JP2005526013A

JP2005526013A - アポトーシス活性ペプチド

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Publication number: JP2005526013A
Application number: JP2003554725A
Authority: JP
Inventors: マルク，アンドレフレイベルグ，; ペーターフリーデル，; ディルクカイゼル，
Original assignee: サイトツールズゲーエムベーハー
Priority date: 2001-12-20
Filing date: 2002-12-18
Publication date: 2005-09-02
Anticipated expiration: 2022-12-18
Also published as: WO2003054009A2; ES2583032T3; US20110178000A1; JP4384494B2; US9017693B2; DE10163130A1; AU2002366739A1; EP1458748A2; US7892556B2; EP2332964A1; ES2369883T3; US20050222020A1; ATE517117T1; WO2003054009A3; EP1458748B1; EP2332964B1; AU2002366739A8; DE10163130B4

Abstract

アポトーシスに影響を与える、特別なアミノ酸配列とペプチドおよび／または該ペプチドから誘導されるペプチド類似体、ならびに診断手段としての薬剤の製造のための前記物質の使用、を示す。

Description

本発明は、アポトーシス活性ペプチドと該ペプチドの薬剤製造のための使用とに関する。

アポトーシスは遺伝子的にコード化された自殺プログラムであり、特定の生理学的または病理学的条件下で真核細胞に誘発される。アポトーシスの誘発はきわめて精密に制御されなければならない。活性過多(hyperactivity)は変性疾患を生じうるからである。他方、アポトーシス誘発の減少は腫瘍の進行に寄与しうる。

すでに、いろいろな低分子量アポトーシス誘発体(inductor)が提案されている。重要な種類は腫瘍細胞増殖抑制物質である。しかし、大部分の場合、これらの細胞増殖抑制物質その他の物質がどのような仕方でアポトーシスを誘発しうるのかは不明である。

アポトーシスの誘発は、たとえば、一連の死受容体、すなわち“死ドメイン”(DD)たとえばCD95、TNF-RI、DR3、DR4、またはDR5を含む受容体によって生じうる。これらの受容体は、その配位子と結合したあと、アポトーシスシグナル発生路を誘起する。たとえば、CD95受容体は、CD95配位子の結合のあと、アダプター蛋白質FADD/MORＴ1と相互作用し、それによって、プロテアーゼFLICE/CASpase-8の“漸増(recruitment)”と活性化とがDISC“Death Inducing Signaling Complex(死誘発シグナル発生複合体)"において誘発される。FADDとFLICEとはそれぞれ“死エフェクタードメイン”(DED)を有している。これらのシグナル路による外部からのアポトーシスの誘発は、たとえば、細胞毒（細胞毒性物質）の添加、照射、ウイルス、成長因子の除去、または機械的な細胞損傷によって、可能である。しかし、アポトーシス誘発のこれらの可能性には、それぞれ欠点が存在する。癌細胞の場合の、細胞毒たとえば細胞増殖抑制因子の添加または照射には、抵抗力の発達が起こり、またさらに、本来アポトーシスを誘発すべきでない正常細胞の損傷も起こる。

一般に、アポトーシスの誘発は、たとえば、癌の治療において、腫瘍起因性血管形成過程その他を避けるために、提案されている。以上、誘発体について述べたが、これらはさらに多くの欠点を有している。たとえば、細胞増殖抑制物質は強い副作用を引起す。

しかし、アポトーシスがマイナスの効果を有し、また治療のためにアポトーシスを抑制すべき病理学的状態に関しても議論されている。

そのような病気の一例は、動脈硬化症である。特に、本件の発明者は、以前、特に動脈硬化症病変部の領域において、アポトーシス細胞（特に、内皮細胞、平滑筋細胞）が発生し、またそのような発生は流れ阻害状態の場合に促進されること、すなわち流れ依存性(flow-dependent)であるということを示すことができた(Freiberg et al.,BBRC,286,141 149,2001)。さらに、本件の発明者は、TSP-1とIAPおよび／またはα_vβ₃との結合を阻害する物質は流れ依存アポトーシスを抑制しうるということを示すこともできた。

発生アポトーシスの増大との関連で議論されているその他の病気としては、AIDSおよびアルツハイマー病がある。

傷の治癒においても、関与細胞たとえば線維芽細胞、筋肉細胞、および内皮細胞のアポトーシスが、重要な役割を演じている。したがって、アポトーシスの抑制が傷の治癒に好ましい影響を及ぼすと考えられる。

したがって、アポトーシスにプラスまたはマイナスの影響を及ぼす物質に対する大きな要求が存在する。特に、流れ依存性の、したがって動脈硬化症に関係するアポトーシスを抑制できるのが好ましいと考えられる。さらに、アポトーシスの抑制または誘発を示す状態の治療、特に動脈硬化症ならびにAIDS、アルツハイマー病、および癌の治療のために使用できる物質を含む薬剤組成物に対する強い要求も存在する。ここで、そのような物質は、可能であれば、最低限の分子量を有し、かつ／または小さなペプチドであって、高い生体有効性(biological availability)が保証されるようにすべきである。

したがって、本発明の目的は、アポトーシス活性物質好ましくはペプチドを提供することである。特に、本発明のもう一つの目的は、TSP-1によって誘発される内皮細胞の流れ依存アポトーシスを抑制することのできる物質好ましくはペプチドを提供することである。本発明のさらなる目的は、アポトーシスの抑制または誘発が示される病気、たとえばAIDS、アルツハイマー病、癌、および傷治癒時の疾患が治療できる製剤を提供することである。

これらの目的、およびここではあからさまには述べないが、先行技術の前記説明から困難なく導き出せるその他の目的は、特許請求の範囲に示す本発明の代表的実施形態によって達成することができる。

前記目的は、特に、SEQ ID NO １〜19に示されているアミノ酸配列の一つを有するペプチドを含む有効物質を製造することによって達成される。

本発明の好ましい実施形態の場合、アポトーシス抑制物質が、一般式(1)
Ｒ−Ａ₁−Ｙ−Ｖ−Ｖ−M
のアミノ酸配列を有する。ここで、Ａ₁はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｍ、Ｎ、Ｔ、Ｗ、もしくはＹ、またはこれらの物質の薬剤的に許容される塩である。

本発明のもう一つの好ましい実施形態の場合、アポトーシス誘発物質が、
一般式（２）
Ｒ−Ａ₂−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ａ₃
のアミノ酸配列を有する。ここで、Ａ₂はＡ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、もしくはＣであり、Ａ₃は、Ａ₂がＡである場合、Ａであり、Ａ₂がＬ、Ｐ、Ｓ、もしくはＣである場合、Ｍであり、またはＡ₂もしくはＡ₃はこれらの物質の薬剤的に許容される塩である。

本発明のさらなる好ましい特定実施形態は、ＳＥＱＩＤＮＯ１２、１８、および１９に示すアミノ酸配列を有する。

本発明においては、アミノ酸に関する国際共通一文字コードを使用する。すなわち、Ａは、アラニン(Ala)、Ｃは、システイン(Cys)、Ｄは、アスパラギン酸(Asp)、Ｅは、グルタミン酸(Glu)、Ｆは、フェニルアラニン(Phe)、Ｇは、グリシン(Gly)、Ｌはロイシン(Leu)、Ｍは、メチオニン(Met)、Ｎは、アスパラギン(Asn)、Ｐは、プロリン(Pro)、Ｒは、アルギニン(Arg)、Ｓは、セリン(Ser)、Ｔは、トレオニン(Thr)、Ｖは、バリン(Val)、Ｗは、トリプトファン(Trp)、および、Ｙは、チロシン(Tyr)を表す。ここで、Ｌ−アミノ酸は大文字で示し、Ｄ−アミノ酸は小文字の使用によって示す。

特に好ましい側面において、本発明は、サブSEQ ID NO １〜11に示されているペプチド配列の一つを有するアポトーシス抑制物質、好ましくは蛋白質もしくはペプチド、または対応する薬剤的に許容されるこれらのものの塩に関する。

特に好ましい側面において、本発明は、また、サブSEQ ID NO １２〜19に示されているペプチド配列の一つを有するアポトーシス誘発物質、好ましくは蛋白質もしくはペプチド、または対応する薬剤的に許容されるこれらのものの塩にも関する。

さらに、本発明は、SEQ ID NO １〜11に示されているアミノ酸配列の少なくとも一つを有する本発明の物質好ましくは蛋白質もしくはペプチドの、薬剤の製造のための使用、特に、動脈硬化症、AIDS、およびアルツハイマー病、ここで特に好ましくは動脈硬化症の治療用の薬剤の製造のための使用に関する。

さらに、本発明は、SEQ ID NO １２〜19に示されているアミノ酸配列の少なくとも一つを有する本発明のペプチドの、薬剤の製造のための使用、特に、たとえば癌の治療において細胞の死を引起すべき薬剤の製造のための使用に関する。

本発明の発明者は、意外なことに、式(1)によって示されるアミノ酸配列を有するペプチドが非常に強力にアポトーシスを抑制するということを明らかにした。特に、これらのペプチドは、内皮細胞の流れ依存性のTSP-1誘発アポトーシスを抑制するのに非常に良く適している。しかし、これらのペプチドは他の細胞におけるアポトーシスの抑制もできると考えられる。

本発明の特に好ましい実施形態においては、下記のペプチド／ペプチド配列を使用することができる。
１．Ｒ−Ａ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｍ（ＳＥＱＩＤＮＯ１）
２．Ｒ−Ｗ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｍ（ＳＥＱＩＤＮＯ２）
３．Ｒ−Ｙ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｍ（ＳＥＱＩＤＮＯ３）
４．Ｒ−Ｅ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｍ（ＳＥＱＩＤＮＯ４）
５．Ｋ−Ｒ−Ａ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｗ−Ｋ−Ｋ（ＳＥＱＩＤＮＯ５）
６．Ｋ−Ｒ−Ｅ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｍ−Ｗ−Ｋ−Ｋ（ＳＥＱＩＤＮＯ６）
７．Ｒ−Ｇ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｍ（ＳＥＱＩＤＮＯ７）
８．Ｒ−Ｍ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｍ（ＳＥＱＩＤＮＯ８）
９．Ｒ−Ｔ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｍ（ＳＥＱＩＤＮＯ９）
１０．Ｒ−Ｎ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｍ（ＳＥＱＩＤＮＯ１０）
１１．Ｒ−Ｄ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｍ（ＳＥＱＩＤＮＯ１１）
１２．Ｍ−Ｖ−Ｖ−Ｙ−Ｆ−Ｒ（ＳＥＱＩＤＮＯ１２）
１３．Ｒ−Ａ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ａ（ＳＥＱＩＤＮＯ１３）
１４．Ｒ−Ｌ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｍ（ＳＥＱＩＤＮＯ１４）
１５．Ｒ−Ｐ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｍ（ＳＥＱＩＤＮＯ１５）
１６．Ｒ−Ｓ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｍ（ＳＥＱＩＤＮＯ１６）
１７．Ｒ−Ｃ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｍ（ＳＥＱＩＤＮＯ１７）
１８．ｍ−ｖ−ｖ−ｙ−ｆ−ｒ（ＳＥＱＩＤＮＯ１８）
１９．ｍ−ｖ−ｖ−ｙ−ａ−ｒ（ＳＥＱＩＤＮＯ１９）

本発明において、“ペプチド”という言葉は、ペプチド結合で結合された２個以上のアミノ酸の鎖から成る物質を意味するものとする。特に、本発明によるアポトーシス活性のペプチドは、＜１００アミノ酸の鎖長、好ましくは＜７５アミノ酸の鎖長、特に好ましくは＜５０アミノ酸の鎖長、さらに好ましくは＜２５アミノ酸の鎖長、もっとも好ましくは＜１５アミノ酸の鎖長を有する。

したがって、本発明の目的に対して特に好ましいペプチドは、SEQ ID NO １〜19の一つを有し、かつそれぞれＮ末端および／またはＣ末端に１〜３個の付加されたアミノ酸を有するものである。

本発明において、“蛋白質”という言葉は、複数の“ペプチド”がたとえば分子結合（たとえばジスルフィドブリッジまたは塩ブリッジ）によって、互いに結合された物質を意味するものとする。この定義には、天然蛋白質とともに少なくとも部分的に“人造の”蛋白質が含まれ、また、そのような“人造の”蛋白質は、たとえばアミノ酸鎖に天然蛋白質には含まれない残基(chemical residue)を付加することによって改変することができる。

本発明において、“アポトーシス活性の”という言葉は、実施例５および６の示す試験系にそれぞれの物質を添加したときに正または負の抑制指数が得られるということを意味する。特に、内皮細胞好ましくは特にHUVECを、この目的のために、１mlあたり1μgのTSP-1を含む培養基内で培養した。次に、このような正の対照のパーセントアポトーシス値が、実施例に示すように、平行試験において誘発体TSP-1とともに抑制体の可能性のあるものとして使用された物質の抑制指数の計算に使用される。負の対照は他の誘発体が存在しないことを示す。

ここで、正の抑制指数はそれぞれの物質がアポトーシスを抑制することを示す。また、負の抑制指数は、使用した物質がアポトーシスを誘発すること、すなわちTSP-1誘発アポトーシスを促進することを示す。

しかし、負のペプチドは、しばしば、ペプチダーゼに対する低い代謝安定性と割合に小さな生体有効性とを示す。

当業者は、前記ペプチドから出発して、発明的な行為なしで、類似または同等の作用を有し、また特にペプチド類似体(mimetics)とも呼ばれる一連の多数の誘導化合物を開発することができる。

本発明において、ペプチド類似体というのは、ペプチドの構造を模擬し、配位子として、受容体／酵素レベルでの生体活性を模擬するか（作用薬）または妨害するか（拮抗薬）することのできる化合物のことである。ペプチド類似体は特に高められた生体有効性と高められた代謝安定性とを提供すべきものである。類似の程度は、出発構造をわずかに変えたものから純粋の非ペプチドまでわたりうる。たとえば、A.Adang et al.,Recl.Trav.Chim.Pays-Bas 113(1994),63-78を参照されたい。

原理的には、ペプチド構造の類似体化／誘導体化に関しては、下記の可能性がある。
・Ｌ−アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸を使用する。
・アミノ酸の側鎖の変更。
・ペプチド主鎖の変更／延長。
・立体配座安定化のための環化。
・特定の二次構造を強制する鋳型の使用。
・適当な残基／側鎖とともにペプチドの構造を模擬する非ペプチドバックボーンの使用。

ペプチドの蛋白質分解安定性はＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に交換することにより増大させることができるが、一つのアミノ酸の側鎖の変更により、しばしば、ペプチド全体の結合特性の改良がもたらされる。

ペプチドバックボーンを変更すると、一般に、アミド基のアミド類似基への交換が起こる(J.Gante,Angew.Chem.106(1994),1780-1802)。これらの方策により、天然ペプチドの結合親和性と代謝安定性との両方に影響を与えることができる。

線状ペプチドの環化により、該ペプチドの柔軟性したがってその全体的な立体配座が固定される。生体活性立体配座が固定されると、受容体に対するペプチドの親和性が増大する。結合時のエントロピー減少が、柔軟な線状ペプチドとの結合の場合よりも小さくなるからである。この目的のために、受容体の認識に関与しないアミノ酸側鎖を互いに結合させるかまたはペプチド骨格と結合させる。

このペプチドの二次構造は、受容体の分子認識に関して決定的な役割を演じる。αらせんおよびβプリーツシートのほか、いわゆる転回(turns)がペプチド鎖内の転回点として重要な立体配座要素を構成する。これらの構造単位を、ペプチドへの挿入後に特定の二次構造を安定化する要素によって置き換えることが、二次構造類似体の概念を与える。

ペプチドの水溶解度も、たとえば、Ｓ−およびＣ−グリコペプチド誘導体の導入によって増大させることができる。その他の方策としては、たとえば、ペプチドのポリエチレングリコール化(glycolization)がある。

ヘキサペプチドの親油性も、たとえば、フェニルアラニンをペプチド配列に付加することによって、増大させることができる。

ペプチドの環化およびＮ末端修飾は、たとえば、Borchard, Journal of controlled Release 62 (1999),231-238 及びBlackwell et al.,J.Org.Chem.10(2001),5291-302 に述べてある。

したがって、明らかに、当業者は、本発明によって与えられる知識から出発して、容易に、すべて本発明の範囲に含まれる一連の多数のペプチド類似体に到達することができる。

本発明はまた、もう一つの好ましい側面において、SEQ ID NO １〜19から誘導されたペプチド類似体およびそのようなペプチド類似体を含む物質をも提供する。

特に、本発明は、もう一つの側面において、SEQ ID NO １〜11から誘導されたペプチド類似体およびそのようなペプチド類似体を含む物質を、動脈硬化症、AIDS、およびアルツハイマー病、特に好ましくは動脈硬化症の治療用の薬剤の製造のために使用する方法をも提供する。

特に、本発明は、もう一つの好ましい側面において、SEQ ID NO １２〜19から誘導されたペプチド類似体およびそのようなペプチド類似体を含む物質を、癌治療用の薬剤の製造のために使用する方法をも提供する。

本発明のもう一つの好ましい側面においては、前記ペプチドまたは対応する誘導体に変換されたペプチドを、それぞれ診断試薬としても使用することができる。本件の発明者によって示されたように、本発明の物質好ましくはSEQ ID NO １〜19のペプチドは、アポトーシス細胞に結合し、したがって、診断手段としてきわめて有効に使用することができる。たとえば、動脈硬化症病変領域におけるアポトーシス細胞の存在したがってまた病変そのものの存在を示すために使用することができる。そのために、本発明の物質に標識付けをする。そのような標識付けのために、当業者は複数の方法を思いつくであろうが、使用目的に応じていずれかを選択することができる。

適当な方法は、たとえば、米国特許第4,479,930号(Hnatovich)、第4,652,440号(Paik et al.)、および第4,668,503号(Hnatowich)明細書に記載されている。

本発明においては、“本発明によって標識付けした物質”という言葉は、先行技術によって知られていて、ペプチドの標識付けのための標準物質(standard)として使用されている標識付け物質、たとえば通常の放射性同位体（たとえばレニウムまたはテクネチウム）、また酵素、酵素基質、抗体、特定の抗体／フラグメントの認識のためのエピトープ、その他、を含む本発明の任意の物質を表す。当業者は、きわめて容易に、非限定的代表例として挙げた前記物質を特定することができるであろう。

本発明による物質を診断手段として使用すべき場合、先行技術により公知の任意の標識付け法を使用することができる。

製剤の活性成分を構成する本発明による物質は、一般に、薬剤的に許容される基剤に溶解される。薬剤的に許容される基剤の例としては、緩衝液たとえばリン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液がある。ペプチドの活性を維持するために、たとえば製剤において還元環境を維持する薬剤的に許容される物質を添加することもできる。

各患者に対する特定の投与量と薬量(posology)とは、いくつかの要因、たとえば使用されている特定化合物の活性、患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性、栄養物摂取、投与期間、投与方法、排出速度、他の薬剤との組合せ、および治療が加えられる個々の病気の重さ、に依存する。前記投与量と薬量とは、これらの要因に応じて、医師が決定する。

通常、ペプチド薬剤は、非経口的に投与され、たとえば、吸入スプレー投与、直腸からの投与、皮下注射、静脈注射、筋肉注射、関節内および鞘内注射および注入技術により、または、通常の薬剤的に許容される基剤、佐剤、および賦形剤を含む薬剤組成物により外部から、投与される。それぞれの物質の種類に応じて、他の投与方法たとえば経口投与も考慮することができる。傷の治療においては、本発明による物質は、好ましくは軟膏または粉末の形で使用する。

本発明は、また、有効量(active amount)のアポトーシス活性物質、好ましくはペプチド、蛋白質、またはペプチド類似体を通常の薬剤基剤とともに含む製剤をも提供する。薬剤基剤はたとえば固体もしくは液体増量剤、封入剤、または溶剤である。薬剤基剤として使用できる物質の例としては、糖（たとえば、ラクトース、グルコース、およびサッカロース）、でんぷん（たとえば、トウモロコシでんぷん、およびジャガイモでんぷん）、セルロースとその誘導体（たとえば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、および酢酸セルロース）、粉末トラガント、麦芽、ゼラチン、タロー、たとえばカカオバターおよび坐剤ワックスのような薬剤基剤、油（たとえば、ピーナツ油、綿実油、紅花油、ごま油、オリーブ油、トウモロコシ油、大豆油）、多価アルコール（たとえば、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール）、エステル（たとえば、オレイン酸エチル、およびラウリン酸エチル(ethyl laureate)）、寒天、緩衝手段（たとえば、水酸化マグネシウム、および水酸化アルミニウム）、アルギン酸、発熱物質を含まない水(pyrogenically-free water)、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコールおよびリン酸緩衝液、ならびに、薬剤組成物で使用される他の融和性の非毒性物質、がある。湿潤剤、乳化剤(emulgator)、および潤滑剤、たとえばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、被覆剤、および芳香剤、ならびに保存料も、製剤専門家の要求に応じて、製剤中に存在することができる。個々の投与薬の製造のために基剤物質とともに使用される活性物質の量は、治療される患者とそのときの投与法とによって変わる。

本発明による物質、好ましくはペプチド、蛋白質、またはペプチド類似体の薬剤的に許容される塩は、周知の方法により製造することができ、たとえば、本発明の化合物を対応する希酸または塩基たとえば塩酸または水酸化ナトリウム溶液に溶解し、それからこれを凍結乾燥することによって、製造することができる。金属塩は、本発明による化合物を対応するイオンを含む溶液に溶解し、それからＨＰＬＣまたはゲル浸透法によって、得られる化合物を分離することによって、得ることができる。

下記の実施例は本発明をさらに詳しく説明するためのものである。

ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）の培養

溶液（滅菌）
培養基：IF主培養基＋15%(v/v)NCS；5μg/mlトランスフェリン、5μg/mlヘパリン、0.7μg/ml FGF、2mM L-グルタミン[IF主培養基：Iscoveの修正したDulbecco培養基(IMDM)とHamのＦ12との1:1混合物。両方ともLife Technologies、Paisley(イギリス)の製品]。
NCS：新生子牛の血清(Sebak、アイデンバッハ)
FGF：線維芽細胞増殖因子（ここで独自に製造、豚の脳から精製）

器具：
細胞培養容器、ゼラチン被覆

手順：
HUVECの培養は、37℃、5%CO₂、水蒸気飽和雰囲気中で、ゼラチン被覆培養容器内で実施した。培養基は２、３日ごとに交換した。集密的になった場合、細胞を、1:3~1:5の分割比で継代した。HUVECは、厳密に接触阻止状態で成長し、典型的な玉石状の形態を有する単層細胞床を形成する。集密的になったとき、培養物は細胞密度4~9×10⁴個/cm²に達する。アポトーシス検査のために、継代１〜４のHUVEC培養物のみを使用した。

培養容器の被覆：

溶液（滅菌）：
ゼラチン溶液、ミリＱ水(milli-Q-water)中に1%(w/v)
100mlのミリＱ水中に１gのゼラチン（細胞培養試験済み）を懸濁させ、121℃、2barで、20min間、オートクレーブ処理することによって、溶解させ、室温で保存した。
PBS(140ml NaCl、3mM KCl、8mM Na₂HPO₄、1.5mM KH₂PO₄)
8g/l NaCl
0.2g/l KCl
1.44g/l Na₂HPO₄×2H₂O
0.2g/l KH₂PO₄
これらの塩を、対応する体積のミリＱ水に溶解させ、121℃、2barで、20min間、オートクレーブ処理し、室温で保存した。ｐＨ値を管理し、7.2~7.4に保った。

器具：
細胞培養容器

手順：
付着成長細胞の培養のために、培養容器をゼラチンで被覆した。細胞培養容器の底を、滅菌ゼラチン溶液で被覆して、この細胞培養容器を、15min間、室温に保った。ゼラチン溶液を吸い取って、細胞培養容器をPBSで一回洗浄すれば、そのまま使用できる。

付着細胞の継代培養

溶液（滅菌）：
PBS
トリプシン/EDTA溶液
0.05%(w/v)トリプシンと0.02(w/v)EDTAを、PBSに溶解し、無菌でろ過した。

器具：
細胞培養容器、ゼラチン被覆

手順：
トリプシン/EDTA溶液を用いて、細胞を培養容器から分離した。培養基を吸い取って、培養容器の底を簡単にPBSで洗浄し、トリプシン/EDTA溶液（培養表面25cm²に対して~1ml）で被覆した。ふたたびただちに酵素溶液を吸い取り、薄い液体膜が細胞上に残されるようにした。細胞を室温に1~10min間保持し、細胞の分離を顕微鏡下で観察した。細胞の分離を、培養容器のへりを軽くたたくことにより、促進することができた。細胞を新鮮な培養基中に受けて、可能な限り数え、新しい培養容器に接種した。

アポトーシス細胞をDAPIで着色することによるアポトーシス率の決定

DAPIはインドール染料物質グループに属し、選択性のDNS染料物質である。この染料物質は、340~360nmで活性化し、放射ピークは約480nmにある。これはアポトーシス検査に使用される[Cohen et al.,Immunology Today,14,No.3,126-130(1993)参照]。

形態の評価：

溶液：
PBS
ホルムアルデヒド溶液
PBS中に4%(v/v)のホルムアルデヒド
DAPI溶液(Molecular Probes、ライデン、オランダ)
メタノール中に2μg/mlのDAPI

器具：
培養中の細胞を収容したペトリ皿(35mm)

手順：
ペトリ皿の培養物上澄み液を吸い取り、細胞床を1mlのホルムアルデヒド溶液により15min間氷上で固定し、2mlのPBSで2回洗浄してから、0.5mlのDAPI溶液を加えて15min間保持し、PBSで洗浄して、蛍光顕微鏡下で評価した。ＵＶフィルターを取りつけ、20×および40×の対物レンズを使用した。500~1000個の細胞を無作為に選択し、アポトーシス核を有する細胞を数えた。アポトーシス率は下記の式によって計算する。

（数１）
アポトーシス率[%]=アポトーシス細胞の数/総細胞数×100

フローサイトメトリー：

溶液：
PBS
培養基
氷冷(−20℃)エタノール(試薬用)
DAPI緩衝液
DAPI原液
DAPI染料溶液

手順：
培養物上澄み液を吸い取り、細胞を、PBSでの洗浄なしでトリプシン処理した。細胞懸濁液を培養基に受け、計数し、800×gで5min間遠心分離し、沈降物を0.5mlのIFに再懸濁させて、1.5mlの氷冷エタノールに滴下した。得られた懸濁液を20℃で一晩保存した。さらなる遠心分離を行い、沈降物を2ml PBSに再懸濁させたあと、37℃で半時間定温放置し、さらに遠心分離を行い、沈降物を5ml DAPI溶液に再懸濁させ、フローサイトメータで50~300事象/秒の計数速度で計数した。得られた計数結果は、細胞周期G期にある細胞の高いピークを示し、それに続いて一部の細胞がS期にあり(中程度の蛍光強度)、最後のピークがG₂期にある細胞を示す強い蛍光強度を示した。細胞あたりのDNS絶対量の減少により、アポトーシス細胞が副G₁ピークに出現した[Darzynklewicz Z.et al.,Cytometry,13,795-808(1992);Zamai L.et al.,Cytometry,14,891-897(1993)]。これは、この選択条件下でアポトーシスが起こることを示している。

培養内皮細胞の場合の、アポトーシスの誘発と、アポトーシス活性ペプチドまたは蛋白質に対する試験系

細胞を、実施例１に述べたようにして培養した。細胞が完全に密集してから、試験に使用した。まず、トロンボスポンディン 1(1 μg/ml)を、新鮮培養基に加え、新鮮培養基のみがHUVECのアポトーシス率に及ぼす影響と比較した。表１は、トロンボスポンディンの添加がアポトーシス率に有意の増大をもたらすことを示している。新鮮培養基添加時に見られるアポトーシスは、実験の進行中に分泌されるトロンボスポンディンによって誘発される。

TSP-1によるHUVECのアポトーシスの誘発

ペプチド合成

使用したペプチドはNMI(Naturwissenshaftliches und Medizinishes Institut an der Universitat Tuebingen、ロイトリンゲン、ドイツ)が、Cyto Toolsが提供したデータにもとづいて合成したものである。

本発明の方法によるアポトーシス活性六量体ペプチドの同定

実施例１に述べたようにして、細胞を培養した。細胞を、対応する培養容器(たとえば、24穴プレート、キャビティあたり0.5ml)に接種し、完全に密集してから、試験に使用した。細胞に下記の新しい培養基を供給した。
(a)新鮮培養基[基礎アポトーシス率]
(b)1μg/ml のTSP-1を含む新鮮培養基[アポトーシス誘発物質;対照]
(c)培養基(b)＋SEQ ID NO 1 ペプチド 1mM
(d)培養基(b)＋SEQ ID NO 2 ペプチド 1mM
(e)培養基(b)＋SEQ ID NO 3 ペプチド 1mM
(f)培養基(b)＋SEQ ID NO 4 ペプチド 1mM
(g)培養基(b)＋SEQ ID NO 7 ペプチド 1mM
(h)培養基(b)＋SEQ ID NO 8 ペプチド 1mM
(i)培養基(b)＋SEQ ID NO 9 ペプチド 1mM
(j)培養基(b)＋SEQ ID NO 10 ペプチド 1mM
(k)培養基(b)＋SEQ ID NO 11 ペプチド 1mM
(l)培養基(b)＋SEQ ID NO 12 ペプチド 1mM
(m)培養基(b)＋SEQ ID NO 13 ペプチド 1mM
(n)培養基(b)＋SEQ ID NO 14 ペプチド 1mM
(o)培養基(b)＋SEQ ID NO 15 ペプチド 1mM
(p)培養基(b)＋SEQ ID NO 16 ペプチド 1mM
(q)培養基(b)＋SEQ ID NO 17ペプチド 1mM
(r)培養基(b)＋SEQ ID NO 18 ペプチド 1mM
(s)培養基(b)＋SEQ ID NO 19 ペプチド 1mM

実施例１の培養条件下での24時間の培養後、細胞を固定し、DAPIで着色して、蛍光顕微鏡下で形態を調べるか、またはフローサイトメトリーによって調べた。アポトーシス細胞数と総数とを決定し、アポトーシス率(アポトーシス細胞の百分率)を計算した。三つの独立な実験のデータの平均値と標準偏差とを、表２に示す。本発明によるアポトーシス抑制活性ペプチドは、正の抑制率を示すが、本発明による誘発性のペプチドは、負の抑制率を示す。

下記のペプチドを試験した:

*正の抑制率=抑制物質;負の抑制率=誘発物質

本発明においては、抑制率を下記のように計算する:
−抑制率[%]=(測定アポトーシス率・100/アポトーシス率対照)−100

アミノ酸鎖を延長することによる抑制効果の改良

細胞培養と試験を、実施例５に述べたようにして実施した。使用したペプチドを表３に示す。

延長されたペプチド配列の場合の結果

*正の抑制率=抑制物質;負の抑制率=誘発物質

【配列表】

Claims

SEQ ID NO １〜19に示されているアミノ酸配列の一つを有する少なくとも一つのペプチド部分を含むことを特徴とするアポトーシス活性物質。
ペプチドまたは蛋白質であることを特徴とする請求項１に記載の物質。
SEQ ID NO １〜19に示されているペプチドから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載の物質。
アミノ酸配列SEQ ID NO １〜19の一つから誘導されるペプチド類似体であることを特徴とする請求項１に記載の物質。
SEQ ＩD NO １〜11に示されているアミノ酸配列の一つを有する少なくとも一つのペプチド部分、または該アミノ酸配列から誘導されるペプチド類似体を含み、かつ抗アポトーシス活性であることを特徴とする請求項１から４の中の１つに記載のアポトーシス活性物質。
SEQ ID NO １２〜19に示されているアミノ酸配列の一つを有する少なくとも一つのペプチド部分、または該アミノ酸配列から誘導されるペプチド類似体を含み、かつアポトーシス誘発活性であることを特徴とする請求項１から４の中の１つに記載のアポトーシス活性物質。
請求項１〜６の一つに記載の少なくとも一つの物質、または該物質の薬剤的に許容される塩と、薬剤的に許容される基剤とから成ることを特徴とする薬剤組成物。
請求項１〜６の中の１つに記載の物質、または該物質の薬剤的に許容される塩の、薬剤の製造のための使用。
請求項５に記載の物質、または該物質の薬剤的に許容される塩の、動脈硬化の治療用の薬剤の製造のための使用。
請求項５に記載の物質、または該物質の薬剤的に許容される塩の、アルツハイマー病の治療用の薬剤の製造のための使用。
請求項５に記載の物質、または該物質の薬剤的に許容される塩の、AIDSの治療用の薬剤の製造のための使用。
請求項５に記載の物質、または該物質の薬剤的に許容される塩の、傷の治療用の薬剤の製造のための使用。
請求項６に記載の物質、または該物質の薬剤的に許容される塩の、癌の治療用の薬剤の製造のための使用。
標識付けされている、請求項１〜４の中のいずれか１つに記載の物質。
診断手段としての、請求項１４に記載の物質の使用。
動脈硬化病変の発見のための診断手段としての、請求項１４に記載の物質の使用。
癌の診断手段としての、請求項１４に記載の物質の使用。