JP2005525536A - 溶液から分子を抽出するための合体可能なプロセシングモジュール - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、化学分析のための方法及び装置に関連する。一生詳細には、本発明は、生物学的な標本をプロセシング(processing)するための方法に関連する。更に一層詳細には、本発明は生物分子、例えばペプチド及び/又はタンパク質を、溶液中の分子の混合物から抽出するための装置に関連する。
化学分析及び特に生物標本中のタンパク質などの生物分子分析は、速度と正確さに対する要請が高まりつつある。標本の様々な部分の分離、抽出及び調製を促すための様々な方法が提案されているが、そこには、依然として多く複数の標本を調査するための取り扱い及びプロセシング時間が実際上増加する問題がある。
本発明は、先に説明した、生物標本の取り扱い速度を高めるための要請を満足する。詳細に、本発明は、標本を様々な画分へと分離し各画分はその後の検体の抽出に委ねられることを伴う分析に委ねる、かかる標本の取り扱い速度を高める。
この説明において「仮想流チャネル(virtual flow channel)」とは、層になって流れる流体の微小流部分を意味し、当該部分は流れの方向に対して平行である長軸を有し、そして当該部分は流れの方向に対して直行する幅と深さを有し、当該部分は、前記層流及び小(マイクロ)寸法(demention)が理由で、その他の流れる流体とは混合しない実体としてみなすことができ、従って、「仮想チャネル」が構築される。代わりの用語は:「仮想チャネル流」、「仮想流ライン」及び「仮想流レーン」である。
本発明の最初の実施態様は、各々が多孔質床(201)を含むように工夫されているある数の分離チャネル(101、111)を有し、混合物がそれを通過せしめられているときにその成分の1つから物質を吸収することができる抽出器を含んで成る。前記床は、微小ビーズの床などを含んで成ることができる。前記チャネル(101、111)は、微小寸法を有して配置されている。前記チャネルの幅は、典型的に数十mm未満であり、往々にして更により小さい。チャネルの深さもこの程度である。前記微小ビーズは、抑止手段(255、305、405)によってチャネルから抜け出さない予防がされている。前記抑止手段は、メッシュ、又は前記マイクロビーズの直径よりも小さな空間を有し配置されているある数のカラムを含んで成りうる。
代わりの実施態様において、前記抽出器は、合体可能であるように設計されている。そしてこの用語は、前記抽出器が他の装置に対して、接続可能、取り外し可能そして再接続可能であることを意味する。前記合体可能抽出器(207)は、分析装置などの他の部分から手動あるいは自動的に取り外すことができるように工夫されているプレート又は他の可動式実体を含んで成る。前記抽出器は、分析装置の同もしくは他の部分、例えば、洗浄装置もしくは分注装置に対して再接続可能なよう考え出されてもいる。特に、かかる実施態様は、合体並びに分析装置の他の部分から抽出器の入口への流体の流れ、並びに当該抽出器の出口から当該分析装置の他の部分への流れを可能にする合体手段を含んで成る。かかる部分としては、供給装置もしくは洗浄装置、もしくは溶出装置、又はそれらの組み合わせが挙げられる。前記合体手段は、機械的な取り扱いにもかかわらず、物質が合体可能な抽出器から抜け出ることを防ぐための手段をも含んで成りうる。前記手段は、配置された小領域を含んで成って良く、それは物質を毛管力によって抽出器内に維持するだろう。
本発明の実施態様の抽出器に対する検体溶液の供給は、図10を参照にすれば、当該溶液の液滴を液滴入口領域(1010)中に分注することによって行われている。この領域は、抽出床に対する直接流体連結部(1020)を有する。前記抽出器のチャネルの小寸法が理由で、引き続いて毛管力が当該抽出器を満たすだろう。次いで、流体は、ろ紙を出口(1030)にて適用することによって当該抽出器を通り排出される。前記紙は、全ての流体を当該抽出器から排出せしめ液滴を液滴入口領域に残さないかあるいはより多量の流体を当該抽出器の中に入れるための適切なキャピラリー特性を有する。液滴ローディング及びろ紙排出の同じ手順が洗浄及び溶出のために使用できうる。
合体可能抽出器の代わりの実施態様において、図6、7、8、及び9を参照にすれば、抽出器集成体は、「集成体ライン」:抽出器モジュールの効率的且つロボット化された取り扱いを供するための複数の抽出器配列を含んで成るように発明されている。
合体可能な抽出器のこれらの代わりの実施態様の1つにおいて、図6及び図7aを参照にすれば、連結された鎖列抽出器-集成体は、当該鎖列の長軸に対して平行な複数の抽出器の配列(630、640など)及び1つの抽出器の配列を他のものから分ける直角に走っているノッチ(601)を含んで成る。各々の抽出器配列はある数の抽出器チャネル(610)を含んで成る。所定のノッチでカートリッジを曲げることによって、分離配列の1つを、次のディスペンサーの配列(690)などに対して合体せしめることが可能になり、その理由は先の抽出器配列が上方に曲げられて、次の抽出器の配列(690)のために空間を使用可能にするからである。他のノッチで曲げることでも、他の配列を前記ディスペンサー配列(690)に対して合体せしめることが可能になる。
図7bにおいて、鎖列の長軸LAに対して直角に走っている、セクションともいわれる、多数の抽出器の配列を含んで成る直角に連結した鎖列抽出器-集成体が示されている。この直角に連結した鎖列は、多くのマイクロ抽出配列に対する簡単なアクセスを同時に担う、合体表層(710、720)を当該鎖列の長手(long side)において提供する。図9aは、抽出床(911)を有する抽出配列(930)に対して検体を供給するために、ピペット(910)がどのようにして配置されるのかが示されており、当該抽出配列(930)は、以下に記載されたプロセシング法を行う「集成体ライン」取り扱い装置の種類に従って移動するように発明されている。第一段階における第一の場所で、第一番目のピペットの組(910)は検体の液滴を抽出床(911)の入口に配置する。余分な検体は、抽出床(911)出口に配置されている第一吸引装置(920)によって取り除かれる。次いで、抽出配列(930)は第二番目の場所へと移動し、ここで第二番目のピペットの組(935)が洗浄用流体を当該抽出配列に対して加え、そして余分な流体は第二吸引装置(938)によって取り除かれる。次いで、抽出床が第三番目の場所へと移動し、ここで第三番目のピペットの組が溶出流体を前記抽出配列に対して供給し、そしてここでは抽出配列出口に対して連結されている分注配列(950)が、そのようにして溶出された溶出物を液滴(955)として回収して噴出する。
図8には、円形ディスク又は「デイジーホイール」配置を含んで成るマイクロ抽出器集成体の他の有利な実施態様が示されており、ここではある数のセクション、A、B、Cなど各々がマイクロ抽出配列を含んで成り、上記のようにマイクロ抽出配列がローディング及び排出をするために滴下/ろ紙装置のいずれかに対して配置される/合体せしめられる、又は図9に概要が示されているように、他の種類のローディング/排出装置に対して合体せしめられる。図9bは図9aに類似しており、第一(960)、第二(963)、及び第三(969)番目のピペットの組が図9a中の対応するピペットの組910、935、945と同じ機能を有する。ディスペンサー(970)は上記に対応する方法で液滴(980)を噴出する。
上記のマイクロ抽出器の実施態様は、変更を加えることなく又は、僅かな変更により保存ユニットとしても使用でき、タンパク質試料を合体可能なマイクロチップ上に長期に渡り、例えば−20℃で保存し維持することができる。
他の好適な実施態様において、プロセシングモジュールは、上記の機能を有する抽出器部分(302)及びディスペンサー部分(301)を含んで成る。モジュールの第一の部分は抽出器を含んで成り、そして全体的に当該第一部分と一体化されている第二の部分はディスペンサーノズル開口部(501〜506)(図5aでは「上」からみている)の配列を含んで成る。溶出物の各分離流は分離ディスペンサーノズルへ導かれる。前記ノズル(501〜506)は互いに傍らに配置されうる。前記ノズルはお互いの関係においてジクザグ又は僅かにジグザグに配置されても良い。従って、前記ノズルがディスペンサーノズル配列を形成している。
図11を参照にすれば、本発明の代わりの実施態様は圧電作動装置及びディスペンサーノズルの代わりに電気スプレーノズル(1101)及び対応する電源(1105)及び回路(1110)を含んで成り、前記合体可能抽出チップを、電気スプレーを使用する直列質量分析装置;又は他の種類のイオン化装置と適合せしめている。
代わりの実施態様において、前記モジュールには上記抽出手段と一緒に一体化されている等電点電気泳動手段が備えられている。
前記装置は、好適にポリマー又はシリコンで作製されている。ポリマー装置の大量生産のための母型は、好適に金属から又はセラミック材料から作られている。シリコンは本質的に、室温又は近室温でタンパク質混合物共に使用する場合、不活性である。この材料は、確立されたエッチング技術により材料の一部をエッチングするためなどのマイクロマシン化技術にも非常に適している。
前記装置は、好適にプレート構造において作製されており、前記チャネルは第一プレートの表層の層において形成されている。前記チャネルは、引き続いて、第一プレートに対して第二プレートを接着させることによって封止されている。
先に開示された抽出装置は、以下の段階を含んで成る、高い速度で生物標本をプロセシングするための方法において使用されている。その段階とは;前記抽出器を、マイクロビーズを当該抽出器へとローディングするためにプライミング装置に対して合体せしめ、そして当該抽出器をプライミング溶液でフラッシングし、当該抽出器を当該プライミング装置から切り離し、生物標本を流体の層において合体可能なマイクロ抽出装置に流し、所定の生物分子をマイクロビーズに対して前記抽出器内で接着せしめ、当該抽出器を洗浄装置に対して合体せしめ、当該抽出器をフラッシングし、当該抽出器を当該洗浄装置から切り離し、当該抽出器を溶出装置に対して合体せしめ、当該抽出器から所定の生物分子を溶出させる段階を含んで成る。前記生物分子は、MALDI-TOF MSを使用する更なるプロセシングのために、標的プレート上に分注するための分注装置に対して直接、溶出されて良い。
本発明の方法の好適な実施態様は以下の段階を含んで成り、それは:
−マイクロ抽出装置/ユニットを第一番目のプロセスステーションに対して合体せしめる(任意)。かかる第一番目のプロセスステーションにおいて行われる段階は:
−ビーズをマイクロチップにローディングする、いわゆる充填段階、ここで前記ビーズがマイクロ抽出床を形成し;粒子が溶かされている有機溶媒/水混合部を含んで成るスラリーが高圧(約1bar)を使用して合体可能チップへと供給され、それによってビーズ/当該スラリーが充填されること、を含んで成る。このことは、マイクロ抽出床の高効率での操作を達成するために重要である。
−代わりに有機重合調整剤/水混合物を適用すること、又は酸性水溶液を適用することによって前記ビーズを活性化させること。
−試料をマイクロ抽出床(マイクロビーズ)上にロードディングする、即ち、試料を入口にて、入口に圧力を供給するもしくは吸引/低い圧力を出口に供給するもしくは毛管力を使用すること、例えば、液滴を入口にそしてろ紙を出口に適用することによる、のいずれかによって供給すること。この段階の後、試料は精製/100倍濃縮されてチップ中に存在する。
−マイクロ抽出床を、入口で押し出し圧を使用するかあるいは出口で低圧による吸引を使用することで洗浄液、例えば、弱酸性溶液及び/又は弱溶媒(weak solvent)により洗浄すること。
−例えば、チャネルを通じて乾燥空気を供給することによって床/ビーズを乾燥させること。
−(もし必要ならば)前記マイクロ抽出ユニットを第一番目のプロセスステーションから切り離すこと。
−(任意に)前記マイクロ抽出ユニットを第三番目のプロセスステーションに対して合体せしめ、そして好適には当該マイクロ抽出ユニットの下流に位置する装置、好適にはマイクロディスペンサー(各セクションにおいて各マイクロ抽出床に対してその後合体せしめられる単一のディスペンサー、もしくはセクションにおけるマイクロ抽出床全てに対して適合(同時に合体)するディスペンサーの配列、もしくは各々が配列状ディスペンサーの噴射ノズルに対応する、マイクロ抽出床を有するセクション全体に対して合体せしめられる一体化された配列状ディスペンサー)を操作し、前記第二番目のプロセスステーションが、高濃度の所望の検体を有する液滴を溶出及び分注/噴出することができること。
−ビーズから試料を溶出させること。
−試料を標的プレート上に分注すること。
−標的プレートからの分析値の読み込みを行うこと。
−マイクロ抽出モジュール/マイクロ抽出カートリッジを廃棄すること、
である。
図12及び13において、本発明の方法及び装置の実施態様に関する主要なロボット段階と一緒に、試料ロードディング、洗浄、合体及び抽出を行うための要素が示されている。図12はx-並進ステージ(1201)上での96ウェル形式マイクロ抽出チップ配列を示している。前記チップ配列は、x-並進装置、又は示されてはいないx-並進器によって、今後x-方向に言及する矢印(1210)で示された方向において移動可能である。前記x-並進器はチップ配列(1220〜1270)をそれらが真空収穫器(1230)の下で最後になる(end up)ように配置する。この配列は各々、12個のマイクロ抽出器ユニットを含み、そしてかかるマイクロ抽出配列(1220〜1227)を一度に取り扱う配置をされたx-y、又はz-y制御真空収穫器(1230)によって上昇及び移動せしめられる。図12の右の方には、y-制御溶出ピペット(1240)、及びy-制御ディスペンサー洗浄ピペット(1242)が示されている。代わりに、これらのピペットはz-制御されても良い。ピペット(1240、1242)は流体、即ち、溶離剤及び洗浄流体を単一末端マイクロディスペンサー(1245)の入口開口部に対して適用できるように配置されている。マイクロディスペンサー(1245)は、放出態様で、微細な液滴をx-yステージ上のMALDI標的(1250)へ分注できるように配置されている。洗浄中、真空封止装置(1260)が前記ディスペンサーノズルの周囲に適用される。
Claims (31)
- 所定の分子を溶液から抽出するためのプロセシング(processing)モジュールであって、1以上の細長いチャネル(101)を有する抽出ユニットを含んで成り、当該1以上のチャネルの各々は入口(102)及び出口(103)を有し、そして接着ユニット(201)が備えられており、当該ユニットの各々は、前記所定の分子に対して親和性を有する接着手段が備えられており、当該抽出ユニットは更に、1以上の入口及び1以上の出口を有する合体手段(205)を含んで成り、それにより当該抽出器が、対応する合体手段を有する他の装置に対して合体すること及び切り離すことが可能になり、従って、前記溶液又は他の流体が前記他の装置から流れ、1以上の入口配列に入り、1以上のチャネル(101)を流れ抜け(flow through)、そして1以上の出口を介して当該抽出装置を離れることができるプロセシングモジュール。
- 2以上のチャネル(101、111)を含んで成り、当該チャネルの各々がプレート中に溝を含んで成り、各々の溝は分割壁(521〜525)によって近くの溝から分離されており;前記装置は、当該溝の封止として働く封止層(208)をも含んで成る、請求項1に記載のモジュール。
- 前記合体手段が、漏れが生じるのを防ぐ封止手段を有する1以上の領域を含んで成る、請求項2に記載のモジュール。
- 前記合体手段が、漏れが生じるのを防ぐ1以上の疎水領域を含んで成る、請求項2に記載のモジュール。
- 前記合体手段が、漏れが生じるを防ぐ1以上のポリマーフィルムを含んで成る、請求項2に記載のモジュール。
- 前記合体手段が、漏れが生じるのを防ぐ1以上のo-リングを含んで成る、請求項2に記載のモジュール。
- 前記合体手段が、リトグラフ技術を使用しポリマーをパターニングすることによって形成された封止機構を含んで成る、請求項2に記載のモジュール。
- 前記合体手段が、表層修飾技術を使用することで形成された疎水断点(hydrophobic break)を含んで成る封止機構を含んで成る、請求項2に記載のモジュール。
- 前記接着ユニット(201)が、抑止手段(255、305、405、1030)によって各々のチャネルの内側に維持されている多孔質床(201)を含んで成る、請求項2に記載のモジュール。
- 前記接着ユニット(201)が、前記チャネルを規定する表層(101、111)の少なくとも一部を含んで成り且つ当該規定の表層が表層を修飾されたシリコン及び/又は多孔質シリコンを含んで成ることができる、請求項2に記載のモジュール。
- ディスペンサーノズル(307)、流域(310)、柔軟膜(315)及び圧電素子(320)を有するディスペンサーを更に含んで成り、当該素子は、当該膜(315)を制御可能に作動せしめるよう配置されており、それによって当該流域中に存在する的確な量の液体の分注が生じる、請求項2に記載のモジュール。
- 前記チャネルとの流体連絡において配置されており、前記モジュールを、電気スプレーを使用するタンデム質量分析装置;又は他の種類のイオン化装置と適合せしめる、電気スプレーノズル(1101)を更に含んで成る、請求項2に記載のモジュール。
- 前記分割壁は、部分的に又は完全に下流の抑止手段が取り去られ、全チャネル(101〜111)が流れ入る共通流域(310)を形成している、請求項11又は12に記載のモジュール。
- 前記分割壁が前記ディスペンサーの全域に渡り延ばされており、それによって機械的に流れを各々のチャネルから分離する、請求項3〜8のいずれか1項に記載のモジュール。
- 入ってくる溶液を様々なpHの生物分子を含む溶液画分へと分離するために、電場を生成できる自由流(free flow)電気泳動ユニット(130、330)を更に含んで成り、ここで前記チャネル(101)の各々は、対応する溶液の画分を平行層流から受け取るために電場との関係において配置されている、請求項1に記載のモジュール。
- 前記電気泳動ユニットが、前記電場を発生するために前記チャネルの壁に一体化されている一組の電極(332、334)を含んで成る、請求項15に記載のモジュール。
- 1つの流れの方向、即ち、入口からディスペンサー又は出口において連続的又は不連続的に流れる検体を取り扱うことができる、請求項1〜16のいずれか1項に記載のモジュール。
- 前記電気泳動ユニットが、等電点電気泳動区画(135)に対して流体連絡をする側方区画中に配置されている一組の電極を含んで成る、請求項15に記載のモジュール。
- 高められた速度で生物標本をプロセシングするための方法であって:
−流体相における生物標本を、請求項1に記載の合体可能なマイクロ抽出装置に流し;
−所定の生物分子を前記抽出器内のユニットに接着させ、当該抽出器を溶出装置に対して合体せしめ;
−所定の生物分子を前記抽出器から溶出させる、
段階を含んで成る方法。 - 前記抽出器をプライミング(priming)装置に対して、マイクロビーズを当該抽出器にローディングするために合体せしめ、そして当該抽出器をプライミング溶液でフラッシングし、当該抽出器を当該プライミング装置から切り離し、当該抽出器を洗浄装置に対して合体させ、当該抽出器をフラッシングし、当該抽出器を当該洗浄装置から切り離す段階を更に含んで成る、請求項19に記載の方法。
- 前記抽出器を次の抽出装置に対して合体せしめることを更に含んで成る、請求項19に記載の方法。
- 前記次の抽出装置が分注装置である、請求項19に記載の方法。
- 前記分注装置が圧電式、機械式、熱抵抗性又は電気スプレー型である、請求項21に記載の方法。
- 前記流れが1つの流れの方向でのみ生じる、請求項19〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1又は複数の接着ユニットに対して接着するタンパク質試料を、例えば−20℃での長期に渡る保存で維持することができる保存ユニットとして使用するための請求項1又は2に記載のモジュール。
- いくつかのマイクロ抽出配列(1220〜1227)を含んで成るステージ(1201)を直線的に移動せしめる段階を更に含んで成る、請求項24に記載の方法。
- 前記配列(1220)のうち1つを上昇させて横方向に移動させる段階を含んで成る、請求項26に記載の方法。
- 前記上昇が二次元で移動可能な真空収穫手段(1230)によって達成されている、請求項27に記載の方法。
- 前記ディスペンサー(1245)の洗浄をする間に当該ディスペンサーノズルの周囲を真空封止装置(1269)により真空封止する段階を含んで成る、請求項28に記載の方法。
- 前記ステージ(1201)上のモノリシック抽出配列の数が8である、請求項26に記載の方法。
- 各々の配列における前記抽出器の数が12である、請求項26に記載の方法。
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