JP2005530504A - 発明の名称：組織マイクロアレイ構築用手動セット - Google Patents

Abstract

TMAブロック型（１）が下部部品（２）及び上部部品（３）を含み、該下部部品（２）がその基礎部品に対して垂直に、中央部分に行及び列に配置された心棒（４）を備え、該上部部品（３）が縁部分（７）を含む開口部分（６）を有し、該開口部分（６）がTMAブロック型（１）を組立てる際に心棒（４）を収容し、該開口部分（６）の縁部分（７）及びサイズがパラフィンブロック固定器（PBK）の形状及びサイズに適合し、並びに、下部部品（２）及び上部部品（３）がガイド用ニップル（５）及びねじ込みアーム（９）により互いに連結され、水平方向に固定されることを特徴とする：公知の組織中心打抜抽出機SZK及びTMAブロック型（１）を含有する、組織マイクロアレイTMA構築用手動セット。

Description

本発明の対象は、組織中心打抜抽出機（tissue core punch extractor）並びに、下部及び上部部品を有するTMAブロック型を含む、組織マイクロアレイ（TMA）調製用手動装置セットである。

組織マイクロアレイ調製用手動装置セットは、一連のTMAを作成するのに適しており、これにより、従来の一般的な組織学実験室環境に首尾良く適合する一連のTMAを高速かつ正確に「自家（home made）」で調製することが可能になる。

TMA技術は、診断マーカー並びに、悪性腫瘍の侵襲性及び他の特徴に関するパラメータの決定に適用可能である。

TMAは、遡及的研究、すなわち、病理学研究室に保存されている何千もの組織学的検体中の何千もの分子生物学的マーカーを調査するのに非常に有用である。

ゲノム変異および異常遺伝子発現の分析を可能にするDNAチップと同様に、組織マイクロアレイは生物学的検体の並行プロセシングを可能にする。研究者は、たった１つのTMAを使用して、いくつかの悪性腫瘍組織の組織学的検体中の種々の分子パラメータ（DNA、RNA分子生物学的技術および抗原の免疫組織化学／免疫細胞化学）を同時に比較検査することが可能である。

多数のモノクローナル抗体が、診断および治療的適用のために開発および導入され（免疫形態学）、このようなモノクローナル抗体は、無傷の細胞および病理学的（主に悪性）細胞のゲノムおよび表現型を決定し、ならびに新規抗原決定基に特異的なものである。遺伝的方法に基づく診断測定では、DNAおよび／またはRNAの特定セグメントを同定可能であり、この測定はますます利用されるようになっている（分子生物学）。いくつかの研究室では、上記手段の組織反応性および、蔓延しているほとんどの腫瘍に関する適用可能性を評価している。

したがって、この診断技術は実に広く使用されていると考えられる。

この診断技術では、種々の腫瘍組織由来の組織学的検体を適切に配置された集合形式でパラフィン中へ包埋し、TMAを調製する。TMAブロックを切断し、組織学的光学顕微鏡用切片中の点状物として種々の腫瘍組織を提供する。各TMAブロックは何百もの並行した、3-4μm厚連続切片を有してもよいので、何百もの分子パラメータを同一マイクロアレイ上で検査できる。腫瘍マーカーには数週間以内に分析できるものもあるが、従来の方法を用いると、この分析は組織検体あたり何か月もかかるはずである。

発明者らの現在の知見によれば、標準サイズの組織学的切片（凍結及び／又は固定・包埋された組織由来）及び細胞学的サンプル（塗布サンプル、沈降物、インプリント、細胞遠心分離物等）に対して反応を施すことは、腫瘍の分子マーカーを同定し、並びに疾患の進行を予測するのに有用である。技術的及び経済的理由により、同時には、限られた数のサンプルしか検査できず、またその評価には時間がかかり、そして異なる実験室間での比較検査ならびに再現可能な検査は実行が困難である。特に、再現性を欠くことは、単一組織学的ブロック中に種々の組織／ブロック由来の部分を含有する、いわゆる「マルチ組織ブロック」技術の欠点である。さらに、悪性組織内の個々の分子マーカーの分布はかなり不均質であることが多く、したがって微小組織部分は腫瘍細胞集団全体の生物学的特徴を正しく表すものではない。

「チップ」技術に類似、より正確には「チップ」技術に基づく技術、すなわち組織マイクロアレイを適用すれば、何百または何千もの組織検体を調査可能である。

医学生物工学的基礎研究の分野の知見は増加しており、これを利用すれば、診断および治療測定を共に確認できる。それにもかかわらず、関連の適用研究、研究開発（R&D）並びに臨床検査過程には、何年も、あるいは10年を要することすらあり、これに伴って増大する経済的資力を要する。本発明のTMA構築用手動セットは正確かつ費用対効果の優れた様式で必要な検査段階を短縮する。

米国特許第4820504号（特許文献１）の開示内容は、周知の広く使用されている手順を示すものであり、これは複数の組織検体を含有するサンプルを調製するための手順である。その利点には、一般的な研究設備を有するほとんどすべての実験室において適用可能な容易な手順であること、低コストであること、および新規装置を入手する必要がないことが挙げられる。しかしながら、この技術の欠点は、連続的に並べて包埋されている組織サンプルが無作為に位置し、行および列に整理されていないことであり、これによりその評価はかなり困難となり、自動（画像分析）プロセシングはほとんど不可能であるか、あるいは複雑で遅いものとなり、個々の組織サンプルのサイズは互いにおおよそ似かよっているに過ぎない。新規機器はこの手順の開示には属していない。

発明者らの手順および本発明の対象はこれらの欠点に対処することを目的とする。

米国特許第5002377号（特許文献２）は、特定の機器であり、この機器は組織サンプルを規則的な行および列に編成し、これによりマルチ組織ブロックを提供する。この特許権者は、従来機器の特許権者と同一であり、この分野に関する周知の専門家であるが、この技術は広く使用されるに至っていない。この機器の明らかな利点は、その適用により、規則的なほとんど同一サイズの組織サンプルを調製し、包埋できることである。それにもかかわらず、この機器の欠点は、ブロック調製中に、個々の組織の列が、わずかにではあるが移動することがあることである。この機器の最大の欠点は：最もよく適用される、最も有名な実験室機器（装置および準固定資産）と共用できず、一方で、それらの導入には３つの追加ツールおよびかなり熟練した手作業を必要とすることである。第一の機器には、複数の並行切断プレートが含まれ、これにより組織の列を組織サンプルから切り離することができるが、これは比較的大きい検体にのみ適用可能である。他の２つの構成要素は切断された組織の列を単一のパラフィンブロック内へ包埋することを可能にするものである。

米国特許第6103518号（特許文献３）は作業台装置であり、これは有用な組織マイクロアレイを提供する。この手順は、パラフィンブロックの収容箇所について、および供与ブロックの選択部位由来のサンプリング（組織中心）についての十分に習熟された技術に基づく。上記利点を除くと、高い価格、複雑な機械設定、および収容ブロックの収容用の孔を一つずつ作成する必要性があり、日常的な実施において重大な欠点である。
国際公開第01/51910号（特許文献４）は容易なパラフィンブロック構築手順を提示しており、この手順を使用して、一連の組織マイクロアレイを生産することができ、この手順では、いくつかの構成要素からなる型が形成されている。この型を使用して、基本胴体が成型され、この胴体は規則的に配置された開口部を有し、次いでこの開口部内へ組織サンプルが収納される。その後、組織サンプルを含有する基本胴体は軟化温度限界まで加熱され、これは基本胴体を、この手順の後の段階で、その一表面に注がれる流動パラフィンと結合可能にするためであり、これにより流動パラフィンを伴う単一の構成単位を形成する。この流動パラフィン層は、パラフィンブロック固定器をパラフィンブロックに固定するのを支援するためのものであり、このパラフィンブロックは円柱状の孔およびその孔に収容されている組織サンプルを含有する。
しかしながら、この解決策の重大な欠点は、内に組織サンプルを伴う円柱状部分を含有するパラフィンブロックがかなりの加熱作用に付されることである。この加熱作用およびパラフィン再軟化のせいで、組織の円柱状部分は移動し、これにより切片作成時に問題が生じ得る。後期段階での加熱作用についての別の欠点は、パラフィンを軟化するのに必要な熱量によって組織サンプルの円柱状部分が損傷を受けることがあることであり、この加熱により免疫染色の観点から考えて不可逆的な損傷が生じることがあり、結果として加熱によりタンパク質ベースの抗原に変化が生じるためにサンプルは使用不能になり得る。
この解決策の別の重大な欠点は、二段階で注がれたパラフィンブロックでは、切片作成時に剪断力が生じるせいで、パラフィンブロックが別の二時点で作成された二層間の境界で崩れることがあることであり、その結果、パラフィンブロックはブロック固定器から分離することがあり、組織の円柱状部分から所望の切片を作成することが不可能になることがある。
組織サンプル作製用パラフィンブロックの作成に適した例はまた、米国特許第6383801号明細書（特許文献５）および、さらに、国際公開第01/98525号（特許文献６）、第99/44063号（特許文献７）、第01/22086号（特許文献８）および第01/42796号（特許文献９）に見出すことができる。
米国特許第4820504号 米国特許第5002377号 米国特許第6103518号 国際公開第01/51910号 米国特許第6383801号 国際公開第01/98525号 国際公開第99/44063号 国際公開第01/22086号 国際公開第01/42796号

本発明の目的は、上記方法の欠点を排除すること、および組織マイクロアレイ調製用手動装置セットであって、シンプルで、安価で、ならびにすべての広く使用されている組織学実験室の固定および準固定資産と共用できるセットを設計することである。この手動装置適用の原理は、収容ブロックの製造をサンプリングと別工程にすることであり；したがって、サンプルはあらかじめ調製して別の箇所に保存しておくことができ、その後、このサンプルが収容ブロック内へ収納される。この手動装置は、少しのスペースしか必要とせず、容易に手入れができ、基本的にメンテナンスの必要がなく、各部品は外部からの物理的および化学的衝撃に耐性であり、そしてこの収容ブロックは一段階で製造できる。

本発明は、組織マイクロアレイ調製用手動装置セットが、望ましくは、サイズが整合していて、したがって従来の一般的な組織学実験室環境下で使用されている機器と共に適用可能である構成要素から構成されるべきであろうという認識に基づいている。この組織マイクロアレイ調製用手動装置セットは、組織中心打抜抽出機並びに、下部及び上部部品を有するTMAブロック型を含有し、そして従来の、最もよく使用されているパラフィンブロック固定器がこのブロック型と首尾良く適合するように開発された。組織中心打抜抽出機は周知の技術的解決策であり、すなわちその機能は打抜きに基づくものである。打抜用先端は打抜用管として構成され、この管は内径1または2mmを有する。この打抜用管は、サンプルの特定箇所（供与ブロック）から採取された組織の円柱状部分（中心）を収容し、この組織の円柱状部分は打抜用先端から手動で押し出すことができ、この押し出し操作はピストン様探り針の支援によって行われ、この探り針は機器内のコイルばねによって押し戻される。探り針の外径は打抜用先端の内径と同等であるが、打抜用先端内へ自由にスライド可能なサイズである。

TMAブロック型は２つの主要素：下部および上部部品から構成されている。下部部品は1または2 mm幅の心棒群を備え、この幅は打抜用管の直径と同一であり、この心棒群は行および列（lines and columns）に編成されている。下部および上部部品はパラフィンブロックの鋳造時に共に組み合わされ、そして上部部品によって形成される孔内へパラフィンが注がれるので、当該孔の箇所に作成される縁部分は、そのサイズおよび形状が一般に使用されるパラフィンブロック固定器のサイズおよび形状と同一となるようにしておくのが望ましい。
この縁部分の形成により、パラフィンブロック固定器自体を空のパラフィンブロックに固定することが可能になり、この固定をパラフィンブロック成型時に一段階で行うことができる。これにより、既知の手順では必須の工程である、以後の加熱処理を実行する必要がなくなり、よって加熱処理によって生じる上記の不益な影響を克服する。
下部部品では、少なくとも２つの垂直方向のガイド用ニップルが基礎部品内に組み込まれており、このニップルは、型手動装置を分解する際に、パラフィンブロックを平行かつ無傷で取り出す作業を確保するためのものである。TMAブロック型の下部および上部部品を分解する時点での、この２つの構成部品の均等な回収は、少なくとも２つの対角に配置されているねじ込みアームによって確保される。

上で考察した欠点は、組織マイクロアレイ調製用手動装置セットによって確実に排除され、以下の特徴を有する：単独ではすでに既知である組織中心打抜抽出機およびTMAブロック型であって、後者は下部および上部部品を有する；下部部品はその中央部分で行および列に編成され、基礎部品に対して垂直の心棒群を備えている；上部部品は縁部分を含有する開口部分を伴って製造され、この開口部分はTMAブロック型の組立て時に心棒群を収容する；開口部分の縁部分およびサイズはパラフィンブロック固定器の形状およびサイズと適合する；下部および上部部品は互いに連結され、ガイド用ニップルおよびねじ込みアームによって水平方向に固定される；TMAブロック型の下部部品は少なくとも２つの垂直方向のガイド用ニップルを有し、このニップルは上部部品のボアホール内へ垂直方向に取り外し可能に連結される；TMAブロック型の上部部品には、少なくとも２つの対角の貫通ボアホールがあり、このボアホールはねじ込みアームを受け、このねじ込みアームの末端はTMAブロック型の組立て時に下部部品に接触する。

図面により、本発明のTMA構築用手動セットを詳細に示す。
図１．TMAブロック型の軸方向配列図
図２．TMA構築用手動セットのTMAブロック型およびパラフィンブロック固定器の軸方向配列図
図３．完成したパラフィンブロックおよび組織中心打抜抽出機

図１に示すTMAブロック型１は２つの主要素、すなわち下部部品２および上部部品３から構成されている。下部部品２は、直径1または2 mmの心棒４を有し、その心棒４は行および列に配置されている。心棒４の直径は組織中心打抜抽出機１４の打抜用管８の直径と同一である。下部部品２上には、下部部品に対して垂直のガイド用ニップル５があり、このガイド用ニップルは、TMAブロック型１を分解する際、パラフィンブロックを平行かつ無傷で取り出す作業を確保するためのものである。上部部品３のサイズは下部部品２のサイズと同一であり、その中央部分には、縁部分７を含有する開口部分６を有し、この開口部分は心棒４の群を収容する。開口部分６の縁部分７は図２に示す市販のパラフィンブロック固定器１２を収容するように作成されている。下部部品２上には、ガイド用ニップル５があり、このガイド用ニップルは上部部品３上の貫通ボアホール１０と結合される。さらに上部部品３上の別の貫通ボアホール１１はねじ込みアーム９を受け、このアームはパラフィンブロックを有する組立て済み機器鋳造物の２つの部品を均一かつ平行に分解する作業を確保するためのものである。

TMAブロック型１の下部部品２および上部部品３を分解する時点で、この２つの部品の均等な回収は、少なくとも２つの対角に配置されているねじ込みアーム９によって確保される。組織中心打抜抽出機１４の末端は、内径1または2 mmの打抜用管８である。

周知の組織中心打抜抽出機１４はサンプルの特定箇所（供与ブロック）から採取される組織の円柱状部分を収容し、この円柱状部分は打抜用管８から手動で押し出すことができ、この押し出し操作はピストン様探り針の支援によって行い、この探り針は機器内側のコイルばねによって押し戻される。

探り針の外径は打抜用管８の内径と同等であるが、打抜用先端８内へ自由にスライド可能なサイズである。

パラフィンブロックの製造時には、組立て済みTMAブロック型１に開口部分６を通してパラフィンを充填する。パラフィンを収納した後、冷却して機器から取り出すと、パラフィンブロック１３（収容ブロック）が得られ、このブロックは1または2 mm幅の円柱状の孔を含有し、この円柱状の孔は平行の長軸を有し、行および列に規則的に編成されている。これらの孔は同直径を有する組織中心を収容し、この組織中心は供与ブロックから組織中心打抜抽出機１４によって採取されたものであり、最終的にTMAブロックが得られる。

本明細書中の記載から理解できるように、発明者らの目的は本発明の開発によって達成された。このTMA構築用手動セットは、シンプルで、安価な手動機器であり、この機器は取扱いおよび手入れが容易であり、環境に配慮し、そして従来の一般的な組織学実験室環境下において高速かつ正確なTMAの調製を可能にするものである。
さらに別の利点は、この手動セットの独特な構成に基づき、パラフィンブロックを固定器によって一段階で生産することができ、後の加熱処理を全く伴わないことである。これは生産に必要とされる時間を減少させるだけでなく、完成品の機械的特性に関して好都合の影響を有し、この特性には剪断強度も含まれる。

図１はTMAブロック型の軸方向配列図である。 図２はTMA構築用手動セットのTMAブロック型およびパラフィンブロック固定器の軸方向配列図である。 図３は完成したパラフィンブロックおよび組織中心打抜抽出機である。

符号の説明

１ TMAブロック型
２ 下部部品
３ 上部部品
４ 心棒
５ ガイド用ニップル
６ 開口部分
７ 縁部分
８ 打抜用管
９ ねじ込みアーム
１０ 貫通ボアホール
１１ 貫通ボアホール
１２ パラフィンブロック固定器
１３ パラフィンブロック
１４ 組織中心打抜抽出機

Claims (3)

1. TMAブロック型（１）が下部部品（２）及び上部部品（３）からなり、該下部部品（２）がその基礎部品に対して垂直に、中央部分に行及び列に配置された心棒（４）を備え、該上部部品（１３）が縁部分（７）を含む開口部分（６）を有し、該開口部分（６）がTMAブロック型（１）を組立てる際に心棒（４）を収容し、該開口部分（６）の縁部分（７）及びサイズがパラフィンブロック固定器（PBK）の形状及びサイズに適合し、並びに、下部部品（２）及び上部部品（３）がガイド用ニップル（５）及びねじ込みアーム（９）により互いに連結され、水平方向に固定されることを特徴とする：公知の組織中心打抜抽出機SZK及びTMAブロック型（１）を含有する、組織マイクロアレイ（TMA）構築用手動セット。
2. TMAブロック型（１）の下部部品（２）に少なくとも２つの垂直方向のガイド用ニップル（５）を有し、該ニップルが上部部品（３）のボアホール（１０）と結合し、垂直方向に自由に移動可能であることを特徴とする、請求項１に記載の手動装置セット。
3. TMAブロック型（１）の上部部品（３）に少なくとも２つの対角の貫通ボアホール（１１）を有し、該ボアホールがねじ込みアーム（９）を受け、該ねじ込みアームがTMAブロック型（１）を組立てる際に下部部品（２）に接触することを特徴とする、請求項１に記載の手動装置セット。

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