイブリッド形成させることができる。

非放射性ノーザンブロッティング検定も使用してクローンＰ４５０断片を特徴付けた。

ウイルス誘発遺伝子サイレンシング技術を使用することによって上記のように同定された核酸配列を検査することができる（非特許文献８）。

本発明の別の態様では、ＲＮＡ干渉技術（ＲＮＡｉ）を使用して、さらに本発明のタバコ植物中のシトクロムＰ４５０酵素活性を特徴付ける。この技術を説明する以下の参照文献を参照により本明細書に組み込む。（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４）。ＲＮＡｉ技術、アンチセンス技術、または記載した様々な他の方法を使用して植物を形質転換することができる。

外来遺伝物質を植物細胞に導入し、導入遺伝子を安定的に維持し発現する植物を得るためのいくつかの技術がある。このような技術には、ミクロ粒子上にコートされた遺伝物質を直接細胞中に加速させることが含まれる（Ｃｏｒｎｅｌｌの特許文献１、ＤｏｗＥｌａｎｃｏの特許文献２）。アグロバクテリウム技術を使用し、植物を形質転換することができる（トレド大学の特許文献３、ＴｅｘａｓＡ＆Ｍの特許文献４、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔの特許文献５、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔの特許文献６、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔの特許文献７、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔの特許文献８、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔの特許文献９、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔの特許文献１０、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔの特許文献１１、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔの特許文献１２、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔの特許文献１３、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔの特許文献１４、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔの特許文献１５、ＭａｘＰｌａｎｃｋの特許文献１６、ＭａｘＰｌａｎｃｋの特許文献１７、ＭａｘＰｌａｎｃｋの特許文献１８、ＪａｐａｎＮｉｃｏｔｉａｎａの特許文献１９、ＪａｐａｎＮｉｃｏｔｉａｎａの特許文献２０、ＣｉｂａＧｅｉｇｙの特許文献２１、ＣｉｂａＧｅｉｇｙの特許文献２２、ＣｉｂａＧｅｉｇｙの特許文献２３、Ｃａｌｇｅｎｅの特許文献２４、Ｃａｌｇｅｎｅの特許文献２５、Ａｇｒａｃｅｔｕｓの特許文献２６、Ａｇｒａｃｅｔｕｓの特許文献２７参照）。他の形質転換技術にはウイスカ（ｗｈｉｓｋｅｒｓ）の技術が含まれる（Ｚｅｎｅｃａの特許文献２８、Ｚｅｎｅｃａの特許文献２９参照）。植物を形質転換するには電気穿孔法技術も使用されてきた（ＢｏｙｃｅＴｈｏｍｐｓｏｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅの特許文献３０、Ｄｅｋａｌｂの特許文献３１、Ｄｅｋａｌｂの特許文献３２、ＰＧＳの特許文献３３、ＰＧＳの特許文献３４参照）。これらの形質転換特許および刊行物すべてを参照により組み込む。植物を形質転換するための多数の技術に加えて、外来遺伝子と接触する組織の型も変化してよい。このような組織には、胚発生組織、カルス組織Ｉ型およびＩＩ型、胚軸、分裂組織などが含まれるがそれだけには限らないはずである。植物組織はほぼすべて、当技術分野内の適する技術を使用し脱分化中に形質転換することができる。

植物に導入される外来遺伝物質には選択マーカーを含めてよい。特定のマーカーについての選択は当業者の裁量によるが、選択マーカーとして機能し得るはずの本明細書に掲載していない他の遺伝子に加えて、以下の選択マーカーのいずれかを使用することができる。このような選択マーカーには、それだけには限らないが、抗生物質のカナマイシン、ネオマイシン、およびＧ４１８耐性をコードするトランスポゾンＴｎ５のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＡｐｈＩＩ）、並びに、グリホサート；ハイグロマイシン；メトトレキサート；フォスフィノスリシン（ｂａｒ）；クロロスルフロンのようなイミダゾリノン、スルホニルウレアおよびトリアゾロピリミジン除草剤；ブロモキシニル、ダラポンなどの耐性または耐容性（ｔｒｅｌａｎｃｅ）をコードする遺伝子が含まれる。

選択マーカーの他にレポーター遺伝子の使用も所望され得る。時には選択マーカーを用いずにレポーター遺伝子を使用してもよい。通常、レポーター遺伝子は受容生物体または組織中で存在または発現されない遺伝子である。通常、レポーター遺伝子はいくつかの表現型の違いまたは酵素特性を提供する蛋白質をコードする。そのような遺伝子の例が非特許文献１５に提供されている。これを参照により本明細書に組み込む。好ましいレポーター遺伝子には、それだけには限らないが、グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子およびＧＦＰ遺伝子が含まれる。

一度植物組織に導入されると当技術分野で周知のどんな手段によっても構造遺伝子の発現を検定することができ、転写されたｍＲＮＡ、合成された蛋白質、または生じる遺伝子サイレンシングの量として発現を測定するとができる（特許文献３５参照。これを参照により本明細書に組み込む）。植物組織のｉｎｖｉｔｒｏ培養やいくつかの場合では完全な植物への再生についての技術が知られている（特許文献３６参照）。導入された発現複合体を商業的に有用な栽培品種に変形させる手順は当業者に周知である。

一度、所望のレベルのＰ４５０酵素を発現する植物細胞が得られたならば、当技術分野で公知の方法や技術を使用し、そこから植物組織および完全な植物を再生することができる。次いで、再生植物を従来の手段によって増殖し、導入遺伝子を従来の植物品種改良技術によって他の株や栽培品種に移すことができる。

以下の実施例は、本発明を実施する方法を例示し、そして、以下の例は、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲の例示であるが、本発明の範囲を限定するものではない理解されるべきである。

（実施例１）
植物組織の発生およびエチレン処理
植物の生長
植物を鉢に播種し温室で４週間栽培した。４週経った実生を個々の鉢に移植し、温室で２カ月間生長させた。生長中、植物には１日に２度、１５０ｐｐｍのＮＰＫ肥料を含む水を与えた。育った青葉を植物から取って、以下に記載するエチレン処理を行った。

細胞系７８３７９
ケンタッキー大学が公表したバーレー系統のタバコ系統７８３７９を植物材料源として使用した。タバコ育成の当技術分野における標準として１００株の植物を栽培し、移植し、識別番号（１〜１００）を付した。薦められた通りに施肥および農場管理を行った。

１００株の植物の４分の３が、ニコチンの２０から１００％をノルニコチンへ転化させた。１００株の植物の４分の１が、ニコチンの５％未満をノルニコチンへ転化させた。植物番号８７は最小（２％）の転化であったが、植物番号２１は１００％の転化であった．３％未満を転化する植物を非転化体として分類した。植物番号８７および植物番号２１の自家受粉種子、および交配種子（２１×８７および８７×２１）を作成して遺伝子や表現型の差異を研究した。自家受粉体２１由来の植物は転化体であり、８７由来自家受粉体の９９％は非転化体であった。８７由来植物のその他の１％は、低転化率（５〜１５％）を示した。相互交配由来植物はすべて転化体であった。

細胞系４４０７
バーレー系統のタバコ系統４４０７を植物材料源として使用した。均一で代表的な植物（１００株）を選択しタグを付けた。１００株の植物のうち９７株は非転化体であり３株は転化体であった。植物番号５６は最小量の転化率（１．２％）であり植物番号５８は最高レベルの転化率（９６％）であった。これら２つの植物を用いて自家受粉種子および交配種子を作成した。

自家受粉５８由来の植物を、転化体：非転化体比約３：１で分離した。５８−３３および５８−２５をそれぞれ、ホモ接合性転化体植物系統および非転化体植物系統として同定した。５８−３３の転化が安定していることは、その次世代の子孫を分析することによって裏付けられた。

エチレン処理手順
２、３カ月間温室で生長させた植物から青葉を取って０．３％エチレン溶液［Ｐｒｅｐ銘柄のエテホン（ローヌプーランク社）］を噴霧した。噴霧した各葉を加湿器を備えた発酵棚（ｃｕｒｉｎｇｒａｃｋ）中に吊るしプラスチックで被覆した。処理中、試料葉にエチレン溶液を定期的に噴霧した。エチレン処理から約２４〜４８時間後、ＲＮＡを抽出するために葉を採取した。代謝組成分析用に別の副試料を採取して葉の代謝産物濃度、および様々なアルカロイドなどのより特異的な注目成分の濃度を測定した。

一例として、アルカロイド分析は以下のように実施できる。試料（０．１ｇ）を、２ＮのＮａＯＨ０．５ｍｌ、ならびに内部標準としてキノリンおよびメチルｔ−ブチルエーテルを含む抽出溶液５ｍｌと共に１５０ｒｐｍで振盪した。ＦＩＤ検出器を備えたＨＰ６８９０ＧＣで試料を分析した。検出器および注入器には温度２５０℃を利用した。５％フェノールおよび９５％メチルシリコンで架橋した溶融シリカからなるＨＰカラム（３０ｍ−０．３２ｎｍ−１・ｍ）を温度勾配毎分１０℃で１１０〜１８５℃にて使用した。キャリアガスとしてヘリウムを使用し１００℃、流量１．７ｃｍ^３ｍｉｎ^−１、分割比４０：１、注入量２・１でカラムを運転した。

（実施例２）
ＲＮＡの単離
ＲＮＡ抽出のために温室栽培で２カ月経った植物から得た中くらいの葉を記載の通りエチレンで処理した。０時間目および２４〜４８時間目の試料をＲＮＡ抽出用に使用した。場合によっては、老化過程下の葉試料を、頭状花を除去した後１０日目の植物から取った。これらの試料も抽出に使用した。ＲｎｅａｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉＫｉｔ（キアゲン、米国カリフォルニア州バレンシア）を使用し、メーカーのプロトコールに従って全ＲＮＡを単離した。

ＤＥＰＣ処理乳鉢および乳棒を使用し、液体窒素下で組織試料を磨り潰して微粉末にした。約１００ｍｇの磨り潰した組織を１．５ｍｌの滅菌エッペンドルフチューブに移した。全試料が採取されるまでこのサンプル試験管を液体窒素中に置いた。次いで、キットに装備されている緩衝液ＲＬＴ４５０μｌを（β−メルカプトエタノールの添加と共に）個々の試験管に加えた。試料を勢いよくボルテックスし、５６℃で３分間培養した。次いで、溶解物を２ｍｌの採取用試験管に嵌めたＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムに塗布し最大速度で２分間遠心分離した。通過液を採取し、０．５容量のエタノールを透明な溶解物に加えた。試料を十分混合し、２ｍｌの採取用試験管に置かれたＲｎｅａｓｙミニスピンカラムに移した。試料を１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。次に、ピペットで緩衝液ＲＷ１７００μｌをＲｎｅａｓｙカラム上に量り取り、１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。ピペットで緩衝液ＲＰＥを新たな採取用試験管内のＲｎｅａｓｙカラム上に取り、１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。再度、緩衝液ＲＰＥをＲｎｅａｓｙスピンカラムに加え、最速で２分間遠心分離してメンブレンを乾燥した。残存していたエタノールも除去するために分離型採取用試験管中にメンブレンを置き最速でさらに１分間遠心分離した。Ｒｎｅａｓｙカラムを１．５ｍｌの新たな採取用試験管中に移し、Ｒｎａｓｅ不含水４０μｌをピペットで直接Ｒｎｅａｓｙメンブレン上に取った。この最終溶離用試験管を１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。全ＲＮＡの質および量を変性ホルムアルデヒドゲルおよび分光光度計によって分析した。

ＯｌｉｇｏｔｅｘポリＡＲＮＡ精製キット（キアゲン）を使用し、メーカーのプロトコールに従ってポリ（Ａ）ＲＮＡを単離した。最大容量２５０μｌ中約２００μｇの全ＲＮＡを使用した。２５０μｌの容量の緩衝液ＯＢＢ、およびＯｌｉｇｏｔｅｘ懸濁液１５μｌを全ＲＮＡ２５０μｌに加えた。内容物をピペッティングによって完全に混合し、加熱したブロック上７０℃で３分間培養した。次いで、室温で約２０分試料を置いた。ｏｌｉｇｏｔｅｘ：ｍＲＮＡ複合体を最速２分間の遠心分離によってペレット化した。上清５０μｌを残しすべてをマイクロ遠心管から除去した。さらに試料をＯＢＢ緩衝液によって処理した。ボルテックスによってｏｌｉｇｏｔｅｘ：ｍＲＮＡペレットを４００μｌの緩衝液ＯＷ２に再懸濁した。新たな試験管中に置いた小スピンカラム上にこの混合物を移し、最速で１分間遠心分離した。スピンカラムを新たな試験管に移し、４００μｌの追加の緩衝液ＯＷ２をカラムに加えた。次いで、試験管を最速で１分間遠心分離した。スピンカラムを最終の１．５ｍｌマイクロ遠心管に移した。温めた（７０℃）緩衝液ＯＥＢ６０μｌで試料を溶出させた。ポリＡ生成物を変性ホルムアルデヒドゲルおよび分光分析によって分析した。

（実施例３）
逆転写ＰＣＲ
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素を使用し、メーカーのプロトコール（インビトロジェン、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）に従って第１鎖ｃＤＮＡを生成した。ポリＡに富むＲＮＡ／オリゴｄＴプライマー混合物は、全ＲＮＡ５μｇ未満、１０ｍＭのｄＮＴＰ混合物１μｌ、オリゴｄ（Ｔ）_{１２〜１８}（０．５μｇ／μｌ）１μｌ、および１０μｌまでのＤＥＰＣ処理水から構成された。各試料を６５℃で５分間培養し、次いで少なくとも１分間氷上に置いた。反応混合物は、以下の成分のそれぞれを次の順序で加えることによって調製した：１０ＸＲＴ緩衝液２μｌ、２５ｍＭのＭｇＣｌ_２４μｌ、０．１ＭのＤＴＴ２μｌ、およびＲＮａｓｅＯＵＴ組換え型ＲＮａｓｅ阻害剤１μｌ。反応混合物９μｌをピペットで取って各ＲＮＡ／プライマー混合物に加え、穏やかに攪拌した。これを４２℃で２分間培養し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＲＴ１μｌを各試験管に加えた。試験管を４２℃で５０分間を培養した。反応を７０℃で１５分間停止させ、氷上で冷却した。遠心分離によって試料を採取し、ＲＮａｓｅＨ１μｌを各試験管に加え、３７℃で２０分間培養した。２００ピコモルのフォーワードプライマー（ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ）（図７５、配列番号１４９〜１５６と同様のデジェネレートプライマー）および１００ピコモルのリバースプライマー（１８ｎｔオリゴｄ（Ｔ）とそれに続く１個の任意の塩基の混合物）を用いて２回目のＰＣＲを実施した。

反応条件は９４℃で２分間であり、次いで９４℃で１分間、６０℃で２分間、７２℃で３分間で４０サイクルのＰＣＲを実施し、さらに７２℃で１０分間延長した。

増幅試料１０マイクロリットルを１％アガロースゲルを使用し、電気泳動によって分析した。正確なサイズの断片をアガロースゲルから精製した。

（実施例４）
ＰＣＲ断片集団の生成
実施例３のＰＣＲ断片をメーカー使用説明書に従ってｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（プロメガ、米国ウィスコンシン州マディソン）中に結合した。結合生成物をＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換し、青／白選択するためにＬＢ培地プレート上に播種した。コロニーを選択し、ＬＢ培地１．２ｍｌを入れた９６穴プレート中で終夜３７℃で増殖した。選択したコロニーすべてについて凍結ストックを生成した。ＷｉｚａｒｄＳＶミニプレップキット（プロメガ）と共にベックマン社製Ｂｉｏｍｅｃｋ２０００ミニプレップロボティックスを使用し、プレートからプラスミドＤＮＡを精製した。プラスミドＤＮＡを水１００μｌで溶出し、９６穴プレート中に保存した。プラスミドをＥｃｏＲ１によって消化し、１％アガロースゲルを使用し分析してＤＮＡ量および挿入物のサイズを確認した。ＣＥＱ２０００シーケンサ（ベックマン、米国カリフォルニア州Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）を使用し４００〜６００ｂｐの挿入物を含むプラスミドを配列決定した。ＢＬＡＳＴサーチによってＧｅｎＢａｎｋデータベースを用いて配列をアライメントした。Ｐ４５０関連断片を同定し、さらに分析した。

（実施例５）
ｃＤＮＡライブラリーの構築
以下のようにエチレン処理した葉から全ＲＮＡを調製することによりｃＤＮＡライブラリーを構築した。最初に、改変した酸フェノールおよびクロロホルム抽出プロトコールを使用しタバコ系統５８−３３のエチレン処理した葉から全ＲＮＡを抽出した。プロトコールは、磨り潰し続いて抽出緩衝液（１００ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．５、２００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）５ｍｌ中でボルテックスし、これにフェノール（ｐＨ５．５）５ｍｌおよびクロロホルム５ｍｌを加えた組織１グラムを使用するように手直しした。抽出試料を遠心分離し上清を保存した。上清が透明に見えるまでこの抽出ステップをさらに２、３回繰り返した。クロロホルム約５ｍｌを加えて微量のフェノールを除去した。３倍容量のＥＴＯＨおよび１／１０容量の３ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）を加え、−２０℃で１時間保存することによって合わせた上清画分からＲＮＡを沈殿させた。ＲＮＡをＣｏｒｅｘガラス容器に移した後、４℃、９，０００ＲＰＭで４５分間遠心分離した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、４℃、９，０００ＲＰＭで５分間遠心した。ペレットを乾燥した後、ペレット化したＲＮＡをＲＮａｓｅ不含水０．５ｍｌに溶解した。ペレット化したＲＮＡをＲＮａｓｅ不含水０．５ｍｌに溶解した。全ＲＮＡの質および量を、それぞれ、変性ホルムアルデヒドゲルおよび分光光度計によって分析した。

オリゴ（ｄＴ）セルロースプロトコール（インビトロジェン）およびマイクロ遠心機スピンカラム（インビトロジェン）を以下のプロトコールによって使用し、得られた全ＲＮＡをポリＡ＋ＲＮＡについて単離した。約２０ｍｇの全ＲＮＡを２度精製して高品質ポリＡ＋ＲＮＡを得た。変性ホルムアルデヒドゲル、続いて既知の全長遺伝子のＲＴ−ＰＣＲを実施することによってポリＡ＋ＲＮＡ生成物を分析し、ｍＲＮＡが高品質であることを確実にした。さらに、エチレン処理した非転化体の葉、ゼロ時間エチレン処理した転化体の葉、およびエチレン処理した転化体の葉に由来するポリＡ＋ＲＮＡについて、プローブとしてｐ４５０全長を使用しノーザン分析を実施した。試料ごとにポリＡ＋ＲＮＡ１．８μｇを使用し、方法はメーカー使用説明書に提供されているプロトコール（ＫＰＬ社製ＲＮＡ検出ノーザンブロッティングキット、米国メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）に基づいた。移動緩衝液として２０倍ＳＳＣを使用し、ＲＮＡを含むゲルを終夜移動させた。

次に、ｃＤＮＡ合成キット、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット、およびＺＡＰ−ｃＤＮＡＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩゴールドクローニングキット（ストラタジーン、米国カリフォルニア州ＬａＪｏｌｌａ）を使用し、ポリＡ＋ＲＮＡを鋳型として使用してｃＤＮＡライブラリーを作成した。この方法は、メーカーのプロトコールの指示通りに従うことを必要とする。ポリＡ＋ＲＮＡ約８μｇを使用してｃＤＮＡライブラリーを構築した。一次ライブラリーの分析によって約２．５×１０^６〜ｌ×１０^７ｐｆｕであることが明らかになった。ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを使用し、相補性検定によりライブラリーの品質背景試験（ｑｕａｌｉｔｙｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｔｅｓｔ）を完了し、そこでは組換えプラークが背景反応の１００倍を超えて発現した。

ランダムＰＣＲによるライブラリーの一層定量的な分析によって、挿入ｃＤＮＡの平均サイズは約１．２ｋｂであることが示された。方法は、以下のように２段階ＰＣＲ法を使用した。第１段階では、Ｐ４５０断片から得られた予備配列情報に基づいてリバースプライマーを設計した。設計したリバースプライマーおよびＴ３（フォーワード）プライマーを使用してｃＤＮＡライブラリーから対応遺伝子を増幅した。ＰＣＲ反応産物をアガロース電気泳動にかけ、対応する高分子量バンドを切り取り、精製し、クローン化し、配列決定した。第２段階では、リバースプライマー（Ｐ４５０の３’ＵＴＲから設計）と共に、フォーワードプライマーとしてＰ４５０の５’ＵＴＲまたは開始コード領域から設計した新規なプライマーを続くＰＣＲに使用してＰ４５０クローン全長を得た。

リバースプライマーを除いて実施例３に記載したように、構築したｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅によってＰ４５０断片を生成した。ｃＤＮＡ挿入物の下流のプラスミドに位置するＴ７プライマー（図７５を参照のこと）をリバースプライマーとして使用した。実施例４に記載したようにＰＣＲ断片を単離し、クローン化し、配列決定した。

前述の発明の詳細な説明を考察するとき当業者には本発明の実施において多数の修正および変形が思い浮かぶと予想される。したがって、そのような修正および変形は添付の請求項の範囲内に含まれるものとする。

（実施例６）
クローン化断片の特徴付け−逆（ｒｅｖｅｒｓｅ）サザンブロッティング分析
上記実施例で同定したＰ４５０クローンすべてについて非放射性大規模逆サザンブロッティング検定を実施して差分発現を検出する。異なるＰ４５０クラスタのうちでは発現レベルは非常に異なることが観察された。さらに、高発現のものについてリアルタイム検出を行った。

非放射性サザンブロッティング手順を以下のように行った。

１）実施例２に記載したようにキアゲンＲｎａｅａｓｙキットを使用し、エチレン処理した転化体の葉（５８−３３）および非転化体の葉（５８−２５）から全ＲＮＡを抽出した。

２）上記ステップで生成したポリＡ富化ＲＮＡ由来の１本鎖ｃＤＮＡをビオチンテール標識することによってプローブを生成した。プライマーとしてビオチン標識（ｂｉｏｔｉｎａｌｙｔｅｄ）オリゴ（ｄＴ）（プロメガ）を使用したことを除き、実施例３に記載した通り転化体および非転化体の全ＲＮＡ（インビトロジェン）のＲＴ−ＰＣＲによってこの標識１本鎖ｃＤＮＡを生成した。これらをプローブとして使用してクローン化ＤＮＡとハイブリッド形成した。

３）プラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ１で消化しアガロースゲル上を走らせた。同時に、ゲルを乾燥し、２枚のナイロンメンブレン（ＢｉｏｄｙｎｅＢ）に移した。１枚のメンブレンを転化体プローブと、他方を非転化体プローブとハイブリッド形成した。ハイブリッド形成の前にメンブレンをＵＶ架橋した（自動架橋セッティング、２５４ｎｍ、ストラタジーン、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ）。

あるいは、プライマーとしてｐ−ＧＥＭプラスミドの両腕Ｔ３およびＳＰ６に位置する配列を使用し、挿入物を各プラスミドからＰＣＲ増幅した。実施の準備が整った９６穴アガロースゲル上で走らせることによってＰＣＲ生成物を分析した。確認した挿入物を２枚のナイロンメンブレン上にブロット（ｄｏｔｔｅｄ）した。１枚のメンブレンを転化体プローブと、他方を非転化体プローブとハイブリッド形成した。

４）メーカー使用説明書（ＥｎｚｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｃ、米国ニューヨーク州Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ）であるが、厳格な洗浄をするように修正したものに従ってメンブレンをハイブリッド形成し、洗浄した。メンブレンをハイブリッド形成緩衝液（２倍ＳＳＣ緩衝化ホルムアミド、洗浄剤、およびハイブリッド形成促進剤を含む）により４２℃で３０分間予備ハイブリッド形成し、変性プローブ１０μｌにより４２℃で終夜ハイブリッド形成した。次いで、１倍のハイブリッド形成洗浄用緩衝液によってメンブレンの洗浄を室温で１０分を１度、および６８℃で１５分を４度行った。メンブレンは検出の準備が整った。

５）メーカー検出手順（ＥｎｚｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．）に記載されている通り、アルカリフォスファターゼ標識とそれに続くＮＢＴ／ＢＣＩＰ比色検出によって、洗浄したメンブレンを検出した。メンブレンを１倍のブロッキング液により室温で１時間ブロックし、１倍の検出試薬により１０分間３度洗浄し、１倍の予備発色反応緩衝液により５分間２度洗浄し、次いでドットが出現するまで発色液中で３０〜４５分間ブロットを発色させた。試薬はすべて業者から得た（ＥｎｚｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｃ）。

場合によっては、非転化体系統（５８−２５）および転化体系統（５８−３３）由来の全ＲＮＡのものについて、Ｐ４５０断片に特異的プライマーを使用し、１段階ＲＴ−ＰＣＲ（ギブコキット、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を実施した。比較ＲＴ−ＰＣＲを以下のように行った。

１）実施例２に記載したようにエチレン処理した転化体の葉（５８−３３）および非転化体の葉（５８−２５）から全ＲＮＡを抽出した。

２）実施例２に記載したようにキアゲンキットを使用し全ＲＮＡからポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出した。

３）クローン化Ｐ４５０に特異的プライマーを使用しメーカー手順（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）に従って１段階ＲＴ−ＰＣＲを行った。ポリＡに富むＲＮＡを２倍の反応混合物２５μｌ、１０μＭのセンスプライマーｌμｌ、１０μＭのアンチセンスプライマー１μ１、ＲＴ／白金ｔａｑＭｉｘ１μｌ、および水５０μｌまでと共に反応混合物に加えた。反応条件は、５０℃で２０分間、次いで９４℃で２分間であり、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７０℃で１分間で４０サイクルのＰＣＲを実施し、さらに７２℃で１０分間延長した。増幅試料１０マイクロリットルを１％アガロースゲルを使用し、電気泳動によって分析した。

（実施例７）
クローン化断片の特徴付け−ノーザンブロット分析
サザンブロット分析の代わりに、一部のメンブレンをノーザンブロッティング検定の例で記載したようにハイブリッド形成し検出した。以下のように、ノーザンハイブリッド形成を使用し、タバコ中に差分的に発現したｍＲＮＡを検出した。

第１ステップ、プローブの調製：クローン化ｐ４５０ＤＮＡ断片からプローブを調製するためにランダムプライミング法（ランダムプライマーＤＮＡビオチン標識キット、ＫＰＬ）を使用した。次の成分：ＤＮＡ鋳型（使用前に水浴中で５〜１０分間煮沸し、氷上で冷却）０．５μｇ、１倍のランダムプライマー液、１倍のｄＮＴＰ混合物、クレノー１０単位を混合し、水を加えて反応物を５０μｌにした。混合物を３７℃で１から４時間培養した。反応を２００ｍＭのＥＤＴＡ２μｌで停止させた。使用前に９５℃で５分間培養することによってプローブを変性した。

第２ステップ、試料調製：エチレン処理および未処理の新鮮な葉、ならびに老化した葉からＲＮＡ試料を調製した。場合によってはポリＡ富化ＲＮＡを使用した。全ＲＮＡ約１５μｇまたはｍＲＮＡｌ．８μｇ（ＲＮＡおよびｍＲＮＡの抽出方法は実施例５に記載）をＤＥＰＣＨ_２Ｏ（５〜１０μｌ）と等容量にした。同容量のローディングバッファ（１倍のＭＯＰＳ、１８．５％ホルムアルデヒド、５０％ホルムアミド、４％フィコール４００、ブロモフェノール青）、および臭化エチジウム（０．５μｇ／μｌ）０．５μｌを加えた。試料を９０℃で５分間加熱し、氷上で冷却した。

第３ステップ、電気泳動によるＲＮＡの分離：ホルムアルデヒドゲル（１％アガロース、１倍のＭＯＰＳ、０．６Ｍホルムアルデヒド）上を１倍のＭＯＰ緩衝液（０．４Ｍのモルホリノプロパンスルホン酸、０．１Ｍの酢酸Ｎａ−３倍Ｈ_２Ｏ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２にＮａＯＨで調整）により試料を電気泳動させた。１０倍のＳＳＣ緩衝液（１．５ＭのＮａＣｌ、０．１５Ｍのクエン酸Ｎａ）中、キャピラリ法によりＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブレン（ナイロン、アマシャムファルマシアバイオテック）にＲＮＡｓを２４時間移した。ハイブリッド形成前にＲＮＡ試料付きメンブレンをＵＶ架橋した（自動架橋セッティング、２５４ｎｍ、ストラタジーン、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ）。

第４ステップ、ハイブリッド形成：予備ハイブリッド形成緩衝液（５倍のＳＳＣ、５０％ホルムアミド、５倍のデンハート液、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ熱変性させ切断（ｓｈｅａｒｅｄ）した非相同のＤＮＡ）５〜１０ｍｌにより４２℃で１〜４時間メンブレンを予備ハイブリッド形成した。古い予備ハイブリッド形成緩衝液を廃棄し新たな予備ハイブリッド形成緩衝液およびプローブを加えた。ハイブリッド形成を４２℃で終夜実施した。メンブレンを室温で２倍のＳＳＣにより１５分間洗浄、続いて６５℃で２倍のＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより２度洗浄、０．１倍のＳＳＣにより最後の洗浄、またはさらに６５℃で０．１倍のＳＤＳにより洗浄（任意）を行った。

第５ステップ、検出：ＡＰ−ストレプトアビジンおよびＣＤＰ−Ｓｔａｒを使用してハイブリッド形成シグナル（ＫＰＬ社製ＤＮＡ検出ノーザンブロッティングキット）を検出した。メンブレンを室温で３０分間１倍の検出ブロック液によりブロックした。ブロッキング緩衝液を廃棄し、ＡＰ−ＳＡ（１：１０，０００）を含む新たな１倍の検出ブロック液中室温で１時間メンブレンを培養した。メンブレンを１倍のホスファターゼ洗浄液で３度洗浄し、続いて１倍のホスファターゼ検定緩衝液で２度洗浄した。ＣＤＰ−Ｓｔａｒ化学発光基質を用いてシグナルを検出した。湿潤メンブレンをサラン（商標）ラップ下Ｘ線フィルムに暴露した。結果を分析し記録した。

本発明の主眼は、エチレン処理の結果誘発されるか、またはタバコ葉の品質および成分において重要な役割を果たすことができる新規な遺伝子の発見であった。下表に示すように、未誘発植物と比較してエチレン処理によってどの遺伝子が誘発されたかの決定にノーザンブロットは有用であった。興味深いことに、転化体および非転化体では断片のすべてが同様の作用を受けたのではない。当該シトクロムＰ４５０断片を部分的に配列決定してその構造関連性を決定した。この情報を使用し、続いて遺伝子クローン全長を単離配列決定した。断片遺伝子を含む全植物体において下方制御法を使用し、機能性分析を実施した。

（実施例８）
核酸の種類（ＩＤＥＮＴＩＴＹ）および単離された核酸断片の構造関連性
ノーザンブロット分析に関連して１００個超のクローン化ｐ４５０断片を配列決定してその構造関連性を決定した。使用した手法は、Ｐ４５０遺伝子のカルボキシ末端付近に位置する２個のＰ４５０共通モチーフのいずれかに基づくフォーワードプライマーを利用した。フォーワードプライマーは、図１に示すシトクロムＰ４５０モチーフＦＸＰＥＲＦまたはＧＲＲＸＣＰ（Ａ／Ｇ）に対応した。リバースプライマーにはｐＧＥＭプラスミドの両腕に位置するプラスミドＳＰ６またはＴ７のいずれか、またはポリＡテール（ｔａｉｌ）に由来する標準プライマーを使用した。使用したプロトコールを以下に記述する。

メーカーのプロトコール（ベックマンコールター）に従い分光光度法を使用して開始２本鎖ＤＮＡ濃度を推定した。鋳型を水で希釈して適当な濃度にし、９５℃で２分間の加熱によって変性し、続いて氷上に置いた。変性ＤＮＡ鋳型０．５から１０μｌ、１．６ピコモルのフォーワードプライマー２μｌ、ＱｕｉｃｋＳｔａｒｔＭａｓｔｅｒＭｉｘ８μｌを使用し配列決定反応を氷上で調製し、水で全容量を２０μｌにした。熱サイクリングプログラムは、３０サイクルの次のサイクルから構成された：９６℃で２０秒間、５０℃で２０秒間、および６０℃で４分間、続いて４℃で維持。

停止緩衝液（等量の３ＭのＮａＯＡｃ、１００ｍＭのＥＤＴＡおよび２０ｍｇ／ｍｌのグリコーゲン１μｌ）５μｌを加えることによって配列を停止させた。試料を９５％冷エタノール６０μｌで沈殿させ、６０００ｇで６分間遠心分離した。エタノールを廃棄した。ペレットを７０％冷エタノール２００μｌで２度洗浄した。ペレットが乾燥した後、ＳＬＳ液４０μｌを加え、ペレットを再懸濁した。鉱油層を上乗せした。次いで、さらに分析するためにＣＥＱ８０００自動シーケンサ上に試料を置いた。

核酸配列を確認するために、Ｐ４５０遺伝子のＦＸＰＥＲＦまたはＧＲＲＸＣＰ（Ａ／Ｇ）領域に対するフォーワードプライマーを使用して、または、プラスミドまたはポリＡテールのいずれかに対するリバースプライマーを使用して、両方向に核酸配列を再度配列決定した。配列決定はすべて、少なくとも２度両方向に実施した。

ＧＲＲＸＣＰ（Ａ／Ｇ）モチーフをコードする領域後の第１の核酸に対応するコード領域から終止コドンまでシトクロムＰ４５０断片の核酸配列を互いに比較した。Ｐ４５０蛋白質の中で遺伝子の多様性を示す指標としてこの領域を選択した。遺伝的に異なる多数のＰ４５０遺伝子、すなわち７０を超える遺伝子で、他の植物種の遺伝子との類似性が観察された。核酸配列を比較すると、遺伝子はその配列同一性に基づき異なる配列グループ中に配置される恐れがあることが見出された。Ｐ４５０のメンバーの最良の特異的グループ化は、７５％以上の核酸同一性を有する配列（表Ｉに示す）であると決定されることが見出された。同一性の割合を引き下げるとグループは著しく大きなった。８１％以上の核酸同一性を有する配列のグループ化が好ましく、９１％以上の核酸同一性のグループ化がより好ましい、９９％以上の核酸同一性を有する配列のグループ化が最も好ましいことが観察された。大部分のグループは、少なくとも２個のメンバーを含み、しばしば３個の以上のメンバーを含む。他は繰り返しては発見されず、採用した手法が、使用した組織中で低発現および高発現するｍＲＮＡの両方を単離できたことを示唆した。

７５％以上の核酸同一性に基づき、２つのシトクロムＰ４５０グループが、グループ内のものとは遺伝的に異なるタバコシトクロム遺伝子に以前は相同した核酸配列を含むことが判明した。グループ２３は、表Ｉで使用したパラメータ内で、それぞれ、ＣｚｅｒｎｉｃらおよびＲａｌｓｔｏｎらによる先のＧｅｎＢａｎｋ配列ＧＩ：１１７１５７９（ＣＡＡ６４６３５）およびＧＩ：１４４２３３２７（またはＡＡＫ６２３４６）に核酸同一性を示した。ＧＩ：１１７１５７９はグループ２３メンバーに対して９６．９％から９９．５％の範囲の核酸同一性を有するが、ＧＩ：１４４２３３２７はこのグループに対して９５．４％から９６．９％の範囲の同一性を有する。グループ３１メンバーの核酸同一性は、ＲａｌｓｔｏｎらによるＧｅｎＢａｎｋ報告済配列ＧＩ：１４４２３３１９（ＡＡＫ６２３４２）に対して７６．７％から９７．８％の範囲の同一性である。Ｒａｌｓｔｏｎら、Ｃｚｅｒｎｉｃら、Ｗａｎｇら、あるいはＬａＲｏｓａおよびＳｍｉｇｏｃｋｉによって報告されたタバコＰ４５０遺伝子に対して表１の他のＰ４５０同一性グループのどれも表１に使用したパラメータ同一性は含まなかった。

図７６に示すように、適当な核酸デジェネレートプローブ（ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｐｒｏｂｅ）を有するコンセンサス配列が、タバコ植物由来の各グループ別のメンバーを優先的に同定し単離するためのグループから派生する恐れがある。

（実施例９）
単離核酸断片の関連アミノ酸配列同一性
シトクロムＰ４５０断片用に実施例８から得た核酸配列のアミノ酸配列を推定した。推定領域は、ＧＸＲＸＣＰ（Ａ／Ｇ）配列モチーフ直後のアミノ酸からカルボキシ末端の末端、または終止コドンに対応した。断片の配列同一性を比較すると、特有のグループ化は、７０％以上のアミノ酸同一性を有する配列で観察された。好ましいグループ化は、８０％以上のアミノ酸同一性を有する配列で観察され、より好ましい９０％以上のアミノ酸同一性を有する配列で、最も好ましいグループ化は９９％以上のアミノ酸同一性を有する配列で観察された。グループ類および対応するグループメンバーのアミノ酸配列を図２に示す。いくつかの特有の核酸配列は、他の断片に対して完全なアミノ酸同一性を有することが判明し、したがって同一アミノ酸を有するメンバーは１つしかないことが報告された。

表ＩＩグループ１９のアミノ酸同一性は、その核酸配列に基づき３つの異なるグループに対応した。各グループメンバーのアミノ酸配列およびその同一性を図７７に示す。アミノ酸の差異には印を付けた。

遺伝子クローニングおよび植物を使用する機能研究のために各アミノ酸同一性グループの少なくとも１個のメンバーを選択した。さらに、エチレン処理、またはノーザンおよびサザン分析によって評価した他の生物学的差異によって差分的な作用を受けるグループメンバーも遺伝子クローニングおよび機能研究用に選択した。遺伝子クローニング、発現研究、および全植物体評価に役立てるために、配列同一性および差分配列についてペプチド特異的抗体を調製する。

（実施例１０）
ｃＤＮＡＰ４５０クローン全長のクローニング
以下のようにエチレン処理した葉から全ＲＮＡを調製することによりｃＤＮＡライブラリーを構築した。最初に、改変した酸フェノールおよびクロロホルム抽出プロトコールを使用しエチレン処理した葉から全ＲＮＡを抽出した。プロトコールを修正して、１グラムの組織に使用した。この組織は、粉砕され、続いて抽出緩衝液（１００ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．５、２００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）５ｍｌ中ボルテックスされ、これにフェノール（ｐＨ５．５）５ｍｌおよびクロロホルム５ｍｌが加えられた。抽出試料を遠心分離し上清を保存した。上清が透明に見えるまでこの抽出ステップをさらに２、３回繰り返した。クロロホルム約５ｍｌを加えて微量のフェノールを除去した。３倍容量のＥＴＯＨおよび１／１０容量の３ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）を加え、−２０℃で１時間保存することによって合わせた上清画分からＲＮＡを沈殿させた。ＲＮＡをＣｏｒｅｘガラス容器に移した後、４℃、９，０００ＲＰＭで４５分間遠心分離した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、４℃、９，０００ＲＰＭで５分間遠心した。ペレットを乾燥した後、ペレット化したＲＮＡをＲＮａｓｅ不含水０．５ｍｌに溶解した。ペレット化したＲＮＡをＲＮａｓｅ不含水０．５ｍｌに溶解した。全ＲＮＡの質および量を、それぞれ、変性ホルムアルデヒドゲルおよび分光光度計によって分析した。

オリゴ（ｄＴ）セルロースプロトコール（インビトロジェン）およびマイクロ遠心機スピンカラム（インビトロジェン）を使用し、以下のプロトコールによって得られた全ＲＮＡをポリＡ＋ＲＮＡに対して単離した。約２０ｍｇの全ＲＮＡを２度精製して高品質ポリＡ＋ＲＮＡを得た。変性ホルムアルデヒドゲル、続いて既知の全長遺伝子のＲＴ−ＰＣＲを実施することによってポリＡ＋ＲＮＡ生成物を分析し、ｍＲＮＡが高品質であることを確実にした。さらに、エチレン処理した非転化体の葉、ゼロ時間エチレン処理した転化体の葉、およびエチレン処理した転化体の葉から得たポリＡ＋ＲＮＡについてプローブとしてｐ４５０全長を使用してノーザン分析を実施した。試料ごとに１．８μｇのポリＡ＋ＲＮＡを使用し、方法はメーカー使用説明書に提供されているプロトコール（ＫＰＬ社製ＲＮＡ検出ノーザンブロッティングキット）に基づいた。移動緩衝液として２０倍ＳＳＣを使用し、ＲＮＡを含むゲルを終夜移動させた。

次に、ポリＡ＋ＲＮＡを鋳型として使用して、ｃＤＮＡ合成キット、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット、およびＺＡＰ−ｃＤＮＡＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩゴールドクローニングキット（ストラタジーン）を使用し、ｃＤＮＡライブラリーを作成した。この方法は、メーカーのプロトコールの指示通りに従うことを必要とする。ポリＡ＋ＲＮＡ約８μｇを使用してｃＤＮＡライブラリーを構築した。一次ライブラリーの分析によって約２．５×１０^６〜ｌ×１０^７ｐｆｕであることが明らかになった。ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを使用し相補性によりライブラリーの品質背景試験を完了し、そこでは組換えプラークが背景反応の１００倍を超えて発現した。

ランダムＰＣＲによるライブラリーより一層定量的な分析によって挿入ｃＤＮＡの平均サイズは約１．２ｋｂであることが示された。方法は、以下のように２段階ＰＣＲ法を使用した。第１段階では、Ｐ４５０断片から入手した予備配列情報に基づいてリバースプライマーを設計した。設計したリバースプライマーおよびＴ３（フォーワード）プライマーを使用してｃＤＮＡライブラリーから対応遺伝子を増幅した。ＰＣＲ反応産物をアガロース電気泳動にかけ、対応する高分子量バンドを切り取り、精製し、クローン化し、配列決定した。第２段階では、（Ｐ４５０の３’ＵＴＲから設計した）リバースプライマーと共に、フォーワードプライマーとしてＰ４５０の５’ＵＴＲまたは開始コード領域から設計した新規なプライマーを続くＰＣＲに使用してｐ４５０クローン全長を得た。

ＰＣＲ法によって構築したｃＤＮＡライブラリーからＰ４５０遺伝子全長を単離した。２段階のＰＣＲを使用して遺伝子全長をクローン化した。第１段階ＰＣＲでは、非特異的リバースプライマー（Ｔ３）および（Ｐ４５０の下流配列から生成した）特異的フォーワードプライマーを使用してｃＤＮＡライブラリーからＰ４５０の５’末端をクローン化した。次の段階のＰＣＲのフォーワードプライマーを設計するためにＰＣＲ断片を単離し、クローン化し、配列決定した。２つの特異的プライマーを使用して第２段階ＰＣＲで、ｐ４５０クローン全長をクローン化した。続いてクローンを配列決定した。

核酸配列番号１およびアミノ酸配列番号２を示す図である。核酸配列番号３およびアミノ酸配列番号４を示す図である。核酸配列番号５およびアミノ酸配列番号６を示す図である。核酸配列番号７およびアミノ酸配列番号８を示す図である。核酸配列番号９およびアミノ酸配列番号１０を示す図である。核酸配列番号１１およびアミノ酸配列番号１２を示す図である。核酸配列番号１３およびアミノ酸配列番号１４を示す図である。核酸配列番号１５およびアミノ酸配列番号１６を示す図である。核酸配列番号１７およびアミノ酸配列番号１８を示す図である。核酸配列番号１９およびアミノ酸配列番号２０を示す図である。核酸配列番号２１およびアミノ酸配列番号２２を示す図である。核酸配列番号２３およびアミノ酸配列番号２４を示す図である。核酸配列番号２５およびアミノ酸配列番号２６を示す図である。核酸配列番号２７およびアミノ酸配列番号２８を示す図である。核酸配列番号２９およびアミノ酸配列番号３０を示す図である。核酸配列番号３１およびアミノ酸配列番号３２を示す図である。核酸配列番号３３およびアミノ酸配列番号３４を示す図である。核酸配列番号３５およびアミノ酸配列番号３６を示す図である。核酸配列番号３７およびアミノ酸配列番号３８を示す図である。核酸配列番号３９およびアミノ酸配列番号４０を示す図である。核酸配列番号４１およびアミノ酸配列番号４２を示す図である。核酸配列番号４３およびアミノ酸配列番号４４を示す図である。核酸配列番号４５およびアミノ酸配列番号４６を示す図である。核酸配列番号４７およびアミノ酸配列番号４８を示す図である。核酸配列番号４９およびアミノ酸配列番号５０を示す図である。核酸配列番号５１およびアミノ酸配列番号５２を示す図である。核酸配列番号５３およびアミノ酸配列番号５４を示す図である。核酸配列番号５５およびアミノ酸配列番号５６を示す図である。核酸配列番号５７およびアミノ酸配列番号５８を示す図である。核酸配列番号５９およびアミノ酸配列番号６０を示す図である。核酸配列番号６１およびアミノ酸配列番号６２を示す図である。核酸配列番号６３およびアミノ酸配列番号６４を示す図である。核酸配列番号６５およびアミノ酸配列番号６６を示す図である。核酸配列番号６７およびアミノ酸配列番号６８を示す図である。核酸配列番号６９およびアミノ酸配列番号７０を示す図である。核酸配列番号７１およびアミノ酸配列番号７２を示す図である。核酸配列番号７３およびアミノ酸配列番号７４を示す図である。核酸配列番号７５およびアミノ酸配列番号７６を示す図である。核酸配列番号７７およびアミノ酸配列番号７８を示す図である。核酸配列番号７９およびアミノ酸配列番号８０を示す図である。核酸配列番号８１およびアミノ酸配列番号８２を示す図である。核酸配列番号８３およびアミノ酸配列番号８４を示す図である。核酸配列番号８５およびアミノ酸配列番号８６を示す図である。核酸配列番号８７およびアミノ酸配列番号８８を示す図である。核酸配列番号８９およびアミノ酸配列番号９０を示す図である。核酸配列番号９１およびアミノ酸配列番号９２を示す図である。核酸配列番号９３およびアミノ酸配列番号９４を示す図である。核酸配列番号９５およびアミノ酸配列番号９６を示す図である。核酸配列番号９７およびアミノ酸配列番号９８を示す図である。核酸配列番号９９およびアミノ酸配列番号１００を示す図である。核酸配列番号１０１およびアミノ酸配列番号１０２を示す図である。核酸配列番号１０３およびアミノ酸配列番号１０４を示す図である。核酸配列番号１０５およびアミノ酸配列番号１０６を示す図である。核酸配列番号１０７およびアミノ酸配列番号１０８を示す図である。核酸配列番号１０９およびアミノ酸配列番号１１０を示す図である。核酸配列番号１１１およびアミノ酸配列番号１１２を示す図である。核酸配列番号１１３およびアミノ酸配列番号１１４を示す図である。核酸配列番号１１５およびアミノ酸配列番号１１６を示す図である。核酸配列番号１１７およびアミノ酸配列番号１１８を示す図である。核酸配列番号１１９およびアミノ酸配列番号１２０を示す図である。核酸配列番号１２１およびアミノ酸配列番号１２２を示す図である。核酸配列番号１２３およびアミノ酸配列番号１２４を示す図である。核酸配列番号１２５およびアミノ酸配列番号１２６を示す図である。核酸配列番号１２７およびアミノ酸配列番号１２８を示す図である。核酸配列番号１２９およびアミノ酸配列番号１３０を示す図である。核酸配列番号１３１およびアミノ酸配列番号１３２を示す図である。核酸配列番号１３３およびアミノ酸配列番号１３４を示す図である。核酸配列番号１３５およびアミノ酸配列番号１３６を示す図である。核酸配列番号１３７およびアミノ酸配列番号１３８を示す図である。核酸配列番号１３９およびアミノ酸配列番号１４０を示す図である。核酸配列番号１４１およびアミノ酸配列番号１４２を示す図である。核酸配列番号１４３およびアミノ酸配列番号１４４を示す図である。核酸配列番号１４５およびアミノ酸配列番号１４６を示す図である。核酸配列番号１４７およびアミノ酸配列番号１４８を示す図である。ＰＣＲによるシトクロムＰ４５０ｃＤＮＡ断片のクローニングに使用される手順を示す図である。配列番号１４９〜１５６を示す。グループメンバーのアミノ酸同一性を示す図である。グループメンバーのアミノ酸同一性を示す図である。グループメンバーのアミノ酸同一性を示す図である。グループメンバーのアミノ酸同一性を示す図である。配列グループの比較を示す図である。配列グループの比較を示す図である。配列グループの比較を示す図である。配列グループの比較を示す図である。配列グループの比較を示す図である。配列グループの比較を示す図である。配列グループの比較を示す図である。配列グループの比較を示す図である。配列グループの比較を示す図である。配列グループの比較を示す図である。配列グループの比較を示す図である。配列グループの比較を示す図である。配列グループの比較を示す図である。配列グループの比較を示す図である。

Claims

単離核酸分子であって、前記核酸分子が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７または１４９からなる群から選択される核酸配列を含むことを特徴とする単離核酸分子。
前記核酸分子がシトクロムＰ４５０遺伝子の断片を含むことを特徴とする請求項１に記載の単離核酸分子。
前記核酸分子が請求項１に記載の核酸分子に少なくとも７５％の同一性を有することを特徴とする単離核酸分子。
前記核酸分子が請求項１に記載の核酸分子に少なくとも９１％の同一性を有することを特徴とする単離核酸分子。
前記核酸分子が請求項１に記載の核酸分子に少なくとも９９％の同一性を有することを特徴とする単離核酸分子。
トランスジェニック植物であって、前記トランスジェニック植物が請求項１、２、３、４、または５に記載の核酸分子を含むことを特徴とするもの。
前記植物がタバコ植物であることを特徴とする請求項６に記載のトランスジェニック植物。
トランスジェニック植物を生成する方法であって、前記方法が、
（ｉ）請求項１、２、３、４、または５に記載の核酸分子を前記植物中で機能するプロモータに動作可能に結合して植物形質転換ベクターを生成するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記植物形質転換ベクターで前記植物を形質転換するステップ、
（ｉｉｉ）前記形質転換ベクターで形質転換された植物細胞を選択するステップ、および
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の前記植物細胞から植物を再生するステップ
を含むことを特徴とする方法。
前記核酸分子は、アンチセンス方向であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
前記核酸分子は、センス方向であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
前記核酸は、ＲＮＡ干渉方向であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
前記核酸分子は、２本鎖ＲＮＡ分子として発現することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
前記２本鎖ＲＮＡ分子は、長さが約１５から２５ヌクレオチドであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
前記植物は、タバコ植物であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
核酸分子を含有する植物を選択する方法であって、前記植物が核酸配列の存在について分析され、前記核酸配列が配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５０、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９２、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５または１４７からなる群から選択されることを特徴とする方法。
前記植物がＤＮＡハイブリッド形成によって分析されることを特徴とする請求項１５に記載の植物を選択する方法。
前記植物がＰＣＲ検出法によって分析されることを特徴とする請求項１５に記載の植物を選択する方法。
前記ＤＮＡハイブリッド形成は核酸プローブを含み、前記核酸プローブは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５および１４７からなる群から選択されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
前記植物は、トランスジェニック植物であることを特徴とする請求項１５に記載の植物を選択する方法。
前記植物は、突然変異集団から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の植物を選択する方法。
前記植物は、品種改良集団から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の植物を選択する方法。