JP2005530513A - 植物成長調節物質の高効率スクリーニング方法 - Google Patents
植物成長調節物質の高効率スクリーニング方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005530513A JP2005530513A JP2004517364A JP2004517364A JP2005530513A JP 2005530513 A JP2005530513 A JP 2005530513A JP 2004517364 A JP2004517364 A JP 2004517364A JP 2004517364 A JP2004517364 A JP 2004517364A JP 2005530513 A JP2005530513 A JP 2005530513A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- photomixotrophic
- cell
- culture
- plant growth
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5097—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving plant cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2430/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving synthetic organic compounds as analytes
- G01N2430/20—Herbicides, e.g. DDT
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Botany (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
1)マイクロウェルプレートに緑色培養(photomixotrophic)細胞及び植物成長調節物質候補群を添加して培養する工程;
2)前記培養後、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロライドを処理する工程;
3)前記2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロライドを処理した後、マイクロウェル内の溶液を除去した後、エタノールを添加して反応させる工程;
4)前記工程3の反応溶液を新しいマイクロウェルプレートに移す工程;及び
5)前記工程4のマイクロウェルプレートを高効率スクリーニング判読機を利用して吸光度値を測定する工程を含む方法に関するものである。
本発明の方法は、多数の試料を簡便かつ迅速にスクリーニングでき、また、植物成長調節物質の生体内活性を測定できるため、植物成長抑制物質及び活性物質のスクリーニング方法として効果的に使用できる。
Description
本発明は、植物成長調節物質の高効率スクリーニング方法に関するものである。より詳細には、緑色培養(photomixotrophic)細胞に植物成長調節物質候補群を添加して培養した後、細胞の成長を同時に大規模に測定することを含む、植物成長調節物質の高効率スクリーニング方法に関するものである。
除草剤を含む植物成長調節剤(plant growth regulator, PGR)の開発のための薬剤の1次効能評価は、温室で若い植物体を対象にして、薬剤が植物体の成長に及ぼす影響を調査するのが一般的である。前記の方法は、植物体に対する直接的な成長阻害等を評価できる長所があるけれど、効能評価の初期工程で多量の薬剤が必要なだけではなく、効能評価をするには多くの時間と費用が求められる短所がある。
本発明は、緑色培養(photomixotrophic)細胞を利用した植物成長調節物質の高効率スクリーニング方法を提供する。
本発明は、緑色培養(photomixotrophic)細胞に植物成長調節物質候補群を添加して培養した後、細胞の成長を同時に大規模に測定することを含む、植物成長調節物質の高効率スクリーニング方法を提供する。すなわち本発明は、植物成長調節物質候補群を添加した光混合栄養(photomixotrophic)細胞を培養する工程、および細胞の成長を同時に大規模に測定する工程を含む、植物成長調節物質の高効率スクリーニング方法を提供する。
1)植物体に対する活性を反映できる適切な培養細胞の構築、
2)少ない量の試料でも多数の試料を同時にスクリーニングするための培養システムの構築、
3)活性を定量的に分析するための簡単な処理方法の構築及び
4)活性測定の自動評価システムの構築が求められる。
1)マイクロウェルプレートに緑色培養(photomixotrophic)細胞及び植物成長調節物質候補群を添加して培養する工程;
2)前記培養後に、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロライドを処理する工程;
3)前記、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロライドを処理した後、マイクロウェル内の溶液を除去した後、エタノールを添加して反応させる工程;
4)前記工程3の反応溶液を新しいマイクロウェルプレートに移す工程;及び
5)前記工程4のマイクロウェルプレートを高効率スクリーニング判読機を利用して吸光度値を測定する工程を含む。すなわち本方法は以下の工程を含む:
1)植物成長調節物質候補群を添加した光混合栄養(photomixotrophic)細胞をマイクロウェルプレート中で培養する工程;
2)2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロライドで処理する工程;
3)マイクロウェルから溶液を除去した後、エタノールを添加して反応させる工程;
4)前記工程3の反応液を新しいマイクロウェルプレートに移す工程;及び
5)前記工程4のマイクロウェルプレートの吸光度を高効率スクリーニングリーダーを利用して測定する工程。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
但し、下記の実施例は、本発明を例示しただけのものであり、本発明の内容が下記の実施例に内容により限定されるものではない。
ゼニゴケ(Marchantia polymorpha L.)緑色培養(photomixotrophic)細胞は、オオタ等が開発した細胞(Ohta等, Planta, 1977年、第136巻、229-232頁)を使用した。ビタミン類と多量元素(macronutrients)は、M51培地(Furner等, Plant Sci Lett, 1978年、第11巻、169-176頁)、酸加水分解カゼイン(casamino acid)、グルタミン(glutamine)と2,4-Dを含んだ微量元素(micronutrients)は、B5培地(Gamborg等, Exp Cell Res, 1968年、第50巻、151-158頁)を利用して培地を製造した(表1)。下記の表1の組成で製造した液体培地 50mlが入っている250mlフラスコにゼニゴケ懸濁培養細胞を細胞生重量0.5gで接種した後、25℃、約15μmol m-2・s-1の光条件で100rpmで懸濁培養した(図1)。細胞は、9日間隔で継代培養した。
本発明に使用するすべての化合物と抽出物は、アセトン、N,N-ジエチルホルムアミド(N,N-dimethylformamide; 以下「DMF」と略称する)等に溶解させた後、一定濃度になるように細胞培養開始と同時に各ウェルに1.5μlを無菌的に処理した。各化合物を溶解した有機溶媒の最終処理濃度は1%(1.5μl/150μl)とした。
ゼニゴケ緑色培養(photomixotrophic)細胞、タバコ緑色培養(photomixotrophic)細胞及びイネ従属培養細胞を使用して、下記の表2に記載したように、既存に使用されている作用機序が異なる除草剤13種を多様な濃度で処理した後、前記実施例2で行なったTTC分析方法を実施して前記細胞に及ぼす除草剤の成長阻害活性を調査した。イネは、未成熟胚から開発されたもの(Korean J Plant Tissue Culture, 1991年、第18巻、209-214頁)を使用した。
多様な植物体から分離して報告された天然化合物(表3)を使用して、ゼニゴケ緑色培養(photomixotrophic)細胞に対する生育阻害活性を調査するために、前記実施例2で行なった効能評価法にしたがって調査した後、水生植物のアオウキクサ(Lemna paucicostata)(韓国化学研究院)に対する生育阻害活性と比較した。ゼニゴケ緑色培養(photomixotrophic)細胞の場合は、化合物の最終処理濃度を1ppmにし、アオウキクサの場合は化合物の最終処理濃度を31ppmにした。
自生植物利用技術開発事業団内韓国植物抽出物銀行から分譲されたガマズミ(Viburnum dilatatum)果実を含む49種の植物から抽出したメタノール抽出物(最終濃度10ppm)を使用して、実施例2で行なった効能評価法にしたがいゼニゴケ緑色培養(photomixotrophic)細胞に及ぼす影響を調査した。
土壌から分離した放線菌(Actinomycetes spp.)培養液を対象に実施例2で行なった効能評価法にしたがって、ゼニゴケ緑色培養(photomixotrophic)細胞に対する生育阻害活性を測定した後、これらをアオウキクサ(Lemna paucicostata)と多様な雑草を利用したポットテスト(pot test)の結果と比較した。本発明で使用した放線菌は、大韓民国全域の土壌から分離した微生物を同定して放線菌であると一次的に同定された菌株を使用した。表6及び表7に記載したように任意に命名した。ここで滅菌培養液は、培養液自体を121℃で5時間滅菌(autoclave)したもので、最終濃度が1ppmになるように処理し、培養液のエチルアセテート(ethyl acetate, EtOAc)抽出物は、培養液1mlとエチルアセテート1mlを混合してよく撹拌した後、遠心分離して下層(水層)を除去して得られるエチルアセテート層を濃縮したものを10ppmになるよう処理した。アオウキクサに対する生育阻害活性テストは、滅菌していない微生物培養液を31ppmになるよう処理して、前記実施例4で実施したように行なった。また、温室で実施したポット実験をするための植物は、イチビ(Abutilon avicennaeVelvetleaf)、クサネム(Aeschynomene indica)、カモジグサ(Agropyron smithii)、ヒルガオ(Calystegia japonica)、メヒジバ(Digitaria sanguinalis)、イヌビエ(Echinochloa crus-galli)、コナギ(Monochoria vaginalis)、イネ(Oryzae sativa)、オオクサキビ(Panicum dichotomiflorum)、ウリカワ(Sagittaria pygmaea)、ホタルイ(Scirpus juncoides)、イヌホオズキ(Solanum nigrum)、モロコシ(Sorghum bicolor)、クローバ(Trifolium repens)、オナモミ(Xanthium strumarium)を試験用ポット(350cm2)に播種して常法にしたがい栽培して使用した。滅菌していない微生物培養液(最終処理濃度が40kg/ha濃度になるように調整した0.1%のTween20溶液)を手動噴霧器(hand sprayer)で前記に記載したすべての植物の茎葉に処理した後、温室で2週間生育させた後、処理14日後に現われる除草活性効能を形態学的、生理学的観察根拠により肉眼で調査して活性を6等級に分類するポットテストを行なった。即ち、10%以下の阻害活性は0、20〜30%の阻害活性は1、40〜50%の阻害活性は2、60〜70%の阻害活性は3、80〜90%の阻害活性は4、100%の完全阻害活性は5で示した。最少1個の草種に対する除草活性を根拠に定めた。測定した阻害活性値はすべての植物に対する阻害活性を平均で示した。
ゼニゴケの%活性=[1-(化合物処理のOD/対照区のOD)]×100で、
+値は細胞成長阻害活性を、-値は細胞成長促進活性を示す。
前記で詳しく見たように、葉緑体が分化された植物培養細胞をマイクロウェルプレートで合成化合物、天然化合物または天然抽出物等と共に一定期間培養した後、試薬等を添加して培養細胞の成長を高効率スクリーニング判読機等で測定する本発明のスクリーニング方法は、非常に少ない量の試料でも多数の試料を簡便かつ迅速に薬剤の効能を評価できる方法である。したがって、本発明の高効率スクリーニング方法を利用すると植物成長調節物質を短い時間に少ない費用でスクリーニングして、開発するのに有用に利用できる。
Claims (7)
- 緑色培養(photomixotrophic)細胞に植物成長調節物質候補群を添加して培養した後、細胞の成長を同時に大規模に測定することを含む植物成長調節物質の高効率スクリーニング方法。
- 前記緑色培養(photomixotrophic)細胞が、ゼニゴケ緑色培養(photomixotrophic)細胞またはタバコ緑色培養(photomixotrophic)細胞であることを特徴する、請求項1に記載の方法。
- 前記植物成長調節物質候補群が、合成化合物、天然物を含む純粋化合物、植物抽出物及び微生物培養液を含む抽出物または分画からなる群から選択されることを特徴する、請求項1に記載の方法。
- 前記培養が、マイクロウェルプレートで培養することを特徴する、請求項1に記載の方法。
- 細胞の成長を測定する際に、培養した細胞に2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロライド(2,3,5-triphenyltetrazolium chlorolide)を添加した後、吸光度値を測定することを特徴する、請求項1に記載の方法。
- 前記方法が、
1)マイクロウェルプレートに緑色培養(photomixotrophic)細胞及び植物成長調節物質候補群を添加して培養する工程;
2)前記培養後、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロライドを処理する工程;
3)前記2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロライドを処理した後、マイクロウェル内の溶液を除去した後、エタノールを添加して反応させる工程;
4)前記工程3の反応溶液を新しいマイクロウェルプレートに移す工程;及び
5)前記工程4のマイクロウェルプレートを高効率スクリーニング判読機を利用して吸光度値を測定する工程を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記工程3が、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロライドを4.5乃至5.5時間の間処理した後、マイクロウェル内の溶液を除去した後、95%エタノールを添加して60℃で1時間の間反応させることを特徴する、請求項6に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2002-0036512A KR100463714B1 (ko) | 2002-06-27 | 2002-06-27 | 식물생장조절물질의 고효율 스크리닝 방법 |
PCT/KR2003/001041 WO2004003225A1 (en) | 2002-06-27 | 2003-05-28 | Method for high throughput screening of plant growth regulator |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005530513A true JP2005530513A (ja) | 2005-10-13 |
Family
ID=29997395
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004517364A Pending JP2005530513A (ja) | 2002-06-27 | 2003-05-28 | 植物成長調節物質の高効率スクリーニング方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20050176584A1 (ja) |
JP (1) | JP2005530513A (ja) |
KR (1) | KR100463714B1 (ja) |
AU (1) | AU2003228117A1 (ja) |
WO (1) | WO2004003225A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009028011A (ja) * | 2007-07-30 | 2009-02-12 | Kao Corp | 細胞呼吸活性の測定方法及びそのキット、タンパク質生産性向上株のスクリーニング方法及びそのキット |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070255506A1 (en) * | 2006-04-26 | 2007-11-01 | Affymetrix, Inc. | System, Method, and Computer Product for Instrument Control and Management of Consumable Resources |
KR101136039B1 (ko) * | 2010-01-28 | 2012-04-18 | 인천대학교 산학협력단 | 좀개구리밥의 생장 면적 변화율 또는 형광 특성을 이용한 수질 독성 평가 방법 |
WO2012107451A2 (en) | 2011-02-08 | 2012-08-16 | Vib Vzw | Method to screen compounds influencing plant cell growth and production |
WO2014130357A1 (en) | 2013-02-19 | 2014-08-28 | Heliae Development, Llc | Bioreactor array and methods of combinatorial testing |
CN103808678A (zh) * | 2014-02-25 | 2014-05-21 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 一种测定细胞活力的方法、试剂盒及其应用 |
CN104062294A (zh) * | 2014-07-11 | 2014-09-24 | 青岛千士医疗科技有限公司 | 一种支气管/肺上皮细胞线粒体损伤的检测方法 |
WO2019050314A1 (ko) * | 2017-09-07 | 2019-03-14 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | 세포 배양을 위한 맞춤형 생장 인자 스크리닝 시스템 |
CA3156785A1 (en) * | 2019-11-04 | 2021-05-14 | Oxford University Innovation Limited | Identification and characterisation of herbicides and plant growth regulators |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
USH1919H (en) * | 1995-12-01 | 2000-11-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Agricultural product microscreen method and apparatus |
-
2002
- 2002-06-27 KR KR10-2002-0036512A patent/KR100463714B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-05-28 AU AU2003228117A patent/AU2003228117A1/en not_active Abandoned
- 2003-05-28 JP JP2004517364A patent/JP2005530513A/ja active Pending
- 2003-05-28 US US10/519,511 patent/US20050176584A1/en not_active Abandoned
- 2003-05-28 WO PCT/KR2003/001041 patent/WO2004003225A1/en active Application Filing
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009028011A (ja) * | 2007-07-30 | 2009-02-12 | Kao Corp | 細胞呼吸活性の測定方法及びそのキット、タンパク質生産性向上株のスクリーニング方法及びそのキット |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2004003225A1 (en) | 2004-01-08 |
KR20040001352A (ko) | 2004-01-07 |
US20050176584A1 (en) | 2005-08-11 |
KR100463714B1 (ko) | 2004-12-29 |
AU2003228117A1 (en) | 2004-01-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11197457B2 (en) | Designed complex endophyte compositions and methods for improved plant traits | |
dos Santos et al. | Inoculation with five diazotrophs alters nitrogen metabolism during the initial growth of sugarcane varieties with contrasting responses to added nitrogen | |
Kiełkowska et al. | Exogenously applied polyamines reduce reactive oxygen species, enhancing cell division and the shoot regeneration from Brassica oleracea L. var. capitata protoplasts | |
Niemenak et al. | Micropropagation of cocoyam (Xanthosoma sagittifolium L. Schott) in temporary immersion bioreactor | |
Díaz-González et al. | Mutualistic fungal endophyte Colletotrichum tofieldiae Ct0861 colonizes and increases growth and yield of maize and tomato plants | |
CN110100674A (zh) | 外源谷氨酸在缓解水稻镉胁迫和降低水稻植株镉含量中的应用 | |
Lőrincz et al. | Artificial tripartite symbiosis involving a green alga (Chlamydomonas), a bacterium (Azotobacter) and a fungus (Alternaria): morphological and physiological characterization | |
JP2005530513A (ja) | 植物成長調節物質の高効率スクリーニング方法 | |
Custódio et al. | Application of in vitro plant tissue culture techniques to halophyte species: A review | |
Zheng et al. | Regulative effect of imazethapyr on Arabidopsis thaliana growth and rhizosphere microbial community through multiple generations of culture | |
Yuorieva et al. | Plants, Cells, Algae, and Cyanobacteria In Vitro and Cryobank Collections at the Institute of Plant Physiology, Russian Academy of Sciences—A Platform for Research and Production Center | |
Manickavelu et al. | Organogenesis induction in rice callus by cyanobacterial extracellular product | |
Mistry et al. | Ethyl methane sulfonate and sodium azide-mediated chemical and X-ray-mediated physical mutagenesis positively regulate Peroxidase 1 gene activity and biosynthesis of antineoplastic vinblastine in Catharanthus roseus | |
CN112602717B (zh) | 一种防控稻瘟病菌的药物 | |
Martins et al. | Hybridization assays in strawberry tree toward the identification of plants displaying increased drought tolerance | |
Murch et al. | Genetic diversity in seed populations of Echinacea purpurea controls the capacity for regeneration, route of morphogenesis and phytochemical composition | |
Handa et al. | Use of plant cell cultures to study production and phytotoxicity of Alternaria solani toxin (s) | |
CN114938809A (zh) | 武夷菌素和ε-聚赖氨酸的复配组合物及杀菌方法和应用 | |
Martinez-Rodriguez et al. | Micropropagation of seed-derived clonal lines of the endangered Agave marmorata Roezl and their compatibility with endophytes | |
Echbab et al. | Successful nodulation of Casuarina by Frankia in axenic conditions | |
GREBENNIKOVA et al. | ADAPTIVE CAPACITY OF SOME LAVENDER AND LAVANDIN CULTIVARSIN VITRO AND IN SITU | |
Ewald et al. | Endogenous bacteria in tissue cultures of conifers-appearance and action | |
Romadanova et al. | In Vitro Collection for the Safe Storage of Grapevine Hybrids and Identification of the Presence of Plasmopara viticola Resistance Genes | |
Northmore et al. | Thidiazuron induces high-frequency indirect shoot organogenesis of Bienertia sinuspersici: a single-cell C 4 species | |
Manchanda et al. | Effects of various carbohydrates on the in vitro pollen germination of Vinca rosea and Cucumis melo var. utilissimus |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070831 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20071129 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20071206 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080225 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090302 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20090317 |