JP2005525800A - 遺伝的に修飾された脊椎動物前駆体リンパ球の生成方法及び異種結合タンパク質の産生を目的としたその使用。 - Google Patents
遺伝的に修飾された脊椎動物前駆体リンパ球の生成方法及び異種結合タンパク質の産生を目的としたその使用。 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005525800A JP2005525800A JP2003567945A JP2003567945A JP2005525800A JP 2005525800 A JP2005525800 A JP 2005525800A JP 2003567945 A JP2003567945 A JP 2003567945A JP 2003567945 A JP2003567945 A JP 2003567945A JP 2005525800 A JP2005525800 A JP 2005525800A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- heterologous
- expression
- antibody
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 128
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 112
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 title claims abstract description 81
- 239000002243 precursor Substances 0.000 title claims abstract description 50
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 123
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 title abstract description 98
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 389
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 228
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 207
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 198
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 178
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 163
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 128
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 99
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 99
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 88
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 86
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 83
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 80
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 76
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 76
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 71
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 claims description 62
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 62
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 62
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 60
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 58
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 54
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 53
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 53
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 49
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 46
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 46
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims description 44
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 44
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 43
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 claims description 41
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 35
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 31
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 30
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 30
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 29
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 28
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims description 28
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 claims description 27
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 27
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims description 27
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 26
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 26
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 25
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 24
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 24
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 24
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 24
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 24
- 108060006897 RAG1 Proteins 0.000 claims description 20
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 20
- 102000001183 RAG-1 Human genes 0.000 claims description 19
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 19
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 19
- 101150008942 J gene Proteins 0.000 claims description 18
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 18
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 18
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 18
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 claims description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 17
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 17
- 101150097493 D gene Proteins 0.000 claims description 16
- 108010032099 V(D)J recombination activating protein 2 Proteins 0.000 claims description 16
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 102100029591 V(D)J recombination-activating protein 2 Human genes 0.000 claims description 14
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 claims description 14
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 14
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 14
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 13
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 13
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 12
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 12
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 11
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 claims description 10
- 210000005211 primary lymphoid organ Anatomy 0.000 claims description 10
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 claims description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 9
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 9
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 claims description 7
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 7
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 7
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 7
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims description 6
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 6
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 6
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 claims description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 6
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 claims description 6
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims description 5
- 230000011712 cell development Effects 0.000 claims description 5
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 claims description 5
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 claims description 5
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 claims description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 4
- 241000700198 Cavia Species 0.000 claims description 4
- 108010060248 DNA Ligase ATP Proteins 0.000 claims description 4
- 102100033195 DNA ligase 4 Human genes 0.000 claims description 4
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 claims description 4
- 102100027828 DNA repair protein XRCC4 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100022204 DNA-dependent protein kinase catalytic subunit Human genes 0.000 claims description 4
- 101710157074 DNA-dependent protein kinase catalytic subunit Proteins 0.000 claims description 4
- 241000283086 Equidae Species 0.000 claims description 4
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000649315 Homo sapiens DNA repair protein XRCC4 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000804921 Homo sapiens X-ray repair cross-complementing protein 5 Proteins 0.000 claims description 4
- 108010033737 Pokeweed Mitogens Proteins 0.000 claims description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 claims description 4
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 4
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 4
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 claims description 4
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 claims description 4
- 102100033733 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Human genes 0.000 claims description 4
- 102100036973 X-ray repair cross-complementing protein 5 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100036976 X-ray repair cross-complementing protein 6 Human genes 0.000 claims description 4
- 101710124907 X-ray repair cross-complementing protein 6 Proteins 0.000 claims description 4
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 claims description 4
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 claims description 3
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 claims description 3
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100039897 Interleukin-5 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims description 3
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 3
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 claims description 3
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 claims description 3
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims description 3
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims description 3
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 claims description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 3
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 claims description 3
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010031480 Artificial Receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 claims description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 2
- 108010084313 CD58 Antigens Proteins 0.000 claims description 2
- 102100025221 CD70 antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 102100027221 CD81 antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 102100030886 Complement receptor type 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000934356 Homo sapiens CD70 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 101000914479 Homo sapiens CD81 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 101000727061 Homo sapiens Complement receptor type 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000777628 Homo sapiens Leukocyte antigen CD37 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 claims description 2
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 claims description 2
- 101001063392 Homo sapiens Lymphocyte function-associated antigen 3 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000835093 Homo sapiens Transferrin receptor protein 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000801228 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 claims description 2
- 101000801232 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 claims description 2
- 101000611023 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100022339 Integrin alpha-L Human genes 0.000 claims description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100031586 Leukocyte antigen CD37 Human genes 0.000 claims description 2
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 claims description 2
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 claims description 2
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100030984 Lymphocyte function-associated antigen 3 Human genes 0.000 claims description 2
- 102000018170 Lymphotoxin beta Receptor Human genes 0.000 claims description 2
- 108010091221 Lymphotoxin beta Receptor Proteins 0.000 claims description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 claims description 2
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 101710187830 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 claims description 2
- 102100040403 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010047295 complement receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 102000006834 complement receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 claims description 2
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 claims description 2
- 229940100602 interleukin-5 Drugs 0.000 claims description 2
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 claims description 2
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 claims 18
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 claims 2
- 108091008032 B cell costimulatory receptors Proteins 0.000 claims 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 claims 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims 1
- -1 poly-dldC Proteins 0.000 claims 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 4
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 abstract description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 155
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 151
- 101150012195 PREB gene Proteins 0.000 description 134
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 114
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 109
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 100
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 82
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 57
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 50
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 49
- 239000000047 product Substances 0.000 description 49
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 46
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 43
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 43
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 42
- 102100021592 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 41
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 41
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 34
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 32
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 30
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 30
- 101100353154 Mus musculus Preb gene Proteins 0.000 description 29
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 25
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 25
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 25
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 25
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 24
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 23
- 210000001948 pro-b lymphocyte Anatomy 0.000 description 22
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 22
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 21
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 21
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 20
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 17
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 description 17
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 15
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 15
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 15
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 15
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 15
- 238000013461 design Methods 0.000 description 15
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 15
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 14
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 14
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 12
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 12
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 12
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 11
- 229940100994 interleukin-7 Drugs 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 11
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 11
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 11
- 102000019260 B-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 10
- 108010012919 B-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 10
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 10
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 10
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 9
- 108010014608 Proto-Oncogene Proteins c-kit Proteins 0.000 description 9
- 102000016971 Proto-Oncogene Proteins c-kit Human genes 0.000 description 9
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 9
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 9
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 8
- 108700025866 RAG-1 Genes Proteins 0.000 description 8
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 8
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 8
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 7
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 7
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 7
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 7
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 7
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 101100179469 Mus musculus Ighg2b gene Proteins 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 230000006909 anti-apoptosis Effects 0.000 description 6
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 6
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 6
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 6
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 6
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 5
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 5
- ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N L-Histidinol Natural products OCC(N)CC1=CN=CN1 ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N L-histidinol Chemical compound OC[C@@H](N)CC1=CNC=N1 ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 5
- 101100381517 Mus musculus Bcl2 gene Proteins 0.000 description 5
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000024191 minimally invasive lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 5
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 5
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 5
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 4
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 4
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 4
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 4
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 4
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 4
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 4
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 4
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 4
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 210000005210 lymphoid organ Anatomy 0.000 description 4
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 4
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 4
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150104214 HGPRT gene Proteins 0.000 description 3
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 3
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 3
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 3
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 210000001280 germinal center Anatomy 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 210000003297 immature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 210000005212 secondary lymphoid organ Anatomy 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 3
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 3
- 101100189106 Arabidopsis thaliana PAB5 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010003497 Asphyxia Diseases 0.000 description 2
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000005768 DNA-Activated Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108010006124 DNA-Activated Protein Kinase Proteins 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102100029098 Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 2
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 2
- 101001065566 Mus musculus Lymphocyte antigen 6A-2/6E-1 Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 108700029233 VDJ Exons Proteins 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 108700000711 bcl-X Proteins 0.000 description 2
- 102000055104 bcl-X Human genes 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 108091005948 blue fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 2
- 108010082025 cyan fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 2
- 210000001102 germinal center b cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 2
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 2
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 2
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 2
- 241000714175 Abelson murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 0 CC(C)(*)C[C@](C(CCC1=C)C#C)C1NC Chemical compound CC(C)(*)C[C@](C(CCC1=C)C#C)C1NC 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010012335 Dependence Diseases 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 101100220044 Homo sapiens CD34 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000854886 Homo sapiens Immunoglobulin iota chain Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100020744 Immunoglobulin iota chain Human genes 0.000 description 1
- 102100029567 Immunoglobulin kappa light chain Human genes 0.000 description 1
- 101710189008 Immunoglobulin kappa light chain Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 101150062031 L gene Proteins 0.000 description 1
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 101000800763 Naja pallida Short neurotoxin 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000016979 Other receptors Human genes 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108010018324 Surrogate Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000002663 Surrogate Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 210000001099 axilla Anatomy 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 150000005829 chemical entities Chemical class 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 108091008034 costimulatory receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008303 genetic mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011331 genomic analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004013 groin Anatomy 0.000 description 1
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037189 immune system physiology Effects 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 1
- 238000012917 library technology Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000713 mesentery Anatomy 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 239000002719 pyrimidine nucleotide Substances 0.000 description 1
- 101150013400 rag1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003571 reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007474 system interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 210000003412 trans-golgi network Anatomy 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0635—B lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
- C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
- C12N2799/027—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a retrovirus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本発明は一般に、遺伝子工学及び抗体産生の分野に関する。特に、本発明は、より成熟したリンパ球系統細胞へと分化する潜在能力をもつ遺伝的に修飾された脊椎動物前駆体リンパ球の生成及びあらゆる異種抗体又は結合タンパク質の産生を目的とするその使用に関する。
Description
親和力:レセプタ−リガンド相互作用の会合対解離の速度比により決定される、そのコグネイト抗原(又はそのリガンド又は結合パートナ)についての抗原レセプタ(又は任意のレセプタ)の結合の強度。
(a)少なくとも1つの異種抗体、抗原レセプタ、人工結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメント(単複)をコードする少なくとも1つの外因性遺伝要素を導入することによって、
(i)一次リンパ器官から誘導され、かつ
(ii)成熟リンパ球系統細胞へと分化する潜在能力を有する、
脊椎動物前駆体リンパ球を遺伝的に修飾する段階;及び
(b)インビトロ又はインビボのいずれかでの前記遺伝的に修飾された前駆体リンパ球の成熟リンパ球系統細胞への分化をもたらし、かくして異種抗体、抗原レセプタ、人工結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメント(単複)を産生する能力をもつリンパ球を生成する段階、
を含んで成る方法を提供している。
(a)ハイブリッドーマ細胞を生成するために不死の骨髄腫細胞に分化したリンパ球を融合させること、
(b)例えばアペルソンマウス白血病ウイルス(A−MuLV)形質転換ウイルスにそれを感染させること、
(c)例えば過剰発現の時点で、安定した形でトランスフェクトされた細胞の不死化を導くv−ab1またはSV40大型T抗原といったような少なくとも1つの形質転換する癌遺伝子の発現を確保するベクター構成体でそれをトランスフェクトすること、
によって、達成でき、かくして、前記異種抗体、抗原レセプタ、人工結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメント(単複)を常時産生する能力をもつ脊椎動物リンパ球が生成さえることになる。
(a)V、D及びJ遺伝子セグメントの全て又は一部分を含めた、免疫グロブリン重鎖遺伝子座のコーディング領域、及びその膜貫通エキソンを伴う又は伴わないμ、δ、γ、ε及びα重鎖のための定常領域エキソン用のコーディング領域のうちのいずれか;
(b)V及びJ遺伝子セグメントコーディング領域のいずれかを含めた免疫グロブリンκ及び/又はλ軽鎖遺伝子座のコーディング領域、ならびに定常領域エキソンのうちのいずれか;
(c)V、D及びJ遺伝子セグメントの全て又は一部を含めたT細胞レセプタα、β、γ及びδ遺伝子座のコーディング領域、及びα、β、γ及びδ定常領域エキソンのためのコーディング領域のいずれか;
(d)重鎖イントロンエンハンサ及び3’αエンハンサを含む、シス作用性免疫グロブリン重鎖遺伝子座エンサ要素;
(e)κ重鎖イントロンエンハンサ(κiE)、3’κエンハンサ及びλ2−4及びλ3−1エンハンサを含むシス作用性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座;
(f)TCRα、β、γ及びδエンハンサを含めた、シス作用性T細胞レセプタ遺伝子座エンハンサ要素;
(g)そのプロモータ及びエンハンサ要素を含むトランス作用性組換え活性化遺伝子、RAG−1及びRAG−2ならびにそのコーディング領域;及び
(h)そのプロモータ及びエンハンサ要素を含む、Ku70、Ku86、DNA依存性タンパク質キナーゼ(DNA−PKcs)の触媒サブユニット、DNAリガーゼIV、XRCC4及びArtemisを含む、V(D)J組換えに不可欠のトランス作用性DNA修復遺伝子、なたびに該遺伝子のコーディング領域
から成るグループの中から選択されている少なくとも1つの遺伝要素の少なくとも1つの対立遺伝子を機能的に不活性化するように設計された少なくとも1つのベクター構成体を前記脊椎動物前駆体リンパ球内に導入することによって達成されるということが好ましい。
(a)野生型であるか又は一次アミノ酸配列(単複)内に単数又は複数の指定された突然変異を有するか又は人工的なものである、少なくとも1つの異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメントの発現を確保するべく操作可能な形でリンクされている、プロモータ、エンハンサ及びコーディング核酸配列を含んで成る組換え型レトロウイルスDNA構成体;
(b)野生型であるか又は一次アミノ酸配列(単複)内に単数又は複数の指定された突然変異を有するか又は人工的なものである、少なくとも1つの異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメントの発現を可能にするべく操作可能な形でリンクされている、プロモータ、エンハンサ及びコーディング核酸配列を含んで成る組換え型プラスミドベースのDNA構成体;
(c)野生型であるか又は一次アミノ酸配列(単複)内に単数又は複数の指定された突然変異を有する、少なくとも1つの異種抗原又はT細胞レセプタ又はその機能的フラグメントのV(D)J組換え及びその後の発現を可能にするように操作可能な形でリンクされた、再配置されていないV、D及びJ遺伝子セグメントを伴う組換え型プラスミドベースのミニ−免疫グロブリン又はT細胞レセプタ遺伝子座;
(d)野生型であるか又は一次アミノ酸配列(単複)内に単数又は複数の指定された突然変異を有する、少なくとも1つの異種抗原又はT細胞レセプタ又はその機能的フラグメントのV(D)J組換え及びその後の発現を可能にするように操作可能な形でリンクされた、生殖細胞系列立体配置内の免疫グロブリン又はT細胞レセプタ遺伝子座の一部又は全てを含む、細菌、酵母又は脊椎動物人工染色体;
(e)野生型であるか又は一次アミノ酸配列(単複)内に単数又は複数の指定された突然変異を有する、少なくとも1つの異種抗原又はT細胞レセプタ又はその機能的フラグメントの(D)J組換え及びその後の発現を可能にするように設計された修飾された配置内の少なくとも1つの異種免疫グロブリン又はT細胞レセプタ遺伝子座の一部又は全てを含む、細菌、酵母又は脊椎動物人工染色体;
(f)一次アミノ酸配列(単複)に関して野生型である、少なくとも1つの異種抗体又はT細胞レセプタのV(D)J組換え及びその後の発現を可能にする生殖細胞系列立体配置内の免疫グロブリン又はT細胞レセプタ遺伝子座の一部又は全てを包含する異種染色体のフラグメントである染色体導入要素、から成るグループの中から選択された遺伝子構成体上に担持されており、ここで、少なくとも1つの外因性遺伝要素が、最も好ましくは、未変性又は修飾済みヒト抗体、ヒト結合タンパク質、ヒト抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメントをコードすることが好ましい。
(a)例えばCMV(サイトメガロウイルス)、SV40(シミアンウイルス40)、β−アクチン又はPGK(ホスホグリセレートキナーゼ)プロモータなどの構成性プロモータ、又は、例えばCD19プロモータ又はIgH及びIgL鎖遺伝子プロモータといったようなB系統特異的プロモータを含めたプロモータ要素;
(b)免疫グロブリン及びTCR遺伝子座を含む、任意の抗原レセプタからの可変(V)領域エキソン;
(c)例えばEμH又はκiEイントロンエンハンサ要素のような、異種抗体又は結合タンパク質の高レベル及びB系統特異的発現を可能にするエンハンサ要素;
(d)抗体及び結合タンパク質の分泌された及び膜結合された形態をコードするエキソンを含む定常領域エキソン(図7a、b);及び
(c)異種抗体又は結合タンパク質の可変領域コーディングエキソンの体細胞超変異のために必要とされる、重及び軽鎖遺伝子座の3’免疫グロブリン遺伝子エンハンサ(すなわち3’α、3’κ、又はλ3−1及びλ2−4エンハンサ)のいずれか(図7a、b)。
(a)前記脊椎動物前駆体リンパ球の増殖を停止させ、あらゆる前駆体リンパ球成長因子の不在下で培養することによってその成熟リンパ球系統細胞への分化を誘発すること;及び
(b)(i)インタロイキン−2、インタロイキン−4、インタロイキン−5、インタロイキン−6、インタロイキン−10、インタロイキン−13、TGF−β及びIFN−γを含む可溶性T細胞関連刺激因子;
(ii)CD40、B7−1(CD80)、B7−2(CD86)、補体レセプタ1(CD35)及び2(CD21)、LFA−1(CD11a)、LFA−3(CD58)、CD19、CD20、CD30、CD32、CD37、CD38、CD70、CD71、lgα(CD79α)、lgβ(CD79β)、TAPA−1(CD81)、Fas(CD95)、TNF−レセプタ1(p55、CD120a)、TNF−レセプタ2(p75、CD120b)、Ox−40(CD134)、及びリンフォトキシン−βレセプタに特異的な活性組換え型リガンド又はアゴニスト抗体を含む、B細胞の副刺激レセプタを活性化する因子;及び
(iii)B細胞マイトジェン因子、1型のT細胞依存性抗原及び、リポポリサッカリド(LPS)、グラム陰性菌からのリポタンパク質、ポリアニオン、ポリ−dldC、ヤマゴボウマイトジェン(PWM)及び抗免疫グロブリン試薬を含むその他のポリクローナル活性体、及びそれらの組合せの中から選択された成分のうちの少なくとも1つの存在下で前記細胞をさらに培養することによりリンパ球終末分化を誘発すること、
によりもたらすことが好ましい。
(a)少なくとも1つの外因性遺伝要素を前記分化されたリンパ球から単離する段階、及び
(b)前記少なくとも1つの異種抗体、抗原レセプタ、人工結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメント(単複)の産生を可能にする状況下に前記遺伝要素(単複)を置く段階、
が続くことが好ましい。
(a)膜結合又は分泌され、天然の抗体の中に見られる化学量論的組成物内の非相同重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方から成り、かつ既知の重(μ、δ、γ、ε)及び/又は軽(κ及びλ)鎖イソタイプのいずれかから成る抗体;
(b)一次アミノ酸配列に関して完全にヒトである重鎖及び軽鎖ポリペプチドの組合せを伴う抗体;
(c)異なる脊椎動物種からの異種重鎖又は軽鎖ポリペプチドを含有するハイブリッド抗体;
(d)完全に又は部分的に異種である、分泌されたFab、scFv及びF(ab’)2抗体フラグメント、
(e)二重特異性又は多重特異性抗体フラグメントを結果としてもたらす、リンカーペプチドを介して共有結合でカップリングされた抗体のフラグメント、
(f)免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質と構造的類似性をもつ、α、β、γ及びδイソタイプ、抗原レセプタ及びその他の結合タンパク質のT細胞レセプタ、
及びそれらの機能的フラグメントから成るグループの中から選択されることが好ましい。
本発明に従って使用される遺伝要素を担持するプラスミドが、プタペスト条約に基づき、以下の受入れ番号で2001年12月17日付けでドイツのブラウンシュバイクにあるSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)に寄託された。
プラスミド 受入れ番号
pBS−DT4 DSM14703
pPGK−hygro DSM14704
pGL2neo(m)+ DSM14705
pBS−DT4−tox176 DSM14706
間質細胞及びIL7応答性マウス前駆体B細胞が、交尾後15〜18日目のマウスの胚の胎児肝臓の中、成体マウスの骨髄内ならびに新生動物(生後3週間未満)の脾臓内に見い出される(ローリンク(Rolink)ら,s.a.)。これらのpreB細胞を単離するため、マウスをCO2窒息により殺処分し、それぞれの器官を滅菌条件下でとり出す。大腿部及び頸骨をとり出し、滅菌したハサミで骨の両端を開き、5mlの使い捨て注射器及び25又は26ゲージの針を用いて2〜5mlのリン酸緩衝溶液(PBS)で骨髄を洗い流すことによって、完全骨髄細胞が得られた。同様に滅菌条件下で調製した単離済みの脾臓又は胎児肝臓を、5〜10mlのPBSの入ったペトリ皿内の滅菌200メッシュの鋼製格子上に置く。器官を細片にカットし、5ml入りのプラスチック製注射器のプランジャを備えた金属格子を通して穏やかに押しつぶす。遠心分離によりひとたび細胞懸濁液を洗浄し(200g、10分、4℃)、10〜20ml入りのPBS内に再懸濁させる。全ての細胞調製は、氷冷溶液で実施され、組織培養内に移送するまで細胞懸濁液を氷上に保つ。
(1リットルの培地のための処方):
長期増殖性間質細胞及びIL7依存性マウスpreB細胞は、インビトロで達成可能な、より成熟したB系統細胞へと分化するその潜在能力を保持する。この分化は、成熟B細胞表現型をもつ細胞への分化をまず誘発し、第2に抗体分泌性形質細胞の表現型をもつ細胞への分化を誘発することによって、2段階で実施され得る。
ハイグロマイシンB薬物耐性マーカーのための開いた読取り枠(ORF)及びマウスbcl−2cDNAの両方が、市販のCMV−プロモータ/IRESベクター−pIRES(クロンテック(Clontech))内にクローニングされる。このために、制限エンドヌクレアーセ−Xbal及びNotlのための(大文字で示された)付加的な制限酵素認識部位を含む、
空のレトロウイルス移入ベクターpLIB及びデュアルbcl−2/ハイグロマイシンB発現ベクターpBcl2−IRES−hygroBの多重クローニング部位の中には適合性のある制限酵素部位が欠如していることに起因して、構成性CMVプロモータ及びポリアデニル化部位を含むBcl−2−IRES−ハイグロマイシンBのための全発現カセットは、充当された制限酵素認識部位でのPCRを用いてpLIB内にクローニングされる。このために、CMV−bcl2−IRES−ハイグロマイシンB発現カセットは、SaII及びClaIのための制限酵素認識部位を含む
マウスpreB細胞内に遺伝要素を安定した形で移入する1つの方法は、レトロウイルス形質導入を使用することである(図8)。この手順のためには、レトロウイルスゲノムのパッケージングに必要なレトロウイルス配列を含む組換え型DNA構成体(5’LTR、パッケージングシグナルPsi(+)、3’LTR)ならびに問題の異種配列又は遺伝子が、レトロウイルス粒子の産生のために必要とされる遺伝子を構成的に発現するパッケージング細胞系列内に過渡的に又は安定した形でトランスフェクトされる。
GPE細胞を、ST−2及びPA−6間質細胞のためにも使用され例1で記述したIMDMベースの低血清培地の中で成長させる。トランスフェクションの前日に、トリプシン処理により接着GPEパッケージ細胞を収獲し50%のコンフルーエントで新鮮なIMDM−ベースの低血清培地内に播種し、10%のCO2中37℃で培養させる。翌日、標準的なリン酸カルシウム沈殿を用いてT75(75cm2入り)組織培養フラスコのGPE細胞につき20μgのレトロウイルスDNAをトランスフェクトする。トランスフェクションから24時間後に、トランスフェクトされたGPE細胞を、preB細胞内への組換え型レトロウイルスの形質導入のために使用することができる。
トランスフェクトされたGPE細胞によって産生された組換え型レトロウイルスの形質導入のために、2つの方法を互換的に使用することができる: 第1の方法は、調整細胞培養上清でのpreB細胞の感染に依存している。このために、トランスフェクトされたGPE細胞からの細胞培地をトランスフェクションから24時間後に交換し、さらにもう24時間の細胞培養後に収穫する。次に細胞培養上清を含有する組換え型レトロウイルスを1:8(体積)〜1:1(体積)の比で8μg/mlのポリブレンの存在下で増殖性preB細胞の培養に対して添加し、インキュベーションを37℃で3〜6時間続行する。その後、細胞を収獲し、ポリブレン/レトロウイルス含有培地を除去し、100UのrIL7を含むpreB細胞培地内の新鮮な3000ラドでγ照射された間質細胞上に1−2×105の密度で細胞を平板固定する。レトロウイルス形質導入されたpreB細胞を次に24時間後に収獲する。
マウス前駆体B細胞からの異種の、好ましくはヒトの抗体の生成のための第1の段階は、その他の方法の中でも例えばpreB細胞内の免疫グロブリン遺伝子座内での遺伝子ターゲティングにより達成可能である、内因性マウスIgH及びIgLの不活性化である。理論的には、3つのマウス免疫グロブリン遺伝子座すなわちIgH、IgκL及びIgλL鎖遺伝子座の全てを不活性化することが必要となる。しかしながら、マウスλL鎖遺伝子座は、各々1つずつ遺伝子セグメントを伴う3つの機能的V−J−Cクラスタしか含んでいない。その上、マウスB細胞の5%未満しか、λL鎖遺伝子座を発現しない。従って実際的には、異種IgH及びIgκL鎖遺伝子又は遺伝子座の移入時点でpreB細胞から産生された大部分のB細胞(>95%)が異種抗体を確実に発現することになるように、内因性マウスIgH及びκL鎖遺伝子座を不活性化するだけで充分である。
一般的には、内因性IgH及びκL鎖遺伝子座の不活性化のための最も制御された方法は、遺伝子ターゲティングを使用することである(以下参照)。しかしながら、IgH鎖遺伝子座の場合、もう1つの方法を応用することができる。
内因性のIgH及びIgκL鎖遺伝子座の両方の遺伝子ターゲティングされた不活性化を結果としてもたらす方法についての2つの例が、内因性IgH及びIgκL鎖タンパク質を発現する潜在能力のないpreB細胞を類似の要領で導くことになる数多くのシス作用性突然変異についての一例として提示されている(図5a、b)。両方のターゲティング戦略について、まず最初に、標的遺伝子座に相同なDNA配列の挿入を可能にするユニークなクローニング部位、loxP部位によりフランキングされているネオマイシン又はピューロマイシンといったような正の薬物選択マーカー、及び細胞のゲノム内への遺伝子ターゲティングベクターの無作為組込みに対して選択することになる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV−tk)を含む空の正−負の遺伝子ターゲティングベクターを構築することが必要である。loxPでフランキングされた(floxされた)正の選択マーカーの存在は、第1の対立遺伝子のターゲティングに成功した後同系のloxP認識部位の間にある任意のヌクレオチド配列を欠失させるcreリコンビナーゼの過渡的発現の時点で細胞から抗生物質耐性マーカーを欠失させることができるため、同じ抗生物質を用いた同じ細胞クローン内で両方の対立遺伝子の逐次的遺伝子ターゲティングを可能にすることになる。空の正−負のターゲティングベクターは以下のように構築される(図6a、b):
遺伝子ターゲティング構成体の無作為染色体組込みに対する選択を可能にする負の選択マーカーとして、構成性β−アクチンプロモータの制御下でのジフテリア毒素α(マクキャリック(McCarrick)ら,s.a)又はその減衰バージョンであるジフテリア毒素α(DT−α tox(76)(マクスウェル(Maxell)ら,s.a.)についての発現カセットを使用することができる。マウス胚基幹細胞での遺伝子ターゲティング実験では単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子(HSV−tk)のようなその他の負の選択マーカーが一般に使用されるものの、ジフテリア毒素α及びその減衰型突然変異体tox176は、体細胞内での遺伝子ターゲティングのために有効であることが実証されている(グラワンダ(Grawunder)ら,Mol.Cell,2,p477-484,1998)。ジフテリア毒素発現カセットは、プラスミドpBS−DT4(配列番号2)又はpBS−DT4tox176(配列番号3;図6a参照)から2.1kbのBgIII−Xbalフラグメントとして単離され、BgIII−NheIで線状化されたpBSL内に連結されて、結果としてpBSL−DT4及びpBSLDT4tox176をそれぞれもたらす(図6a参照)。
正/負の遺伝子ターゲティングベクターの生成のための次の段階は、ジフテリア発現カセットの上流側でのpBSL−DT4又はpBSL−DT4−tox176内への正の薬物選択マーカーの挿入である。代表的な例として、pBSL−DT4内のジフテリア毒素α発現カセットの上流側でのIoxP部位でフランキングされたネオマイシン、ピューロマイシン及びハイグロマイシンB発現カセットの挿入が提示されている。しかしながら、ジフテリア毒素αの減衰バージョンを含有するpBSLDT4tox176ベクターに対して同一のクローニング戦略を適用することができるということも指摘しておくべきである。さらに、例えばヒスチジノール、マイコフェノール酸、ブレオマイシン又はゼオシンに対する耐性を付与するその他の正の薬物選択マーカーを使用することが可能である。
loxP部位でフランキングされたネオマイシン耐性カセットを、1497bpのBsp1201−Xbalで消化されたDNAフラグメントとしてプラスミドpGL2neo(m)+(配列番号4)から単離でき、Notl−Xbalで線状化されたpBSL−DT4内に連結させて空のターゲティングベクター、pBSL−flneo−DT4生成することができる。
ネオマイシン以外のfloxされた抗生物質選択マーカーはほとんど見当らないことから、pBSL−DT4内へのloxPでフランキングされたピューロマイシン又はハイグロマイシンBマーカーの挿入のための1つの基本的な段階は、2つのloxP部位を挿入する予備的段階である。これは、pBSL−DT4でアニールされた合成DNAオリゴマの中に挿入することによって達成できる。合成loxP部位は、以下の2つの相補的DNAオリゴの中に含まれている;
内因性遺伝子座のためのターゲティングベクターのクローニングの代表例として、内因性IgH及びIgκL鎖遺伝子座のシス作用性のターゲティングされた突然変異及びマウスpreB細胞内のRAG遺伝子のトランス作用性突然変異にとって有用なGTVについてのクローニング戦略が記述される。
両方のIgH鎖対立遺伝子上で数多くの異なるシス作用性のターゲティングされた欠失を生成することにより、preB細胞内の内因性マウスIgH鎖遺伝子座の不活性化を達成することができる。IgH不活性化欠失の1つは、例えば、ここで内因性IgH対立遺伝子を内因性免疫グロブリン産生能力の無いものにする可能性の1つとして記述されている全てのDH及びJH遺伝子セグメントの欠失である。ターゲティングベクターの構成は、ここで1例として「floxされた」ネオマイシンターゲティング構成体を用いて紹介されている(図5a参照)。例えばピューロマイシン又はハイグロマイシンBといったようなその他の正の抗生物質選択マーカーを含む遺伝子ターゲティングベクターのクローニングのためには、類似の戦略を適用することができる。
IgH鎖遺伝子座の場合と同様、κL鎖遺伝子座は、Jκ遺伝子セグメント、κL鎖イントロンエンハンサ(κiE)、定常κL鎖領域(Cκ)又は3’κエンハンサ(3’κE)の全ての欠失を含めた、複数のシス作用性突然変異によって不活性化され得る。一例として、Jκ遺伝子セグメントの全てのターゲティングされた欠失のために使用できるターゲティング構成体及び方法が記述されている。さらに、本書で記述されているターゲティング構成体の構築は本書では、「floxされた」ネオマイシン耐性マーカーを含む構成体をターゲティングする目的でのみ紹介されている。「floxされた」ピューロマイシン又はハイグロマイシンB発現カセットを含有するターゲティング構成体のクローニングは、類似の要領で実施される。Jκ遺伝子セグメントクラスタの上流側の短かい相同性領域は、公開されたNCBI−ジェンバンク(Genbank)エントリV00777に従って、設計された以下のプライマを用いてマウスゲノミックDNAからPCR増幅され得る(補足されたNotI制限酵素認識部位のヌクレオチドは大文字で印刷されている):
κiE及び定常κL鎖領域(Cκ)を含んでいるJκ遺伝子セグメントクラスタの下流側にある長いDNA配列相同性領域は、公開されたNCBI−ジェンバンク(Genbank)配列エントリV00777に基づいて設計された以下のプライマを用いてマウスゲノミックDNAからPCR増幅され得る(補足されたAscI制限酵素認識部位のヌクレオチドは大文字で印刷されている):
IgH及びIgκL鎖遺伝子座内にシス作用性突然変異を導入することにより内因性免疫グロブリンを発現するpreB細胞の潜在能力を不活性化することに対する代替案として、トランス作用性突然変異を導入することによってその内因性Ig遺伝子の再配置についてpreB細胞を不能にすることもできる。これは例えば、Ig遺伝子再配置にとって不可欠である2つの組換え活性化(RAG)遺伝子のうちの1つをターゲティングすることによって達成できる。RAG−1又はRAG−2遺伝子のいずれかの中に欠失をもつマウスpreB細胞は、免疫グロブリン遺伝子セグメントを再配置できなくなり、従って内因性免疫グロブリンを発現することができない。
内因性遺伝子座の両方の対立遺伝子の逐次的なターゲティングされた欠失のためには、2つの異なる戦略を応用することができる。1つの戦略は、2つの異なる対立遺伝子のターゲティングのために2つの異なる正の選択マーカーを伴うターゲティングベクターを利用することである。代替的に、もう1つの戦略は、両方の内因性対立遺伝子の逐次的ターゲティングのため同じターゲティング構成体を2回使用することにある。しかしながら、後者の戦略の場合、第1の対立遺伝子のターゲティングの後に、preB細胞内へのcre−リコンビナーゼのための発現ベクターの過渡的発現が続いていなくてはならず、これは、もう一方の対立遺伝子の第2のターゲティングのために同じ抗生物質選択を使用できるような形で、loxP部位がフランキングされた薬物選択マーカーの永久的欠失を導くことになる。
ヒト免疫グロブリンの産生のためにマウス間質細胞、IL7依存性preB細胞を再プログラミングする目的で、ヒト抗体ポリペプチドをコードする新規のレトロウイルス発現ベクターを使用することができる。B細胞分化期に応じて、まずは膜結合免疫グロブリンとして、その後は分泌された免疫グロブリンとして、ヒトIgH及びL鎖タンパク質の調節された発現を可能にする組換え型レトロウイルスベクターの生成方法について記述する。あらゆるタイプの異種結合タンパク質をこれらのレトロウイルスベクター内にクローニングし、あらゆるタイプの異種でかつヒトの結合タンパク質の発現を可能にすることができる、ということに留意すべきである。従って本書で記述されているヒトIgH及びIgL鎖の発現のためのレトロウイルス移入ベクターのクローニングについての説明は、除外としてではなく例示としてみなされるべきである。組換え型レトロウイルスベクターは、最高7〜10kbの異種DNA配列を収容することができ、これには、全ての必要とされる細胞型及び分化期特異的プロモータ、エンハンサ及び制御要素ならびに内因性Ig遺伝子スプライスシグナルを含めたIgH及びL鎖糖タンパク質のための別々の構成体の設計が必要とされる。これらの制御要素は、免疫グロブリンの適正な発現、膜被着及び分泌、さまざまなB細胞分化期内のその親和力成熟、ならびに形質細胞内の異種抗体の高レベル分泌を確保するのに必要である。IgH及びL鎖のための個々のレトロウイルス構成体をpreB細胞内に同時形質導入することができ、この時点で、構成体は感染したpreB細胞のゲノム内に安定した形で組込まれる。潜在性発現内在性免疫グロブリンの無いマウスpreB細胞が使用される場合(以上の記述参照)には、レトロウイルス形質導入を受けたpreB細胞の分化時点で、B系統細胞内で異種又はヒト抗体又は結合タンパク質のみが発現されることになる。
さまざまなIgH及びL鎖タンパク質のためのレトロウイルス構成体は場合によってマウス細胞内に形質導入されることになるため、Ig発現を制御するプロモータ及びエンハンサ要素は、B系統特異的マウス転写因子での最適な相互作用を確保するべくマウス由来のものとなる。
IgH鎖発現のために設計された構成体と類似の要領で、IgκL鎖の分化期特異的発現のために設計されたレトロウイルス構成体は、明確なκL鎖遺伝子座特異的プロモータ及びエンハンサ要素の存在を必要とする。これらには、Vκプロモータ、κ軽鎖イントロンエンハンサ(κiE)及びκ3’エンハンサ(κ3’E)要素が含まれる。これらの要素の逐次的クローニングは以下のように達成することができる(図13a、b)。
一部のケースでは、κL鎖の代りにλL鎖を含む異種抗体を産生することが望まれる。レトロウイルス構成体pAB−7.1−Pur及びpAB−8.1Pur内のヒトCκコーディング領域をヒトCκコーディング領域のいずれかと交換するだけで充分であるかもしれないものの、完全な内因性λL鎖発現パターンは、λL鎖遺伝子座特異的プロモータ及びエンハンサ要素によりλL鎖の発現を制御することによってのみ達成されることになる。このことは特に、κL鎖遺伝子再配置及び発現がB細胞分化中のλL鎖の再配置及び発現に先行するマウス系においてあてはまる。
III部位内にVλVλ再配置された可変領域エキソンをクローニングしなければならない。
これまで記述した異なるヒトIgH及びIgL鎖のためのレトロウイルス発現構成体は、可変ドメインのためのコーディング領域を除いて、ヒト抗体発現のための全てのコーディング領域及び制御要素を含んでいる。例えば、可変領域ドメインをコードするエキソンのさまざまなレパートリ(ライブラリ)を、さまざまなVHDJH及びVLJLDNA再配置を伴うBリンパ球を含むヒト末梢血リンパ球のゲノミックDNAからクローニングすることができる。可変ドメインのためのこれらのコーディング領域は、小胞体、トランスゴルジ網を通り、場合によって細胞表面に至るまでのIgH及びIgL鎖の適切な輸送のために必要とされる各々のVHDJHL及びVLJL再配置エキソンから5’のところに位置設定された(図15)共通のリーダーエキソンを含有している必要がある。ヒトIgH、IgκL及びIgλL可変領域リーダー配列の大部分のリーダー配列に結合する縮重プライマが記述されてきており、これらは、VHDJH又はVLJL可変コーディング領域のクローニングのためのさまざまなヒトJH及びJL 遺伝子セグメントを増幅する縮重プライマと組合わせて使用される。PCR産物の一方向クローニングに用いられる制限酵素のための認識部位(図15参照)が、縮重プライマの5’末端に補足され、大文字で強調されている。わずか1つ以上のヌクレオチドを含むことのできる縮重プライマ内の位置は、カッコ内に示されている。
間質細胞及びIL7依存性マウスpreB細胞のレトロウイルス形質導入については、例3で詳細に記述した。IgH及びIgL鎖をコードするレトロウイルス発現構成体の逐次的形質導入のためには、エコトロピックパッケージング細胞のトランスフェクション及びpreB細胞内に組換え型レトロウイルスを感染させるための条件について、同一のプロトコルが用いられる。唯一の差異は、2つのレトロウイルス発現構成体が以下で概略的に説明するプロトコルによって逐次的に形質導入されるという点にある。
安定した形で形質導入を受けたレトロウイルス発現ベクターからの異種IgH及びL鎖を発現するIL7依存性preB細胞及び間質細胞が、B細胞欠損JHTマウス内へ、又はCD4+Tヘルパー細胞と合わせてcB17SCID、RAG−2又はRAG−2マウス内に静脈内注射され、かくして、移植を受けた細胞は、移植を受けたマウスの抗原性刺激の時点でT細胞依存性又は独立性免疫応答を始めることができるようになる。
HupreB細胞及びTヘルパー細胞を用いて移植され再構築された免疫障害をもつマウスの免疫化は、基本的に記述された通りに行なわれる(ハーロウ及びレイン(Harlow and Lane),Cold Spring Harbor Laboratory Press,p150〜173)。簡単に言うと、10〜50μgの抗原を250μlのPBS中に溶解させ、250μlの完全フロイントアジュバントと勢よく混合され、抗原−アジュバント混合物が、腹腔内注射される。2週間後に5〜20μgの抗原を腹腔内でマウスに追加投与し、今度は不完全フロインドアジュバンドと混合させる。最初の追加抗原投与の後10日目に、マウスを血清中の抗原特異的異種抗体について分析する。最高の応答を示すマウスに、その後4週間目で再び、腹腔内及び静脈内の両方で不完全フロインドアジュバント中の5〜20μgの抗原を追加投与する。3日後、マウスから脾細胞を単離させ、異種抗原特異的モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞の生成のためにこれを使用する。
同時に間質細胞及びIL7依存性HupreB細胞を、インビトロで完全に組織培養内で抗体分泌細胞へと分化させることができる。このために組織培地及び2〜3日間の照射済み間質細胞上での連続的培養からIL7を撤去することによって連続的に増殖するHupreB細胞培養をまず表面免疫グロブリン陽性B細胞へと分化させる。培地中に成長因子が不在である場合には、増殖は停止し、分化が誘発され、この誘発には、bcl−2のような抗アポプトーシス遺伝子が分化細胞内で発現されないかぎりアポプトーシスの誘発が伴う。
インビトロ分化(例11)の時点又は移植されたマウスの免疫化後(図10)のいずれかで、HupreB細胞から誘導された形質細胞を不死化するために、不死の骨髄腫細胞系列と形質細胞を融合させることが必要である。細胞融合に用いられる骨髄腫細胞系列には、ヌクレオチド生合成のサルベージ経路に関与するHGPRT遺伝子の発現が欠如している。これらの細胞は、正規の組織培地内で非決定的に成長するものの、ヌクレオチド合成が組織培地への例えばアミノプテリンといった薬物の添加によって新たに遮断された場合に、死枯することになる。対照的に、HGPRT遺伝子を発現する細胞は、特に付加的なチミジン及びヒポキサンチンが補充された場合、HGPRT遺伝子産物がそれぞれピリミジン及びプリンヌクレオチドの合成のためにこれらの物質を利用できることから、アミノプリテンによる新たなヌクレオチド合成の遮断から切り抜けることができる。かくして、(ヒポキサンチン(hypoxanthine)、アミノプテリン(aminopterine)及びチミジン(thymidine)を含有する)HAT選択培地内では、致死的であるものHGPRT+である抗体分泌形質細胞及び不死であるもののHGPRT−であり従ってアミノプテリン感応性骨髄腫細胞の融合の結果得られた細胞のみが生き延び増殖する。これらの細胞は、ハイブリドーマ細胞と呼ばれ、サブクローニングされた場合、形質細胞融合パートナによりコードされる特異性をもつモノクローナル抗体を分泌することになる。
ヒトにおけるインビボ産生が除外されることを条件として、
(a)少なくとも1つの結合タンパク質又はその機能的フラグメントをコードする少なくとも1つの外因性遺伝要素を導入することによって、
(i)一次リンパ器官から誘導され、かつ
(ii)成熟リンパ球系統細胞へと分化する潜在能力を有する、
脊椎動物前駆体リンパ球を遺伝的に修飾する段階;及び
(b)インビトロ又はインビボのいずれかでの前記遺伝的に修飾された前駆体リンパ球の成熟リンパ球系統細胞への分化をもたらし、かくして前記結合タンパク質又はその機能的フラグメントを産生する能力をもつリンパ球を生成する段階、
を含んで成る方法を提供している。
(a)ハイブリッドーマ細胞を生成するために不死の骨髄腫細胞に分化したリンパ球を融合させること、
(b)例えばアベルソンマウス白血病ウイルス(A−MuLV)形質転換ウイルスにそれを感染させること、または
(c)例えば過剰発現の時点で、安定した形でトランスフェクトされた細胞の不死化を導くv−ab1またはSV40大型T抗原といったような少なくとも1つの形質転換する癌遺伝子の発現を確保する適切なベクター構成体でそれをトランスフェクトすること、
によって、達成でき、かくして、前記結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメントを常時産生する能力をもつ脊椎動物リンパ球が生成されることになる。
(a)野生型であるか又は一次アミノ酸配列内に指定された突然変異を有するか又は人工的なものである、少なくとも1つの結合タンパク質、又はその機能的フラグメントの発現を確保するべく操作可能な形でリンクされている、プロモータ、エンハンサ及びコーディング核酸配列を含んで成る組換え型レトロウイルスDNA構成体;
(b)野生型であるか又は一次アミノ酸配列内に指定された突然変異を有するか又は人工的なものである、少なくとも1つの結合タンパク質、又はその機能的フラグメントの発現を可能にするべく操作可能な形でリンクされている、プロモータ、エンハンサ及びコーディング核酸配列を含んで成る組換え型プラスミドベースのDNA構成体;
(c)野生型であるか又は一次アミノ酸配列内に指定された突然変異を有する、少なくとも1つの異種抗原又はT細胞レセプタ又はその機能的フラグメントのV(D)J組換え及びその後の発現を可能にするように操作可能な形でリンクされた、再配置されていないV、D及びJ遺伝子セグメントを伴う組換え型プラスミドベースのミニ−免疫グロブリン又はT細胞レセプタ遺伝子座;
(d)野生型であるか又は一次アミノ酸配列内に指定された突然変異を有する、少なくとも1つの異種抗原又はT細胞レセプタ又はその機能的フラグメントのV(D)J組換え及びその後の発現を可能にするように操作可能な形でリンクされた、生殖細胞系列立体配置内の免疫グロブリン又はT細胞レセプタ遺伝子座の一部又は全てを含む、細菌、酵母又は脊椎動物人工染色体;
(e)野生型であるか又は一次アミノ酸配列内に指定された突然変異を有する、少なくとも1つの異種抗原又はT細胞レセプタ又はその機能的フラグメントのV(D)J組換え及びその後の発現を可能にするように設計された修飾された配置内の少なくとも1つの異種免疫グロブリン又はT細胞レセプタ遺伝子座の一部又は全てを含む、細菌、酵母又は脊椎動物人工染色体;
ヒトにおけるインビボ産生が除外されることを条件として、
(a)少なくとも1つの結合タンパク質又はその機能的フラグメントをコードする少なくとも1つの外因性遺伝要素を導入することによって、
(i)一次リンパ器官から誘導され、かつ
(ii)成熟リンパ球系統細胞へと分化する潜在能力を有する、
脊椎動物前駆体リンパ球を遺伝的に修飾する段階;又は、代替的には、
(i)一次リンパ器官から誘導され、かつ
(ii)成熟リンパ球系統細胞へと分化する潜在能力を有し、かつ
(iii)少なくとも1つの結合タンパク質又はその機能的フラグメントをコードする少なくとも1つの外因性遺伝要素を担持する、
遺伝的に修飾された脊椎動物前駆体リンパ球を使用する段階;
(b)インビトロ又はインビボのいずれかでの前記遺伝的に修飾された前駆体リンパ球の成熟リンパ球系統細胞への分化をもたらし、かくして前記結合タンパク質又はその機能的フラグメントを産生する能力をもつ遺伝的に修飾され分化された脊椎動物リンパ球を生成する段階;
又、代替的には、
前記結合タンパク質又はその機能的フラグメントを産生する能力を持つ前記遺伝的に修飾され分化された脊椎動物リンパ球を使用する段階;
(c)結合タンパク質又はその機能的フラグメントの発現をもたらす段階、
を含む方法を提供している。
この状況下で、遺伝的に修飾され分化された脊椎動物リンパ球の生成を含む以上の方法のいずれにも以下の段階、
(a)少なくとも1つの外因性遺伝要素を前記分化されたリンパ球から単離する段階、及び
(b)前記少なくとも1つの結合タンパク質又はその機能的フラグメントの産生を可能にする状況下に前記遺伝要素を置く段階、
が続くことが好ましい。
(a)膜結合又は分泌され、天然の抗体の中に見られる化学量論的組成物内の非相同重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方から成り、かつ既知の重(μ、δ、γ、α、ε)及び/又は軽(κ及びλ)鎖イソタイプのいずれかからなる抗体;
(b)一次アミノ酸配列に関して完全にヒトである重鎖及び軽鎖ポリペプチドの組合せを伴う抗体;
(c)異なる脊椎動物種からの異種重鎖又は軽鎖ポリペプチドを含有するハイブリッド抗体;
(d)完全に又は部分的に異種である、分泌されたFab、scFv及びF(ab')2抗体フラグメント、
(e)二重特異性又は多重特異性抗体フラグメントを結果としてもたらす、リンカーペプチドを介して共有結合でカップリングされた抗体のフラグメント、
(f)免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質と構造的類似性をもつ、α、β、γ及びδイソタイプ、抗原レセプタ及びその他の結合タンパク質のT細胞レセプタ、
及びそれらの機能的フラグメントからなる群の中から選択されることが好ましい。
(a)一次リンパ器官から誘導され、成熟リンパ球系統細胞へと分化する潜在能力をもち、
(b)あらゆる異種抗体、T細胞レセプタ及び膜結合免疫グロブリンを含む可変ドメイン及び定常領域から成るあらゆる異種抗原レセプタ、生殖細胞系列でコードされた異種免疫グロブリン又は抗原レセプタから誘導不可能な野生型免疫エフェクタ機能又は修飾された又は人工的なエフェクタ機能のいずれかを表示するあらゆる異種人工結合タンパク質、及びそれらのあらゆる機能的フラグメントを内含する、抗原又はリガンドに対し選択的に結合する能力をもつ少なくとも1つの異種結合タンパク質又はその機能的フラグメントをコードする少なくとも1つの外因性遺伝要素を担持し、かつ
(c)前記少なくとも1つの外因性遺伝要素に操作可能な形でリンクされた少なくとも1つの選択マーカーを担持する、
遺伝的に修飾された脊椎動物前駆体リンパ球を提供している。
更にもう1つの態様に従うと、本発明は、
(a)あらゆる異種抗体、T細胞レセプタ及び膜結合免疫グロブリンを含む可変ドメイン及び定常領域から成るあらゆる異種抗原レセプタ、生殖細胞系列でコードされた異種免疫グロブリン又は抗原レセプタから誘導不可能な野生型免疫エフェクタ機能又は修飾された又は人工的なエフェクタ機能のいずれかを表示するあらゆる異種人工結合タンパク質、及びそれらのあらゆる機能的フラグメントを内含する、抗原又はリガンドに対し選択的に結合する能力をもつ少なくとも1つの異種結合タンパク質又はその機能的フラグメントをコードする少なくとも1つの外因性遺伝要素を担持し、かつ
(b)前記少なくとも1つの外因性遺伝要素に操作可能な形でリンクされた少なくとも1つの選択マーカーを担持する、
成熟リンパ球系統細胞を提供している。
さらなる態様に従うと、本発明は、
(a)あらゆる異種抗体、T細胞レセプタ及び膜結合免疫グロブリンを含む可変ドメイン及び定常領域から成るあらゆる異種抗原レセプタ、生殖細胞系列でコードされた異種免疫グロブリン又は抗原レセプタから誘導不可能な野生型免疫エフェクタ機能又は修飾された又は人工的なエフェクタ機能のいずれかを表示するあらゆる異種人工結合タンパク質、及びそれらのあらゆる機能的フラグメントを内含する、抗原又はリガンドに対し選択的に結合する能力をもつ少なくとも1つの異種結合タンパク質又はその機能的フラグメントをコードする少なくとも1つの外因性遺伝要素を担持し、
(b)前記少なくとも1つの外因性遺伝要素に操作可能な形でリンクされた少なくとも1つの選択マーカーを担持し、かつ
(c)前記少なくとも1つの異種結合タンパク質又はその機能的フラグメントを産生する、成熟リンパ球系統細胞から誘導された不死化された細胞を提供する。
間質細胞及びIL7応答性マウス前駆体B細胞が、交尾後15〜18日目のマウス胎児の胚の胎児肝臓の中、成体マウスの骨髄内ならびに新生動物(生後3週間未満)の脾臓内に見い出される(ローリンク(Rolink)ら,Blood, 81,p.2290-2300,1993)。これらのpreB細胞を単離するため、マウスをCO2窒息により殺処分し、それぞれの器官を滅菌条件下でとり出す。大腿部及び頸骨をとり出し、滅菌したハサミで骨の両端を開き、5mlの使い捨て注射器及び25又は26ゲージの針を用いて2〜5mlのリン酸緩衝溶液(PBS)で骨髄を洗い流すことによって、完全骨髄細胞が得られた。同様に滅菌条件下で調製した単離済みの脾臓又は胎児肝臓を、5〜10mlのPBSの入ったペトリ皿内の滅菌200メッシュの鋼製格子上に置く。器官を細片にカットし、5ml入りのプラスチック製注射器のプランジャを備えた金属格子を通して穏やかに押しつぶす。遠心分離によりひとたび細胞懸濁液を洗浄し(200g、10分、4℃)、10〜20ml入りのPBS内に再懸濁させる。全ての細胞調製は、氷冷溶液で実施され、組織培養内に移送するまで細胞懸濁液を氷上に保つ。
Claims (27)
- 任意の異種抗体、抗原レセプタ、人工結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメント(単複)の産生のために使用可能な脊椎動物リンパ球の生成方法において、
(a)少なくとも1つの異種抗体、抗原レセプタ、人工結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメント(単複)をコードする少なくとも1つの外因性遺伝要素を導入することによって、
(i)一次リンパ器官から誘導され、かつ
(ii)成熟リンパ球系統細胞へと分化する潜在能力を有する、
脊椎動物前駆体リンパ球を遺伝的に修飾する段階;及び
(b)インビトロ又はインビボのいずれかでの前記遺伝的に修飾された前駆体リンパ球の成熟リンパ球系統細胞への分化をもたらし、かくして異種抗体、抗原レセプタ、人工結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメント(単複)を産生する能力をもつリンパ球を生成する段階
を含んで成る方法。 - (a)ハイブリッドーマ細胞を生成するために骨髄腫細胞に分化したリンパ球を融合させること、
(b)形質転換ウイルスにそれを感染させること;
(c)少なくとも1つの形質転換する癌遺伝子の発現を確保するベクター構成体でそれをトランスフェクトすること、
によって、分化したリンパ球を不死化させ、かくして、前記異種抗体、抗原レセプタ、人工結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメント(単複)を常時産生する能力をもつ脊椎動物リンパ球を生成する段階をさらに含んで成る、請求項1に記載の方法。 - 脊椎動物前駆体リンパ球が、リンパV(D)J組換え機構の少なくとも1つの構成要素を発現することができ、軟骨魚類、硬骨魚、両生類、は虫類、鳥類、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマを含む哺乳動物、及びマウス、ラット、ウサギ及びモルモットを含むゲッ歯類を含む顎口脊椎動物に由来する(なおマウスからのマウス前駆体(pre)Bリンパ球が好まれる)、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記脊椎動物前駆体リンパ球が、内因性抗体及び/又は抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント(単複)を発現する潜在能力を有しておらず、これは内因性免疫グロブリン又はそのフラグメントの発現が欠如している脊椎動物前駆体リンパ球を単離/選択すること及び/又は、
(a)V、D及びJ遺伝子セグメントの全て又は一部分を含めた、免疫グロブリン重鎖遺伝子座のコーディング領域、及びその膜貫通エキソンを伴う又は伴わないμ、δ、γ、ε及びα重鎖のための定常領域エキソン用のコーディング領域のうちのいずれか;
(b)V及びJ遺伝子セグメントコーディング領域のいずれかを含めた免疫グロブリンκ及び/又はλ軽鎖遺伝子座のコーディング領域、ならびに定常領域エキソンのうちのいずれか;
(c)V、D及びJ遺伝子セグメントの全て又は一部を含めたT細胞レセプタα、β、γ及びδ遺伝子座のコーディング領域、及びα、β、γ及びδ定常領域エキソンのためのコーディング領域のいずれか;
(d)重鎖イントロンエンハンサ及び3’αエンハンサを含む、シス作用性免疫グロブリン重鎖遺伝子エンハンサ要素;
(e)κ重鎖イントロンエンハンサ(κiE)、3’κエンハンサ及びλ2−4及びλ3−1エンハンサを含むシス作用性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座;
(f)TCRα、β、γ及びδエンハンサを含めた、シス作用性T細胞レセプタ遺伝子座エンハンサ要素;
(g)そのプロモータ及びエンハンサ要素を含むトランス作用性組換え活性化遺伝子、RAG−1及びRAG−2ならびにそのコーディング領域;及び
(h)そのプロモータ及びエンハンサ要素を含む、Ku70、Ku86、DNA依存性タンパク質キナーゼ(DNA−PKcs)の触媒サブユニット、DNAリガーゼIV、XRCC4及びArtemisを含む、V(D)J組換えに不可欠のトランス作用性DNA修復遺伝子、ならびに該遺伝子のコーディング領域、
から成るグループの中から選択されている少なくとも1つの遺伝要素の少なくとも1つの対立遺伝子を機能的に不活性化するように設計された少なくとも1つのベクター構成体を前記脊椎動物前駆体リンパ球内に導入することによって達成される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ベクター構成体が、好ましくは正のトランスフェクタントの選択を可能にする正の選択マーカーにフランキングする、相同的組換えのための機能を付与する前記少なくとも1つの遺伝要素に対するDNA配列相同性をもつ領域を含む遺伝子ターゲティングベクターを内含している、請求項4に記載の方法。
- 前記遺伝子ターゲティングベクターが付加的に、正の選択マーカーをフランキングし、同族リコンビナーゼ酵素の少なくとも1つをコードする核酸配列のトランスフェクション及び過渡的発現の時点で前記正の選択マーカーの欠失を可能にする、部位特異的DNA組換え酵素のための一対のDNA認識配列を含んで成る、請求項5に記載の方法。
- 前記遺伝子ターゲティングプラスミドベクターが付加的に、内部で前記遺伝子ターゲティングベクターが非相同的組換えによりゲノム内に無作為に組込まれているトランスフェクタントに対する選択を可能にする負の選択マーカーを含んで成る、請求項5又は6に記載の方法。
- 異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント(単複)をコードする前記少なくとも1つの外因性遺伝要素が、
(a)野生型であるか又は一次アミノ酸配列(単複)内に単数又は複数の指定された突然変異を有するか又は人工的なものである、少なくとも1つの異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメントの発現を可能にするべく操作可能な形でリンクされている、プロモータ、エンハンサ及びコーディング核酸配列を含んで成る組換え型レトロウイルスDNA構成体;
(b)野生型であるか又は一次アミノ酸配列(単複)内に単数又は複数の指定された突然変異を有するか又は人工的なものである、少なくとも1つの異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメントの発現を可能にするべく操作可能な形でリンクされている、プロモータ、エンハンサ及びコーディング核酸配列を含んで成る組換え型プラスミドベースのDNA構成体;
(c)野生型であるか又は一次アミノ酸配列(単複)内に単数又は複数の指定された突然変異を有する、少なくとも1つの異種抗原又はT細胞レセプタ又はその機能的フラグメントのV(D)J組換え及びその後の発現を可能にするように操作可能な形でリンクされた、再配置されていないV、D及びJ遺伝子セグメントを伴う組換え型プラスミドベースのミニ−免疫グロブリン又はT細胞レセプタ遺伝子座;
(d)野生型であるか又は一次アミノ酸配列(単複)内に単数又は複数の指定された突然変異を有する、少なくとも1つの異種抗原又はT細胞レセプタ又はその機能的フラグメントのV(D)J組換え及びその後の発現を可能にするように操作可能な形でリンクされた、生殖細胞系列立体配置内の免疫グロブリン又はT細胞レセプタ遺伝子座の一部又は全てを含む、細菌、酵母又は脊椎動物人工染色体;
(e)野生型であるか又は一次アミノ酸配列(単複)内に単数又は複数の指定された突然変異を有する、少なくとも1つの異種抗原又はT細胞レセプタ又はその機能的フラグメントの(D)J組換え及びその後の発現を可能にするように設計された修飾された配置内の少なくとも1つの異種免疫グロブリン又はT細胞レセプタ遺伝子座の一部又は全てを含む、細菌、酵母又は脊椎動物人工染色体;
(f)一次アミノ酸配列(単複)に関して野生型である、少なくとも1つの異種抗体又はT細胞レセプタのV(D)J組換え及びその後の発現を可能にする生殖細胞系列立体配置内の免疫グロブリン又はT細胞レセプタ遺伝子座の一部又は全てを包含する異種染色体のフラグメントである染色体導入要素、
から成るグループの中から選択された遺伝子構成体上に担持されている、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。 - 少なくとも1つの外因性遺伝要素が、未変性又は修飾済みヒト抗体、ヒト結合タンパク質、ヒト抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメントをコードする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1つの外因性遺伝要素が結合領域の親和力成熟を受ける能力をもつ異種又は人工レセプタをコードする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 脊椎動物前駆体リンパ球の分化がインビトロで、
(a)前記脊椎動物前駆体リンパ球の増殖を停止させ、あらゆる前駆体リンパ球成長因子の不在下で培養することによって成熟リンパ球系統細胞への分化を誘発すること;及び
(b)(i)インタロイキン−2、インタロイキン−4、インタロイキン−5、インタロイキン−6、インタロイキン−10、インタロイキン−13、TGF−β及びIFN−γを含む可溶性T細胞関連刺激因子;
(ii)CD40、B7−1(CD80)、B7−2(CD86)、補体レセプタ1(CD35)及び2(CD21)、LFA−1(CD11a)、LFA−3(CD58)、CD19、CD20、CD30、CD32、CD37、CD38、CD70、CD71、lgα(CD79α)、lgβ(CD79β)、TAPA−1(CD81)、Fas(CD95)、TNF−レセプタ1(p55、CD120a)、TNF−レセプタ2(p75、CD120b)、Ox−40(CD134)、及びリンフォトキシン−βレセプタに特異的な活性組換え型リガンド又はアゴニスト抗体を含む、B細胞の副刺激レセプタを活性化する因子;及び
(iii)B細胞マイトジェン因子、1型のT細胞依存性抗原及び、リポサッカリド(LPS)、グラム陰性菌からのリポタンパク質、ポリアニオン、ポリ−dldC、ヤマゴボウマイトジェン(PWM)及び抗免疫グロブリン試薬を含むその他のポリクローナル活性体、
及びそれらの組合せの中から選択された成分のうちの少なくとも1つの存在下で前記細胞をさらに培養することによりリンパ球終末分化を誘発すること
によりもたらされる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。 - インビボでの前記分化が、適切な脊椎動物宿主内への前記遺伝的に修飾された前駆体リンパ球の移植の時点でもたらされる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リンパ球が、ナイーブな又は抗原で初回免疫されたTヘルパーリンパ球を用いて前記宿主内に同時移植される、請求項12に記載の方法。
- 前記インビボでの分化の後には、少なくとも1つの所望の免疫原性化合物又は組成物での前記宿主の免疫化が続いている、請求項12又は13に記載の方法。
- 前記脊椎動物宿主が、内因性B細胞、T細胞及び/又はNK(ナチュラルキラー)細胞又はその組合せの生成に関して欠損している適合性のある宿主である、請求項12〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 脊椎動物宿主が、軟骨魚類、硬骨魚、両生類、は虫類、鳥類、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマを含む哺乳動物、及びマウス、ラット、ウサギ及びモルモットを含むゲッ歯類を含む顎口脊椎動物の中から選択され、マウスが好ましい宿主種である、請求項12〜15のいずれか1項に記載の方法。
- それ自体既知の要領でいずれかの異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント(単複)を産生することを目的とした、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法により得ることのできる、遺伝的に修飾され分化された脊椎動物リンパ球の使用。
- 請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法の後には、
(a)少なくとも1つの外因性遺伝要素を前記分化されたリンパ球から単離する段階、及び
(b)前記少なくとも1つの異種抗体、抗原レセプタ、人工結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメント(単複)の産生を可能にする状況下に前記遺伝要素(単複)を置く段階、
が続く、請求項17に記載の使用。 - 前記異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント(単複)が、1つのユニークな特異性を示し従ってモノクローナルである、請求項17又は18に記載の使用。
- 前記異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント(単複)が複数のユニークな特異性を示し、従ってポリクローナルである、請求項17又は18に記載の使用。
- 前記異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント(単複)が、ヒトの遺伝的レパートリ又はその一部分に基づいて組立てることができるようなヒト抗体、抗原レセプタ又は結合タンパク質に完全に又は部分的に類似している、請求項17〜20のいずれか1項に記載の使用。
- 産生させるべき異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント(単複)が、
(a)膜結合又は分泌され、天然の抗体の中に見られる化学量論的組成物内の非相同重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方から成り、かつ既知の重(μ、δ、γ、ε)及び/又は軽(κ及びλ)鎖イソタイプのいずれかから成る抗体;
(b)一次アミノ酸配列に関して完全にヒトである重鎖及び軽鎖ポリペプチドの組合せを伴う抗体;
(c)異なる脊椎動物種からの異種重鎖又は軽鎖ポリペプチドを含有するハイブリッド抗体;
(d)完全に又は部分的に異種である、分泌されたFab、scFv及びF(ab’)2抗体フラグメント、
(e)二重特異性又は多重特異性抗体フラグメントを結果としてもたらす、リンカーペプチドを介して共有結合でカップリングされた抗体のフラグメント、
(f)免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質と構造的類似性をもつ、α、β、γ及びδイソタイプ、抗原レセプタ及びその他の結合タンパク質のT細胞レセプタ、
及びそれらの機能的フラグメントから成るグループの中から選択される、
請求項17〜21のいずれか1項に記載の使用。 - 請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法により得ることのできる、遺伝的に修飾された脊椎動物前駆体リンパ球及びより成熟したリンパ球系統細胞。
- 請求項2〜16のいずれか1項に記載のものに従って得ることのできる、異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメントを産生する不死化された細胞。
- 請求項4〜7のいずれか1項に記載の方法において使用するためのベクター構成体。
- 請求項8に記載の方法において使用するための遺伝的構成体。
- 野生型免疫エフェクタ機能、又は生殖細胞系列でコード化された異種免疫グロブリン又は抗原レセプタから誘導不可能な修飾済み又は人工エフェクタ機能を示す、請求項17〜22のいずれか1項に記載の方法により得られた、少なくとも1つの抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメントを含む、薬学又は診断用調製物。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/EP2001/015303 WO2003068819A1 (en) | 2001-12-22 | 2001-12-22 | Method for the generation of genetically modified vertebrate precursor lymphocytes and use thereof for the production of heterologous binding proteins |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005525800A true JP2005525800A (ja) | 2005-09-02 |
JP2005525800A5 JP2005525800A5 (ja) | 2006-01-05 |
JP4238138B2 JP4238138B2 (ja) | 2009-03-11 |
Family
ID=27675551
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003567945A Expired - Fee Related JP4238138B2 (ja) | 2001-12-22 | 2001-12-22 | 遺伝的に修飾された脊椎動物前駆体リンパ球の生成方法及び異種結合タンパク質の産生を目的としたその使用。 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7741077B2 (ja) |
JP (1) | JP4238138B2 (ja) |
CN (1) | CN100360565C (ja) |
AU (1) | AU2002226390B2 (ja) |
CA (1) | CA2471392A1 (ja) |
IL (2) | IL162111A0 (ja) |
NZ (1) | NZ534205A (ja) |
WO (1) | WO2003068819A1 (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007060864A1 (ja) * | 2005-11-24 | 2007-05-31 | National University Corporation NARA Institute of Science and Technology | 増殖と分化の制御可能な抗体産生前駆b細胞 |
JP2012509666A (ja) * | 2008-11-21 | 2012-04-26 | カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー | 生体外におけるヒトbリンパ球産生培養システム |
JP2013516194A (ja) * | 2010-01-08 | 2013-05-13 | イミュソフト コーポレーション | B細胞を形質導入するためのベクターおよび方法 |
JP2013099358A (ja) * | 2005-12-09 | 2013-05-23 | Academisch Medisch Centrum Bij De Univ Van Amsterdam | 抗体産生細胞の安定性に影響を与える手段および方法 |
Families Citing this family (39)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1568765A1 (en) * | 2004-02-23 | 2005-08-31 | GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH | Method for genetic diversification in gene conversion active cells |
WO2006072803A2 (en) * | 2005-01-10 | 2006-07-13 | Medical Research Council | Antibody |
WO2007067032A1 (en) | 2005-12-09 | 2007-06-14 | Academisch Medisch Cemtrum Bij De Universiteit Van Amsterdam | Means and methods for influencing the stability of cells |
US10155038B2 (en) | 2007-02-02 | 2018-12-18 | Yale University | Cells prepared by transient transfection and methods of use thereof |
US9249423B2 (en) | 2007-02-02 | 2016-02-02 | Yale University | Method of de-differentiating and re-differentiating somatic cells using RNA |
US8859229B2 (en) * | 2007-02-02 | 2014-10-14 | Yale University | Transient transfection with RNA |
NZ579010A (en) * | 2007-02-20 | 2012-03-30 | Anaptysbio Inc | Somatic hypermutation systems |
JP5537420B2 (ja) | 2007-05-31 | 2014-07-02 | ユニヴァーシティ オブ ワシントン | 標的遺伝子の誘導性変異誘発 |
AU2008284015B2 (en) | 2007-08-03 | 2014-05-15 | Musc Foundation For Research Development | Human monoclonal antibodies and methods for producing the same |
EP2098536A1 (en) | 2008-03-05 | 2009-09-09 | 4-Antibody AG | Isolation and identification of antigen- or ligand-specific binding proteins |
WO2010027062A1 (ja) * | 2008-09-04 | 2010-03-11 | 独立行政法人理化学研究所 | B細胞由来iPS細胞およびその用途 |
AU2010271583B2 (en) | 2009-07-15 | 2015-02-12 | Kling Biotherapeutics B.V. | Means and methods for producing high affinity antibodies |
AU2010334809C1 (en) | 2009-12-23 | 2015-02-26 | Agenus Inc. | Binding members for human cytomegalovirus |
KR101667088B1 (ko) * | 2010-02-12 | 2016-10-17 | 니토 보세키 가부시기가이샤 | Ku86 와 이의 자가항체와의 복합체의 면역 측정 방법, 여기에 사용되는 키트 및 이를 이용한 암판정 방법 |
BR112013004266A8 (pt) | 2010-08-23 | 2018-01-02 | Univ Texas | anticorpos anti-ox40 e métodos de uso dos mesmos. |
HUE033141T2 (en) | 2010-12-02 | 2017-11-28 | Aimm Therapeutics Bv | Instruments and methods for producing high affinity antibodies |
CN102229960B (zh) * | 2011-06-03 | 2013-04-03 | 中国科学院微生物研究所 | 小鼠白血病病毒转化骨髓细胞建立细胞系的方法及其应用 |
KR102542272B1 (ko) | 2011-10-28 | 2023-06-13 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 유전자 변형된 t 세포 수용체 마우스 |
US8962315B2 (en) | 2011-12-22 | 2015-02-24 | Elwha Llc | Compositions and methods including recombinant B lymphocyte cell line including at least one endogenous gene expressing at least one endogenous membrane immunoglobulin reactive to a first antigen and including at least one exogenously incorporated nucleic acid expressing at least one exogenous secreted immunoglobulin reactive to a second antigen |
US9175072B2 (en) * | 2011-12-22 | 2015-11-03 | Elwha Llc | Compositions and methods including recombinant B lymphocyte cell line including an exogenously incorporated nucleic acid expressing an exogenous membrane immunoglobulin reactive to a first antigen and including an endogenous gene expressing an endogenous secreted immunoglobulin reactive to a second antigen |
US10233424B2 (en) | 2011-12-22 | 2019-03-19 | Elwha Llc | Compositions and methods including cytotoxic B lymphocyte cell line expressing exogenous membrane immunoglobulin different from secreted immunoglobulin |
US10745468B2 (en) | 2011-12-22 | 2020-08-18 | Kota Biotherapeutics, Llc | Compositions and methods for modified B cells expressing reassigned biological agents |
DK2840892T3 (en) * | 2013-02-20 | 2018-07-23 | Regeneron Pharma | Non-human animals with modified heavy chain immunoglobulin sequences |
CN103571796B (zh) * | 2013-11-15 | 2015-04-29 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 鸡白介素-10单克隆抗体及其制备方法和应用 |
WO2015115892A1 (en) | 2014-01-31 | 2015-08-06 | Aimm Therapeutics B.V. | Means and methods for producing stable antibodies |
US20170058029A1 (en) * | 2014-05-02 | 2017-03-02 | Chiome Bioscience Inc. | Human antibody-producing cell |
US10793642B2 (en) | 2014-12-11 | 2020-10-06 | Inbiomotion S.L. | Binding members for human c-MAF |
ES2959608T3 (es) * | 2015-04-03 | 2024-02-27 | Dana Farber Cancer Inst Inc | Composición y métodos de edición del genoma de células B |
HRP20231039T1 (hr) | 2015-04-06 | 2023-12-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Imunosni odgovori posredovani humaniziranim t stanicama kod ne-humanih životinja |
EP3320099B1 (en) * | 2015-07-09 | 2023-09-13 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) | Lentiviral vector expressing membrane-anchored or secreted antibody |
WO2017025871A1 (en) | 2015-08-07 | 2017-02-16 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Combination therapy comprising anti ctla-4 antibodies |
KR20180042449A (ko) * | 2015-09-15 | 2018-04-25 | 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 | T 세포 수용체(tcr) 결합 항체 및 이의 용도 |
US11377637B2 (en) | 2016-04-15 | 2022-07-05 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Transgenic T cell and chimeric antigen receptor T cell compositions and related methods |
EP3469069A4 (en) | 2016-06-10 | 2020-01-22 | Kota Biotherapeutics, LLC | COMPOSITIONS AND METHODS COMPRISING A B LYMPHOCYTE CELL LINE EXPRESSING A MEMBRANE IMMUNOGLOBULIN DIFFERENT FROM A SECRETED IMMUNOGLOBULIN AND CYTOLYTIC FUNCTION |
EP3494140A1 (en) | 2016-08-04 | 2019-06-12 | GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd | Anti-icos and anti-pd-1 antibody combination therapy |
EP3548068A1 (en) | 2016-12-01 | 2019-10-09 | GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited | Combination therapy |
BR112019011370A2 (pt) | 2016-12-01 | 2019-10-15 | Glaxosmithkline Ip Dev Ltd | terapia de combinação |
EP3635011A1 (en) | 2017-06-09 | 2020-04-15 | GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited | Combination therapy with icos agonist and ox40 agonist to treat cancer |
CN110831971A (zh) | 2017-06-09 | 2020-02-21 | 葛兰素史克知识产权开发有限公司 | 用icos激动剂和ox40激动剂治疗癌症的组合疗法 |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5169939A (en) * | 1985-05-21 | 1992-12-08 | Massachusetts Institute Of Technology & Pres. & Fellows Of Harvard College | Chimeric antibodies |
US6051225A (en) * | 1988-10-19 | 2000-04-18 | The Dow Chemical Company | Family of high affinity, modified antibodies for cancer treatment |
EP1690935A3 (en) | 1990-01-12 | 2008-07-30 | Abgenix, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
US5622853A (en) | 1990-05-01 | 1997-04-22 | Becton Dickinson And Company | T lymphocyte precursor |
DK0585287T3 (da) | 1990-07-10 | 2000-04-17 | Cambridge Antibody Tech | Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer |
US5874299A (en) | 1990-08-29 | 1999-02-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
KR100272077B1 (ko) * | 1990-08-29 | 2000-11-15 | 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 | 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물 |
US6300129B1 (en) * | 1990-08-29 | 2001-10-09 | Genpharm International | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
EP0605522B1 (en) | 1991-09-23 | 1999-06-23 | Medical Research Council | Methods for the production of humanized antibodies |
JPH05184386A (ja) | 1991-12-27 | 1993-07-27 | Sumitomo Chem Co Ltd | 改変抗体及び改変抗体を産生する組み換え体 |
GB9423085D0 (en) | 1994-11-16 | 1995-01-04 | Stringer Bradley M J | Targeted T lymphocytes |
US20040016007A1 (en) * | 2000-05-15 | 2004-01-22 | Sonoko Habu | Chimeric mouse having immunity constructed by using human cd34-positive cells and use thereof |
US20050196755A1 (en) | 2000-11-17 | 2005-09-08 | Maurice Zauderer | In vitro methods of producing and identifying immunoglobulin molecules in eukaryotic cells |
-
2001
- 2001-12-22 US US10/499,631 patent/US7741077B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-12-22 JP JP2003567945A patent/JP4238138B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-12-22 NZ NZ534205A patent/NZ534205A/en unknown
- 2001-12-22 IL IL16211101A patent/IL162111A0/xx unknown
- 2001-12-22 WO PCT/EP2001/015303 patent/WO2003068819A1/en active Application Filing
- 2001-12-22 AU AU2002226390A patent/AU2002226390B2/en not_active Ceased
- 2001-12-22 CN CNB018239560A patent/CN100360565C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-12-22 CA CA 2471392 patent/CA2471392A1/en not_active Abandoned
-
2004
- 2004-05-20 IL IL162111A patent/IL162111A/en not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-12-18 US US12/642,754 patent/US20110059056A1/en not_active Abandoned
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007060864A1 (ja) * | 2005-11-24 | 2007-05-31 | National University Corporation NARA Institute of Science and Technology | 増殖と分化の制御可能な抗体産生前駆b細胞 |
JP2013099358A (ja) * | 2005-12-09 | 2013-05-23 | Academisch Medisch Centrum Bij De Univ Van Amsterdam | 抗体産生細胞の安定性に影響を与える手段および方法 |
JP2012509666A (ja) * | 2008-11-21 | 2012-04-26 | カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー | 生体外におけるヒトbリンパ球産生培養システム |
JP2013516194A (ja) * | 2010-01-08 | 2013-05-13 | イミュソフト コーポレーション | B細胞を形質導入するためのベクターおよび方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN100360565C (zh) | 2008-01-09 |
JP4238138B2 (ja) | 2009-03-11 |
AU2002226390A1 (en) | 2003-09-04 |
IL162111A0 (en) | 2005-11-20 |
US7741077B2 (en) | 2010-06-22 |
WO2003068819A1 (en) | 2003-08-21 |
CN1633448A (zh) | 2005-06-29 |
NZ534205A (en) | 2006-04-28 |
US20060052585A1 (en) | 2006-03-09 |
AU2002226390B2 (en) | 2007-11-15 |
CA2471392A1 (en) | 2003-08-21 |
US20110059056A1 (en) | 2011-03-10 |
IL162111A (en) | 2009-07-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4238138B2 (ja) | 遺伝的に修飾された脊椎動物前駆体リンパ球の生成方法及び異種結合タンパク質の産生を目的としたその使用。 | |
EP1321477B1 (en) | Method for the generation of genetically modified vertebrate precursor lymphocytes and use thereof for the production of heterologous binding proteins | |
AU2009248834B2 (en) | Method of generating single VL domain antibodies in transgenic animals | |
KR100891634B1 (ko) | 비동족형 스위치 영역에 의해 인간 항체의 특정 이소타입을생산하는 트랜스제닉 동물 | |
KR100416680B1 (ko) | 세포 융합 방법에 의한 다성분 단백질의 제조 | |
JP6043431B2 (ja) | 特異的な結合タンパク質または機能性タンパク質の遺伝子転位を利用した同定 | |
US6677138B2 (en) | Production of a multimeric protein by cell fusion method | |
CN103946236B (zh) | 表达cd40l的哺乳动物细胞及其用途 | |
JP6019540B2 (ja) | 抗原特異的又はリガンド特異的結合タンパク質の同定 | |
ZA200403978B (en) | Method for the generation of genetically modified vertebrate precursor lymphocytes and use thereof for the production of heterologous binding proteins. | |
AU768101B2 (en) | Production of a multimeric protein by cell fusion method | |
AU2015200339A1 (en) | Method of generating single VL domain antibodies in transgenic animals |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080122 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080418 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080425 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080519 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080528 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080623 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080630 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080718 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080819 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081106 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20081216 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20081219 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111226 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121226 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121226 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131226 Year of fee payment: 5 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |