JP2005525914A - デリバリー系における細胞沈殿の妨害のための細胞デリバリー流体 - Google Patents

Abstract

方法は、哺乳類への移植のために細胞の種類を選択し、そして細胞種の比重又は密度を同定することを含む。次に、選択された細胞種の比重又は密度にほぼ適合した比重又は密度の範囲内の比重又は密度を有するキャリアー流体が選択される。哺乳類の組織への生育細胞のデリバリーのための流体も提供され、キャリアー流体組成物の密度はキャリアー流体により首尾一貫してデリバリーされる細胞の密度と適合される。

Description

発明の分野
発明は、医療用装置に関連する細胞デリバリーキャリアー媒質、及び組織の成長を生じさせるために細胞デリバリーする方法に関する。
発明の背景
以前、組織の新規な成長をもたらすために哺乳類の体内の位置へ細胞をデリバリーすることに興味があった。この技術は、移植された細胞からの新規な組織の成長を促進するためにデザインされ、しばしば細胞を受取る同じ哺乳類に由来し、そして移植の領域内で新規な組織を生成するようにデザインされる。様々な種類の組織を移植して良く、例えば、骨、軟骨、筋肉及び他の種類を含む。

心臓の組織は、心筋梗塞又は鬱血性心機能不全により重度の損傷を受けた心臓の壁及び他の領域を修復するための、細胞デリバリーの努力の対象でもあった。そのような使用の一つの例は、損傷を受けた組織を再生させ、再度の血管形成及び脈管形成を促進させるために患者の心筋へ外科手術によりデリバリーされた骨格筋由来の筋原細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）又は幹細胞を含む。デリバリーあたりの細胞の所望な容量濃度（ｖｏｌｕｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）は指示に従い変化するが、幾千万から幾億の細胞を一つ又は複数の部位へデリバリーされることを意図させることも稀ではない。
発明の簡単な概要
発明は、デザインされた部位への細胞の意図されたデリバリーの間の細胞沈殿（ｓｅｔｔｌｉｎｇ）の問題の認識を含み、即ち意図された濃度の細胞がデリバリーされることを妨害する。この問題を克服する方法、及び続くデリバリーの不正確さは、細胞沈殿を防ぐ、哺乳類への移植のための細胞キャリアー流体懸濁液を製造する方法を提供することである。上記の方法は、哺乳類への移植のために細胞の種類を選択し、そして細胞の種類の特定の重量を同定することを含む。次に、特定の重量の範囲内で特定の重量を有するキャリアー流体が選択される。これにより、細胞が浮遊又は沈殿する傾向がないように、しかし懸濁液中でとどまることにより哺乳類において一つ又は複数のデリバリーの行き先において受容可能な率の細胞のデリバリーを可能にさせるように、選択された細胞種による特定重量の適切な適合が可能になる。デリバリーの行き先において受容可能な生存率の細胞を補償するように、同定された流体が適切な浸透圧及びｐＨを有することを補償することがさらに望まれる。キャリアー流体及び細胞を適当な流体懸濁液中へ混合させることにより、経皮又は外科手術により、特定の部位への意図された量の特定の細胞の、より正確且つ堅実なデリバリーを達成することが可能である。

哺乳類の組織へのデリバリーのための細胞キャリアー流体懸濁液は、キャリアー流体成分の密度を目的の細胞の密度に適合させるようにも提供される。従って、当該細胞キャリアー流体懸濁液は、欠損した組織を治療することにおいて多大なる有効性を伴って組織形成流体懸濁液を提供する。
発明の詳細な説明
発明は、哺乳類内部の標的とされたデリバリー部位への、懸濁液中の細胞の正確且つ予測可能なデリバリーのための新規な方法及び組成物を提供する。当該方法及び組成物は、標的の位置において新規な組織を成長させるための、より正確且つ精密な量の細胞及び懸濁流体のデリバリーを意図する。そのような細胞は、成熟した筋原性細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、プルキニエ細胞、繊維芽細胞）、前駆（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）筋原性細胞（例えば、筋原細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ））、成熟非筋原性細胞（例えば、内皮及び上皮細胞）、造血細胞（単球、マクロファージ、繊維芽細胞、アルファ島細胞、ベータ島細胞、臍帯血細胞、赤血球、血小板等）又は幹細胞（多能性幹細胞、間充織細胞、内胚葉幹細胞、外胚葉幹細胞、成人又は胎児、又は自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）、同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）又は異種（ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ））を含んでよい。より特定すれば、この発明に従いデリバリーしてよい細胞は、さらに、島細胞、肝細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、神経細胞、グリア細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、骨格筋原細胞、髄核細胞及び上皮細胞を含む。上記の細胞種の何れも、組換え技術により細胞内へ導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを含むように遺伝子操作することができる。細胞に導入されたＤＮＡ又はＲＮＡは、限定ではないが、新規の遺伝子、プロモーター、干渉ＲＮＡ等を含む。従って、組織は、軟骨、皮膚、上皮層、新規器官、中枢神経系組織及び筋肉の新規な成長をもたらすように形成してよく、特定の心筋機能の再生に適切な組織を含む。本発明の本質的な側面に沿った方法及び組成物は、例えば上に掲載されたものであろうとなかろうと莫大な種類の細胞のデリバリーを、はるかに改善された様式にて増加した効率を伴って可能にさせるかもしれないことが認識される。細胞密度適合したキャリアー流体と共に使用された上記細胞の何れもが、放射性同位体標識、蛍光タグ、控訴によるタグにより標識されるか又はタグを付加されるか、あるいは特定の細胞蛋白質抗体マーカーと混合してさらに使用されてよいことが認識される。

正確な細胞デリバリーのチャレンジ（及び栄養を伴う）は、キャリアー媒質としてのゲルマトリックスの使用により取り組まれ、例えば米国特許第６，１７１，６１０号Ｂ１；第６，１２９，７６１号；第５，６６７，７７８号に示されるとおりである。典型的には、デリバリー部位において細胞を安定化させるために、ヒドロゲル中の懸濁液中に細胞を入れる。しかしながら、カテーテルを通した高粘度ゲルの注射に要求される相対的に高い圧力のために、ゲルの使用による問題が持ち上がり、直接の外科手術経路よりも低い侵入性のアプローチを一般には考慮する。さらに、相対的に長い分子であって高い粘度を有する物質であって、デリバリーの間に剪断応力の増加をもたらして細胞により多くの損傷をもたらす物質を、ゲルは利用する。あるいは、外科手術によるか又は内視鏡によりデリバリーされるゲルはそれらの手法に付随する危険因子及び非能率をも共有するに違いない。

別の種類の細胞デリバリーは米国特許第５，５４３，３１６号において示されたものであり、延長された期間にわたり筋原細胞の生存性を保持するようにデザインされた特定の成分を有する注射グレードの媒質を筋原細胞と共に含む注射可能な組成物を記載する。媒質の浸透圧は、好ましくは約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇから約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇ（例えば、より好ましくは約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約４５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約５５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、等）である。この技術は、極めて高濃度の細胞の意図されたデリバリーと組み合わされ、有効な細胞デリバリー治療のチャレンジを克服する別の方法を代表する。

上記の引用は、細胞デリバリーの不正確さの原因に関しての過去の誤解の一例である。過去において、細胞死が細胞デリバリーの問題の原因であり、例えば時間、圧力、デリバリー媒体の管腔の直径、及びデリバリーされる細胞のサイズの組み合わせにより誘導される剪断応力により引き起こされるものと推定されてきた。何が十分に理解されていなっかったかと言えば、流体溶液中の細胞沈殿がデリバリーの不正確さの重要な原因であったということであった。

何が十分理解されていなかったか又は明らかにされていなかったかといえば、流体媒質中でデリバリーされる細胞の両立しない濃度の問題に対する単純な解釈である。出願人はこの問題を認識して、有効な治療に対するこの障害を克服するためにデザインされた特性を有する細胞デリバリー媒質を同定した。当該細胞デリバリー媒質は、デリバリーする細胞と密度が適合する。例えば、経静脈カテーテルデリバリーにおいては、細胞デリバリー媒質は約１００ｐｓｉを下回る圧力にて送達可能な十分低い粘度を有することが好ましい（限定ではないが、例えば、８０ｐｓｉ，７０ｐｓｉ，６０ｐｓｉ，４０ｐｓｉ，３５ｐｓｉ，２０ｐｓｉ，又は１５ｐｓｉ等におよそ等しいか又はそれ未満の圧力を含む）。

当業者は、デリバリーチューブの内径（Ｉ．Ｄ．）がデリバリーされた溶液の流体力学に影響することを認識する。例えば、０．０１２インチの内径の６０インチの長さのカテーテルにおいては、１センチポアズの流体を容易にデリバリーすることは可能であったが、使用された圧力においては５センチポアズの流体をデリバリーすることは不可能であった。類似の例において、０．０１７インチの内径の１２インチの長さのカテーテルにおいて、５０センチポアズを含む５０センチポアズまでの流体を容易にデリバリーすることは可能であった。これらの特性は、細胞の生存性、内科医のデリバリーの容易さ、及び患者の安楽及び回復を最大化する。

様々な内径のカテーテルを選択された細胞密度溶液（限定ではないが、０．０１７インチ、０．０１６インチ、０．０１４インチ、０．０１３５インチ、０．００１２インチ、０．００９インチ等）にて使用できることが認識される。同様に、これらの溶液中の細胞に関して証明された高い生存率のため、以前に可能であると信じられていたよりもはるかに高い剪断速度を使用することができ、限定ではないが、１０００ ｌ／秒、２０００ ｌ／秒、３０００ ｌ／秒、４０００ ｌ／秒、５０００ ｌ／秒、６０００ ｌ／秒、７０００ ｌ／秒、８０００ ｌ／秒に等しいか又はそれより大きい速度を含む。記載された細胞デリバリー流体の一つの特徴は、それらがカテーテル中ではるかに高い剪断応力を細胞に残存させることである（限定ではないが、１Ｎ／ｍ^２，２Ｎ／ｍ^２，３Ｎ／ｍ^２，４Ｎ／ｍ^２，５Ｎ／ｍ^２，６Ｎ／ｍ^２等に等しいか又はそれより大きい応力を含む）。当業者は、細胞の生存性がカテーテル中の剪断応力に比例し、そしてそれが経験する時間の長さが有効な剪断応力に比例することを認識するはずである。細胞がカテーテル内で有効な剪断応力を経験する有効な時間は約１０ｍｓｅｃほどの短さから上は５０００ｍｓｅｃであってよいことが認識される（４０００ｍｓｅｃ未満、３０００ｍｓｅｃ未満、２０００ｍｓｅｃ未満、１０００ｍｓｅｃ未満の範囲を含む）。よって、細胞に関しての理想的な生存率は、デリバリーの要求、剪断応力、及びデリバリー時間を有効に適合させることにより最適化してよい。

また、細胞デリバリー装置を用いて、相対的に短い長さで出来る限り大きな内腔サイズのデリバリー装置において、より直接的な外科によるアプローチにより高い粘度が可能かもしれず、そしてこの発明の利益をなおも享受することが認識される。しかしながら、細胞キャリアー流体媒質は、最適な結果のために、それが輸送する細胞と適合した密度（又は比重）でなければならない。しかしながら、本発明は、デリバリーされた細胞を伴うこれらのキャリアーの使用がカテーテル内での少なくとも一つの測定可能な流体力学を改善するか又は有効なデリバリーの少なくとも一つの測定値を改善するように、最適に適合された細胞密度キャリアーより低いものを使用してよい。密度キャリアーの上述の適合と整合して、細胞密度溶液があらゆる所定の細胞密度の約１０％以内、約５％以内、約２％以内、約１％以内、約０．１％以内、又は約０．０１％以内であってよい。正確な処方を用いて、適切かもしれない媒質の公知の例は、Ｉｓｏｖｕｅブランドイメージ増強媒質（Ｂｒａｃｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓより販売）、パーフルオロオクチルブロミド（パーフルブロン）、Ｏｘｙｇｅｎｔブランド名にて知られる（Ａｌｌｉａｎｃｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓより販売）、デキストラン溶液、例えば、Ｄｅｘｔｒａｎ ４０ Ｉ．Ｐ．，標準塩溶液中のＭｉｃｒｏｓｐａｎ ４０、及び５％デキストロース中のＭＩＣＲＯＳＰＡＮ４０（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃメセンテロイデスにより製造）を含む。

本発明の別の態様において、細胞密度適合溶液は、イメージ増強剤としても機能するかもしれない。イメージ増強剤は、デリバリーされた流体をイメージして細胞密度を釣り合わせるために有効に使用することができる。そのような試薬は、ヨウ素に基づく溶液（例えば、イオパミドール、Ｉｓｏｖｕｅ−３００としてＢｒａｃｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓにより販売）、ガドジアミド（Ｃｌａｒｉｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより販売されているＯｍｉｎｉｓｃａｎ）、及びＩｎＦｅＤ（Ｓｃｈｅｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌにより製造されている鉄デキストラン）を含む。

本発明のさらに別の態様において、細胞医密度適合溶液は、その検出の助けとなるように、標識されるか又はタグを付加してもよい。多数の上記の試薬が、放射性要素と共に合成されるか又は放射性タグを付加されやすい（例えば、放射性Ｃ^１４又はＨ^３標識されたグルコース溶液、放射性Ｏｓｏｖｕｅ、放射活性ヨウ素（Ｉ^１２５）試薬、等）。イメージ増強剤は、デリバリーされた流体をイメージして細胞密度を釣り合わせるために有効に使用することができる。そのような試薬は、ヨウ素に基づく溶液（例えば、イオパミドール、Ｉｓｏｖｕｅ−３００としてＢｒａｃｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓにより販売）、ガドジアミド（Ｃｌａｒｉｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより販売されているＯｍｉｎｉｓｃａｎ）、及びＩｎＦｅＤ（Ｓｃｈｅｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌにより製造されている鉄デキストラン）を含む。

多数の文献が細胞密度を決定するために利用可能である。以下に掲載されるのは、所定の細胞種に関して公表されたいくつかの密度の値である。
細胞比重
赤血球細胞： １．１０
幹細胞（ＣＤ３４細胞）： １．０６５
血小板： １．０６３
単球： １．０６８
リンパ球： １．０７７
肝細胞： １．０７−１．１０
顆粒球： １．０８−１．０９
掲載された値は例示であって限定ではなく、関連した細胞集団に関して実験的に決定することができる。例えば、Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａの製品）は細胞の密度勾配遠心分離のための満足に表示された媒質である。Ｐｅｒｃｏｌｌは遠心分離の間に自己生成された勾配を形成して、遠心分離前にＰｅｒｃｏｌｌと混合された細胞は、勾配がインサイチュにて形成されるにつれて、密度差によりバンドを形成する。Ｐｅｒｃｏｌｌは細胞密度を見いだすのに使用可能な密度マーカービーズ（Ｓｉｇｍａ製品番号＃ＤＭＢ−１０）と共に使用することができる。

記載されたキャリアー中に懸濁されてデリバリーされた細胞は、実際の有効な細胞濃度において広範囲に変更してよい。細胞濃度は、ミリリットルあたり約１ｘ１０^９細胞からミリリットル（ｍｌ）あたり約１ｘ１０^６細胞に変化してよい（細胞のサイズに依存して約１ｘ１０^９細胞／ｍｌ、約５ｘ１０^８細胞／ｍｌ、約１ｘ１０^８細胞／ｍｌ、約５ｘ１０^７細胞／ｍｌ、約１ｘ１０^７細胞／ｍｌ、約５ｘ１０^６細胞／ｍｌ、及び約１ｘ１０^６細胞／ｍｌ等を含む）。細胞の数と共に、細胞のデリバリーされる濃度の選択は、標的部位へのデリバリーされた細胞及び媒質のための適当なデリバリーキャリアーを選択することにおいて適合された一つの基準である。

この発明のいくつかの到達点の一つは、キャリアー媒質に入れられた細胞の不所望の沈殿を軽減するか又は防ぐことである。これは、公知の一致した（及び好ましくは極めて高い）細胞デリバリー濃度比、即ち、デリバリーされた細胞を達成するためになされ、即ち、医師により特定の部位へデリバリーされることを意図された利用可能な細胞と比較して、デリバリーされた細胞が１：１の値に近くなるべきである。高いパーセンテージのデリバリーされた細胞が機能して十分に受容されるレベルで複製するように受容可能な生存率（好ましくは１：１に近い）が達成されることを補償することが、類似の到達点である。この到達点を達成する方法及び組成物を提供することは、この種の処理の既知のデリバリーの能力を超える巨大な改善を可能にし、そして多数の人々に利用可能なこの形態の医学処置の信頼性を改善する。

出願人は、カテーテルに基づく細胞デリバリーにおいては細胞死より細胞の損失があるいは決定的な問題であったことを、調査を通して十分に理解した。その実現後に、デリバリー構造への接着よりむしろ細胞の沈殿により引き起こされるものとして、特定の実験が細胞の損失を確認した。出願人は、細胞沈殿の問題がポンプ又はカテーテルの使用を通してか否かに拘わらず、あらゆる細胞デリバリー法に対しての決定的な成分であることも、調査を通して十分に理解した。カテーテルの応用は、心臓デリバリーカテーテルによる使用を含むはずである；心外膜、心内膜、心膜、管腔内（ｉｎｔｒａｌｕｍｅｎａｌ）（例えば、冠動脈内、静脈内）等など。細胞デリバリー均衡溶液の使用は、他の非心臓性デリバリー方法論、例えば神経血管、末梢血管等においても、より適切なはずであり、より一般的には細胞のシリンジデリバリーである。
実施例Ｉ
繊維芽細胞を１００分にわたり５０ｍＬの遠心分離管内で、氷上及び室温（ＲＴ）の両方で保存した。氷及びＲＴ懸濁液の両方の上部及び底部から２０分ごとにピペットによりサンプルを取り出した。最初の６０分間は混合をしなかった。８０分の時間点において、穏やかな混合（手で渦を巻かせる）をサンプリング直前に行った。１００分の時間点において、激しい混合（手で激しく混合）をサンプリングの直前に行った。

図１は、この実験の結果としての上部／底部細胞係数比を示す。室温においたか氷上においたかに拘わらず、静止の繊維芽細胞懸濁液の層化が明らかに証明される。６０分過ぎて、懸濁液の上部から採られた細胞の濃度は底部から採られた濃度のたった３０％であった。しかし、穏やかな混合の後に（８０分時間点）、懸濁液の平衡が明らかに復活した。

実施例Ｉに示す結果は、時間を掛けて動かさなくしたときに繊維芽細胞懸濁液がそれらの初期濃度を維持しないことを証明する。結果が示すことは、懸濁液の沈殿が起こるが、穏やかな混合によりこれらの懸濁液は平衡に戻るということである。この発見はデリバリー装置、デリバリー媒質、及び全デリバリー系のデザインに対して潜在的な衝撃を有するが、適切な濃度の治療用の細胞がカテーテルを通して反復して且つ確実性をもってデリバリーされ得ることを確実にすることが決定的になるからである。しかしながら、迅速な沈殿が起こるかもしれないと認識したなら、デリバリー媒体及び注射物の（ｉｎｊｅｃｔａｔｅ）媒質の一定の撹拌によりそのような現象を阻止する必要があるかもしれない。しかしながら、実際問題として、そのような撹拌は医師にとっては不所望である。結果として、その媒質によりデリバリーされる細胞を用いてキャリアー媒質の適合された密度を達成するために新規な溶液を出願人は見いだした。

通常の塩溶液より高く細胞媒質の比重を増加させるために、Ｉｓｏｖｕｅブランドのイメージ増強媒質の等張希釈溶液を用いて、ヒト繊維芽細胞の沈殿の阻止を調査した。
実施例ＩＩ
Ｉｓｏｖｕｅ−３００イメージ増強媒質（Ｂｒａｃｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから販売）及びヒトの皮膚の繊維芽細胞の希釈液として、細胞デリバリー媒質の密度を細胞と適合させた。Ｉｓｏｖｕｅはイオパミドールの活性剤を伴う非イオン性イメージ増強媒質である。Ｉｓｏｖｕｅ−３００のパッケージ挿入物は、３００ｍｇ／ｍＬ（６１％）としての濃度、６１６ｍＯｓｍ／ｋｇ水のオスモル濃度、２０Ｃにおける８．８ｃＰの粘度、及び１．３３９の比重を記載する。１：２に希釈されたＩｓｏｖｕｅのオスモル濃度は約３００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、そして計算された比重は１．１７０である。ハンクスバランスド塩溶液（ＨＢＳＳ）に懸濁された繊維芽細胞を、次に、希釈されたＩｓｏｖｕｅ媒質により希釈することにより、比重１．０６０を達成した。ＨＢＳＳ及び希釈されたＩｓｏｖｕｅ媒質の両方のオスモル濃度は約３００ｍＯｓｍ／ｋｇであるから、希釈により、希釈された細胞懸濁液のオスモル濃度は変化しない。

試験された溶液の比重は１．０６０（媒質Ａ）、１．０８０（媒質Ｂ）、及び１．００５（対照−媒質Ｃ）であった。３つの溶液の上部及び底部の細胞濃度を、沈殿時間の前と４時間後に計数した。図２に示すとおり、対照に比して、高密度溶液の両方共が顕著に繊維芽細胞の沈殿を遅延させた。時間をかけた上部層の比較もなされ得る。４時間後に、対照は上部層中に細胞がゼロであり、そして希釈されたＩｓｏｖｕｅ溶液は上部層中の初期細胞計数の１０５及び５７％を有した。４時間後に、全溶液の底の層は初期の計数よりも多い細胞を含んだ。

トリパン細胞計数（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌのトリパンブルーを用いて）を２つの時間点（０及び４時間）において実施した。染色された（死んだ）細胞の数は、塩溶液の対照に比較して、希釈されたＩｓｏｖｕｅ溶液に関して顕著には異ならなかった。希釈されたＩｓｏｖｕｅ溶液は接触の４時間後に細胞膜を顕著に破壊しなかったようである。細胞増殖アッセイは、Ｉｓｏｖｕｅへの暴露並びに塩溶液対照との共存後に繊維芽細胞が増殖したことを示した。
実施例ＩＩＩ
この実験は実施例ＩＩにおいて実施されたのとほとんど一緒であるが、筋原細胞を繊維芽細胞の代わりに用いた点が異なる。通常の塩溶液より高く細胞媒質の比重を増加させるために、Ｉｓｏｖｕｅイメージ増強媒質の等張希釈溶液を用いて、筋原細胞の沈殿の阻止を調査した。試験された溶液の比重は１．０６０（媒質Ａ）、１．０８０（媒質Ｂ）、及び１．００５（対照−媒質Ｃ）であった。３つの溶液の上部及び底部の細胞濃度を、沈殿時間の前と４時間後に計数した。

図３に示すとおり、ＨＢＳＳ対照に比して、高密度溶液の両方共が顕著に筋原細胞の沈殿を遅延させた。４時間後に、対照は上部層中に細胞がゼロであり、そして希釈されたＩｓｏｖｕｅ溶液は上部層中の初期細胞計数の７５及び８５％を有した。４時間後に、媒質Ａ及びＢは、遠心分離管の底の層に凝集した細胞のいくつかを有する対照を懸濁した細胞の繊維（ｓｔｒａｎｄｓ）を有した。４時間後の筋原細胞の繊維は予測外であったが、繊維芽細胞において観察されなかったからである。遠心分離管を増殖アッセイの前に手による渦巻きで穏やかに撹拌した。穏やかな混合の後のこれらの細胞の計数は、容器の壁又はお互い（凝集）への接着のために、細胞の２４−４０％が４時間後に損失していたことを示す。細胞の沈殿は接着よりも重要な問題であり、対照は沈殿の４時間後に管の底に２９倍の増加数の細胞を有した。筋原細胞の密度は約１．０６ｇ／ｍｌである。トリパン染色された（死んだ）細胞の数は極めて少なく、そして３つの溶液間で顕著に異ならなかった。希釈したＩｓｏｖｕｅ媒質は接触の４時間後に筋原細胞の膜を顕著に破壊しないらしい。細胞増殖アッセイは、Ｉｓｏｖｕｅへの暴露の前と同じく、暴露の後でも、筋原細胞が増殖したことを示す。

出願人の以前の実験は、キャリアー流体の密度及び浸透圧をデリバリーされる細胞のそれらに適合させることにより、細胞の沈殿が最小になり得ることを証明した。追加の実験は、様々な物質との接着のために細胞への起こり得る損傷に関する既知の問題の見地からなされた。出願人は実験を成功し、生存していると証明されたが、増殖性の筋原細胞が広範囲のカテーテル材料を通して何れもデリバリーできる。カテーテル材料は、限定ではないが、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリイミド（ＰＩ−医薬グレード）、ポリウレタン、ポリアミド、シリコーン、ポリエチレン、ポリウレタンブレンド、ポリエーテルブロックアミド（例えば、ＰＥＢＡＸ）等を含むか、又は限定ではないがステンレス鋼（ＳＳ）、チタニウムアロイ、ニッケルチタニウムアロイ（例えば、Ｎｉｔｉｎｏｌ）、クロミウムアロイ（ＭＰ３５Ｎ，Ｅｌｇｉｌｏｙ，Ｐｈｙｎｏｘ等）、コバルトアロイ等を含む様々な金属材料を含む様々なポリマーを含んでよい。より好ましくは、カテーテル材料は、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリイミド（ＰＩ）、及びステンレス鋼（ＳＳ）からなる群から選択される。細胞をカテーテルを通してデリバリーした時に研究した一つの特徴（細胞密度溶液中での正確な混合の後）は、期待された移植期間にわたり細胞を保持し、輸送し、そして注入するために使用される様々な容器における筋原細胞及び繊維芽細胞の挙動であった。従って、さらなる実験は、カテーテルの長さ、腔のサイズ、及び血管を介した細胞デリバリーに適したそれらの代表的な材料において、密度適合したデリバリー媒質及び非密度適合デリバリー媒質の組み合わせを含んだ。図４及び６に示されたとおり、及び以下の実施例ＩＶ及びＶＩの研究において使用されたとおり、媒質の幾つかは相対的に高い剪断時間を経るが、それは以前には接着及び細胞デリバリーの不正確さの鍵となるインディケーターであると信じられていた。

実施例ＩＶは、細胞沈殿阻害媒質を用いてカテーテルを通して筋原細胞をデリバリーさせることにより同時に実施された、細胞デリバリーと細胞沈殿の阻害の２つの技術を評価する。上記の研究は、パラメーターのバリエーション及び細胞の生存に対するそれらの効果に焦点を合わせる。興味のあるデザインパラメーターは、圧力、流速、カテーテルの直径、カテーテルの長さ、及び細胞の濃度を含む。沈殿阻害媒質からデリバリーされる細胞の濃度と生存率を測定して、ＨＢＳＳからデリバリーされた細胞のそれらと比較する。沈殿阻害媒質中に懸濁させた細胞が混合の要求なしにデリバリーできるか否かを決定するための努力において、細胞を４０分間沈殿させる。
実施例ＩＶ
３つの異なるデリバリー溶液を調製した。細胞濃度は全３ｍｌに関しての比（２ｍＬ細胞懸濁液／１ｍＬキャリアー溶液）を使用することにより一定に保った。細胞懸濁液は３つの溶液全てにおいて同じであった。３つのキャリアー溶液各々の組成は以下のとおりであった：
溶液１及び２：以前の実験で使用されたとおりハンクスバランスド塩溶液（ＨＢＳＳ）；
溶液３：Ｉｓｏｖｕｅ３７０／脱イオン（ＤＩ）Ｈ_２Ｏミックス、１．０６０の比重及び３００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度に調節。

溶液３は、Ｉｓｏｖｕｅ３７０イメージ増強媒質をＩｓｏｖｕｅ３００の代わりに用いた以外は、以前の実験の細胞沈殿阻害媒質と類似に調製した。Ｉｓｏｖｕｅ３７０は簡単に言えばＩｓｏｖｕｅ３００よりも濃縮されたイオパミドール溶液であり、そしてＤＩ Ｈ_２Ｏによる追加の希釈（各１６．２ｍＬのＩｓｏｖｕｅ３７０に関して３．８ｍＬのＤＩ Ｈ_２Ｏ）がＩｓｏｖｕｅ３７０媒質の特性をＩｓｏｖｕｅ３００媒質の特性に戻したことが見いだされた。実施例ＩＩＩにおける上記参照方法により希釈を引き続き続けた。

５０ｍＬの遠心分離管内で細胞とキャリアー溶液を混合し、溶液１、２及び３と標記し、そして以下の通りに使用した。カテーテルアッセンブリー１５２．４ｃｍ（６０インチ）長を０．０１２”ＩＤ ＰＥＥＫ管から構築した。筋原細胞は実験を通して５０ｍＬ遠心分離管に保管し、そして使用までは決して凍らせなかった。ＥＦＤモデル１５００ＸＬ流体デリバリー系の使用により、カテーテルを通して細胞をデリバリーした。各実験に関して、以下のデータ−回収した：
・３つの最初の５０ｍＬ遠心分離管の各々からの筋原細胞に対する、血球計計数、及びトリパンブルー生存性計数；
・それら各々のカテーテルを通したデリバリー直後（ｔ＝０）の各溶液からの筋原細胞に対する、血球計計数、及びトリパンブルー生存性計数；
・それら各々のカテーテルを通したデリバリー直後（ｔ＝４０）の各溶液からの筋原細胞に対する、血球計計数、及びトリパンブルー生存性計数。

以下の表Ｉ，ＩＩ及びＩＩＩは、各溶液に関する混合プロトコルを示す。簡単に言えば、溶液１がｔ＝０前に混合しｔ＝４０前には混合しなかったＨＢＳＳ／細胞溶液；溶液２がｔ＝０前とｔ＝４０前の共に混合したＨＢＳＳ／細胞溶液；そして、溶液３がｔ＝０前に混合しｔ＝４０前には混合しなかったＩｓｏｖｕｅ／細胞溶液である。

イヌの骨格筋原細胞を、十分な細胞が利用可能になるまで培養した。筋原細胞を解離させ、洗浄し、そしてＨＢＳＳ中に、適当なキャリアー溶液を含む５０ｍＬ遠心分離管へと再懸濁した。この実験において、出願人は、百万細胞／ｍＬの最小値にてカテーテルへデリバリーすることができた。

前のセクションにて記載された全てのサンプルからの細胞を血球計を使用したマニュアルどおりに計数した。表ＩＶは細胞計数比を細胞／ｍＬの単位で示す。

表ＩＶの結果は、混合なしに４０分が経過した後でさえも、細胞沈殿阻害媒質（このケースでは、Ｉｓｏｖｕｅ３７０媒質の希釈溶液）の使用により、筋原細胞の初期濃度をデリバリーさせることが可能であることを明確に証明する。沈殿阻害媒質からのデリバリー後の筋原細胞の濃度は４０分後でも本質的に変化しなかった（ｔ＝０濃度の９４％）が、混合無しのＨＢＳＳ中の４０分後のデリバリーでは顕著な数の筋原細胞が損失した（ｔ＝０のたった３８％しかデリバリーされなかった）。これらの結果は、混合しなくても、カテーテルデリバリーにおいて筋原細胞の濃度を保持することに関しての細胞沈殿阻害媒質の有効性を明確に示す。
実施例Ｖ
ヒトの皮膚の繊維芽細胞を回収し、計数し、そして等しく２つの別々の管に分割した。各管内の細胞の数は約３億７５００万細胞であった。各管の組成は次の通りであった：
溶液−：ハンクスバランスド塩溶液（ＨＢＳＳ）と、細胞；
溶液＋：ハンクスバランスド塩溶液（ＨＢＳＳ）と、Ｉｓｏｖｕｅ３７０と混合された細胞、１．０６０の比重及び３００ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度に調節。管を室温に放置し、０、４０分及び３時間目に写真を撮った（図５）。図５は、標準のハンクスバランスド塩溶液に比しての、細胞沈殿に対して、Ｉｓｏｖｕｅ３７０を含む比重適合溶液が有する効果を示す。
実施例ＶＩ
細胞デリバリー流体の性能を、材料、長さ、及びデリバリー圧力を変えながら異なるカテーテルを横切って（以下の一般的カテーテルアッセンブリーも参照）、異なる細胞種に関して（例えば、繊維芽細胞及び筋原細胞−以下の細胞調製も参照）評価するために、幾つかの試験を実施した（図６）。様々なデリバリーパラメーター、例えば、剪断応力、剪断圧力、剪断時間に基づいて（以下の流体流れパラメーターも参照）、デリバリーによりもたらされる生存細胞のパーセンテージを測定した。

図７Ａから７Ｈは管腔カテーテル表面のＳＥＭ写真である。図面の各対において、左のイメージは１００Ｘ拡大にて撮られ、そして右のイメージは１０００Ｘであった。１０００Ｘイメージは類似の１００Ｘイメージのほぼ中心からの典型のエリアである：図７Ａと７Ｂは細胞への暴露無しの後のＰＥＥＫカテーテル管腔の写真である；図７Ｃと７Ｄは筋原細胞のデリバリー後のＰＥＥＫカテーテル管腔の写真である；図７Ｅと７Ｆは細胞への暴露無しの後のステンレス鋼カテーテル管腔の写真である；筋原細胞へのデリバリー後のステンレス鋼カテーテル管腔の写真である。これらのイメージは、細胞デリバリーがカテーテルの内部表面に対してほんの僅かな残余の細胞しか残さないことを示す。
一般的な細胞と調製
ヒト皮膚繊維芽細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）又は後の実験ではイヌの骨格筋原細胞を組織培養用フラスコ中で、特別生育培地（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて培養した。培地は３日ごとに交換してコンフルエントになったとき、細胞を継代して培養物を増殖させた。十分な細胞が利用可能であることを測定したのちに、細胞を一度ハンクスバランスド塩溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄し、そして次に５分間の酵素洗浄（０．２５％トリプシン）を３７℃にて行って、細胞を解離させた。結果の細胞懸濁液を血清含有生育培地で中和して、次に遠心分離（８００ｇ）を１０分間行って細胞沈殿させた。上清を捨てて、沈殿をＨＢＳＳ溶液に懸濁した。この点において、おおよその細胞濃度を血球計細胞計数により測定した。所望の細胞濃度を得るために、ＨＢＳＳの容量を調整した。初期細胞濃度は、血球計細胞計数及びＨＢＳＳ希釈により計算した。最終細胞懸濁液は、実験の継続のために氷の下で保存した。
一般的試験カテーテルアッセンブリー
試験カテーテルアッセンブリーは、様々な長さ及び直径の、ＰＥＥＫ（ポリエーテルエーテルケトン），ＰＩ（ポリイミド），［又は後の実験では、ステンレス鋼（ＳＳ）］のセグメントを、Ｌｏｃｔｉｔｅ７７０１によりプライミングした後に、Ｌｏｃｔｉｔｅ４０１接着剤によりルアーロック（Ｌｕｅｒ−ｌｏｃｋ）突出部アダプターへ結合させることにより、作成した。
一般的流体流れのセットアップ
流体流れのセットアップは、３ｃｃシリンジを適合させた圧縮空気（最大８５ｐｓｉ）により運転される流体ディスペンサー（ＥＦＤ，モデル１５００ＸＬ）からなった。投入される流体（興味のある細胞懸濁液又はＤＩ水）をシリンジに負荷した。シリンジチップを前のセクションで記載された試験カテーテルアッセンブリーに適合させた。デリバリー時間（もっとも近い０．１秒まで）及び圧力（８０ｐｓｉまで）をこの系に適合することができる。適当な容量の細胞懸濁液をデリバリーすることを保証するため、準備段階の流速の測定はＤＩ水を用いて行った。

デリバリーに関して意図された細胞の密度適合の基本的特性をそれが有し、公知の生物学上の適合性が好ましくは高価でなく、そしてイオン塩溶液の用途の種類に適しているなら、様々な媒質の何れもがキャリアー媒質に適していたことが認識される。好ましい細胞デリバリー流体のためのデリバリー装置は医者にとって公知の外観及び間隔を有する成分及び技術を利用してよく、そして低い粘度の流体の特性の媒質の特性のために官能基の容易性を有してよい。出願人により同定された密度適合技術は、複合体を混合するゾーン、リュアーズ（ｌｅｕｅｒｓ）等に関する要求をうまく回避することによりデリバリー系のより単純な構造を可能にさせる。デリバリー系の全ての容器及び管に等しく分配された細胞を用いて、正確で一致した数の細胞がデリバリーされ、より一致した治療結果を達成する。これは、デリバリーカテーテルへの置換後に流体を混合又は振動させる必要無しに達成可能である。一つの態様において、カテーテルは使い捨て医療用装置であるが、これは要求されない。デリバリー系カテーテルは、医学グレードのプラスチック材料及び／又は他の材料、例えば、ステンレス鋼又は他の適切な材料から構築してよい。

この発明の別の態様は、細胞デリバリーの患者に対する効率を増加さる方法を含み、正確な濃度の細胞を患者にデリバリーさせるためのキャリアー流体を提供する工程を含む。キャリアー流体は、溶液中で混合されたときに、患者にデリバリーされる細胞の密度に実質適合させた密度を有するべきである。また、上記溶液は、約６．０から８．０、そしてより好ましくは６．８から７．６、そしてもっとも好ましくは約７．０、約７．２、そして約７．４のｐＨを有するべきである。好ましくは、バランスを取られた媒質は、前記のとおりに実質上等張である。さらなる工程は、キャリアー流体と細胞の密度適合溶液の細胞デリバリーを別の医学的手法と組み合わせることを含む。医学的手法は、様々な種類かつ理想的にはあらゆる医学的な適用のためであってよい。上記の組み合わせは同時に起きてよいが、組み合わせは同時に達成されず、しかし相乗様式にて細胞デリバリー及び他の医学的手法の一つ又は両方を増加させるかもしれない。一つの態様において、医学的手法は、心臓ペース、心臓刺激、心臓電気治療、心臓薬理治療、心臓監視、心臓イメージング、心臓感作、心臓マッピング、椎間手法、外科手法、注入手法、診断手法、及び治療手法のリストから選択してよい。別の態様において、上記医学手法が、神経学的刺激、神経学的電気治療、神経薬理学的治療、神経学上のモニタリング、神経学上のイメージング、神経学上の感作、神経学上のマッピング、椎間手法、外科手法、注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）手法、診断手法、及び治療手法のリストから選択してよい。

即ち、デリバリー系において細胞沈殿を阻害するための細胞デリバリー流体の態様が開示される。当業者は、本発明がそれらの開示以外の態様により実施できることを認識する。開示された態様は、例示の目的であって限定の目的で提示されたのではなく、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。

図１は、上部と底部の細胞カウント比のグラフである。 図２は、上部と底部の全細胞カウントの比のグラフである。 図３は、筋原細胞の沈殿のグラフである。 図４は、カテーテルの値の表である。 図５は、細胞の沈殿の間に撮られたイメージからなる。 図６は、カテーテルを通した細胞デリバリーのデリバリー動力学の表である。 図７Ａ−Ｈは、カテーテル管腔のＳＥＭ写真である。

Claims (42)

1. 哺乳類への移植のための細胞キャリアー流体懸濁液を調製する方法であって、
   ａ．哺乳類への移植のための細胞の種類を選択し、そして細胞種の比重を明らかにし；
   ｂ．選択された細胞種の比重に適切に適合させるようにデザインされた比重の範囲内で比重を有するキャリアー流体を選択することにより哺乳類内のデリバリー目的地において細胞の受容可能なデリバリー比を生じさせ；
   ｃ．同定された流体が適切なオスモル濃度及びｐＨを有することによりデリバリー目的地において細胞の受容可能な生存性を保証することを確実にし；そして
   ｄ．キャリアー流体と細胞を流体懸濁液内で混合すること
   を含む方法。
2. 細胞選択工程が繊維芽細胞又は筋芽細胞を含む細胞種から選択される、請求項１記載の方法。
3. 細胞選択工程が、島細胞、多能性幹細胞、間充織細胞、内胚葉幹細胞、外胚葉幹細胞、肝細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、神経細胞、グリア細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、骨格筋原細胞、髄核細胞、上皮細胞、筋原性細胞、アルファ島細胞、ベータ島細胞、マクロファージ、心筋細胞、プルキニエ細胞、赤血球、血小板及び繊維芽細胞からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
4. キャリアー流体選択工程が、細胞種の比重の約１０％、約５％、約２％、約１％、約０．１％及び約０．０１％からなる群以内の比重を有する流体を選択することを含む、請求項１記載の方法。
5. 細胞種選択工程が、さらに、選択された細胞種を溶液中に入れることを含む、請求項１記載の方法。
6. 混合工程が実質上等張の流体懸濁液をもたらす、請求項１記載の方法。
7. 混合工程が約＋３００／−５０ｍＯｓｍ／ｋｇの等張の範囲内である流体懸濁液をもたらす、請求項１記載の方法。
8. 同定された流体が適切なオスモル濃度及びｐＨを有することを確実にする工程が、デリバリーされた細胞は少なくとも約４時間の時間少なくとも約８０％生存可能であることを確実にする、請求項１記載の方法。
9. 同定された流体が適切なｐＨを有することを確実にする工程が、約６．０から約８．０の範囲のｐＨを有する流体の選択を含む、請求項１記載の方法。
10. 混合工程がバイオリアクター中でキャリアー流体と細胞を混合することを含む、請求項１記載の方法。
11. 細胞が標識されているか又は細胞同定マーカーによりタグを付加されている、請求項１記載の方法。
12. 細胞キャリアー流体がイメージ増強剤も含む、請求項１記載の方法。
13. 細胞キャリアー流体がイメージ増強剤でもある、請求項１記載の方法。
14. 細胞キャリアー流体が放射性要素でもある、請求項１記載の方法。
15. 哺乳類の組織へ細胞をデリバリーするための細胞デリバリーキャリアー流体懸濁液であって、
    ａ．新規な組織の生育を生じさせるための、哺乳類内の目的部位へのデリバリーのための大量の細胞；
    ｂ．溶液中で混合されたときに細胞の密度を実質上適合させる密度を有するキャリアー流体、及び約６．０から８．０の範囲のｐＨを有する実質上等張な溶液；及び
    ｃ．細胞がキャリアー流体溶液中で実質上分散したままであることにより、目的部位へ首尾一貫したデリバリー濃度の細胞を提供すること
    を含む懸濁液。
16. 細胞が、軟骨を形成する細胞、骨を形成する細胞、筋肉細胞、繊維芽細胞、及び器官の細胞からなる群から選択される、請求項１５記載の懸濁液。
17. 懸濁液の等張性が約３００ｍＯｓｍ／ｋｇから約５０ｍＯｓｍ／ｋｇの間である、請求項１５記載の懸濁液。
18. 細胞が、島細胞、多能性幹細胞、間充織細胞、内胚葉幹細胞、外胚葉幹細胞、肝細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、神経細胞、グリア細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、骨格筋原細胞、髄核細胞、上皮細胞、筋原性細胞、アルファ島細胞、ベータ島細胞、マクロファージ、心筋細胞、プルキニエ細胞、赤血球、血小板及び繊維芽細胞からなる群から選択される、請求項１５記載の懸濁液。
19. キャリアー流体が、イオパミドール、パーフルオロオクチルブロミド、ガドジアミド、及び鉄デキストランからなる群から選択される、請求項１５記載の懸濁液。
20. 細胞が標識されているか又は細胞同定マーカーによりタグを付加されている、請求項１５記載の懸濁液。
21. 細胞キャリアー流体がイメージ増強剤も含む、請求項１５記載の懸濁液。
22. 細胞キャリアー流体がイメージ増強剤でもある、請求項１５記載の懸濁液。
23. 細胞キャリアー流体が放射性要素でもある、請求項１５記載の懸濁液。
24. 患者への細胞デリバリーの効率を増加させる方法であって、
    ａ．正確な濃度の細胞を患者へデリバリーするためのキャリアー流体を用意し、キャリアー流体は溶液と混合したときに患者へデリバリーされる細胞の密度と実質上適合した密度を有し、そして溶液は約６．０から８．０の範囲のｐＨを有し且つ実質上等張であり；そして
    ｂ．キャリアー流体と細胞の密度適合溶液の細胞デリバリーを別の医学手法と組み合わせること
    を含む方法。
25. 別の医学手法が、心臓ペーシング、心臓刺激、心臓電気治療、心臓薬理学治療、心臓モニタリング、心臓イメージング、心臓感作、心臓マッピング、椎間手法、外科手法、診断手法、及び治療手法のリストから選択される、請求項２４記載の方法。
26. 別の医学手法が、神経学的刺激、神経学的電気治療、神経薬理学的治療、神経学上のモニタリング、神経学上のイメージング、神経学上の感作、神経学上のマッピング、椎間手法、外科手法、注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）手法、診断手法、及び治療手法のリストから選択される、請求項２４記載の方法。
27. 別の医学手法が、骨格、内皮、平滑筋、器官、軟骨、中枢神経系、末梢神経系、リンパ系、及び心臓血管系のリストから選択される、請求項２４記載の方法。
28. 細胞デリバリーがポンプを用いてなされる、請求項２４記載の方法。
29. 細胞デリバリーがカテーテルを用いてなされる、請求項２４記載の方法。
30. 細胞デリバリーがシリンジを用いてなされる、請求項２４記載の方法。
31. 細胞デリバリーが薬剤点滴機構においてなされる、請求項２４記載の方法。
32. 細胞キャリアー流体がイメージ増強剤でもある、請求項２４記載の方法。
33. 細胞キャリアー流体が放射性要素も含む、請求項２４記載の方法。
34. 細胞が、島細胞、多能性幹細胞、間充織細胞、内胚葉幹細胞、外胚葉幹細胞、肝細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、神経細胞、グリア細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、骨格筋原細胞、髄核細胞、上皮細胞、筋原性細胞、アルファ島細胞、ベータ島細胞、マクロファージ、心筋細胞、プルキニエ細胞、赤血球、血小板及び繊維芽細胞からなる群から選択される、請求項２４記載の方法。
35. 細胞が標識されているか又は細胞同定マーカーによりタグを付加されている、請求項２４記載の方法。
36. 細胞キャリアー流体がイメージ増強剤も含む、請求項２４記載の方法。
37. 使用又は調節のために適した特定の特徴を有する流体に関する使用であって、細胞デリバリーキャリアー媒質としての使用であり、
    ａ．哺乳類の組織生育部位へデリバリーされる細胞密度に実質上適合した密度を有するキャリアー流体として流体を作成し、流体が作成されることにより、それを溶液として細胞と混合したときに溶液が約６．０から８．０の範囲のｐＨを有して実質上等張であり；
    ｂ．但し、細胞は首尾一貫したデリバリー濃度の細胞を目的部位へ提供するためにキャリアー流体溶液内に実質上分散したままである、
    使用。
38. 流体が非イオン性イメージ増強剤からなる群から選択される製剤を含む、請求項３７記載の流体。
39. 流体が、イオパミドール及びパーフルオロオクチルブロミドからなる群から選択される製剤を含む、請求項３７記載の流体。
40. 細胞が標識されているか又は細胞同定マーカーによりタグを付加されている、請求項３７記載の流体。
41. 細胞キャリアー流体がイメージ増強剤でもある、請求項３７記載の流体。
42. 細胞キャリアー流体が放射性要素でもある、請求項３７記載の流体。

Images