JP2005524053A - 乳房の疾患を検出するために有用な試薬及び方法 - Google Patents

乳房の疾患を検出するために有用な試薬及び方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、患者における乳癌の検出のための２つ又はそれ以上の乳房特異的マーカーの使用に関する。

Description

本発明は一般に乳房の疾患を検出することに関する。さらに、本発明はまた、乳房の疾患を検出するための試薬及び方法に関する。より特定すると、本発明は、ポリペプチド配列のような試薬、ならびにこれらの配列を利用する方法に関する。ポリペプチド配列は、乳癌のような、乳房の疾患又は状態を検出する、診断する、病期分類する、監視する、予後を判定する、インビボで画像化する、予防する又は治療する、若しくは素因を判定するために有用である。
乳癌は、米国では女性において発生する癌の最も一般的な形態である。米国における乳癌の発生率は、１９９８年には１８０，３００例が乳癌の診断を受け、４３，９００例が乳癌に関連して起こった死亡と数量化される（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙの統計）。世界的には、乳癌の発生率は１９８５年の７００，０００例から１９９０年には約９００，０００例に増加した。Ｇ．Ｎ．Ｈｏｒｔｏｂａｇｙｉら、ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ４５：１９９−２２６（１９９５）。
乳癌のような、乳房の疾患又は状態を検出する、診断する、病期分類する、監視する、予後を判定する、インビボで画像化する、予防する又は治療する、若しくは素因を判定するために使用される手法は、患者の結果にとって決定的に重要である。例えば、早期乳癌と診断された患者は、遠隔転移乳癌との診断を受けた患者についての約２０％という生存率に比べて、９０％以上の５年相対生存率を有する（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙの統計）。現在、早期乳癌の最良の初期指標は乳房の理学的検査とマンモグラフィである。Ｊ．Ｒ．Ｈａｒｒｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，第４版、ｐ．１２６４−１３３２、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｊ／Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．（１９９３）。マンモグラフィは理学的検査によって検出できるより前に乳癌を検出しうるが、限界がある。例えば、マンモグラフィの予測値は観察者の技術と乳房Ｘ線像の質に依存する。さらに、疑わしい乳房Ｘ線像の８０−９３％が偽陽性であり、乳癌を有する女性の１０−１５％が偽陰性の乳房Ｘ線像を示す。Ｃ．Ｊ．Ｗｒｉｇｈｔら、Ｌａｎｃｅｔ ３４６：２９−３２（１９９５）。早期乳癌を検出するためにより感受性が高く且つ特異的な新しい診断方法が明らかに必要とされている。
乳癌患者は、初期治療後及び補助療法の間、治療に対する応答を判定し、持続性又は再発性疾患、若しくは早期遠隔転移を検出するために厳密に監視される。乳癌を監視するための現在の診断手法は、マンモグラフィ、骨スキャン、胸部Ｘ線写真、肝機能検査及び血清マーカーについての検査を含む。患者を監視するために最も一般的に使用される血清腫瘍マーカーは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及びＣＡ １５−３である。ＣＥＡの限界は、転移性疾患を有する女性の約４０％において高い血清レベルが存在しないことを含む。加えて、補助療法中のＣＥＡ上昇は再発に関係せず、臨床的に重要でない他の因子に関連すると考えられる。ＣＡ １５−３も、重要な数の進行性疾患患者において陰性の場合があり、それ故転移を予測することができない。ＣＥＡ及びＣＡ １５−３のいずれもが非悪性の良性状態において上昇することがあり、偽陽性結果を生じる。それ故、癌の再発を検出する上でより感受性があり、特異的な乳房関連マーカーを見出すことは臨床的に有益である。Ｊ．Ｒ．Ｈａｒｒｉｓら、前出、Ｍ．Ｋ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，第１巻、第４版、ｐ．５３１−５４２、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｊ／Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．１９９３。
乳癌を管理する上でのもう１つの重要な段階は患者の疾患の病期を判定することであり、それは、病期判定が潜在的な予後値を有しており、最適の治療法を設計するための判定基準を提供するからである。現在、乳癌の病理学的病期分類は臨床的病期分類よりも好ましい。前者がより正確な予後を与えるからである。Ｊ．Ｒ．Ｈａｒｒｉｓら、前出。他方で、臨床的病期分類は、病理学的評価のために組織を採取する侵襲性手順に依存しないため、それが少なくとも病理学的病期分類と同程度に正確であれば、好ましい。乳癌の病期分類は、浸潤の様々な段階を区別できる、血清中又は尿中の新しいマーカーを検出することによって改善できる。そのようなマーカーは、乳房の原発腫瘍に由来するが、血液、骨髄又はリンパ節に存在する細胞によって発現されるタンパク質マーカーでありえ、これらの遠位器官への転移についての感受性のある指標として役立つ。例えば、乳房上皮細胞に関連する特異性タンパク質抗原が、免疫組織化学的手法により、乳癌患者の骨髄、リンパ節及び血液において検出され、転移が示唆された。Ｋ．Ｐａｎｔｅｌら、Ｏｎｋｏｌｏｇｉｅ １８：３９４−４０１（１９９５）。
そのような診断手法はまた、極めて侵襲性の低い手順によって得られる血液、血漿、血清又は尿などの被験試料において、免疫学的方法によって検出可能な様々な疾患マーカーの出現に基づく免疫学的アッセイを含みうる。これらの診断手順は、患者にとって低いコストで、医師が乳房疾患を有する患者を管理する上で助けとなる情報を提供する。前立腺特異抗原（ＰＳＡ）及びヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）などのマーカーが存在し、それぞれ前立腺癌及び精巣癌に関して患者をスクリーニングするために臨床的に使用される。例えば、ＰＳＡは通常前立腺によって高いレベルで精液中に分泌されるが、正常な前立腺を有する男性の血液中にも非常に低いレベルで存在する。血清中の高レベルのＰＳＡタンパク質は、無症候性男性における前立腺癌又は前立腺疾患の早期検出に使用される。例えば、Ｇ．Ｅ．Ｈａｎｋｓら、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，第１巻、第４版、ｐ．１０７３−１１１３、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｊ／Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．１９９３。Ｍ．Ｋ．Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，第１巻、第４版、ｐ．５３１−５４２、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｊ／Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．１９９３参照。同様に、乳房で正常に発現されるが、乳房の疾患の結果として不適切な身体画分において高い量で認められる新しいマーカーの使用によって乳房疾患の管理が改善される。
さらに、早期乳癌の生物学的行動を予測しうる新しいマーカーも重要な価値を持つ。患者の生命を脅かす又は将来脅かす早期乳癌は、脅威ではない又は脅威とはならないものよりも臨床的に重要である。Ｇ．Ｅ．Ｈａｎｋｓら、前出。そのようなマーカーは、組織学的には陰性のリンパ節を有するいずれの患者が癌の再発を経験するかを予測するため及びまた原位置の腺管癌のいずれの症例が侵襲性乳癌へと進行するかを予測するために必要である。より正確な予後マーカーは、臨床医が、攻撃的に治療しなければ進行して転移することになる、乳房に限局した早期癌を正確に特定することを可能にする。さらに、患者に攻撃的な癌についてのマーカーが存在しなければ、患者は高価で利益のない治療を免れることができる。Ｊ．Ｒ．Ｈａｒｒｉｓら、前出。Ｅ．Ｒ．Ｆｒｙｋｂｅｒｇら、Ｃａｎｃｅｒ ７４：３５０−３６１（１９９４）。
それ故、乳房の疾患又は状態を検出する、診断する、病期分類する、監視する、予後を判定する、インビボで画像化する、予防する又は治療する、若しくは素因を判定するために有用な特異的方法及び試薬を提供することは有益である。そのような方法は、癌を含む、乳房に関連する疾患及び状態において過剰発現される遺伝子産物に関して被験試料を検定することを含む。そのような方法は、身体の様々な組織及び画分における分布が、癌を含む乳房関連疾患及び状態によって変化している遺伝子産物に関して被験試料を検定することをさらに含みうる。そのような方法は、被験試料中のｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製すること、必要に応じて、その遺伝子又はフラグメントに対応するｃＤＮＡの部分を増幅すること、及び癌を含む疾患又は状態の存在の指標としてそのｃＤＮＡ産物を検出すること又は疾患の存在の指標としての遺伝子配列を含むｍＲＮＡの翻訳産物を検出することを含む。有用な試薬は、生検組織、血液又は他の被験試料から抽出したｍＲＮＡの逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＰＣＲ、又はハイブリダイゼーションアッセイなどの診断方法において使用しうるポリヌクレオチド又はそのフラグメント；又はそのようなｍＲＮＡの翻訳産物であるタンパク質；又はこれらのタンパク質に対する抗体を含む。そのようなアッセイは、該遺伝子の産物に関して試料を検定するため及び乳房の疾患の指標としてその産物を検出するための方法を含む。例えば、これらのアッセイは、体内で起こりうる可能な翻訳後修飾に照らして遺伝子産物（タンパク質）を検出するための方法を含む。そのような翻訳後修飾は、タンパク質分解プロセシング、鎖の末端の変化、グリコシル化、脂質の付加、硫酸化、γ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、ＡＤＰ−リボシル化、ジスルフィド結合形成、及び補因子、阻害因子（小分子及びタンパク質の両方）、活性化因子（小分子及びタンパク質の両方）、及びマルチサブユニット複合体の形成における他のタンパク質などの分子との多数の非共有結合相互作用を含みうる。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，第２版、ｐ．７８−１０２、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．１９９３参照。一部の修飾は配列特異的であり、それ故予測的であるが、また一方で、配列特異的ではなく、経験的データによってのみ認められる修飾もある。
ウテログロビンファミリーのタンパク質は、その機能はまだ特定されていないが、乳房の疾患又は状態を検出する、診断する、病期分類する、監視する、予後を判定する、インビボで画像化する、予防する又は治療する、若しくは素因を判定するために使用しうる少数の配列を含む。Ｌ．Ｍｉｅｌｅら、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．１７：６７９−６９２（１９９４）。実験的に，ウテログロビンはそれ自体のもう１つの分子と複合して、ホモ二量体マルチサブユニット複合体を形成することが認められた。Ｒ．Ｂａｌｌｙら、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０６：１５３−１７０（１９８９）；Ｉ．Ｍｏｒｉｚｅら、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９４：７２５−７３９（１９８７）；Ｔ．Ｃ．Ｕｍｌａｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １：５３８−５４５（１９９４）；Ｔ．Ｃ．Ｕｍｌａｎｄら、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２４：４４１−４４８（１９９２）。ウテログロビンにわずかに関連すると思われる他の配列は、ラットステロイド結合タンパク質及びネコ主要アレルゲンを含む。ウテログロビンと同様に、これらのタンパク質はマルチサブユニット複合体として存在すると判定された。ウテログロビンとは異なって、これらのサブユニットはヘテロ二量体である、すなわち異なる配列からのものである。さらに、これらのヘテロ二量体は、ネコ主要アレルゲンにおけるように、それら自身のもう１つのコピーと複合して、αβ／αβヘテロ四量体を形成するか、若しくはαβ／α’β（αとα’は相同であるが同一ではない）のサブユニット構造を有するラットステロイド結合タンパク質などの異なるヘテロ二量体と複合する。Ｍ．Ｐａｒｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２９８：９２−９４（１９８２）。ネコ主要アレルゲンの場合、αはウテログロビンファミリーに相同であるが、βは相同ではない。Ｊ．Ｐ．Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎら、ＰＮＡＳ ８８：９６９０−９６９４（１９９１）。ラットステロイド結合タンパク質の場合は、α、α’及びβはウテログロビンファミリーのタンパク質と様々な度合の相同性を有する。
マンマグロビン（ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ）は、離れた関連成員ではあるが、新たに発見されたウテログロビンファミリーの追加成員として最近記述された。その発現は、ノーザンブロット及びＲＴ／ＰＣＲ分析により乳房上皮に限定されると報告されている。Ｍ．Ａ．Ｗａｔｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５６：８６０−８６５（１９９６）。その遺伝子は染色体１１ｑ１３番に定位され、いくつかの潜在的転写制御エレメントが特定された。Ｍ．Ａ．Ｗａｔｓｏｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １６：８１７−８２４（１９９８）。さらに、そのポリヌクレオチド配列は米国特許第５，６６８，２６７号に記述されている。しかし、そのタンパク質産物の性質を記述した報告はない。
ＢＵ１０１は子宮内膜特異的ウテログロビンとして最初に記述された（ＷＯ９７／３４９９７号）。これに対し、本発明者らは最近、ＢＵ１０１を乳房特異的ウテログロビンとして記述した（１９９７年８月１５日付出願の米国特許一部継続出願通し番号第０８／９１２，２７６号のために放棄された１９９６年８月１９日出願の米国特許願通し番号第０８／６９７，１０５号参照）。乳房臨床標本におけるその検出をこれらの先行出願の中で示した。マンマグロビン及びＢＵ１０１タンパク質産物の性質を新たに本出願において述べる。
癌を含む乳房の疾患及び状態のための薬剤治療又は遺伝子治療は、これらの特定された遺伝子配列又はそれらの発現タンパク質に基づくことができ、個々の治療の効果を監視することができる。さらに、癌などの早期段階の乳房疾患を検出することができる使用可能な選択的、非外科的診断方法を得ることは有益である。
ここで言及するすべての米国特許及び特許公開は、その全体が参照してここに組み込まれる。
本発明は、少なくとも１コピーのＢＵ１０１ポリペプチド（配列番号６）及び少なくとも１コピーのマンマグロビンポリペプチド（配列番号５）が存在するが、１又はそれ以上の未知のポリペプチドも同時に含みうる、新しい実体、特に多量体ポリペプチド複合体を提供する。マンマグロビンポリペプチドは、５３位及び／又は６８位に位置する又はそのいずれでもない位置のアスパラギン残基で結合した糖を有する糖タンパク質として存在しうる。さらに、マンマグロビンポリペプチドは、ジスルフィド結合を通してＢＵ１０１ポリペプチドに共有結合しうる。どちらの配列も、それらの成熟形態では３個のシステイン残基を含む。このジスルフィド結合したヘテロ二量体は該複合体の１個のサブユニットを構成し、同じ構成物のもう１つのサブユニットと相互作用してαβ／αβヘテロ四量体を形成しうる、若しくは同一でない構成物のサブユニットと相互作用してαβ／α’β又はαβ／αβ’又はαβ／α’β’ヘテロ四量体を形成しうる［ここでは、βはＢＵ１０１ポリペプチドを表わし、βはマンマグロビンポリペプチドを表わし、α’はＢＵ１０１ポリペプチドに相同であるが同一ではないポリペプチドを表わし、及びβ’はマンマグロビンポリペプチドに相同であるが同一ではないポリペプチドを表わす］。ＢＵ１０１ポリペプチドをコードする遺伝子は、このポリペプチドの５３番のアミノ酸にプロリン残基（ＣＣＧによってコードされる）又はロイシン残基（ＣＴＧによってコードされる）のいずれかを生じる一塩基Ｔ／Ｃ多型を含みうる。多量体ポリペプチド複合体は、組換えテクノロジーによって、天然ソースからの分離によって、又は合成手法によって生産することができる。
１又はそれ以上の発現ベクターでトランスフェクトした宿主細胞をインキュベートすることを含む、多量体ポリペプチド複合体の少なくとも１個のエピトープを含むポリペプチド又はポリペプチド複合体を生産するための方法を提供する。前記ベクターは、１個又はそれ以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記ポリペプチドは、ＢＵ１０１ポリペプチド（配列番号６）、マンマグロビンポリペプチド（配列番号５）、若しくは未知のα’又はβ’ポリペプチド、及びそのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明は、多量体ポリペプチド抗原の少なくとも１つの成分ポリペプチド配列又はそのフラグメントをコードする核酸配列でコトランスフェクトされた細胞を提供する。前記核酸配列は、ＢＵ１０１（配列番号２）、マンマグロビン（配列番号１）、α’、又はβ’、及びそれらのフラグメント又は相補物から成る群より選択される。
ＢＵ１０１ポリペプチド（配列番号６）、マンマグロビンポリペプチド（配列番号５）、未知のα’又はβ’ポリペプチド、又は多量体ポリペプチド複合体、又はそのフラグメントのいずれかから成る抗原に対する抗体を生産するための方法も提供し、前記方法は、個体に単離免疫原性ポリペプチド、ポリペプチド複合体、又はそのフラグメントを投与することを含み、前記単離免疫原性ポリペプチドは、多量体ポリペプチド複合体の少なくとも１個のエピトープを含み、前記の少なくとも１個のＭＰＡエピトープは、配列番号５、配列番号６、及びそのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも２０％の同一性を有する。
免疫原性ポリペプチド、ポリペプチド複合体、又はそのフラグメントは、免疫応答を生じさせるのに十分な量で投与される。単離した免疫原性ポリペプチド、ポリペプチド複合体、又はそのフラグメントは、ＢＵ１０１ポリペプチド（配列番号６）、マンマグロビンポリペプチド（配列番号５）、未知のα’又はβ’ポリペプチド配列、及びそのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列を含む。
また、多量体ポリペプチド複合体の少なくとも１個のエピトープに特異的に結合する抗体も提供する。前記抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体でありうる。前記エピトープは、ＢＵ１０１ポリペプチド（配列番号６）、マンマグロビンポリペプチド（配列番号５）、未知のα’又はβ’ポリペプチド、又はそれらの何らかの組合せから成る群より選択されるアミノ酸配列から誘導される。すなわち、前記エピトープはポリペプチド配列間で共有されていてもよい。
また、ＢＵ１０１ポリペプチド（配列番号６）の少なくとも１個のエピトープに特異的に結合する抗体も提供する。前記抗体は、前記多量体ポリペプチド複合体に結合していてもよく又は結合していなくてもよい。前記抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体でありうる。前記エピトープは、ＢＵ１０１ポリペプチド（配列番号６）、及びそのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列から誘導される。
また、マンマグロビンポリペプチド（配列番号５）の少なくとも１個のエピトープに特異的に結合する抗体も提供する。前記抗体は、前記多量体ポリペプチド複合体に結合していてもよく又は結合していなくてもよい。前記抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体でありうる。前記エピトープは、マンマグロビンポリペプチド（配列番号５）、及びそのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列から誘導される。
また、未知のα’ポリペプチドの少なくとも１個のエピトープに特異的に結合する抗体も提供する。前記抗体は、前記多量体ポリペプチド複合体に結合していてもよく又は結合していなくてもよい。前記抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体でありうる。
また、未知のβ’ポリペプチドの少なくとも１個のエピトープに特異的に結合する抗体も提供する。前記抗体は、前記多量体ポリペプチド複合体に結合していてもよく又は結合していなくてもよい。前記抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体でありうる。
多量体ポリペプチド抗原を含むことが疑われる被験試料においてその多量体ポリペプチド抗原を検出するための方法も提供する。この方法は、被験試料を、多量体ポリペプチド抗原の少なくとも１個のエピトープに特異的に結合する抗体又はそのフラグメントに、抗原／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下で接触させること；及び被験試料における該多量体ポリペプチド抗原の存在の指標として、前記抗体を含むそのような複合体の存在を検出することを含む。前記抗体は固相に結合させることができ、モノクローナル又はポリクローナル抗体のいずれでもよい。
被験試料中の多量体ポリペプチド抗原の存在を測定するためのアッセイキットも包含される。１つの実施形態では、前記アッセイキットは、多量体ポリペプチド抗原に特異的に結合する抗体が入った容器を含み、前記抗原は、ＢＵ１０１遺伝子、マンマグロビン遺伝子、α’遺伝子、又はβ’遺伝子のいずれかによってコードされる少なくとも１個のエピトープを含む。これらの試験キットは、被験試料（血液、尿、唾液及び糞便など）を採集するために有用なツールが入った容器をさらに含みうる。そのようなツールは、血液を採集して安定化するためのランセット及び吸収紙又は吸収布；唾液を採集して安定化するための綿棒；尿又は糞便試料を採集して安定化するためのコップを含む。紙、布、綿棒、コップ等のような採集用具は、試料の変性又は不可逆的吸着を避けるために任意に処理してもよい。これらの採集用具はまた、標本の完全性を維持するのを助けるために防腐剤、安定剤又は抗菌剤で処理してもよく又はこれらを含んでもよい。前記抗体は固相に結合することができる。
該多量体ポリペプチド抗原に特異的に結合する抗体を、これらの抗体を含むことが疑われる被験試料において検出するためのもう１つの方法を提供する。この方法は、被験試料を、該多量体ポリペプチド複合体の少なくとも１個のエピトープを含むポリペプチドに接触させることを含む。接触は、抗原／抗体複合体が形成されるのに十分な時間及び条件下で実施する。この方法はさらに、前記ポリペプチドを含む複合体を検出することを包含する。前記ポリペプチド複合体は固相に結合することができる。さらに、前記ポリペプチド複合体は、組換えによって又は合成によって生産するか、又は天然ソースから精製することができる。
被験試料中の抗多量体ポリペプチド複合体抗体の存在又はＭＰＡ自体の存在を測定するためのアッセイキットも包含される。１つの実施形態では、このアッセイキットは、多量体ポリペプチド複合体の少なくとも１個のポリペプチド又は完全な複合体自体が入った容器を含む。さらに、この試験キットは、被験試料（血液、組織、尿、唾液及び糞便など）を採集するために有用なツールが入った容器を含みうる。そのようなツールは、血液を採集して安定化するためのランセット及び吸収紙又は吸収布；唾液を採集して安定化するための綿棒；尿又は糞便試料を採集して安定化するためのコップを含む。紙、布、綿棒、コップ等のような採集用具は、試料の変性又は不可逆的吸着を避けるために任意に処理してもよい。これらの採集用具はまた、標本の完全性を維持するのを助けるために防腐剤、安定剤又は抗菌剤で処理してもよく又はこれらを含んでもよい。また、前記ポリペプチドは固相に結合することができる。抗原自体を検出しようとする場合は、抗体がキットの容器内に存在する。さらに、抗原を検出しようとする場合は、界面活性剤及び／又は還元剤もキット中に存在しうる。
本発明のもう１つの実施形態では、疾患又は状態を検出する又は診断することを目的として患者における該抗原の局在を検出する又は画像化するために、多量体ポリペプチド抗原に対する抗体又はそのフラグメントを使用することができる。そのような抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであるか、又は分子生物学手法によって作製することができ、放射性同位元素及び常磁性金属を含むがこれらに限定されない、様々な検出可能標識で標識することができる。さらに、モノクローナル、ポリクローナル、又は分子生物学手法によって作製される抗体又はそのフラグメントは、該多量体ポリペプチド抗原の発現を特徴とする疾患の治療のための治療物質として使用することができる。治療適用の場合は、前記抗体は誘導体化せずに使用してもよく、又は放射性同位元素、酵素、毒素、薬剤、プロドラッグ等のような細胞傷害性物質で誘導体化してもよい。
本発明はまた、多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）を含むことが疑われる被験試料においてそのＭＰＡの存在を検出するさらなる方法を包含する。前記ＭＰＡは、少なくとも１個のＢＵ１０１ポリペプチド及び少なくとも１個のマンマグロビンポリペプチドを含む。この方法は、（ａ）被験試料を、ＭＰＡの少なくとも１個のエピトープに特異的な少なくとも１つの抗体に、ＭＰＡ／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で接触させること；前記の生じたＭＰＡ／抗体複合体に、検出可能なシグナルを生じることができるシグナル生成化合物に結合した抗体を含むコンジュゲートを、そのコンジュゲートが結合抗原に結合するのに十分な時間及び条件下で加えること；及び（ｃ）シグナル生成化合物によって生じるシグナルを検出することにより、被験試料中に存在しうるＭＰＡの存在を検出すること、の段階を含む。この方法及びここで述べるその他の方法において検出される多量体ペプチド抗原は、配列番号５、配列番号６、及びそれらのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも２０％の同一性を有する少なくとも１個のポリペプチドをさらに含みうる。段階（ａ）の方法で使用する抗体は、ＨＥＫ−２９３ ＭＢ８細胞又は少なくとも１個のＢＵ１０１ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列及び少なくとも１個のマンマグロビンポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む構築物を含むベクターでトランスフェクトした宿主細胞によって産生されるＭＰＡに対して惹起される。本発明のすべてのアッセイの診断段階において（又はキットにおいて）使用される抗体は、所望する場合は、このようにして作製しうる。さらに、それに対して抗体が産生される、上記方法の段階（ａ）の（及びここで述べる（ａ）と同等の段階を有する他の方法の）エピトープは、２つのベクターを含む宿主細胞によって産生されるＭＰＡから誘導してもよく、前記の２つのベクターのうちの１つは、少なくとも１個のＢＵ１０１ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む構築物を含み、他方は、少なくとも１個のマンマグロビンポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む構築物を含む。本発明のすべてのＭＰＡ検出法において、ＭＰＡの存在は乳癌又は別の乳房状態を指示しうることに留意すべきである。
さらに、本発明はまた、多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）を含むことが疑われる被験試料においてそのＭＰＡの存在を検出するさらなる方法を包含し、前記ＭＰＡは、少なくとも１個のＢＵ１０１ポリペプチド及び少なくとも１個のマンマグロビンポリペプチドを含み、前記方法は、（ａ）被験試料を、ＭＰＡの少なくとも１個のエピトープに特異的な少なくとも１つの抗体に、ＭＰＡ／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で接触させること；（ｂ）生じたＭＰＡ／抗体複合体に、検出可能なシグナルを生じることができるシグナル生成化合物に結合したステロイド又は抗体を含むコンジュゲートを、そのコンジュゲートが結合抗原に結合するのに十分な時間及び条件下で加えること；及び（ｃ）シグナル生成化合物によって生じるシグナルを検出することにより、被験試料中に存在しうるＭＰＡの存在を検出すること、の段階を含む。前記ステロイドは、例えば、プロゲステロン、アルドステロン、アンドロステンジオン、コルチコステロン、コルチゾール、デヒドロエピアンドロステロン、ジヒドロテストステロン、エストラジオール、エストリオール、エストロン、ヒドロキシプロゲステロン、及びテストステロンでありうる。前記抗体は、上述したように生成されるＭＰＡを用いて作製しうる。
本発明はまた、多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）に特異的な抗体を含むことが疑われる被験試料においてその抗体の存在を検出する方法を包含し、前記ＭＰＡは、少なくとも１個のＢＵ１０１ポリペプチド及び少なくとも１個のマンマグロビンポリペプチドを含む。前記方法は、（ａ）被験試料を、配列番号５、配列番号６、及びそれらのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも２０％の同一性を有するアミノ酸配列又はそのフラグメントから誘導される少なくとも１個のＭＰＡエピトープに、ＭＰＡ／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で接触させること；（ｂ）生じたＭＰＡ／抗体複合体に、検出可能なシグナルを生じることができるシグナル生成化合物に結合した、被験試料中の抗体と結合する抗体を含むコンジュゲートを、そのコンジュゲートが結合抗原に結合するのに十分な時間及び条件下で加えること；及び（ｃ）シグナル生成化合物によって生じるシグナルを検出することにより、被験試料中に存在しうるＭＰＡの存在を検出すること、の段階を含む。
本発明はまた、少なくとも１個のＢＵ１０１ポリペプチド及び少なくとも１個のマンマグロビンポリペプチドを含む多量体ポリペプチド抗原を含む組成物を包含する。やはり、前記抗原はさらに、配列番号５、配列番号６、及びそれらのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも２０％の同一性を有する少なくとも１個のポリペプチドを含む。前記組成物は、多量体ポリペプチド抗原に結合した少なくとも１個の抗体をさらに含み、その抗体は、ＢＵ１０１ポリペプチド、マンマグロビンポリペプチド、及び配列番号５、配列番号６及びそれらのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも２０％の同一性を有する１個のポリペプチドから成る群より選択される少なくとも１個のポリペプチドに特異的である。特に、２個の抗体が存在してもよく、各々は、配列番号５、配列番号６及びそれらのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも２０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む別々のポリペプチドに結合する。より詳細には、前記の２個の抗体の各々は、ＢＵ１０１ポリペプチド又はそのフラグメントに結合しうるか、若しくは２個の抗体の各々は、マンマグロビンポリペプチド又はそのフラグメントに結合しうる。あるいは、前記抗体の１つはＢＵ１０１ポリペプチド又はそのフラグメントに結合し、他方の抗体はマンマグロビンポリペプチド又はそのフラグメントに結合しうる。２個の抗体の１つがＢＵ１０１ポリペプチド又はそのフラグメントに結合するとき、他方は、配列番号５、配列番号６及びそれらのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも２０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合しうる。２個の抗体の１つがマンマグロビンポリペプチド又はそのフラグメントに結合するとき、他方は、配列番号５、配列番号６及びそれらのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも２０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合しうる。
さらに、本発明はまた、（ａ）少なくとも１個のＢＵ１０１ポリペプチド及び少なくとも１個のマンマグロビンポリペプチドを含む多量体タンパク質抗原（ＭＰＡ）に特異的な標識抗体を患者に投与すること；及び（ｂ）その標識の存在が患者におけるＭＰＡ及び乳癌の存在を指示する、標識の存在を局在化すること、の段階を含む、乳癌を有することが疑われる患者において乳癌を検出する方法を包含する。
本発明はまた、上述したように、乳癌を治療する方法を含む。そのような方法の１つは、少なくとも１個のＢＵ１０１ポリペプチド及び少なくとも１個のマンマグロビンポリペプチドを含む多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）に特異的な抗体を患者に投与することを含む。
さらに、本発明は、（ａ）患者から切除した腫瘍から誘導される組織切片又は細胞培養を調製すること；（ｂ）前記組織切片又は細胞培養を、ＢＵ１０１ポリペプチド、マンマグロビンポリペプチド、及び配列番号５、配列番号６及びそれらのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも２０％の同一性を有するポリペプチドから成る群より選択される、多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）の少なくとも１個のポリペプチドに特異的な抗体に、抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で接触させること；及び（ｃ）その複合体の存在が前記患者におけるＭＰＡ及び乳癌の存在を指示する、前記組織切片又は細胞培養における前記複合体の存在を局在化すること、の段階を含む、乳癌を有することが疑われる患者において乳癌を診断する方法を包含する。
本発明に包含される、乳癌を有することが疑われる患者において乳癌を診断するもう１つの方法は、前記患者からの生物学的試料において、ＢＵ１０１ポリペプチド、マンマグロビンポリペプチド、及び配列番号５、配列番号６及びそれらのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも２０％の同一性を有するポリペプチドから成る群より選択される、多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）の少なくとも１個のポリペプチドの存在又は不在を検出し、その少なくとも１個のポリペプチドの存在が患者におけるＭＰＡ及び乳癌の存在を指示する段階を含む。生物学的試料は、例えば組織、尿、唾液、糞便、骨髄又は血液でありうる。
本発明に包含される、乳癌を有することが疑われる患者において乳癌を診断するもう１つの方法は、前記患者において細胞外ＢＵ１０１の存在又は不在を検出し、細胞外ＢＵ１０１の存在が、患者における乳癌及び、少なくとも１個のＢＵ１０１ポリペプチド及び少なくとも１個のマンマグロビンポリペプチドを含む多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）中のマンマグロビンによるＢＵ１０１の細胞外への輸送を指示する段階を含む。
本発明はまた、（ａ）患者から生物学的試料を得ること；（ｂ）その生物学的試料中の遊離ＢＵ１０１ポリペプチドの量を測定すること；（ｃ）マンマグロビンポリペプチドと複合した、前記生物学的試料中に存在するＢＵ１０１ポリペプチドの量を測定すること；（ｄ）遊離ＢＵ１０１ポリペプチド対複合ＢＵ１０１ポリペプチドの比率を比較し、１より高い比率が患者における乳癌の存在を指示すること、の段階を含む、乳癌を有することが疑われる患者において乳癌を検出するさらなる方法を包含する。
本発明はまた、（ａ）患者から生物学的試料を得ること；（ｂ）その生物学的試料中の遊離マンマグロビンポリペプチドの量を測定すること；（ｃ）ＢＵ１０１ポリペプチドと複合した、前記生物学的試料中に存在するマンマグロビンポリペプチドの量を測定すること；（ｄ）遊離マンマグロビンポリペプチド対複合マンマグロビンポリペプチドの比率を比較し、１より高い比率が患者における乳癌の存在を指示すること、の段階を含む、乳癌を有することが疑われる患者において乳癌を検出する方法を包含する。
加えて、本発明は、疑わしいＭＰＡを抗体又は化合物に接触させる前に、還元剤及び界面活性剤から成る群より選択される少なくとも１つの成員にＭＰＡ（又は被験試料）を暴露することを含む、ＭＰＡに関する免疫測定法においてＭＰＡの認識を増強するための方法を包含する。疑わしいＭＰＡを同時に熱に暴露してもよい。ＭＰＡの検出を含む上記及び下記で述べるすべての方法において、被験試料又はＭＰＡを、そのＭＰＡを抗体又は化合物に接触させる前に、還元剤及び／又は界面活性剤のいずれかに暴露してもよいことに留意すべきである。加熱を同時に使用してもよく、又は使用しなくてもよい。
さらに、本発明はまた、ＭＰＡを還元剤及び界面活性剤から成る群より選択される少なくとも１つの成員に暴露することを含む、前記ＭＰＡを解離するための方法を包含する。加熱を付加的に使用してもよい。
本発明はまた、ＭＢ８細胞又は少なくとも１個のＢＵ１０１ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列及び少なくとも１個のマンマグロビンポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む構築物を含むベクターでトランスフェクトした宿主細胞によって産生される診断試薬を包含する。この試薬は、例えば、ＭＰＡでありうる。
加えて、本発明は、２つのベクターでトランスフェクトした宿主細胞によって産生される診断試薬を包含し、前記の２つのベクターのうちの１つは、少なくとも１個のＢＵ１０１ポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む構築物を含み、他方は、少なくとも１個のマンマグロビンポリペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む構築物を含む。
また、本発明は、ＨＥＫ２９３−ＭＢ８細胞系からの単離細胞ならびに生成される細胞系自体を包含する。
さらに、本発明はまた、多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）を含むことが疑われる被験試料においてＭＰＡの存在を検出するための方法を包含し、前記ＭＰＡは、少なくとも１個のＢＵ１０１ポリペプチド及び少なくとも１個のマンマグロビンポリペプチドを含み、前記方法は、（ａ）被験試料を、ＭＰＡ、ＭＰＡのポリペプチド及びそれらのフラグメントから成る群より選択される標識抗原に接触させること；（ｂ）被験試料及び段階（ａ）の標識抗原を、抗ＭＰＡ抗体に、ＭＰＡ／抗ＭＰＡ抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で接触させること；及び（ｃ）標識抗原中の標識によって生成されるシグナルを検出することにより、被験試料中に存在しうるＭＰＡの存在を検出すること、の段階を含む。
また、本発明は、ＭＰＡを含むことが疑われる被験試料においてＭＰＡの存在を検出するための方法を包含し、前記ＭＰＡは、少なくとも１個のＢＵ１０１ポリペプチド及び少なくとも１個のマンマグロビンポリペプチドを含み、前記方法は、（ａ）被験試料を、ＭＰＡに結合する標識抗体に、被験試料ＭＰＡ／標識抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下で接触させること；（ｂ）段階（ａ）の複合体を、ＭＰＡ、ＭＰＡのポリペプチド、ＭＰＡのフラグメント及びＭＰＡのポリペプチドのフラグメントから成る群より選択される抗原に、抗原／標識抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下で接触させること；及び（ｃ）そのシグナルが被験試料中のＭＰＡの存在を指示する、標識抗体によって生成されるシグナルの存在を検出すること、の段階を含む。加えて、本発明は、多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）を含むことが疑われる被験試料においてＭＰＡの存在を検出するための方法を包含し、前記ＭＰＡは、少なくとも１個のＢＵ１０１ポリペプチド及び少なくとも１個のマンマグロビンポリペプチドを含み、前記方法は、（ａ）被験試料を、ＭＰＡに結合する標識ステロイドに、ＭＰＡ／標識ステロイド複合体の形成に十分な時間及び条件下で接触させること；（ｂ）段階（ａ）のＭＰＡ／標識ステロイド複合体を、ＭＰＡ、ＭＰＡのポリペプチド、ＭＰＡのフラグメント及びＭＰＡのポリペプチドのフラグメントから成る群より選択される抗原に、抗原／標識ステロイド複合体の形成に十分な時間及び条件下で接触させること；及び（ｃ）標識ステロイドの標識によって生成されるシグナルを検出することにより、被験試料中に存在しうるＭＰＡの存在を検出すること、の段階を含む。
本発明はまた、ＭＰＡを含むことが疑われる被験試料においてＭＰＡの存在を検出するための方法を包含し、前記ＭＰＡは、少なくとも１個のＢＵ１０１ポリペプチド及び少なくとも１個のマンマグロビンポリペプチドを含み、前記方法は、（ａ）被験試料を、ＭＰＡ／ステロイド複合体の形成に十分な時間及び条件下でステロイドに接触させること；（ｂ）生じたＭＰＡ／ステロイド複合体に、検出可能なシグナルを生じることができるシグナル生成化合物に結合した抗体を含むコンジュゲートを、そのコンジュゲートが結合ＭＰＡに結合するのに十分な時間及び条件下で加えること；及び（ｃ）シグナル生成化合物によって生じるシグナルを検出することにより、被験試料中に存在しうるＭＰＡの存在を検出すること、の段階を含む。
さらに、本発明はまた、多量体ポリペプチド抗原（ＭＰＡ）に特異的な抗体を含むことが疑われる被験試料においてその抗体の存在を検出するための方法を包含し、その方法は、（ａ）被験試料を、前記抗体に特異的な抗−抗体に、抗体／抗−抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で接触させること；（ｂ）生じた抗体／抗−抗体複合体に、検出可能なシグナルを生じることができるシグナル生成化合物に結合したＭＰＡを含むコンジュゲートを、そのコンジュゲートが結合抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で加えること；及び（ｃ）シグナル生成化合物によって生じるシグナルを検出することにより、被験試料中に存在しうる抗体の存在を検出すること、の段階を含む。
さらに、本発明はまた、ＭＰＡに特異的な抗体を含むことが疑われる被験試料においてその抗体の存在を検出するための方法を包含し、その方法は、（ａ）被験試料を、ＭＰＡ、ＭＰＡのポリペプチド、ＭＰＡのフラグメント及びＭＰＡのポリペプチドのフラグメントから成る群より選択される抗原に、抗体／標識抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で接触させること；（ｂ）段階（ａ）の生じた複合体を、ＭＰＡに結合する抗体に、すべての非結合標識抗原が、ＭＰＡに結合する前記抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で接触させること；及び（ｃ）標識抗原によって生じるシグナルを検出することにより、被験試料中に存在しうる抗体の存在を検出すること、の段階を含む。
また、本発明は、ＭＰＡに特異的な抗体を含むことが疑われる被験試料においてその抗体の存在を検出するための方法を包含し、その方法は、（ａ）被験試料を、ステロイドと複合したＭＰＡに、抗体／ＭＰＡ／ステロイド複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で接触させること；（ｂ）生じた抗体／ＭＰＡ／ステロイド複合体に、検出可能なシグナルを生じることができるシグナル生成化合物に結合した、前記被験試料中の前記抗体と反応性である抗体を含むコンジュゲートを、そのコンジュゲートが結合抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で加えること；及び（ｃ）シグナル生成化合物によって生じるシグナルを検出することにより、被験試料中に存在しうる抗体の存在を検出すること、の段階を含む。
本発明のもう１つの局面は、少なくとも１つの乳房特異的マーカー、ＢＵ１０１と、もう１つの乳房特異的マーカー、新たに述べるムチン様タンパク質であるＢＳ１０６のパネルを包含する。ＢＳ１０６は、乳房特異的マーカーに関するＩｎｃｙｔｅデータベースのデータ検索を通して発見した新規ムチン様タンパク質である。それは、６４の乳房組織ライブラリー中の３１０ＥＳＴ及び他の組織からの１，２２８ライブラリー中の５ＥＳＴにおいて見出された。ＢＳ１０６遺伝子は染色体１２番に位置し、４個のエキソンから成り、分泌シグナルを含む予測Ｍｒ＝１１ｋｄの９０アミノ酸である。ＢＳ１０６は他の遺伝子と有意の相同性を持たないが、ムチン様の小さな縦列反復配列、ＴＴＡＡＸＴＴＡ及びＯ結合グリコシル化のための多数の部位を含む。同様に、ＢＵ１０１及びＢＳ１０６のいずれかまたは両方と共にマンマグロビンを含むパネルも想定される。
マンマグロビンとＢＵ１０１はいずれも、これまでに１５の成員が様々な種から特定されている、セクレトグロビンスーパーファミリーの成員である。ＢＵ１０１に対して産生される抗体は、還元条件下で１８ｋｄの特異的バンドを検出し、非還元条件下で２４ｋｄの特異的バンドを検出する。そのより大きな種の同一性は、マンマグロビンとＢＵ１０１のヘテロ二量体であることが示された。発現マーカーが有用であるためには、乳癌の大部分が検出可能なレベルの遺伝子を発現しなければならない。今回の試験において、本発明者らは、原発性乳癌の実質的なパネルにおいてこれら２つのマーカーの発現パターンを検討した。さらに、本発明者らは、これらの新しいマーカーを、潜伏乳癌細胞を検出する上でのそれらの効果に関して試験された２つのマーカー、マンマグロビン及びサイトケラチンの発現と比較した（Ｚａｃｈ，Ｏ．，Ｋａｓｐａｒｕ，Ｈ．，Ｋｒｉｅｇｅｒ，Ｏ．，Ｈｅｈｅｎｗａｒｔｅｒ，Ｗ．，Ｇｉｒｓｃｈｉｋｏｆｓｋｙ，Ｍ．，及びＬｕｔｚ，Ｄ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍａｍｍａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｓ ｖｉａ ａ ｎｅｓｔｅｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ ｍＲＮＡ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：２０１５−２０１９，１９９９；Ｇｒｕｎｅｗａｌｄ，Ｋ．，Ｈａｕｎ，Ｍ．，Ｕｒｂａｎｅｋ，Ｍ．，Ｆｉｅｇｌ，Ｍ．，Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｏｌｚｎｅｒ，Ｅ．，Ｇｕｎｓｉｌｉｕｓ，Ｅ．，Ｄｕｎｓｅｒ，Ｍ．，Ｍａｒｔｈ，Ｃ．，及びＧａｓｔｌ，Ｇ．Ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ａ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｉｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｏ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ−ｇｒｏｗｔｈ−ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ−１９．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．８０：１０７１−１０７７，２０００；Ｋａｈｎ，Ｈ．Ｊ．，Ｙａｎｇ，Ｌ．Ｙ．，Ｌｉｃｋｌｅｙ，Ｌ．，Ｈｏｌｌｏｗａｙ，Ｃ．，Ｈａｎｎａ，Ｗ．，Ｎａｒｏｄ，Ｓ．，ＭｃＣｒｅａｄｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｅｔｈ，Ａ．，及びＭａｒｋｓ，Ａ．ＲＴ−ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＫ１９ ｍＲＮＡ ｉｎ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．６０：１４３−１５１，２０００；Ｍｉｙａｓｈｉｒｏ，Ｉ．，Ｋｕｏ，Ｃ．，Ｈｕｙｎｈ，Ｋ．，Ｉｉｄａ，Ａ．，Ｍｏｒｔｏｎ，Ｄ．，Ｂｉｌｃｈｉｋ，Ａ．，Ｇｉｕｌｉａｎｏ，Ａ．，及びＨｏｏｎ，Ｄ．Ｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒｓ ｗｉｔｈ ｕｓｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＭＡＧＥ−Ａ ｇｅｎｅｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４７：５０５−５１２，２００１参照）。
本発明のこの局面からの恩恵は、マーカーが個々に限られた発現プロフィールを有することである；しかし、これらのマーカーの２つ又はそれ以上の組合せは、大部分の乳癌を検出する上で有用である。言い換えると、異なるマーカーのパネルは、それらを個々に使用するのと異なって、乳癌の診断のための包括的な分析を提供する。
さらに、本発明のもう１つの局面は、ＢＵ１０１及びＭＰＡの存在のための検定を包含する。この組合せを含むパネルはまた、それらのマーカーを個別に使用するよりも、患者の診断のより包括的な分析を提供する。
本発明は、少なくとも１コピーのＢＵ１０１ポリペプチド（配列番号６）及び少なくとも１コピーのマンマグロビンポリペプチド（配列番号５）が存在するが、その複合体は１又はそれ以上の未知のポリペプチドも同時に含みうる、新しい実体、特に多量体ポリペプチド複合体を提供する。マンマグロビンは、５３位及び／又は６８位に位置する又はそのいずれでもない位置のアスパラギン残基で結合した糖を有する糖タンパク質として存在しうる。さらに、マンマグロビンは、ジスルフィド結合を通してＢＵ１０１ポリペプチドに共有結合しうる。どちらのポリペプチドも、それらの成熟形態では３個のシステイン残基を含む。このジスルフィド結合したヘテロ二量体は該複合体の１個のサブユニットを構成し、同じ構成物のもう１つのサブユニットと相互作用してαβ／αβヘテロ四量体を形成しうる、若しくは同一でない構成物のサブユニットと相互作用してαβ／α’β又はαβ／αβ’又はαβ／α’β’ヘテロ四量体を形成しうる［ここでは、αはＢＵ１０１を表わし、βはマンマグロビンを表わし、α’はＢＵ１０１に相同であるが同一ではない配列を表わし、及びβ’はマンマグロビンに相同であるが同一ではない配列を表わす］。ＢＵ１０１遺伝子は、ＢＵ１０１ポリヌクレオチド配列（配列番号２）の２５４位にＴ／Ｃ多型を含みうる。この多型は、この位置にプロリンアミノ酸（ＣＣＧ）又はロイシンアミノ酸（ＣＴＧ）のいずれかを生じる。本発明で述べるいずれの実験でも、２つのＢＵ１０１ヌクレオチド変異体の間で、又はそれぞれ発現されたポリペプチドにおいて、生物学的な差異は認められなかった。多量体ポリペプチド複合体は、組換えテクノロジーによって、天然ソースからの分離によって、又は合成手法によって生産することができる。
本発明はまた、多量体ポリペプチド複合体の成分ポリペプチド鎖の全体又は部分配列、及びこれらの抗原に対する抗体を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドなどの試薬を作製することを含む、この多量体ポリペプチド複合体に関して被験試料を検定するための方法を提供する。ここで提供する方法によって検定しうる被験試料は、組織、細胞、尿を含む体液、及び分泌物を含む。
ポリペプチド配列の部分配列は、診断的免疫測定法における標準品又は試薬として、薬剤スクリーニングアッセイのための標的として、及び／又は様々な治療のための成分として又は標的部位として有用である。これらのポリペプチド配列内に含まれる少なくとも１個のエピトープに対するモノクローナル及びポリクローナル抗体は、多量体ポリペプチド複合体に関連する疾患又は状態、特に乳癌についての治療薬のためならびに診断試験のため及びスクリーニングのための送達剤として有用である。
アミノ酸配列の「類似性」を判定するための手法はこの技術分野において周知である。一般に、「類似性」は、アミノ酸が同一であるか若しくは電荷又は疎水性などの類似した化学的及び／又は物理的特性を有する、適切な位置の２個又はそれ以上のポリペプチドの正確なアミノ酸対アミノ酸の比較を意味する。その後、比較したポリペプチド配列間でいわゆる「パーセント類似性」を決定することができる。アミノ酸配列の同一性を判定するための手法もこの技術分野において周知であり、アミノ酸配列を決定して、これを第二のアミノ酸配列と比較することを含む。一般に、「同一性」は、２個のポリペプチド配列の正確なアミノ酸対アミノ酸の一致を表わす。それらの「パーセント同一性」を決定することにより、２個又はそれ以上のアミノ酸配列を比較することができる。ペプチド配列である２個の配列のパーセント同一性は、２個の整列配列の間の正確な対合の数を、より短い配列の長さで除して、１００を乗じた数である。配列についてのおよその整列は、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編集、補遺５、３：３５３−３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）によって規格化されたスコアマトリックスを用いて、ペプチド配列に関して使用するように拡大することができる。ペプチド配列についてのこのアルゴリズムの実施は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｇｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により、それらのＢｅｓｔＦｉｔ実用アプリケーションにおいて提供される。この方法のためのデフォルトパラメータは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ，バージョン８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｇｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩより入手可能）の中に記述されている。配列間のパーセント同一性又は類似性を算定するのに同様に適する他のプログラムは、この技術分野において一般的に知られている。
ここで述べる構成物及び方法は、乳房組織の疾患又は状態の指標としてのある種のマーカーの特定を可能にする。そこから得られる情報は、多量体ポリペプチド複合体に関連する疾患又は状態、特に乳癌を検出する、診断する、病期分類する、監視する、予後を判定する、インビボで画像化する、予防する又は治療する、若しくは素因を判定する上での助けとなる。試験方法は、例えば、ここで提供する多量体ポリペプチド複合体を利用した免疫測定法を含む。
この多量体ポリペプチド複合体は、免疫原性であると認めうるユニークエピトープを含む。これらのエピトープは、多量体ポリペプチド複合体に関連する疾患又は状態にユニークであると考えられる。また、この多量体ポリペプチド複合体はマーカーとして有用であると思われる。このマーカーは、乳癌などの疾患において上昇するか、乳癌などの疾患において変化するか、又は正常なタンパク質複合体として存在するが不適切な身体画分において出現する。エピトープのユニーク性は、（ｉ）ＢＵ１０１遺伝子（配列番号２）、マンマグロビン遺伝子（配列番号１）、α’又はβ’遺伝子によってコードされるタンパク質及びポリペプチドに対する抗体との免疫学的反応性及び特異性；及び（ｉｉ）他の組織マーカーとの交差反応性の不在によって判定しうる。免疫学的反応性を判定するための方法は周知であり、例えば放射線免疫検定法、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、赤血球凝集反応（ＨＡ）、蛍光偏光免疫測定法（ＥＰＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）その他を含むが、これらに限定されない。適切な方法のいくつかの例をここで述べる。
さらに、細胞内での多量体ポリペプチド複合体の生物学的合成及び構築は、正常な条件下では高度に調節されている。疾患状態下では、多量体ポリペプチド複合体の合成及び構築は調節不全となりうる。転写活性化の調節不全は、その遺伝子産物の上方調節又は下方調節を引き起こしうる。成分ポリペプチド鎖の１つだけの遺伝子が上方調節される状況下では、この遺伝子産物の高いレベルが転写され、ポリペプチドへと翻訳されうる。これは、多量体ポリペプチド複合体の他の成分と無関係に単一ポリペプチドの蓄積を引き起こしうる。多量体ポリペプチド複合体の成分ポリペプチドの遊離の量又は総量に関する多量体ポリペプチド複合体の測定はこの調節不全の指標であり、乳癌などの疾患を指示すると考えられる。
さらに、多量体ポリペプチド複合体の合成及び構築の調節不全は、この複合体の成分ポリペプチド鎖のいずれか１つの過剰生産／蓄積を生じさせうる。正常な状況下では、多量体ポリペプチド複合体は由来する哺乳類細胞から分泌されることが認められている。しかし、個々の成分ポリペプチド鎖は、その多量体ポリペプチド複合体の他の成分とは無関係に、同じプロセシングを受けないことがある。例えば、ＢＵ１０１ポリペプチドの発現は、その多量体ポリペプチド複合体の他のポリペプチドとは無関係に、細胞の内部に保持される非分泌形態のポリペプチドを生じうる。細胞内部での遊離ＢＵ１０１又は他の成分ポリペプチド鎖の蓄積は転写及び／又は翻訳の異常から生じることがあり、癌などの疾患の結果でありうる。
さらに、細胞の損傷及び崩壊は、その多量体の対合ポリペプチド鎖を伴わない、細胞内部からのＢＵ１０１ポリペプチド（配列番号６）の放出を生じうる。これは、細胞を取り巻く間質液中のＢＵ１０１ポリペプチド又は他の成分ポリペプチド鎖の蓄積を導きうる。さらに、組織損傷及び破壊は、それぞれの対合ポリペプチド鎖を伴わない、ＢＵ１０１ポリペプチド（配列番号６）又は他の成分ポリペプチド鎖の組織からの放出をもたらしうる。細胞及び組織の損傷／破壊はいずれも、乳癌などの疾患の結果であると考えられる。
異なる記述がない限り、下記の語は下記の意味を有するものとする：
「によってコードされる」は、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を表わし、但しそのポリペプチド配列又はその部分は、該核酸配列によってコードされるポリペプチドからの少なくとも３個から５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも８個から１０個のアミノ酸、さらに一層好ましくは少なくとも５個から２０個のアミノ酸を含む。また、その配列によってコードされるポリペプチドで免疫学的に特定しうるポリペプチド配列も包含される。従って、「ポリペプチド」、「タンパク質」又は「アミノ酸」配列は、マンマグロビン遺伝子（配列番号１）、ＢＵ１０１遺伝子（配列番号２）、α’又はβ’遺伝子（すなわち、そのコードされるポリペプチドが多量体ポリペプチド複合体を形成する遺伝子）によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約５０％の同一性、好ましくは約６０％の同一性、より好ましくは約７５％から８５％の同一性、最も好ましくは約９０％から９５％又はそれ以上の同一性を有する。さらに、マンマグロビン遺伝子（配列番号１）、ＢＵ１０１遺伝子（配列番号２）、α’遺伝子又はβ’遺伝子（すなわち、そのコードされるポリペプチドが多量体ポリペプチド複合体を形成する遺伝子）によってコードされる「ポリペプチド」、「タンパク質」又は「アミノ酸」配列は、マンマグロビン遺伝子（配列番号１）、ＢＵ１０１遺伝子（配列番号２）、α’遺伝子、又はβ’遺伝子のポリペプチド又はアミノ酸配列と少なくとも約６０％の類似性、好ましくは約７５％の類似性、より好ましくは約８５％の類似性、最も好ましくは約９５％又はそれ以上の類似性を有していてもよい。
それらの語がここでは交換可能に使用されうる「組換えポリペプチド」、「組換えタンパク質」、又は「組換え手法によって生産されるポリペプチド」は、その由来又は操作により、それが自然の状態で結合しているポリペプチドの全部又は一部に結合していない及び／又はそれが自然の状態で結合しているもの以外のポリペプチドに結合しているポリペプチドを表わす。組換え又はコードされるポリペプチド又はタンパク質は、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるわけではない。化学合成又は組換え発現系の発現を含む何らかの方法でも生成されうる。
ここで使用する「合成ペプチド」の語は、当業者に周知の方法によって化学合成されうる、あらゆる長さの重合体形態のアミノ酸を意味する。これらの合成ペプチドは様々な適用において有用である。
「精製ポリペプチド」又は「精製タンパク質」は、対象ポリペプチドが天然に結合している細胞成分を基本的に含まない、例えば約５０％未満、好ましくは約７０％未満、より好ましくは約９０％未満を含む、対象ポリペプチド又はそのフラグメントを意味する。対象ポリペプチドを精製するための方法はこの技術分野において既知である。
「単離された」の語は、物質がその本来の環境（例えば、それが天然に生じる場合は天然環境）から切り離されていることを意味する。例えば、天然に生じるポリヌクレオチド又は生存動物中に存在するポリペプチドは単離されていないが、自然系においてその共存する物質の一部又は全部から分離されている、同じポリヌクレオチド又はＤＮＡ又はポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部でありうる及び／又はそのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドは組成物の一部でありうるが、そのベクター又は組成物がその天然環境の一部ではないという意味でさらに単離されうる。
「ポリペプチド」及び「タンパク質」はここでは交換可能に使用され、下記で述べるすべてのポリペプチドを包含する。ポリペプチドの基本構造は周知であり、この技術分野の数え切れぬほどのテキスト及び他の公表文献の中で記述されている。これに関して、その語は、ペプチド結合によって互いに線状鎖に結合されている２個又はそれ以上のアミノ酸を含むペプチド又はタンパク質を表わすために使用される。ここで使用するとき、その語は、この技術分野では一般に、例えばペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも称される短鎖、及び、多くの種類が存在する、この技術分野では一般にタンパク質と称される長鎖の両方を表わす。
ポリペプチドはしばしば、一般に２０種の天然アミノ酸と称される２０のアミノ酸以外のアミノ酸を含むこと、及び所与のポリペプチドにおいて、プロセシング及び他の翻訳後修飾などの天然の過程によってのみならず、この技術分野で周知の化学修飾手法によっても、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸が修飾されうることは認識される。ポリペプチドにおいて天然に生じる一般的な修飾でさえもここで網羅的に列挙するにはあまりに数多いが、それらは基本的なテキスト及びより詳細な単行書ならびに多大の研究文献において広く記述されており、当業者には周知である。本発明のポリペプチドにおいて存在しうる既知の修飾の中で、ごく限られた例示として挙げられるのは、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化及びユビキチン化などの、転移ＲＮＡを介したタンパク質へのアミノ酸の付加である。
そのような修飾は当業者に周知であり、学術文献に極めて詳細に記述されている。いくつかの特に一般的な修飾、例えばグリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化及びＡＤＰ−リボシル化は、例えばＰｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）などの最も基本的なテキストに述べられている。これに関しては、例えばＷｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，ｐ．１−１２、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓより、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）及びＲａｔｔａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）によって提供されるもののように、多くの詳細な総説が入手可能である。
周知であり、上記で述べたように、ポリペプチドが必ずしも常に完全に線形ではないことは認識される。例えば、ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝していてもよく、またそれらは、一般に自然のプロセシング事象及び自然には起こらないヒトの操作によってもたらされる事象を含む翻訳後事象の結果として、分枝を伴って又は伴わずに、環状であってもよい。環状、分枝及び分枝環状ポリペプチドは、非翻訳自然プロセスによって及び全面的な合成方法によっても合成されうる。
修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシル末端を含む、ポリペプチド内のいずれの部位でも起こりうる。実際に、共有結合修飾によるアミノ又はカルボキシル基又はその両方の遮断は、天然及び合成ポリペプチドにおいて一般的である。例えば、タンパク質分解プロセシングの前に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において生成されるポリペプチドのアミノ末端残基は、ほとんど不変的にＮ−ホルミルメチオニンである。
ポリペプチド内で起こる修飾はしばしば、それがどのようにして生成されるかの関数である。例えば宿主細胞においてクローン化遺伝子を発現することによって生成されるポリペプチドに関しては、その修飾の性質及び度合は、主として宿主細胞の翻訳後修飾能力及びポリペプチドアミノ酸配列内に存在する修飾シグナルによって決定される。例えば、周知のように、大腸菌などの細菌宿主ではしばしばグリコシル化が起こらない。従って、グリコシル化を所望するときは、グリコシル化する宿主、一般には真核細胞においてポリペプチドを発現すべきである。昆虫細胞はしばしば哺乳類細胞と同じ翻訳後グリコシル化を生じ、この理由から、天然パターンのグリコシル化を有する哺乳類タンパク質を効率的に発現するために昆虫細胞発現系が開発された。同様の配慮が他の修飾にも適用される。
所与のポリペプチド内のいくつかの部位で同じ種類の修飾が同じ度合又は異なる度合で存在しうることは認識される。また、所与のポリペプチドは多くの種類の修飾を含みうる。
一般に、ここで使用するとき、ポリペプチドの語はそのようなすべての修飾、特に宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現することによって合成されるポリペプチド内に存在するものを包含する。
「多量体ポリペプチド複合体」及び「多量体ポリペプチド抗原」及び「ポリペプチド複合体」は、ここでは交換可能に使用され、少なくとも２又はそれ以上の分離した個々のポリペプチド鎖を含む実体を表わす。同一であるか又は異なるこれらの鎖は、共有結合するか又は非共有結合的に連結することができる。これらのポリペプチド鎖は、組換えによって生産するか、化学的に合成するか、又は天然のソースから単離することができる。個々の鎖から多量体ポリペプチド複合体を創造するには、当業者に既知の手法が使用できる。
そのような多量体ポリペプチド複合体の最も簡単な例は、個々の鎖が同じである二量体である。これらの鎖は、例えばジスルフィド結合によって共有結合していてもよく、又は水素結合と静電的相互作用によって非共有結合的に連結されていてもよい。わずかにより複雑な例は、個々の鎖が同じでない二量体である。やはり、これらの鎖は共有結合又は非共有結合で連結されていてもよい。多量体ポリペプチド複合体の複雑性のもう１つのレベルは、三量体、四量体、五量体、及びより高次の複合体を形成する、複合体に寄与する個々の鎖の数の高さである。やはり、一部の鎖は共有結合的に相互作用し、また他の鎖は非共有結合的に相互作用しうる。そのような配置はタンパク質の結晶構造又は溶体構造において認めることができ、その構造を生じる相互作用の詳細な性質が明らかになる。例えば、ヘモグロビンはその複合体内に４つの個別鎖を有し、その内の２つがある１つの配列（α）であり、２つがもう１つ別の配列（β）遺伝子であって、α２β２ヘテロ四量体を形成している。もう１つの例は、２つのα鎖、１つのβ鎖、１つのβ’鎖（ベータと相同であるが同一ではない）及び１つの記号σ鎖が複合体を形成する、α２ββ’σ配置を有する大腸菌ＲＮＡポリメラーゼである。多くのより複雑な例が知られている。一部のタンパク質は、それでもなお固定された全体サイズと化学量論を備える、各々大きな数のいくつかの鎖を有しており、例えばピルビン酸デヒドロゲナーゼ［ｔ２４（ｐ２）１２（ｆ２）１２］は２４コピーのサブユニットｔ、１２コピーのホモ二量体ｐ２、及び１２コピーのホモ二量体ｆ２から成る。その他は、相対的構成物は固定されうるが、全体の大きさは固定されない多量体構造、例えば微小管［（αβ）ｎ］である。
一般に、ここで使用するとき、多量体ポリペプチド複合体の語はそのようなすべての配置を包含する。
「成熟」ポリペプチドの語は、該ポリペプチド及びその由来細胞にとって適切な、完全な翻訳後修飾を受けたポリペプチドを表わす。
特定ポリペプチドの「フラグメント」は、その特定ポリペプチドから誘導される少なくとも約少なくとも３個から５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約８個から１０個のアミノ酸、さらに一層好ましくは少なくとも約５個から２０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を表わす。
「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養」、及び単細胞実体として培養される微生物又は高等真核細胞系を表わす他のそのような語は、組換えベクター又は他の転移されたＤＮＡのためのレシピエントとして使用できる又は使用されている細胞を指し、トランスフェクトされた原細胞の原子孫を含む。
ここで使用するとき「レプリコン」は、細胞内でポリヌクレオチド複製の自律単位として行動する、プラスミド、染色体又はウイルスなどの何らかの遺伝的要素を意味する。
「ベクター」は、結合したセグメントの複製及び／又は発現をもたらすように、もう１つ別のポリヌクレオチドセグメントに結合されたレプリコンである。
「制御配列」は、それが連結されているコード配列の発現を生じさせるために必要なポリヌクレオチド配列を表わす。そのような制御配列の性質はその宿主生物に依存して異なる。原核生物では、そのような制御配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位及びターミネーターを含む；真核生物では、そのような制御配列は一般に、プロモーター、ターミネーター及び、一部の場合、エンハンサーを含む。従って「制御配列」の語は、少なくとも、その存在が発現のために必要であるすべての成分を含むことが意図されており、またその存在が好都合である付加的な成分、例えばリーダー配列も含みうる。
「オープンリーディングフレーム」又は「ＯＲＦ」の語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域を表わす。この領域は、コード配列の一部又はコード配列全体でありうる。
「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれたとき、ｍＲＮＡに転写され、ポリペプチドへと翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドンと３’末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列は、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及び組換えポリヌクレオチド配列を含みうるが、これらに限定されない。
「によって／として免疫学的に特定しうる」との語は、その指定されたポリペプチド中にも存在し、且つその指定ポリペプチドにユニークであるエピトープ及びポリペプチドの存在を表わす。免疫学的同一性は、抗体結合及び／又は結合における競合によって決定されうる。これらの手法は当業者に既知であり、ここでも記述する。エピトープのユニーク性はまた、そのエピトープをコードするポリヌクレオチド配列についての、ＧｅｎＢａｎｋなどの既知のデータバンクのコンピュータ検索によって及び他の既知のタンパク質とのアミノ酸配列比較によっても決定できる。
ここで使用するとき、「エピトープ」は、ポリペプチド又はタンパク質の抗原決定基を意味する。推定では、エピトープは、そのエピトープにユニークな空間立体配座で３個のアミノ酸を含みうる。一般に、１個のエピトープは少なくとも５個のそのようなアミノ酸から成り、より一般的には、少なくとも８個から１０個のアミノ酸から成る。空間立体配座を検討する方法はこの技術分野において既知であり、例えばｘ線結晶解析及び二次元核磁気共鳴を含む。
「立体配座エピトープ」は、免疫学的に認識可能な構造の、隣接する順序又は非隣接順序で同じポリペプチド上に存在するか又は異なるポリペプチド上に存在するアミノ酸の特定並置から成るエピトープである。
ポリペプチドは、そのポリペプチド内に含まれる特異的エピトープの抗体認識によって抗体に結合するとき、抗体と「免疫学的に反応性」である。免疫学的反応性は、抗体結合によって、より特定すると抗体結合の反応速度論によって、及び／又はそれに対して該抗体が産生されるエピトープを含む既知のポリペプチドを競合因子として使用する結合における競合によって、決定されうる。ポリペプチドが抗体と免疫学的に反応性であるかどうかを判定するための方法はこの技術分野において既知である。
ここで使用するとき、「対象エピトープを含む免疫原性ポリペプチド」の語は、対象とする天然ポリペプチド又はそのフラグメント、ならびに他の手段によって、例えば化学合成又は組換え生物における該ポリヌクレオチドの発現によって生産されるポリペプチドを意味する。
「トランスフェクション」の語は、導入のために使用する方法に関わりなく、原核又は真核宿主細胞への外来性ポリヌクレオチドの導入を表わす。「トランスフェクション」の語は、ポリヌクレオチドの安定な導入及び一過性導入の両方を表わし、ポリヌクレオチドの直接取込み、形質転換、形質導入、及びｆ−交配を包含する。ひとたび宿主細胞に導入されれば、その外来性ポリヌクレオチドは非組込みレプリコンとして、例えばプラスミドとして保持されるか、又は選択的に、宿主ゲノムに組み込まれうる。
「治療」は、予防及び／又は療法を表わす。
ここで使用する「個体」の語は、脊椎動物、特に哺乳類種の成員を表わし、家畜、ペット動物、霊長類及びヒトを含むが、これらに限定されない；より特定すると、この語はヒトを指す。
「被験試料」の語は、分析物（対象抗体又は対象抗原など）のソースである個体の身体の成分を表わす。これらの成分はこの技術分野において周知である。被験試料は、典型的には標的配列含むことが疑われるあらゆるものである。被験試料は、個体から標本を得ること、及び必要に応じて、含まれる細胞を破壊して標的核酸を遊離させることなどの、この技術分野において周知の方法を用いて調製できる。これらの被験試料は、ここで述べる本発明の方法によって試験することができる生物学的試料を含み、全血、血清、血漿、脳脊髄液、痰、気管支洗浄液、気管支吸引液、リンパ液、及び気道、腸管及び尿生殖器路の様々な外分泌物、涙、唾液、乳、白血球、骨髄腫等のようなヒト及び動物の体液；細胞培養上清などの生物学的液体；固定しうる組織標本；及び固定しうる細胞標本を含む。
「精製産物」は、その産物が正常に結合している細胞成分から及び対象試料中に存在しうる他の種類の細胞から単離された産物の標本を表わす。
ここで使用する「分析物」は、被験試料中に存在する可能性がある、検出すべき物質である。分析物は、それに対して特異的な天然結合成員（抗体など）が存在するか又はそれに対して特異的な結合成員が調製できる、何らかの物質でありうる。従って、分析物は、アッセイにおいて１又はそれ以上の特異的結合成員に結合することができる物質である。「分析物」はまた、抗原性物質、ハプテン、抗体及びそれらの組合せを含む。特異的結合対の成員として、分析物は、ビタミンＢ１２の測定のための特異的結合対の成員としての内性因子タンパク質の使用、葉酸を測定するための葉酸結合タンパク質の使用、又は糖質の測定のための特異的結合対の成員としてのレクチンの使用などの、天然に生じる特異的結合パートナー（対）によって検出することができる。分析物は、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ヌクレオチド標的等を含みうる。分析物は、血液、血漿又は血清、尿等のような体液に可溶性でありうる。分析物は、細胞表面又は細胞内のいずれかで、組織中に存在しうる。分析物は、血液、尿、乳房吸引液などの体液中に分散した細胞上又は細胞内に存在するか、又は生検試料として入手しうる。
「乳房の疾患」、「乳房疾患」、及び「乳房の状態」は、非定型過形成、線維腺種、嚢胞性乳房疾患、及び癌を含むがこれらに限定されない、乳房の何らかの疾患又は状態を表わすためにここでは交換可能に使用される。
ここで使用する「乳癌」は、原位置の腺管癌、上皮内小葉癌、浸潤性腺管癌、髄様癌、管状腺癌、粘液性癌腫、浸潤性小葉癌、浸潤性面ぽう癌及び炎症性乳癌を含むがこれらに限定されない、乳房の悪性疾患を表わす。
「発現配列タグ」又は「ＥＳＴ」は、組織から抽出したｍＲＮＡの逆転写とそれに続くベクターへの挿入によって作製されたｃＤＮＡインサートの部分配列を表わす。
「転写産物イメージ」は、ライブラリーにおけるＥＳＴの定量的分布を示す表又はリストを指し、そのライブラリーが作製された組織において活性な遺伝子を示す。
本発明は、特異的結合成員を利用するアッセイを提供する。ここで使用する「特異的結合成員」は、特異的結合対の成員である。すなわち、２個の異なる分子のうちの１個が、化学的又は物理的手段を通して第二の分子に特異的に結合している、２個の異なる分子。それ故、一般的な免疫測定法の抗原と抗体の特異的結合対に加えて、他の特異的結合対は、ビオチンとアビジン、糖質とレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター分子とレセプター分子、補因子と酵素、酵素阻害因子と酵素等を含みうる。さらに、特異的結合対は、もとの特異的結合成員の類似体である成員、例えば分析物類似体を含みうる。免疫反応性特異的結合成員は、組換えＤＮＡ分子によって形成されるものを含む、抗原、抗原フラグメント、モノクローナル及びポリクローナルの両方の抗体及び抗体フラグメント、及びそれらの複合体を含む。
特異的結合成員は「特異的結合分子」を含む。「特異的結合分子」は、何らかの特異的結合成員、特に免疫反応性特異的結合成員を意味する。それ自体で、「特異的結合分子」の語は、抗体分子（ポリクローナル及びモノクローナル試料の両方から得られる）、ならびに下記のものを包含する：ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えばＷｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９（１９９１）、及び米国特許第４，８１６，５６７号参照）；Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ａｂ）フラグメント；Ｆｖ分子（非共有結合へテロ二量体、例えばＩｎｂａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２６５９−２６６２（１９７２）、及びＥｈｒｌｉｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９：４０９１−４０９６（１９８０）参照）；一本鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えばＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３（１９８８）参照）；ヒト化抗体分子（例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）、及び１９９４年９月２１日公開のイギリス特許公開広報第ＧＢ ２，２７６，１６９号参照）；及び、親抗体分子の免疫学的結合特性を保持する、そのような分子から得られる何らかの機能的フラグメント。
ここで使用する「ハプテン」の語は、抗体に結合することができるが、担体タンパク質に結合しない限り抗体産生を惹起することができない部分抗原又は非タンパク質結合成員を表わす。
ここで使用する「捕捉試薬」は、サンドイッチアッセイにおけるような分析物、競合アッセイにおけるような指示試薬又は分析物、又は間接アッセイにおけるような、それ自体が分析物に特異的である補助特異的結合成員、のいずれかに特異的である非標識特異的結合成員を表わす。この捕捉試薬は、アッセイの実施前又はアッセイの実施中に直接又は間接的に固相に結合することができ、それによって被験試料からの固定複合体の分離を可能にする。
「指示試薬」は、特異的結合成員に複合した（「結合した」）、外部手段によって検出できる測定可能なシグナルを生成することができ、且つそれを生成する「シグナル生成化合物」（「標識」）を含む。特異的結合対の抗体成員であることに加えて、指示試薬はまた、ビオチン又は抗ビオチン、アビジン又はビオチン、糖質又はレクチンなどのハプテン−抗ハプテン系、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター又はレセプター分子、酵素補因子及び酵素、酵素阻害因子又は酵素等のいずれかを含む、何らかの特異的結合対の成員でありうる。免疫反応性特異的結合成員は、サンドイッチアッセイにおけるような対象ポリペプチド、競合アッセイにおけるような捕捉試薬、又は間接アッセイにおけるような補助特異的結合成員のいずれかに結合することができる抗体、抗原、又は抗体／抗原複合体でありうる。プローブ及びプローブアッセイを述べるときは、「レポーター分子」の語を使用しうる。レポーター分子は、カルバゾール又はアダマンタンなどの、特異的結合対の特異的結合成員に複合した、上述したようなシグナル生成化合物を含む。
考慮される様々な「シグナル生成化合物」（標識）は、色原体、酵素などの触媒、フルオレセイン及びローダミンなどの発光化合物、ジオキセタン、アクリジニウム、フェナントリジニウム及びルミノールなどの化学発光化合物、放射性元素及び直接視覚標識を含む。酵素の例は、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等を含む。個々の標識の選択は決定的に重要ではないが、それ自体で又は１又はそれ以上の付加物質と協力して、シグナルを生成することができなければならない。
「固相」（「保持体」）は当業者に既知であり、反応トレーのウエルの壁面、試験管、ポリスチレンビーズ、磁気又は非磁気ビーズ、ニトロセルロースストリップ、膜、ラテックス粒子などの微粒子、ヒツジ（又は他の動物の）赤血球及びＤｕｒａｃｙｔｅｓ（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬより入手可能な、ピルビン酸アルデヒド及びホルムアルデヒドによって「固定された」赤血球）等を含む。「固相」は決定的に重要ではなく、当業者によって選択されうる。従って、ラテックス粒子、微粒子、磁気又は非磁気ビーズ、膜、プラスチックチューブ、マイクロタイターウエルの壁面、ガラス又はシリコンチップ、ヒツジ（又は他の適切な動物の）赤血球及びＤｕｒａｃｙｔｅｓ（登録商標）はすべて適切な例である。ペプチドを固相に固定するための適切な方法は、イオン性、疎水性、共有結合性相互作用等を含む。ここで使用する「固相」は、不溶性であるか又はその後の反応によって不溶性にすることができる何らかの物質を表わす。固相は、捕捉試薬を誘引し、固定するその内在性能力に応じて選択することができる。代替的に、固相は、捕捉試薬を誘引し、固定する能力を有する付加的なレセプターを保持することができる。付加レセプターは、捕捉試薬自体又は捕捉試薬に複合した荷電物質と反対の電荷を有する荷電物質を含みうる。さらにもう１つの選択肢として、前記レセプター分子は、固相に固定された（結合した）、特異的結合反応を通して捕捉試薬を固定する能力を備えた何らかの特異的結合成員でありうる。レセプター分子は、アッセイの実施前又はアッセイの実施中に、捕捉試薬を固相物質に間接結合させることができる。固相は、それ故、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁気又は非磁気金属、試験管のガラス又はシリコン表面、マイクロタイターのウエル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、ヒツジ（又は他の適切な動物の）赤血球、Ｄｕｒａｃｙｔｅｓ（登録商標）及び当業者に既知の他の構造でありうる。
固相はまた、検出抗体がアクセスできる十分な多孔度と抗原を結合するための適切な表面親和性を備えた適切な多孔性物質を含みうることが想定され、本発明の範囲内である。ミクロ細孔構造が一般に好ましいが、水和状態でゲル構造を有する物質も使用しうる。そのような有用な保持体は、ニトロセルロース及びナイロンを含むが、これらに限定されない。ここで述べるそのような多孔性保持体は、好ましくは、厚さ約０．０１ｍｍから０．５ｍｍ、好ましくは約０．１ｍｍのシートの形態である。孔径は広い範囲内で変化しうるが、好ましくは約０．０２５ミクロンから１５ミクロン、特に約０．１５ミクロンから１５ミクロンである。そのような保持体の表面は、保持体への抗原又は抗体の共有結合を生じさせる化学的プロセスによって活性化しうる。抗原又は抗体の不可逆性結合は、しかしながら、一般に、十分には理解されていない疎水力による多孔性物質への吸着によって得られる。他の適切な保持体はこの技術分野において既知である。
試薬
本発明は、少なくとも１コピーのＢＵ１０１ポリペプチド（配列番号６）及び少なくとも１コピーのマンマグロビンポリペプチド（配列番号５）を含むが、１又はそれ以上の未知のポリペプチドも同時に含みうる、多量体ポリペプチド複合体又は抗原、及びこの多量体ポリペプチド複合体に特異的な抗体などの試薬を提供する。本発明のポリペプチド配列又は抗体は、乳癌のような、乳房の疾患及び状態を検出する、診断する、病期分類する、監視する、予後を判定する、インビボで画像化する、予防する又は治療する、若しくは素因を判定することを導く情報を提供するために使用しうる。
本発明は、これまでの出願において提供されるような推定アミノ酸配列を有する成分、ならびに１個又はそれ以上の未知のポリペプチド配列を含む多量体ポリペプチド複合体、ならびにそのような多量体ポリペプチド複合体のフラグメント、類似体及び誘導体に関する。本発明の多量体ポリペプチド複合体は、組換えによって生産されるか、天然ソースから精製されるか、又は合成されうる。多量体ポリペプチド複合体のフラグメント、誘導体又は類似体は、その成分ポリペプチド鎖のいずれかの１個又はそれ以上のアミノ酸残基が、保存されたアミノ酸残基又は保存されていないアミノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸残基）で置換されており、そのような置換されたアミノ酸残基が遺伝暗号によってコードされているか又はコードされていなくてもよい；若しくは、１個又はそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むものであってもよく；若しくは、多量体ポリペプチド複合体のいずれか又はすべての鎖が、多量体ポリペプチド複合体の半減期を上昇させる化合物（例えばポリエチレングリコールなど）のようなもう１つ別の化合物と融合しているものであってもよく；若しくは、リーダー又は分泌配列又は多量体ポリペプチド複合体の精製に用いられる配列又はプロタンパク質配列などの、付加的なアミノ酸が多量体ポリペプチド複合体のいずれか又はすべての鎖に融合しているものであってもよい。そのようなフラグメント、誘導体及び類似体は本発明の範囲内である。本発明の多量体ポリペプチド複合体は、好ましくは単離された形態で提供され、好ましくは精製されている。
それ故、本発明の多量体ポリペプチド複合体のいずれかの鎖は、天然ポリペプチドのものと同一であるアミノ酸配列若しくは１個又はそれ以上のアミノ酸置換に帰するわずかな変異によって異なるアミノ酸配列を有しうる。その変異は、置換アミノ酸が類似の構造又は化学特性を有する「保存的変化」、例えばイソロイシンによるロイシンの置換又はセリンによるトレオニンの置換でありうる。これに対し、変異は、非保存的変化、例えばトリプトファンによるグリシンの置換を含みうる。同様のわずかな変異はまた、アミノ酸の欠失又は挿入、又はその両方を含みうる。いずれの及びいくつのアミノ酸残基が、生物学的又は免疫学的活性の変化を伴わずに置換、挿入又は欠失されうるかを判定する上での手引きは、この技術分野において周知のコンピュータプログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて見出しうる。
従って、本発明の多量体ポリペプチド複合体は、少なくとも１コピーのＢＵ１０１配列（α）、少なくとも１コピーのマンマグロビン配列（β）の組成物を有していてもよく、また少なくとも１コピーの未知の配列、α’又はβ’を有していてもよく又は有していなくてもよい。これらの成分はいかなる比率でも存在しうる。
本発明はまた、ここで提供するポリペプチドの生産に関する教示も提供する。
薬剤スクリーニング
本発明は、多量体ポリペプチド複合体に特異的に結合する少なくとも１つの化合物を特定するために、その多量体ポリペプチド複合体又はそのフラグメントへの特異的結合に関して多数の化合物をスクリーニングする方法を提供する。そのような方法は、少なくとも１つの化合物を提供すること；多量体ポリペプチド複合体を、結合のために適切な条件下で十分な時間、各々の化合物と一緒にすること；及び各々の化合物への多量体ポリペプチド複合体の結合を検出すること、の段階を含む。
そのような試験において用いるポリペプチド複合体、ポリペプチド又はペプチドフラグメントは、溶液中に遊離しているか、保持体に固定されているか、細胞表面に坦持されているか又は細胞内に局在しうる。スクリーニングの１つの方法は、ポリペプチド複合体、ポリペプチド又はペプチドフラグメントを発現することができる組換え核酸で安定にトランスフェクトされた真核又は原核宿主細胞を使用する。薬剤、化合物又は他の何らかの物質が、競合結合アッセイにおいてそのようなトランスフェクト細胞に対してスクリーニングしうる。例えば、ポリペプチドと試験する物質の間の複合体の形成を、生存細胞又は固定細胞のいずれかにおいて測定することができる。
本発明はそれ故、多量体ポリペプチド複合体に関連する疾患を治療するための使用できる薬剤、化合物又は他の何らかの物質をスクリーニングする方法を提供する。これらの方法は、その物質をポリペプチド複合体、ポリペプチド又はそのフラグメントに接触させること、及び物質とポリペプチドの間の複合体の存在又はポリペプチドと細胞の間の複合体の存在に関して検定することを含む。競合結合アッセイでは、典型的にはポリペプチドを標識する。適切なインキュベーション後、遊離（又は非複合）ポリペプチド又はそのフラグメントを、結合形態で存在するものから分離し、遊離又は非複合標識の量を、特定物質がそのポリペプチドに結合する能力又はポリペプチド／細胞複合体に干渉する能力の測定値として使用する。
本発明はまた、ポリペプチドに特異的に結合することができる中和抗体が、ポリペプチド複合体、ポリペプチド又はそのフラグメントへの結合に関して被験物質と競合する、競合的スクリーニングアッセイの使用を包含する。このように、前記抗体は、ここで提供する多量体ポリペプチド複合体と１個又はそれ以上の抗原決定基を共有する、被験試料中のポリペプチドの存在を検出するために使用できる。
スクリーニングのためのもう１つの手法は、ここで開示する多量体ポリペプチド複合体の少なくとも１個のポリペプチドに対して適切な結合親和性を有する化合物についての高流量スクリーニングを提供する。簡単に述べると、多数の異なる小ペプチド被験化合物を、プラスチックピン又は他の何らかの表面などの固相上で合成する。ペプチド被験化合物をポリペプチドと反応させ、洗浄する。そのようにして固相に結合したポリペプチドをこの技術分野において周知の方法によって検出する。精製ポリペプチドはまた、ここで述べるスクリーニング手法において使用するためにプレート上に直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体を使用してポリペプチドを捕捉し、それを保持体上に固定することができる。例えば、参照してここに組み込まれる、１９８４年９月１３日公開のＥＰ ８４／０３５６４号参照。
合理的な薬剤設計のゴールは、対象とする生物活性ポリペプチド又はそれらが相互作用するアゴニスト、アンタゴニスト又は阻害因子を含む小分子の構造的類似体を生成することである。そのような構造的類似体は、該ポリペプチドのより活性な又はより安定な形態である薬剤、若しくはインビボでポリペプチドの機能を増強する又は機能に干渉する薬剤を設計するために使用できる。参照してここに組み込まれる、Ｊ．Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１９−２１（１９９１）。
例えば、１つのアプローチでは、ポリペプチド又はポリペプチド−阻害因子複合体の三次元構造を、ｘ線結晶解析によって、コンピュータモデリングによって、又は最も典型的にはこの２つのアプローチの組合せによって決定する。構造を明らかにし、分子の活性部位を決定するためには、ポリペプチドの形状と電荷の両方を確認しなければならない。よりまれではあるが、ポリペプチドの構造に関する有用な情報は、相同タンパク質の構造に基づくモデリングによっても入手しうる。両方の場合に、類似ポリペプチド様分子を設計するため又は効率的な阻害因子を特定するために関連構造情報が使用される。
理論的薬剤設計の有用な例は、参照してここに組み込まれる、Ｓ．Ｂｒａｘｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：７７９６−７８０１（１９９２）によって示されたような改善された活性又は安定性を有する分子、若しくはＳ．Ｂ．Ｐ．Ａｔｈａｕｄａら、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１１３（６）：７４２−７４６（１９９３）によって示されたような天然ペプチドの阻害因子、アゴニスト又はアンタゴニストとして働く分子を含みうる。
また、上述したようなアッセイによって選択された標的特異的抗体を単離すること、及びその後その結晶構造を決定することも可能である。原則として、このアプローチは、その後の薬剤設計の基礎となりうる活性基を提供する。さらに、機能的な薬理活性抗体に対する抗イディオタイプ抗体（「抗−ｉｄ」）を作製することにより、タンパク質結晶解析を全面的に回避することも可能である。鏡像の鏡像として、抗ｉｄの結合部位がもとのレセプターの類似体である。その後抗ｉｄを使用して、化学的又は生物学的に生産されたペプチドのバンクからペプチドを特定し、単離することができる。単離されたペプチドは、その後、活性基（すなわちプロトタイプ薬剤）として働くことができる。
Ｘ線結晶解析などの分析試験を実施するために十分な量の本発明の組換えポリペプチド複合体を生産することが可能である。さらに、核酸配列から導かれるポリペプチドアミノ酸配列の知識は、ｘ線結晶解析の代りに又はｘ線結晶解析に加えて、コンピュータモデリング手法を使用する場合の手引きを提供する。
多量体ポリペプチド複合体に特異的な抗体（例えば抗多量体ポリペプチド複合体抗体）はさらに、そのポリペプチド複合体に結合することによってポリペプチド複合体の生物学的作用を阻害するために使用しうる。このように、前記抗体は、治療において、例えば乳癌及びその転移を含む乳房組織疾患を治療するために使用しうる。
さらに、そのような抗体は、被験試料中の多量体ポリペプチド複合体の存在又は不在を検出することができ、それ故、乳房組織の疾患又は状態、特に乳癌の診断のための診断マーカーとして有用である。そのような抗体はまた、乳癌などの乳房組織疾患又は状態についての診断マーカーとしても機能しうる。
本発明はまた、本発明のポリペプチドのアンタゴニスト及び阻害因子を対象とする。アンタゴニスト及び阻害因子は、ポリペプチド複合体の機能を阻害する又は排除するものである。それ故例えば、アンタゴニストは、本発明のポリペプチドに結合して、その機能を阻害又は排除しうる。アンタゴニストは、例えば、ポリペプチドに結合することによって多量体ポリペプチド複合体の活性を排除する、そのポリペプチドに対する抗体でありえ、又は一部の場合は、アンタゴニストはオリゴヌクレオチドでありうる。小分子阻害因子の例は、小ペプチド又はペプチド様分子を含むが、これらに限定されない。
アンタゴニスト及び阻害因子は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール及びそれらの組合せを含むがこれらに限定されない、製薬上許容される担体を伴う組成物として使用しうる。多量体ポリペプチド複合体阻害因子の投与は好ましくは全身性である。本発明はまた、そのようなポリペプチド複合体の作用を阻害する抗体も提供する。
組換えテクノロジー
本発明は、ＢＵ１０１ポリペプチド（配列番号６）、マンマグロビンポリペプチド（配列番号５）、及び未知のα’及び／又はβ’ポリペプチドの同時発現のための宿主細胞及び発現ベクター、及びそれらがコードする多量体ポリペプチド複合体の生産のための方法を提供する。そのような方法は、ＢＵ１０１ポリペプチド（配列番号６）、マンマグロビンポリペプチド（配列番号５）、及び未知のα’及び／又はβ’ポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養すること、及びその細胞培養から多量体ポリペプチド及び／又は多量体ポリペプチド複合体を回収することを含む。
本発明はまた、本発明のＢＵ１０１、マンマグロビン、及び未知のα’及び／又はβ’ポリペプチドを個別にコードするベクター；本発明のベクターで遺伝子操作される宿主細胞；及び組換え手法による本発明の多量体ポリペプチド複合体のサブユニットのいずれか又は全部の生産を提供する。
宿主細胞は、クローニングベクター又は発現ベクターでありうるベクターで遺伝子操作される（トランスフェクトされる、形質導入される又は形質転換される）。前記ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形態でありうる。遺伝子操作宿主細胞は、プロモーターを活性化する、トランスフェクトされた細胞を選択する、又はＢＵ１０１（配列番号２）、マンマグロビン（配列番号１）、又は未知のα’及び／又はβ’遺伝子を増幅するために適宜に修正された従来の栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨ等のような培養条件は、発現のために選択した宿主細胞に関してこれまで使用されているものであり、当業者には明白である。
組換え手法によってポリペプチド又はポリペプチド複合体を生産するためにポリヌクレオチドを使用しうる。従って、ポリヌクレオチド配列は、様々な発現ビークルのいずれか１つ、特にポリペプチドを発現するためのベクター又はプラスミドに含まれうる。そのようなベクターは、染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡの組合せから誘導されるベクター；ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス及び仮性狂犬病ウイルスなどのウイルスＤＮＡを含む。しかし、他のいかなるプラスミド又はベクターも、それが宿主において複製可能であり且つ生育可能である限り、使用しうる。
適切なＤＮＡ配列を、様々な手順によって前記ベクターに挿入しうる。一般に、この技術分野において既知の手順によってＤＮＡ配列を適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。そのような手順その他は当業者の範囲内であるとみなされる。発現ベクター内のＤＮＡを、ｍＲＮＡ合成を指令するために適切な発現制御配列（プロモーター）に作動可能に連結する。そのようなプロモーターの代表的な例は、ＬＴＲ又はＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃ又はｔｒｐ、ファージλＰ ｓｕｂ Ｌプロモーター、及び原核又は真核細胞又はそれらのウイルスにおける遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターを含むが、これらに限定されない。発現ベクターはまた、翻訳開始及び転写終結のためのリボソーム結合部位を含む。前記ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含みうる。さらに、発現ベクターは、好ましくは、真核細胞培養物のためのジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性など、若しくは大腸菌におけるテトラサイクリン又はアンピシリン耐性などの、トランスフェクトされた宿主細胞の選択のための表現型形質を提供する遺伝子を含む。
上述したような適切なＤＮＡ配列、ならびに適切なプロモーター又は制御配列を含むベクターは、適切な宿主をトランスフェクトしてその宿主に該タンパク質を発現させるために使用しうる。適切な宿主の代表的な例として、次のものが挙げられる：大腸菌、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などの細菌細胞；ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）；酵母などの真菌細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）及びＳｆ９などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ又はボーズメラノーマなどの動物細胞；植物細胞等。適切な宿主の選択は、ここで提供する教示から当業者の範囲内であるとみなされる。
より特定すると、本発明はまた、上記で広く述べたような１個又はそれ以上の配列を含む組換え構築物を包含する。この構築物は、本発明の配列が正又は逆方向に挿入された、プラスミド又はウイルスベクターなどのベクターを含む。この実施形態の好ましい局面では、構築物はさらに、該配列に作動可能に連結された、例えばプロモーターを含む調節配列を含む。数多くの適切なベクター及びプロモーターが当業者に既知であり、市販されている。例として下記のようなベクターが提供される。細菌：ｐＩＮＣＹ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐＳＰＯＲＴ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；真核生物：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかし、他のいかなるプラスミド又はベクターも、それが宿主において複製可能であり且つ生育可能である限り、使用しうる。
プラスミドｐＩＮＣＹは、そのポリリンカー（マルチクローニングサイト）内に２つの修飾を有することを除いて、一般にプラスミドｐＳＰＯＲＴ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤより入手可能）と同一である。これらの修飾は、（１）ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を持たないこと、及び（２）そのＥｃｏＲＩ制限部位が異なる位置にあることである。ｐＩＮＣＹは、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩの両方でｐＳＰＯＲＴ１を開裂し、その切り出したポリリンカーのフラグメントを合成ＤＮＡフラグメント（配列番号３−４）で置き換えることによって創造される。この置換は当業者に既知であるように実施されうる。例えば、２個のヌクレオチド配列、配列番号３−４を５’末端リン酸で合成によって作製し、一緒に混合して、その後ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで切断したｐＳＰＯＲＴ１プラスミドへの付着末端連結を実施するための標準条件下で連結する。次に適切な宿主細胞（大腸菌ＤＨ５αなど）を連結したＤＮＡでトランスフェクトし、組換えクローンをアンピシリン耐性に関して選択する。その後プラスミドＤＮＡを個々のクローンから作製し、挿入配列が適切な方向で存在することを確認するために制限酵素分析又はＤＮＡ配列決定に供する。当業者に既知の他のクローニング戦略も使用しうる。
プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクター又は選択マーカーを有する他のベクターを用いて所望遺伝子から選択することができる。２つの適切なベクターはｐＫＫ２３２−８及びｐＣＭ７である。特定の名称が付与されている細菌プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、ＳＰ６、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰ ｓｕｂ Ｒ、Ｐ ｓｕｂ Ｌ及びｔｒｐを含む。真核生物プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、前初期単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルスからのＬＴＲ及びマウスメタロチオネイン−Ｉを含む。適切なベクター及びプロモーターの選択は十分に当業者のレベルの範囲内である。
さらなる実施形態では、本発明は、上述した構築物を含む宿主細胞を提供する。この宿主細胞は、哺乳類細胞などの高等真核細胞、又は酵母細胞などの下等真核細胞であるか、又は細菌細胞などの原核細胞でありうる。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランを介したトランスフェクション、又は電気穿孔法によって実施できる［Ｌ．Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇ，Ｐａｒａｍｏｕｎｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔ Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）］。
宿主細胞内の構築物は、組換え配列によってコードされる遺伝子産物を生産するために従来のように使用できる。代替的に、本発明のポリペプチドは従来のペプチドシンセサイザーによって合成生産することができる。
組換えタンパク質は、適切なプロモーターの制御下で、哺乳類細胞、酵母、細菌、又は他の細胞において発現されうる。ＤＮＡ構築物から誘導したＲＮＡを使用してそのようなタンパク質を生産するために無細胞翻訳系も使用できる。原核及び真核生物宿主に関して使用するための適切なクローニング及び発現ベクターは、参照してここに組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）に記述されている。
高等真核生物による、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター内にエンハンサー配列を挿入することによって高められる。エンハンサーは、その転写を高めるようにプロモーターに働きかける、通常約１０ｂｐから３００ｂｐの、ＤＮＡのシス作用性エレメントである。その例は、複製起点（ｂｐ１００−２７０）の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーを含む。
一般に、組換え発現ベクターは、複製起点、及び宿主細胞のトランスフェクションを可能にする選択マーカー、例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＲＰ１遺伝子、及び下流の構造配列の転写を指令する高発現遺伝子から誘導されるプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、特に、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）などの解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、又は熱ショックタンパク質をコードするオペロンから誘導されうる。非相同構造配列は、適切な時期に、翻訳開始及び終結配列、及び好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔又は細胞外媒質への分泌を指令することができるリーダー配列と共に構築される。場合により、非相同配列は、所望特性、例えば発現された組換え産物の安定化又は精製の単純化を付与するＮ末端特定ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる。
細菌での使用のための有用な発現ベクターは、所望タンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、機能的プロモーターを伴った作動可能な読み枠内の適切な翻訳開始及び終結信号と共に挿入することによって構築される。前記ベクターは、１個又はそれ以上の表現型選択マーカー及びベクターの維持を確保するため、及び所望する場合は、宿主内での増幅を提供するための複製起点を含む。トランスフェクションのための適切な原核細胞宿主は、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｒａ ｔｙｐｉｍｕｒｉｕｍ）及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）内の様々な種を含むが、その他も常套的選択事項として使用しうる。
細菌での使用のための有用な発現ベクターは、選択マーカー及び周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝子エレメントを含むプラスミドから誘導される細菌複製起点を含む。他のベクターは、ＰＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）及びＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含むが、これらに限定されない。これらのｐＨＲ３２２「骨格」部分を、適切なプロモーター及び発現すべき構造配列と結合する。
適切な宿主をトランスフェクトし、その宿主が適切な細胞密度の増殖した後、選択したプロモーターを適切な手段（例えば温度変化又は化学的誘導）によって抑制解除し、細胞をさらなる期間培養する。細胞を、典型的には遠心分離によって採集し、物理的又は化学的手段によって破壊して、生じた抽出物をさらなる精製のために保持する。蛋白質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、音波破砕、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用を含む何らかの好都合な方法によって破壊することができる。そのような方法は当業者に周知である。
様々な哺乳類細胞培養系も、組換えタンパク質を発現するために使用できる。哺乳類発現系の例は、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ ２３：１７５（１９８１）によって述べられているサル腎線維芽細胞のＣＯＳ−７系統、及びＣ１２７、ＨＥＫ−２９３、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞系統などの、適合性ベクターを発現することができる他の細胞系統を含む。哺乳類発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターとエンハンサー、及びまた何らかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位と受容部位、転写終結配列及び５’側隣接非転写配列を含む。ＳＶ４０ウイルスゲノムから誘導されるＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位及びポリアデニル化部位は、必要な非転写遺伝子エレメントを提供するために使用しうる。代表的な有用ベクターは、ｐＲｃ／ＣＭＶ及びｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡより入手可能）を含む。
ポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィー、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー又はレクチンクロマトグラフィーを含む既知の方法によって組換え細胞培養から回収され、精製される。精製の間に存在するカルシウムイオンの濃度が低い（約０．１ｍＭから５ｍＭ）ことが望ましい［Ｐｒｉｃｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４：９１７（１９６９）］。ポリペプチドの立体配置を完成させるときに、必要に応じて、タンパク質リフォールディングの段階を使用することができる。最後に、最終精製段階のために高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が使用できる。
従って、本発明のポリペプチドは、高発現細胞系統から発現される天然精製産物であるか、又は化学合成手順の産物であるか、又は原核又は真核生物宿主から組換え手法によって（例えば、培養中の細菌、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳類細胞によって）生産されうる。組換え生産手法において用いる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、哺乳類又は他の真核生物糖質でグリコシル化されていてもよく又はグリコシル化されていなくてもよい。本発明のポリペプチドはまた、開始アミノ酸としてメチオニン残基を含みうる。
ｃＤＮＡを含むプラスミドは、公表されている既知の手順に従って入手可能なプラスミドから構築することができる。加えて、記述されているものと等価のプラスミドがこの技術分野において既知であり、当業者には明白である。ｃＤＮＡは、特定宿主における蛋白質の発現に有用であることが知られている他のベクターに移動させることができる。標的ｃＤＮＡの両末端の延長部にハイブリダイズするのに十分なクローニング部位及びＤＮＡのセグメントを含むオリゴヌクレオチドプライマーは、標準的な方法によって化学合成することができる。次にこれらのプライマーを使用して、ＰＣＲによって所望遺伝子セグメントを増幅することができる。生じた新しい遺伝子セグメントを標準条件下に適切な制限酵素で消化して、ゲル電気泳動によって単離することができる。代替的に、ｃＤＮＡを適切な制限酵素で消化し、欠けている遺伝子セグメントを化学合成オリゴヌクレオチドで充填することによって同様の遺伝子セグメントを作製することができる。２個以上の遺伝子からのコード配列のセグメントを連結し、適切なベクターにおいてクローニングして、組換え配列の発現を至適化することができる。
そのようなキメラ分子のための適切な発現宿主は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びヒト胚腎（ＨＥＫ）２９３細胞などの哺乳類細胞、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母細胞、及び大腸菌などの細菌を含むが、これらに限定されない。これらの細胞系の各々について、有用な発現ベクターはまた、細菌における繁殖を可能にする複製起点及び細菌における選択を可能にするβ−ラクタマーゼ抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーを含みうる。さらに、前記ベクターは、トランスフェクトした真核宿主細胞における選択を可能にする、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子などの第二選択マーカーを含みうる。真核生物発現宿主において使用するためのベクターは、対象とする配列がポリＡを欠く場合、３’ポリＡ尾部の付加を必要とすることがある。
加えて、該ベクターは、遺伝子発現を高めるプロモーター又はエンハンサーを含みうる。そのようなプロモーターは宿主特異的であり、ＣＨＯ細胞についてのＭＭＴＶ、ＳＶ４０、又はメタロチオネインプロモーター；細菌宿主についてのｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｃ又はＴ７プロモーター；若しくは酵母についてのα因子、アルコールオキシダーゼ又はＰＧＨプロモーターを含むが、これらに限定されない。ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを有する又は有さないアデノウイルスベクターが、哺乳類細胞系統におけるタンパク質発現を促進するために使用しうる。ひとたび組換え細胞の均一な培養物が得られれば、大量の組換え生産タンパク質が順化培地から回収でき、この技術分野で周知のクロマトグラフィー法を用いて分析することができる。多量の分泌タンパク質の生産のための代替的な方法は、哺乳動物胚のトランスフェクション及びトランスジェニックウシ、ヤギ、ヒツジ等によって生産された乳からの組換えタンパク質の回収を含む。ポリペプチド及び密接に関連する分子が、タンパク質精製を容易にするように組換え発現しうる。１つのアプローチは、ヒトポリペプチド上に天然では存在しない１又はそれ以上の付加的なポリペプチドドメインを含むキメラタンパク質の発現を含む。そのような精製を容易にするドメインは、固定化金属での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンドメインなどの金属キレート化ペプチド、固定化免疫グロブリンでの精製を可能にするプロテインＡドメイン、及びＦＬＡＧＳ延長／アフィニティー精製系（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）で使用されるドメインを含むが、これらに限定されない。ポリペプチド配列と精製ドメインの間に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からの第ＸＡ因子又はエンテロキナーゼなどの開裂性リンカー配列を含めることは、ポリペプチドを回収するために有用でありうる。
免疫測定法
そのフラグメント、誘導体及び類似体を含む、ポリペプチド、多量体ポリペプチド複合体、又はそのようなポリペプチド又は多量体ポリペプチド複合体を発現する細胞は、乳房組織に対する抗体を検出するための様々なアッセイにおいて利用でき、その多くをここで述べる。それらはまた、抗体を産生するための免疫原としても使用できる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル又はモノクローナル抗体、キメラ、単鎖及びヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメント、又はＦａｂ発現ライブラリーの産物でありうる。そのような抗体及びフラグメントの生産のためにこの技術分野で既知の様々な手順が使用しうる。
例えば、多量体ポリペプチド複合体に対して産生される抗体は、多量体ポリペプチド複合体の動物への直接注入によって又は多量体ポリペプチド複合体をマウス、ウサギ、ヤギ又はヒトなどの動物に投与することによって入手できる。マウス、ウサギ又はヤギが好ましい。多量体ポリペプチド複合体は、ＢＵ１０１（配列番号６）、マンマグロビン（配列番号５）、及び未知のα’及び／又はβ’ポリペプチド、及びそれらのフラグメントから成る配列の群で構成される。そのようにして得られた抗体は、その後、多量体ポリペプチド複合体自体に結合する。このように、多量体ポリペプチド複合体のフラグメントだけをコードする配列又はその成分ポリペプチドのいずれかをコードする配列を使用して、天然ポリペプチド複合体に結合する抗体を作製することができる。次にそのような抗体を使用して、多量体ポリペプチド複合体を含むことが疑われる組織などの被験試料からその多量体ポリペプチド複合体を単離することができる。モノクローナル抗体の作製のためには、連続細胞系統培養物によって生産される抗体を提供するいかなる手法も使用できる。その例は、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）によって述べられているようなハイブリドーマ手法、トリオーマ手法、Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）によって述べられているようなヒトＢ細胞ハイブリドーマ手法及びＣｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐ．７７−９６（１９８５）によって述べられているようなヒトモノクローナル抗体を生産するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ手法を含む。単鎖抗体の生産のために述べられている手法は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生産するために適合させることができる。例えば、参照してここに組み込まれる、米国特許第４，９４６，７７８号参照。
モノクローナル抗体又はそのフラグメントは、多量体ポリペプチド複合体の抗原を検出するために個別に提供されうる。ここで提供するモノクローナル抗体（及びそのフラグメント）の組合せはまた、多量体ポリペプチド複合体の他の領域に特異的に結合する抗体と共に、本発明の多量体ポリペプチド複合体に結合する少なくとも１つの抗体が存在し、各々の抗体が異なる結合特異性を有する混合物又は「カクテル」中の成分として一緒に使用しうる。例えば、１つのモノクローナル抗体は、２個又はそれ以上の異なるポリペプチドの成分から誘導される共有エピトープを認識しうる。この場合、そのエピトープはポリペプチドが存在する多量体複合体に特異的であるが、個々の単離ポリペプチドには結合しない。また別のモノクローナル抗体は、単一ポリペプチド配列内で規定されるエピトープを認識しうる。この場合、そのエピトープは個々の単離ポリペプチドならびに多量体ポリペプチド複合体の両方に存在しうる。また別のモノクローナル抗体は、単一ポリペプチド配列内で規定されるエピトープを認識しうる。この場合、そのエピトープは個々の単離ポリペプチドには存在しうるが、多量体ポリペプチド複合体には存在しない。そのエピトープは、他のポリペプチドとの複合の結果として埋没されるか又は立体配座的に異なりうる。従って、このカクテルは、ここで開示する多量体ポリペプチドのいずれかの単一抗原決定基に対して産生される本発明のモノクローナル抗体及びこれらの抗原又は他の関連タンパク質の抗原決定基に特異的な他のモノクローナル抗体を含むことができる。
アッセイ様式において使用できるポリクローナル抗体又はそのフラグメントは、本発明の多量体ポリペプチド複合体又はそのアッセイで付加的に使用される、この複合体の成分ポリペプチドのいずれか、又はそのフラグメントに特異的に結合すべきである。使用されるポリクローナル抗体は、好ましくは、多量体ポリペプチド複合体に結合するヒト、ヤギ、ウサギ又はヒツジポリクローナル抗体などの哺乳類由来である。最も好ましくは、ポリクローナル抗体はウサギ由来である。アッセイで使用するポリクローナル抗体は、単独で又はポリクローナル抗体のカクテルとして使用できる。アッセイ様式で使用するカクテルは、多量体ポリペプチド複合体に対して異なる結合特異性を有するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体から成るので、それらは、乳癌のような、乳房の疾患又は状態を検出する、診断する、病期分類する、監視する、予後を判定する、インビボで画像化する、予防する又は治療する、若しくは素因を判定するために有用である。
「サンドイッチ」免疫測定法を含む様々なアッセイ様式が本発明の抗体を使用しうる。例えば、本発明の抗体又はそのフラグメントは、被験試料中の多量体ポリペプチド複合体の存在を、存在する場合は、判定するための様々なアッセイ系において使用できる。例えば、第一アッセイ様式では、固相に被覆した、ポリクローナル又はモノクローナル抗体又はそのフラグメント、又はこれらの抗体の組合せを被験試料に接触させて、第一混合物を形成する。この第一混合物を、抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でインキュベートする。次に、シグナル生成化合物が結合した、モノクローナル又はポリクローナル抗体又はそのフラグメント、又はこれらの抗体の組合せを含む指示試薬を前記抗原／抗体複合体に接触させて、第二混合物を形成する。次にこの第二混合物を、抗体／抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でインキュベートする。被験試料中の、固相に捕捉された抗原の存在を、存在する場合は、シグナル生成化合物によって生じた測定可能なシグナルを検出することによって判定する。被験試料中に存在する抗原の量は、生成されるシグナルに比例する。
サンドイッチ免疫測定法のもう１つの例では、本発明の抗体又はそのフラグメントは、多量体ポリペプチド複合体を構成する個々の単離ポリペプチドの存在を、存在する場合は、判定するための様々なアッセイ系において使用できる。この場合、使用する抗体は、個々の単離ポリペプチド中に存在するが、多量体ポリペプチド複合体における結合には使用できないエピトープに結合する。
サンドイッチ免疫測定法のもう１つの例では、本発明の抗体又はそのフラグメントは、多量体ポリペプチド複合体を構成する個々の単離ポリペプチド及び多量体ポリペプチド複合体それ自体の両方の存在を、存在する場合は、判定するための様々なアッセイ系において使用できる。この場合、使用する抗体は、個々の単離ポリペプチド中及び多量体ポリペプチド複合体中に存在するエピトープに結合する。
これらの種々の抗原、特に多量体ポリペプチド複合体（結合）、個々の単離ポリペプチド（遊離）、及び多量体ポリペプチド複合体と個々の単離ポリペプチドの両方（総量）、及びそれらに比率の測定は、乳癌のような、乳房の疾患又は状態を検出する、診断する、病期分類する、監視する、予後を判定する、インビボで画像化する、予防する又は治療する、若しくは素因を判定するために有用であると考えられる。例えば、参照してここに組み込まれる、国際特許公開公報第ＷＯ ９２／０１９３６号参照。
代替的なアッセイ様式では、（１）遊離、結合又は総量の測定が実施できるように多量体ポリペプチド抗原及び／又はその成分ポリペプチド鎖の１つに特異的に結合する、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、又はそのフラグメント、又は保持体に結合したそのような抗体の組合せ；（２）被験試料；及び（３）シグナル生成化合物が結合している、多量体ポリペプチド抗原及び／又はその成分鎖の１つ（又はこれらの抗体の組合せ）の異なるエピトープに特異的に結合する、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又はそのフラグメントを含む指示薬、に接触させることによって混合物を形成する。この混合物を、抗体／抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でインキュベートする。被験試料中に存在する、固相に捕捉された多量体ポリペプチド抗原及び／又はその成分ポリペプチド鎖の１つの存在を、シグナル生成化合物によって生じた測定可能なシグナルを検出することによって判定する。被験試料中に存在する抗原の量は、生成されるシグナルに比例する。
もう１つのアッセイ様式では、固相上に被覆した又は検出可能なシグナルで標識した抗体を、その後、限られた量の抗原に関して患者の試料中に存在するものと（存在する場合は）競合させる。ポリクローナル又はモノクローナル抗体の結合の低下は、患者の試料中に抗原が存在することの指標である。その抗原に対する抗体の存在は、患者における乳房組織疾患、特に乳癌の存在を示唆する。
さらにもう１つの検出方法では、本発明のモノクローナル又はポリクローナル抗体の各々は、免疫組織化学分析による、組織切片中ならびに細胞中の、多量体ポリペプチド複合体及び／又はその成分ポリペプチド鎖の１つを含む多量体ポリペプチド抗原の検出において使用できる。組織切片は、凍結された又は化学的に固定された組織の標本から切り出すことができる。細胞中の抗原を検出しようとする場合は、血液、尿、乳房吸引液、又は他の体液から細胞を単離することができる。細胞は、外科的生検又は針による生検によって入手しうる。本発明の抗体に関して染色するために細胞の特定分画を濃縮するように、磁性粒子又は磁性流体で標識した後、遠心分離又は磁気引力によって細胞を単離することができる。これらの抗体が直接標識されている（例えばフルオレセイン、コロイド状金、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等で）又は二次標識抗種抗体を用いることによって標識されている（ここで例示するような様々な抗体で）、疾患の組織病理学を探索するための細胞化学分析も、本発明の範囲内である。
さらに、これらのモノクローナル抗体は、ＣＮＢｒ−活性化セファロースと同様の基質に結合することができ、組換え及び天然タンパク質を精製するために、細胞培養又は生物学的組織から多量体ポリペプチド複合体及び／又はその成分鎖の１つをアフィニティー精製するために使用できる。
本発明のモノクローナル抗体はまた、治療用途又は他の同様の適用のためのキメラ抗体の作製にも使用できる。
多量体ポリペプチド抗原は、組換え抗原の使用によって、ならびに多量体ポリペプチド複合体の成分ポリペプチド鎖のアミノ酸配列を含む合成ペプチド又は精製ペプチドの使用によってアッセイにおいて検出しうることは、想定されており、本発明の範囲内である。そのようなポリペプチドのアミノ酸配列は、ＢＵ１０１ポリペプチド（配列番号６）、マンマグロビンポリペプチド（配列番号５）、若しくは未知のα’及び／又はβ’ポリペプチド配列、及びそのフラグメントから成る群より選択される。また、多量体ポリペプチド複合体の種々のエピトープを特定する、種々の合成、組換え又は精製ペプチドが、乳癌のような乳房の疾患又は状態を検出する、診断する、病期分類する、監視する、予後を判定する、インビボで画像化する、予防する又は治療する、若しくは素因を判定するためのアッセイにおいて組み合わせて使用できることも本発明の範囲内である。この場合、これらのペプチド又はポリペプチドのすべてを１つの固相上に被覆することができる。又は各々別々のペプチド又はポリペプチドをミクロ粒子などの別々の固相に被覆し、その後一緒にして、後程アッセイで使用できるペプチド又はポリペプチドの混合物を形成してもよい。さらに、種々の抗原からのエピトープを規定する多数のペプチド又はポリペプチドは、乳癌のような、乳房の疾患又は状態の検出、診断、病期分類、監視、予後判定、予防又は治療、若しくは素因の判定のために使用しうることが想定される。固相に被覆した又は検出可能標識で標識したペプチド又はポリペプチドを、その後、限られた量の抗体に関して患者の試料中に存在するもの（存在する場合は）と競合させる。合成、組換え又は精製ペプチドの該抗体（１又はそれ以上）への結合の低下は、患者の試料中に多量体ポリペプチド抗原が存在することの指標である。多量体ポリペプチド抗原の存在は、患者における乳房組織疾患、特に乳癌の存在を示唆する。アッセイ様式の変法は当業者に既知であり、多くを下記で論じる。
もう１つのアッセイ様式では、本発明の少なくとも２個のポリペプチド、ペプチド又は多量体ポリペプチド複合体の１つ又は組合せは、多量体ポリペプチド抗原の検出のための競合プローブとして使用することができる。例えば、ここで開示するモノクローナル及びポリクローナル抗体などの多量体ポリペプチド複合体に対する抗体を、単独で又は組み合わせて、固相に被覆する。次に多量体ポリペプチド抗原を含むことが疑われる被験試料を、シグナル生成化合物及び本発明の少なくとも１つのモノクローナル抗体を含む指示試薬と共に、固相に結合した被験試料と指示試薬又は固相に結合した指示試薬の抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でインキュベートする。固相へのモノクローナル抗体の結合の低下を定量的に測定することができる。
もう１つのアッセイ様式では、抗多量体ポリペプチド抗体及び／又は多量体ポリペプチド抗原の存在を、次のようにして、同時アッセイにおいて検出することができる。被験試料を、固相に結合した第一分析物に特異的な第一結合成員を含む、第一分析物の捕捉試薬、及び第二の固相に結合した第二分析物のための第一結合成員を含む、第二分析物のための捕捉試薬に同時に接触させ、それによって混合物を形成させる。この混合物を、捕捉試薬／第一分析物複合体及び捕捉試薬／第二分析物複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でインキュベートする。そのようにして形成されたこれらの複合体を、次に、シグナル生成化合物で標識した第一分析物に特異的な結合対の成員を含む指示試薬、及びシグナル生成化合物で標識した第二分析物に特異的な結合対の成員を含む指示試薬と接触させて、第二混合物を形成する。この第二混合物を、捕捉試薬／第一分析物／指示試薬複合体及び捕捉試薬／第二分析物／指示試薬複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でインキュベートする。１又はそれ以上の分析物の存在を、被験試料中に１又はそれ以上の分析物が存在することの指標として、いずれか又は両方の固相上に形成された複合体に関して生成されたシグナルを検出することによって判定する。このアッセイ様式では、ここで開示する発現系から誘導される組換え抗原、ならびにここで開示する発現系から誘導されるタンパク質から作製されるモノクローナル抗体が使用できる。例えば、このアッセイ系では、多量体ポリペプチド抗原が第一分析物でありうる。そのようなアッセイ系は、欧州特許公開公報第０４７３０６５号の中でより詳細に述べられている。
さらに他のアッセイ様式では、ここで開示するポリペプチドは、被験試料中の多量体ポリペプチド抗原に対する抗体の存在を検出するために使用しうる。例えば、被験試料を、組換えタンパク質又は合成ペプチドなどの少なくとも１つのポリペプチドが結合した固相と共にインキュベートする。そのポリペプチドは、ＢＵ１０１（配列番号６）、マンマグロビン（配列番号５）、α’ポリペプチド、β’ポリペプチド、及びそのフラグメントから成る群より選択される。これらを、抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で反応させる。インキュベーション後、抗原／抗体複合体を検出する。選択するアッセイ系に応じて、検出を容易にするために指示試薬を使用してもよい。
もう１つのアッセイ様式では、被験試料を、ここで開示するように生産した組換えタンパク質が結合した固相に接触させ、且つ、好ましくは指示試薬で標識した、前記タンパク質に特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体にも接触させる。抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でインキュベートした後、固相を遊離相から分離し、多量体ポリペプチド抗原に対する抗体が存在することの指標として、固相又は遊離相のいずれかにおいて標識を検出する。
ここで開示する組換え抗原を使用した他のアッセイ様式が想定される。これらは、被験試料を、第一ソースからの少なくとも１つの抗原が結合した固相と接触させること、その固相と被験試料を、抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でインキュベートすること、及びその後、第一ソースとは異なる第二ソースから誘導される標識抗原に固相を接触させることを含む。例えば、大腸菌などの第一ソースから誘導される組換えタンパク質を固相上の捕捉抗原として使用し、そのように調製した固相に被験試料を加えて、標準的なインキュベーション及び必要に応じた洗浄段階の後、異なるソース（すなわち大腸菌以外）から誘導される組換えタンパク質を指示試薬の一部として使用して、その後それを検出する。同様に、固相上の組換え抗原と指示相中の合成ペプチドの組合せも可能である。捕捉抗原としての、第一ソースから生成される又は誘導される多量体ポリペプチド複合体に特異的な抗原、及び異なる第二ソースからの多量体ポリペプチド複合体に特異的な抗原を使用するアッセイ様式も想定される。従って、組換え抗原の様々な組合せ、ならびに合成ペプチド、精製タンパク質等の使用は、本発明の範囲内である。これらやその他のアッセイが、本発明者らが権利を共有し、参照してここに組み込まれる、米国特許第５，２５４，４５８号に述べられている。
様々な他の固相を使用する他の実施形態も想定され、本発明の範囲内である。例えば、負に荷電したポリマーで固定可能な反応複合体を固定するためのイオン捕捉手順（欧州特許公開公報第０３２６１００号及び同第０４０６４７３号に述べられている）は、高速溶液相免疫化学反応（ｆａｓｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ−ｐｈａｓｅ ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実施するために本発明に従って使用できる。負に荷電したポリアニオン／免疫複合体と、あらかじめ処理しておいた負に荷電した多孔性基質の間のイオン性相互作用によって、固定可能な免疫複合体を反応混合物の残りの部分から分離し、欧州特許公開公報第０２７３，１１５号の中の化学発光シグナル測定に述べられているものを含む、これまでに記述されている様々なシグナル生成系を用いることによって検出する。
また、本発明の方法は、固相がミクロ粒子（磁性又は非磁性）を含む、自動及び半自動システムを含むミクロ粒子テクノロジーを利用したシステムにおける使用に適応させうる。そのようなシステムは、例えば、それぞれ公開ＥＰＯ特許願第ＥＰ０４２５６３３号及びＥＰ０４２４６３４号に述べられているものを含む。
免疫測定法のための走査型プローブ顕微鏡検査（ＳＰＭ）の使用も、本発明のモノクローナル抗体を容易に適応させうるテクノロジーである。走査型プローブ顕微鏡検査、特に原子間力顕微鏡検査では、捕捉相、例えば本発明のモノクローナル抗体の少なくとも１つを固相に接着させ、走査型プローブ顕微鏡を使用して、固相の表面上に存在しうる抗原／抗体複合体を検出する。走査型トンネル顕微鏡検査の使用は、通常、抗原／抗体複合体を検出するために多くの免疫検定システムにおいて使用しなければならない標識の必要性を排除する。特異的結合反応を追跡するためのＳＰＭの使用は、多くの方法で実施できる。１つの実施形態では、特異的結合パートナー（本発明のモノクローナル抗体である、分析物特異的物質）の１つの成員を走査に適した表面に結合させる。分析物特異的物質の結合は、当業者に既知の方法に従った、プラスチック又は金属表面の固相を含む試験片への吸着によってでありうる。又は、誘導体化プラスチック、金属、ケイ素又はガラスの固相を含む試験片への特異的結合パートナー（分析物特異的物質）の共有結合を使用してもよい。共有結合法は当業者に既知であり、特異的結合パートナーを試験片に不可逆的に連結するための様々な手段を含む。試験片がケイ素又はガラスである場合は、特異的結合パートナーを結合する前にその表面を活性化しなければならない。また、高分子電解質相互作用を使用して、手法及び化学を利用することにより、特異的結合パートナーを試験片の表面に固定してもよい。好ましい結合方法は共有結合手段によるものである。特異的結合パートナーの結合後、非特異的結合を最小限に抑えるために、その表面を血清、タンパク質又は他の遮断物質などの物質でさらに処理してもよい。その表面はまた、アッセイ目的に対するその適合性を確認するために製造場所で又は使用の時点で走査してもよい。走査過程は試験片の特異的結合特性を変化させないと考えられる。
本発明は固相の使用が好ましいことを開示しているが、本発明の抗体、タンパク質及びペプチドなどの試薬は非固相アッセイ系においても使用できると想定される。これらのアッセイ系は当業者に既知であり、本発明の範囲内であるとみなされる。
アッセイのために用いる試薬は、バイアル又はビンなどの１又はそれ以上の容器と共に試験キットの形態で提供することができ、各々の容器は、アッセイで使用されるプローブ、プライマー、モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体のカクテル、又はポリペプチド（例えば組換え又は合成によって生産されたか又は精製された）などの別々の試薬を含むことが想定される。そのポリペプチドは、ＢＵ１０１（配列番号６）、マンマグロビン（配列番号５）、α’ポリペプチド、β’ポリペプチド、及びそのフラグメントから成る群より選択される。当業者に既知である、緩衝液、対照等のような他の成分が、そのような試験キットの中に含まれていてもよい。また、アクセス可能な体液又は廃棄物、例えば血液、尿、唾液及び糞便を含む被験試料を採集するための手段を有する試験キットを提供することも想定される。採集のために有用なそのようなツール（「採集用具」）は、血液を採集して安定化するためのランセット及び吸収紙又は吸収布；唾液を採集して安定化するための綿棒；尿又は糞便試料採集して安定化するためのコップを含む。採集用具である紙、布、綿棒、コップ等は、試料の変性又は不可逆的吸着を避けるために場合により処理してもよい。これらの採集用具はまた、標本の完全性を維持するのを助けるために防腐剤、安定剤又は抗菌剤で処理してもよく又はこれらを含んでもよい。手術又は針生検によって得られた試験標本の採集、安定化及び保存用に設計された試験キットも有用である。すべてのキットは、別々に提供することができる２つの成分の形状を取りうることが想定される。１つの成分は標本の採集及び輸送用であり、他の成分は標本の分析用である。採集成分は、例えば、オープン市場ユーザーに対して提供することができ、分析用成分は、分析物の存在、不在又は量の測定のために検査室スタッフなどの他者に提供することができる。さらに、試験標本の採集、安定化及び保存のためのキットは、初心者による使用のための形状でありえ、また、家庭で使用して、その後被験試料の分析のために検査室へ輸送されるようにオープン市場で入手されうる。
インビボでの抗体の使用
本発明の抗体はインビボで使用することができる。すなわち、それらは、診断又は治療用途のために乳房の疾患を有する又は有することが疑われる患者に注入することができる。インビボ診断のための抗体の使用はこの技術分野において周知である。Ｓｕｍｅｒｄｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ １７：２４７−２５４（１９９０）は、インジウム−１１１を標識として使用する、腫瘍を発現する癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の放射線免疫シンチフォトグラフィー画像化のための最適化抗体−キレート化剤を記述している。Ｇｒｉｆｆｉｎら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃ ９：６３１−６４０（１９９１）は、再発性結腸直腸癌を有することが疑われる患者において癌を検出する場合のこの物質の使用を記述している。磁気共鳴画像のための、常磁性イオンを標識とする同様の物質の使用は、この技術分野において既知である（Ｒ．Ｂ．Ｌａｕｆｆｅｒ，Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２２：３３９−３４２（１９９１））。多量体ポリペプチド抗原に対して産生される抗体は、乳癌などの乳房の疾患を有することが疑われる患者に、患者の疾患の状態を診断する又は病期分類することを目的として注入できることが想定される。使用する標識は、選択する画像化様式に依存する。インジウム−１１１、テクネチウム−９９ｍ又はヨウ素−１３１などの放射性標識は、プレーナースキャン（ｐｌａｎａｒ ｓｃａｎ）又はシングルフォトンエミッション断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）のために使用できる。フッ素−１９などの陽電子放射標識も、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）のために使用できる。ＭＲＩのためには、ガドリニウム（ＩＩＩ）又はマンガン（ＩＩ）などの常磁性イオンが使用できる。乳房内又は乳房の外部における標識の局在は、疾患の拡大の測定を可能にしうる。乳房内の標識の量は、乳癌の存在又は不在の判定を可能にしうる。
乳房の疾患を有することがわかっている患者については、多量体ポリペプチド抗原に対する抗体の注入は治療上の利益を有すると考えられる。前記抗体は、組織又は器官上に若しくは組織又は器官内で発現される多量体ポリペプチド抗原に結合することにより、結合物質を使用せずにその作用を及ぼしうる。代替的に、前記抗体は、その治療効果を増強するために薬剤、毒素又は放射性核種などの細胞傷害性物質に複合しうる。ＧａｒｎｅｔｔとＢａｌｄｗｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４６：２４０７−２４１２（１９８６）は、薬剤−モノクローナル抗体コンジュゲートの作製を記述した。Ｐａｓｔａｎら、Ｃｅｌｌ ４７：６４１−６４８（１９８６）は、様々な癌の治療のための、モノクローナル抗体に複合した毒素の使用を検討した。ＧｏｏｄｗｉｎとＭｅａｒｅｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ８０：２６７５−２６８０（１９９７）は、正常組織への毒性を制限しながら腫瘍に対する用量を最大化するための様々な戦略におけるイットリウム−９０標識モノクローナル抗体の使用を記述している。他の既知の細胞傷害性放射性核種は、銅−６７、ヨウ素−１３１、及びレニウム−１８６を含み、それらのすべてが、乳癌の治療のための多量体ポリペプチド抗原に対するモノクローナル抗体を標識するために使用できる。
以下では本発明を実施例によって説明するが、それらは本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を限定することを意図しない。
（実施例）
乳房組織ライブラリーのマンマグロビン及びＢＵ１０１遺伝子特異的クローンの特定
発現配列タグ（ＥＳＴ）又は転写産物像のライブラリー比較。ｃＤＮＡクローンインサートの部分配列、いわゆる「発現配列タグ」（ＥＳＴ）を、乳癌組織、乳房非腫瘍組織、及び腫瘍及び非腫瘍の多数の他の組織から作製したｃＤＮＡから誘導し、遺伝子転写産物像としてデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱ（商標）データベース、Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａｌｏ，Ａｌｔｏ，ＣＡより入手可能）に登録した。国際特許公開公報第ＷＯ９５／２０６８１号参照。（転写産物像は、所与の組織ライブラリーの中に表示される遺伝子の各々についてのＥＳＴの数のリストである。ＥＳＴの相互配列重複の共有領域はクラスターに分類される。クラスターには、代表的５’ＥＳＴからのクローン番号が割り当てられる。しばしば、対象クラスターは、そのコンセンサス配列を自動クラスター化の判定基準に合致しなかった他のＥＳＴの配列と比較することによって延長できる。すべての使用可能なクラスターと１個のＥＳＴの整列は、そこからコンセンサス配列が導かれるコンティグを表わす。）次に転写産物像を、主として乳房組織ライブラリーを代表するＥＳＴ配列を特定するために評価した。これらの標的クローンを、標的ライブラリーにおけるそれらの存在率（発生率）及びバックグラウンドライブラリーにおけるそれらに不在率に従って等級付けた。低いバックグラウンド発生率とより高い存在率を有するクローンには、より高い試験優先権が与えられた。
マンマグロビン（配列番号１）のコンセンサス配列に対応するＥＳＴは、乳房組織ライブラリーの５６．４％（３９のうち２２）において認められた。配列番号１又はそのフラグメントに対応するＥＳＴは、データベースの他の非乳房ライブラリーの０．９％（７５４のうち７）においてのみ認められた。それ故、配列番号１又はそのフラグメントに対応するＥＳＴは、乳房組織では非乳房組織よりも６０倍以上高い頻度で認められた。
１９９７年８月１５日出願の米国特許一部継続出願通し番号第０８／９１２，１４９号のために放棄された、１９９６年８月１９日出願の米国特許願通し番号第０８／６９７，１０６号は、参照してここに組み込まれる。米国特許一部継続出願通し番号第０８／９１２，１４９号は、マンマグロビンと命名され、乳房組織から転写された、隣接する部分重複ｃＤＮＡ配列及びそれによってコードされるポリペプチドのセットを示しており、それらは、乳癌などの乳房の疾患及び状態を検出する、診断する、病期分類する、監視する、予後を判定する、予防する又は治療する、若しくは個体の素因を判定するために有用である。
同様に、ＢＵ１０１（配列番号２）のコンセンサス配列に対応するＥＳＴは、乳房組織ライブラリーの２５．６％（３９のうち１０）において認められた。配列番号２又はそのフラグメント又は相補物に対応するＥＳＴは、データベースの他の非乳房ライブラリーの１．１％（７５４のうち８）においてのみ認められた。それ故、配列番号２又はそのフラグメント又は相補物に対応するＥＳＴは、乳房組織では非乳房組織よりも２４倍以上高い頻度で認められた。
１９９７年８月１５日出願の米国特許一部継続出願通し番号第０８／９１２，２７６号のために放棄された、１９９６年８月１９日出願の米国特許願通し番号第０８／６９７，１０５号も、参照してここに組み込まれる。米国特許一部継続出願通し番号第０８／９１２，２７６号は、ＢＵ１０１と命名され、乳房組織から転写された、隣接する部分重複ｃＤＮＡ配列及びそれによってコードされるポリペプチドのセットを示しており、それらは、乳癌などの乳房の疾患及び状態を検出する、診断する、病期分類する、監視する、予後を判定する、予防する又は治療する、若しくは個体の素因を判定するために有用である。
マンマグロビン（配列番号１）及びＢＵ１０１（配列番号２）遺伝子を含むＥＳＴのライブラリーを特定する電子ノーザンブロットを比較したとき、マンマグロビン（配列番号１）とＢＵ１０１（配列番号２）は独立して発現される遺伝子であると思われた（図１−２）。電子ノーザンブロットは、一部のライブラリーはマンマグロビン（配列番号１）ＥＳＴを含むがＢＵ１０１（配列番号２）ＥＳＴを含まず、また別のライブラリーはＢＵ１０１（配列番号２）ＥＳＴを含むがマンマグロビン（配列番号１）ＥＳＴを含まないことを明らかにした。
ＬｉｆｅＳｅｑデータベースで検討したときマンマグロビン（配列番号１）とＢＵ１０１（配列番号２）のｍＲＮＡ発現には相関がなかったのに対し、我々は、リボヌクレアーゼ保護アッセイ（図３）において測定したとき、それらの発現の間に密接な相関を認めた。
ＬＩＦＥＳＥＱ（商標）データベースの解析は、ＢＵ１０１ヌクレオチド配列（配列番号２）の２５４番の位置にＴ／Ｃ多型の可能性を示唆する。データベースでは、Ｃヌクレオチド変異体（配列番号２におけるような）の３３件の発生とＴヌクレオチド変異体の８件の発生が存在した。該ポリペプチドのその位置で、Ｃヌクレオチド変異体はプロリン残基（ＣＣＧ）をコードし、Ｔヌクレオチド変異体（ＣＴＧ）は ロイシン残基をコードする。
多量体ポリペプチド複合体に対する抗体の作製
Ａ．ポリクローナル抗血清の生産
１．多量体ポリペプチド複合体を免疫原として使用する動物免疫。体重２ｋｇ以上の雌性白色ニュージーランドウサギを、ポリクローナル抗血清を惹起するために使用した。初回免疫の１週間前に動物から血液５ｍｌから１０ｍｌを採取して、非免疫採血前試料として使用した。
精製組換え多量体ポリペプチド複合体（実施例７に従って生成した）を使用して、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２ｍｇ／ｍｌの濃度のこの蛋白質複合体０．５ｍｌを完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）０．５ｍｌで乳化することによって一次免疫原を調製する。その免疫原を皮下、腹腔内及び／又は筋肉内投与経路で動物のいくつかの部位に注射する。一次免疫の４週間後に、ブースター免疫投与を実施する。ブースター免疫投与に使用する免疫原は、一次免疫原に使用したのと同じポリペプチドを今度は不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）０．５ｍｌで１ｍｇ／ｍｌに希釈することを除いて、そのポリペプチド０．５ｍｌを乳化することによって調製する。やはり、ブースター用量をいくつかの部位に投与し、皮下、腹腔内及び／又は筋肉内タイプの注射が使用できる。ブースター免疫の２週間後に動物から採血し（５ｍｌ）、その血清を、下記で述べるように、該多量体ポリペプチド複合体に対する免疫反応性に関して試験する。適切な力価が得られるまで、ブースターと採血スケジュールを４週間の間隔で反復する。抗血清の力価及び濃度は実施例３で述べるマイクロタイターＥＩＡによって測定する。１：５００の抗体力価をその後の使用及び試験に適切な力価とみなす。
２．ペプチドを免疫原として使用する動物免疫。この多量体ポリペプチド複合体の、ＢＵ１０１及びマンマグロビンを含む個々のポリペプチド鎖に対する抗体の作製を述べた、１９９７年８月１５日出願の米国特許願通し番号第０８／９１２，２７６号のために放棄された、１９９６年８月１９日出願の米国特許願通し番号第０８／６９７，１０６号、及び１９９７年８月１５日出願の米国特許願通し番号第０８／９１２，１４９号のために放棄された、１９９６年８月１９日出願の米国特許願通し番号第０８／６９７，１０６号は、参照してここに組み込まれる。
Ｂ．モノクローナル抗体の作製
１．多量体ポリペプチド複合体を免疫原として使用する免疫プロトコール。マウスにおけるモノクローナル抗体産生のための多量体ポリペプチド複合体の量が、ウサギにおいてポリクローナル抗血清を生産するために使用する量の１０分の１であることを除いて、実施例７で述べるように調製した免疫原を用いてマウスを免疫する。従って、一次免疫原は、ＣＦＡ乳液０．１ｍｌ中の多量体ポリペプチド複合体１００μｇから成る。ブースター免疫に使用する免疫原は、ＩＦＡ０．１ｍｌ中の多量体ポリペプチド複合体５０μｇから成る。モノクローナル抗体の作製のためのハイブリドーマを生成し、標準手法を用いてスクリーニングする。モノクローナル抗体産生のために使用する方法は、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９４（１９７５）において詳述され、Ｊ．Ｇ．Ｒ．Ｈｕｒｒｅｌ編集、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８２）に総説されているような、この技術分野で既知の手順に従う。ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法に基づくモノクローナル抗体産生のもう１つの方法は、参照してここに組み込まれる、Ｌ．Ｔ．Ｍｉｍｍｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：６０４−６１９（１９９０）の方法である。
免疫プログラム（マウス当り）は、一次免疫と追加ブースター免疫から成る。一次免疫のために使用する一次免疫原は、あらかじめＣＦＡ５０μｇ中で乳化したＰＢＳ（ｐＨ７．２）５０μｌ中の多量体ポリペプチド複合体１００μｇから成る。一次免疫後約２週間目と４週間目に実施するブースター免疫は、ＩＦＡ５０μｇで乳化したＰＢＳ（ｐＨ７．２）５０μｌ中の多量体ポリペプチド複合体５０μｇから成る。合計１００μｌのこの免疫原を腹腔内及び皮下経路で各々のマウスに接種する。個々のマウスを、第３回免疫から約４週間後に、実施例３で述べるようなマイクロタイタープレート酵素免疫測定法（ＥＩＡ）によって免疫応答に関してスクリーニングする。第３回免疫から約１５週間後に、静脈内、脾臓内又は腹腔内経路でＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の多量体ポリペプチド複合体５０μｇをマウスに接種する。
この静脈内ブースターの３日後に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法を用いて脾細胞を、例えばＳｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ）と融合する。その融合物を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）プラス１％ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ）を含む、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アルギニン、葉酸を添加した改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養する。バルク培養物を、実施例３のプロトコールに従ってマイクロタイタープレートＥＩＡによってスクリーニングする。免疫原として使用した多量体ポリペプチド複合体と反応性であって、他の無関係なタンパク質と非反応性であるクローンを最終的拡大増殖のために選択する。そのようにして選択したクローンを拡大増殖させ、アリコートに分けて、１０％ＦＣＳ及び１０％ジメチルスルホキシドを含むＤＭＥＭ中で冷凍する。
２．ペプチドを免疫原として使用する免疫プロトコール。先に、１９９７年８月１５日出願の米国特許願通し番号第０８／９１２，２７６号のために放棄された、１９９６年８月１９日出願の米国特許願通し番号第０８／６９７，１０５号、及び１９９７年８月１５日出願の米国特許願通し番号第０８／９１２，１４９号のために放棄された、１９９６年８月１９日出願の米国特許願通し番号第０８／６９７，１０６号の中で記述されているように作製したペプチド／担体免疫原（すなわち担体タンパク質に複合したペプチド）を用いてマウスを免疫した。マウスにおけるモノクローナル抗体生産のために使用したペプチド／担体タンパク質免疫原の量は、ウサギにおいてポリクローナル抗血清を生産するために使用した量の約１０分の１であった。従って、一次免疫原は、ＣＦＡ乳液０．１ｍｌ中の担体タンパク質に複合したペプチド１００μｇから成った。ブースター免疫に使用した免疫原は、ＩＦＡ０．１ｍｌ中のペプチド／担体タンパク質５０μｇから成った。モノクローナル抗体の作製のためのハイブリドーマを生成し、標準手法を用いてスクリーニングした。モノクローナル抗体産生のために使用する方法は、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９４（１９７５）において詳述され、Ｊ．Ｇ．Ｒ．Ｈｕｒｒｅｌ編集、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８２）に総説されているような、この技術分野で既知の手順に従った。ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法に基づくモノクローナル抗体産生のもう１つの方法は、参照してここに組み込まれる、Ｌ．Ｔ．Ｍｉｍｍｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：６０４−６１９（１９９０）の方法である。
免疫プログラム（マウス当り）は、一次免疫と追加ブースター免疫から成った。一次免疫のために使用した一次免疫原は、あらかじめＣＦＡ５０μｇ中で乳化したＰＢＳ（ｐＨ７．２）５０μｌ中のペプチド／担体タンパク質複合体１００μｇから成った。一次免疫後約２週間目と４週間目に実施したブースター免疫は、ＩＦＡ５０μｇで乳化したＰＢＳ（ｐＨ７．２）５０μｌ中のペプチド／担体タンパク質複合体５０μｇから成った。合計１００μｌのこの免疫原を腹腔内経路で各々のマウスに接種した。個々のマウスを、第３回免疫から約４週間後に、実施例３で述べるようなマイクロタイタープレート酵素免疫測定法（ＥＩＡ）によって免疫応答に関してスクリーニングした。第３回免疫から約１５週間後に、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中のペプチド／担体タンパク質複合体２５μｇを静脈内経路でマウスに接種した。
この静脈内ブースターの３日後に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法を用いて脾細胞をＳｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ）と融合した。その融合物を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）プラス１％ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ）を含む、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アルギニン、葉酸を添加した改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。バルク培養物を、実施例３のプロトコールに従ってマイクロタイタープレートＥＩＡによってスクリーニングした。多量体ポリペプチド複合体及び免疫原として使用したペプチドと反応性であって、他の無関係なタンパク質と非反応性であるクローンを最終的拡大増殖のために選択した。最終拡大増殖からの上清を採集し、さらなる特性付けのために使用した。拡大増殖からのハイブリドーマ細胞を採集し、アリコートに分けて、保存のために１０％ＦＣＳ及び１０％ジメチルスルホキシドを含むＤＭＥＭ中で冷凍した。
３．モノクローナル抗体を含む腹水の生産。上述したように調製した凍結ハイブリドーマ細胞を解凍し、拡大増殖培養に入れた。生育可能なハイブリドーマ細胞を腹腔内経路でプリスタン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）処置マウスに接種した。マウスから腹水を採取し、プールして、０．２μフィルターを通してろ過して、精製に必要なプロテインＡカラムの容量を決定するために免疫グロブリンクラスＧ（ＩｇＧ）分析に供した。
４．腹水又は細胞培養上清からのモノクローナル抗体の精製。プロテインＡ、プロテインＧ及びプロテインＬカラムクロマトグラフィー又は沈殿法を含む様々な方法を用いてモノクローナル抗体を腹水又は細胞培養上清から精製することができる。Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ（Ｇ）ＩｇＧ精製キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してモノクローナル抗体Ｈ８５Ｃ２１を精製した。ＩｇＧ ２９μｇ／ｍＬを含むＨ８５Ｃ２１培養上清４７ｍＬを結合緩衝液（０．０２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）（Ｐｉｅｒｃｅ）１００ｍＬと混合した。この混合物１４５ｍＬを、緩衝液で平衡させたプロテインＧカラムに通した。次にカラムを溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．７）（Ｐｉｅｒｃｅ）で溶出した。中和のために１Ｍ重炭酸ナトリウム１μＭが入った試験管に１ｍＬの分画を収集した。分画を２８０ｎｍの吸光度で検査した。適切な分画をプールし、２℃から８℃で一晩、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に対して透析した。２８０ｎｍの吸光度は、ＩｇＧ１．５１ｍｇがプロテインＧカラムから回収されたことを示唆した。このようにして作製し、特性付けた精製モノクローナル抗体を、長期保存のために−８０℃に保持した。
５．モノクローナル抗体のさらなる特性付け。上述したように作製したモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブタイプを、ＥＩＡマイクロタイタープレートアッセイを用いて決定した。簡単に述べると、ペプチド免疫原を５０ｍＭカーボネート、ｐＨ９．６中１ｍｇ／ｍＬで調製し、１００μｌをＩｍｍｕｌｏｎ ２（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇマイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）の各々のウエルに入れた。プレートを室温で１４時間から１８時間インキュベートし、その後脱イオン水で４回洗った。Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）２００μｌを各々のウエルに加えてウエルを遮断し、室温で３０分間インキュベートした後、溶液を廃棄した。上述したような、免疫ウサギ及びマウスから得た抗血清を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（モノラウリン酸ポリオキシエチレンエーテル）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中のタンパク質遮断剤（すなわち３％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液）に希釈し、被覆したマイクロタイタープレートの各ウエルに入れた。次にそれらのウエルを室温で１時間インキュベートした。各々のウエルを脱イオン水で４回洗った。３％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液に１：２０００希釈した、アルカリホスファターゼ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、又はＩｇＧ１、又はＩｇＧ２ａ、又はＩｇＧ２ｂ、又はＩｇＧ３（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）１００μｌを各々のウエルに加えた。ウエルを室温で１時間インキュベートした。次に、各々のウエルを脱イオン水で４回洗った。その後パラニトロフェニルリン酸塩基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）１００μｌを各々のウエルに加えた。ウエルを室温で３０分間インキュベートした。４０５ｎｍの吸光度を各ウエルで読み取った。アイソタイプ試験の結果を表１に示す。
モノクローナル抗体のアリコートを２℃から８℃で継続保存して、所与の期間を通じて光学密度（ＯＤ）の読取りを検定することにより、モノクローナル抗体に関する安定性試験も実施することができる。
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酵素免疫測定法
Ａ．マイクロタイタープレート直接検出ＥＩＡ
組換えポリペプチド複合体（本出願の実施例７又は１９９８年１２月１８日出願の米国特許願通し番号第０９／２１５，８１８号（参照してここに組み込まれる）の実施例２に従って生成される）ポリクローナル及び／又はモノクローナル抗血清（ＢＵ１０１又はマンマグロビンのいずれかに対する）の免疫反応性をマイクロタイタープレートＥＩＡによって測定した。
抗体力価の測定のために、プールして透析した組換えポリペプチド複合体を、５０ｍＭカーボネート緩衝液、ｐＨ９．６中２μｇ／ｍＬで調製し、１００μｌをＩｍｍｕｌｏｎ ２（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇマイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）の各々のウエルに入れた。比較のために、完全長ＢＵ１０１ポリペプチド（配列番号６）及び一過性にトランスフェクトしたマンマグロビンＭ／Ｈ（下記の実施例７Ｃで述べるように）を同様に調製した。プレートを室温で１４時間から１８時間インキュベートし、その後脱イオン水で４回洗った。Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）２００μｌを各々のウエルに加えてウエルを遮断し、プレートを室温で３０分間インキュベートした後、溶液を廃棄した。実施例２で上述したような、免疫ウサギ及びマウスから得た抗血清を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（モノラウリン酸ポリオキシエチレンエーテル）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中のタンパク質遮断剤（すなわち３％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液）に１：１０、１：１００、１：１０００、１：１００００、１：１０００００で希釈し、被覆したマイクロタイタープレートの各ウエルに入れた。次にそれらのウエルを室温で１時間インキュベートした。各々のウエルを脱イオン水で４回洗った。３％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液に１：２０００希釈した、アルカリホスファターゼ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）１００μｌを各々のウエルに加えた。ウエルを室温で１時間インキュベートした。次に、各々のウエルを脱イオン水で４回洗った。その後パラニトロフェニルリン酸塩基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）１００μｌを各々のウエルに加えた。ウエルを室温で３０分間インキュベートした。４０５ｎｍの吸光度を各ウエルで読み取った。力価は、４０５ｎｍで０．５単位の吸光度を生じる抗体の希釈として表わした。
力価に加えて、見かけ親和性［Ｋｄ（ａｐｐ）］も、抗ペプチド抗血清の一部に関して測定した。この場合は、プールして透析した組換えポリペプチド複合体を、ＰＢＳ中１：３、１：９、１：２７、１：８１、１：２４３、１：７２９、１：２１８７、１：６５６１、及び１：１９６８３の希釈で調製し、１００μｌをＩｍｍｕｌｏｎ ２（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇマイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）の各々のウエルに入れた。比較のために、完全長ＢＵ１０１ポリペプチド（配列番号６）及び一過性にトランスフェクトしたマンマグロビンＭ／Ｈ（下記の実施例７Ｃで述べるように）を同様に調製した。プレートを室温で１４時間から１８時間インキュベートし、その後脱イオン水で４回洗った。Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）２００μｌを各々のウエルに加えてウエルを遮断し、プレートを室温で３０分間インキュベートした後、溶液を廃棄した。実施例２で上述したような、免疫ウサギ及びマウスから得た抗血清を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（モノラウリン酸ポリオキシエチレンエーテル）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中のタンパク質遮断剤（すなわち３％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液）に適切な希釈率で希釈し、被覆したマイクロタイタープレートの各ウエルに入れた。次にそれらのウエルを室温で１時間インキュベートした。各々のウエルを脱イオン水で４回洗った。３％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液に１：２０００希釈した、アルカリホスファターゼ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）１００μｌを各々のウエルに加えた。ウエルを室温で１時間インキュベートした。次に、各々のウエルを脱イオン水で４回洗った。その後パラニトロフェニルリン酸塩基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）１００μｌを各々のウエルに加えた。ウエルを室温で３０分間インキュベートした。４０５ｎｍの吸光度を各ウエルで読み取った。ＥＩＡマイクロタイタープレートアッセイの結果を使用して、ミカエリス−メンテン式の類似型（Ｖ．Ｖａｎ Ｈｅｙｎｉｎｇｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１２１巻，ｐ．４７２（１９８６）及びさらにＸ．Ｑｉｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第１５６巻，ｐ．３３５０（１９９６）に述べられている）：
Figure 2005524053
 ［式中、［Ａｇ−Ａｂ］は抗原−抗体複合体濃度であり、［Ａｇ−Ａｂ］ｍａｘは最大複合体濃度であり、［Ａｂ］は抗体濃度であり、及びＫｄは解離定数であった］
に基づいて見掛け解離定数［Ｋｄ（ａｐｐ）］を導いた。曲線への適合の間、［Ａｇ−Ａｂ］を、所与の濃度のＡｂでＯＤ４０５ｎｍのバックグラウンド控除値に置き換えた。Ｋｄ（ａｐｐ）に対応するＫｄ、及び［Ａｇ−Ａｂ］ｍａｘに対応する［ＯＤ４０５ｎｍ］ｍａｘの両方を、適合パラメータとして処理した。ソフトウエアプログラムＯｒｉｇｉｎを曲線への適合のために使用した。図１は、多量体ポリペプチド複合体を認識したモノクローナル抗体の３つの結合曲線を示す。Ｋｄ（ａｐｐ）値は、この複合体に対するモノクローナル抗体の相対的親和性の測定である。表２においてＫｄ（ａｐｐ）値をモノクローナル抗体の各々について列記する。
Figure 2005524053
Figure 2005524053
Ｂ．マイクロタイタープレートサンドイッチＥＩＡ
簡単に述べると、多量体ポリペプチド抗原を含むことが疑われる試料を、抗原／抗体複合体を形成するために、抗ＢＵ１０１、抗マンマグロビン、抗α’ポリペプチド、抗β’ポリペプチド、又は抗多量体ポリペプチドの抗体で被覆したマイクロタイターウエルの何らかの組合せの存在下でインキュベートする。次にマイクロタイターウエルを洗い、シグナル生成化合物（すなわちアルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素）に複合した抗体を含む指示試薬をマイクロタイターウエル上の抗原／抗体複合体に加えて、インキュベートする。マイクロタイターウエルを洗い、シグナル生成化合物と反応して測定可能なシグナルを生じる基質（例えば、それぞれ４−メチルウンベリフェリルリン酸塩（ＭＵＰ）又はＯＰＤ／ペプチドルオキシド）を加えることによって結合抗体／抗原／抗体複合体を検出する。陰性対照によって生じるシグナルと比較して、被験試料中の高いシグナルは、多量体ポリペプチド抗原の存在を検出する。被験試料における多量体ポリペプチド抗原の存在は、乳癌などの乳房の疾患又は状態の診断の指標である。
同様に、多量体ポリペプチド抗原を含むことが疑われる試料を、抗原／ステロイド複合体を形成するために次のステロイド（プロゲステロン、アルドステロン、アンドロステンジオン、コルチコステロン、コルチゾール、デヒドロエピアンドロステロン、ジヒドロテストステロン、エストラジオール、エストリオール、エストロン、ヒドロキシプロゲステロン、及びテストステロン）の１つ又はそれ以上で被覆したマイクロタイターウエルの存在下でインキュベートする。次にそのマイクロタイターウエルを洗い、シグナル生成化合物に複合した抗体又はステロイドのいずれかを含む指示試薬をマイクロタイターウエル上のステロイド／抗原複合体に加えて、インキュベートする。マイクロタイターウエルを洗い、シグナル生成化合物と反応して測定可能なシグナルを生じる基質を加えることにより、結合ステロイド／抗原／指示試薬複合体を検出する。陰性対照によって生じるシグナルと比較して、被験試料中の高いシグナルは、多量体ポリペプチド抗原の存在を検出する。被験試料における多量体ポリペプチド抗原の存在は、乳癌などの乳房の疾患又は状態の診断の指標である。
Ｃ．マイクロタイタープレート競合ＥＩＡ
競合結合アッセイは、標識ポリペプチド又はタンパク質複合体を抗ポリペプチド抗体で被覆したマイクロタイターウエルと接触させたとき測定可能なシグナルを生じる、標識ポリペプチド又はタンパク質複合体を使用する。その標識ポリペプチドを、多量体ポリペプチド抗原を含むことが疑われる被験試料の存在下に、多量体ポリペプチド抗体で被覆したマイクロタイターウエルに加えて、標識ペプチド（又は標識タンパク質）結合抗体複合体及び／又は患者抗原結合抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でインキュベートする。被験試料中の多量体ポリペプチド抗原は、マイクロタイターウエル上の結合部位に関して標識ポリペプチド（又はタンパク質）と競合する。被験試料中の抗原とペプチド又はタンパク質が抗体結合部位に関して競合するので、アッセイにおいて、被験試料中の多量体ポリペプチド抗原は、抗体被覆したマイクロタイターウエルへの標識ペプチドの結合低下を生じさせる。低いシグナル（対照と比較して）は、被験試料における多量体ポリペプチド抗原の存在を指示する。多量体ポリペプチド抗原の存在は、乳癌などの乳房の疾患又は状態の診断を示唆する。
同様に、競合結合アッセイは、標識ポリペプチド又はタンパク質複合体を、ステロイドを提示するマイクロタイターウエルと接触させたとき測定可能なシグナルを生じる、標識ポリペプチド又はタンパク質複合体を使用する。その標識ポリペプチドを、多量体ポリペプチド抗原を含むことが疑われる被験試料の存在下に、ステロイド被覆したマイクロタイターウエルに加えて、標識ペプチド（又は標識タンパク質）結合ステロイド複合体及び／又は患者抗原結合ステロイド複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でインキュベートする。被験試料中の多量体ポリペプチド抗原は、マイクロタイターウエル上の結合部位に関して標識ポリペプチド（又はタンパク質）と競合する。被験試料中の抗原とペプチド又はタンパク質がステロイド結合部位に関して競合するので、アッセイにおいて、被験試料中の多量体ポリペプチド抗原は、ステロイド被覆したマイクロタイターウエルへの標識ペプチドの結合低下を生じさせる。低いシグナル（対照と比較して）は、被験試料における多量体ポリペプチド抗原の存在を指示する。多量体ポリペプチド抗原の存在は、乳癌などの乳房の疾患又は状態の診断を示唆する。
ここで提供し、論じる多量体ポリペプチド複合体は、乳房組織疾患、特に乳癌のマーカーとして有用である。組織、血液、血漿又は血清などの被験試料におけるこのマーカーの出現に基づく試験は、医師が癌の診断を行うのを助けるため、治療プロトコールを選択するのを助けるため、又は選択した治療の成功を追跡するために、低コストで非侵襲性の診断情報を提供することができる。このマーカーは、免疫学的方法によって検出しうる、疾患組織から誘導される抗原として、血液、尿又は糞便などの容易にアクセス可能な体液中に出現しうる。このマーカーは、疾患状態で上昇する、疾患状態で変化する、又は不適切な身体画分に出現する乳房の正常タンパク質であると考えられる。
多量体ポリペプチド複合体の免疫沈降法
実施例２で上述したようにして得られる免疫血清を使用して、組織、血液、血清又は他の体液から調製した溶液から多量体ポリペプチド複合体を免疫沈降させる。組織標本については、組織試料を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５％（ｗ／ｖ）グリセロール、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍｌロイペプチン及び１．０ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド中で均質化することによってタンパク質抽出物を調製する［Ｋａｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７：９８２（１９９４）］。均質化後、ホモジネートを４℃、２０００×ｇで５分間遠心分離して、デブリから上清を分離する。上記と同様であるが、０．１Ｍトリシン及び０．１％ＳＤＳも同時に含む緩衝液で均質化することによってデブリを再抽出する。血清標本は直接使用することができる。他の体液は、免疫沈降法の前に調製が必要であると考えられる。
試料（１０μｌから２００μｌ）をエッペンドルフ試験管に入れて、抗原（存在する場合は）を抗体に結合することによって免疫沈降法を開始する。希釈緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．０２５％アジ化ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミン）で容量を２００μｌにする。ポリクローナル血清（０．５μｌから５μｌ）、ハイブリドーマ培養上清（１０μｌから１００μｌ）、又は腹水（０．１μｌから１μｌ）を加える。室温で１時間半から６時間静かに混合する。５０％プロテインＡセファローススラリー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）２０μｌから４０μｌを加えて免疫複合体を沈降させる。１時間半から１６時間静かに混合する。２００×ｇで１分間遠心分離する。上清を慎重に除去して、ペレットをとっておく。ペレットを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％アジ化ナトリウム１ｍＬ、次いで５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８ １ｍＬで洗う。再び、上清を慎重に除去して、ペレットをとっておく。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、２％β−メルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノールブルー）２０μｌから５０μｌを洗浄したプロテインＡセファロースビーズに加えることによって免疫複合体を解離させる。ふたをして、試料を１００℃で５分間加熱する。微量遠心機にかけてセファロースをペレット化する。上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに適用し、実施例７で述べるように電気泳動を実施する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、タンパク質染色、免疫ブロット法、及び／又はＸ線撮影法によって抗原を検出することができる。
ポリペプチドに特異的に結合する血清抗体の精製
実施例２で上述したようにして得た免疫血清を、実施例７に従って調製する固定化組換えポリペプチド複合体を用いてアフィニティー精製する。希釈した粗抗血清をプロテインＡカラム（Ａｆｆｉ−ＧｅｌプロテインＡ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に通すことによって抗血清のＩｇＧ分画を得る。緩衝液（Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ，製造者から供給される）で溶出して、免疫グロブリンでない実質的にすべてのタンパク質を除去する。０．１Ｍ緩衝グリシン（ｐＨ３）で溶出して、アルブミン及び他の血清タンパク質を実質的に含まない免疫グロブリン調整物を得る。
特異的抗原−結合抗体のより高い分画を含む調整物を得るために免疫アフィニティークロマトグラフィーを実施する。抗血清を惹起するために使用するポリペプチドをクロマトグラフィー樹脂に固定し、そのエピトープに対する特異的抗体を樹脂に吸着させる。非結合成分を洗い流した後、特異的抗体を０．１Ｍグリシン緩衝液、ｐＨ２．３で溶出する。免疫反応性を保存するために抗体分画を直ちに１．０Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で中和する。選択するクロマトグラフィー樹脂は、ポリペプチド中に存在する反応基に依存する。ポリペプチドがアミノ基を有する場合は、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １０又はＡｆｆｉ−Ｇｅｌ １５などの樹脂を使用する（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。ポリペプチドのカルボキシ基を通したカップリングを所望する場合は、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １０２を使用することができる。（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。ポリペプチドが遊離スルフヒドリル基を有する場合は、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ ５０１などの有機水銀樹脂が使用できる（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。
代替的に、脾臓を採取して、上述したようなこの技術分野で既知の常套的方法に従ってモノクローナル抗体を作製するためのハイブリドーマの生産に使用することができる。
多量体ポリペプチド複合体の免疫組織化学的検出
実施例２で上述し、表３に列挙したモノクローナル抗体を使用して、ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した細胞系統（下記の実施例７で述べるような、ＭＢ８）ならびに悪性及び正常乳房組織を、標準的な手順を用いて免疫組織化学的に標識した。Ｄ．Ｌ．Ｓｐｅｃｔｏｒら、Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９９８。簡単に述べると、５μｍ切片を切断し、正に荷電したスライド上に置いて、それらを６０℃のスライド加温器上で３０分間加熱した。切片をザイレン中で各々５分間ずつ２回、１００％エタノール中で各々１分間ずつ２回、９５％エタノール中で各々１分間ずつ３回、及び蒸留水で３分間、再水和した。切片を、１０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．０中、Ｂｌａｃｋ ａｎｄ Ｄｅｃｋｅｒ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｓｔｅａｍｅｒで３０分間加熱した。切片を蒸留水で５分間洗い、その後Ｔｒｉｓ緩衝食塩水［０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６、０．１５Ｍ ＮａＣｌ］（ＴＢＳ）に希釈した１Ｘカゼイン（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）で１５分間遮断した。ハイブリドーマ培養上清をＴＢＳに１：１希釈した。この希釈上清を切片に加え、室温で６０分間インキュベートして、その後ＴＢＳ中で各々５分間ずつ２回洗った。検出のために、ＬＳＡＢ＋キット（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を使用した。切片をリンク抗体と共に室温で３０分間インキュベートし、その後ＴＢＳ中で各々５分間ずつ２回洗った。次に切片をストレプトアビジンと共に室温で３０分間インキュベートし、ＴＢＳ中で各々５分間ずつ２回洗った。切片をＢＣＩＰ／ＮＢＴ／ＩＮＴ基質（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）で１５分間視覚化し、蒸留水に入れて、水性封入媒質で封入した。切片を１０Ｘ対物レンズのＮｉｋｏｎ Ｏｐｔｉｐｈｏｔ ＩＩ光学顕微鏡で観察し、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ ＣｏｏｌＳｎａｐ ＣＣＤカメラ及びＭｅｔａｍｏｒｐｈバージョン４．０ソフトウエアで記録した。図２及び３は、それぞれモノクローナル抗体Ｈ９Ｃ６５及びＨ９５Ｃ３０による２つの悪性乳房切片、１つの正常乳房切片、及びＭＢ８細胞系統の免疫組織化学的染色の結果を示す。
Figure 2005524053
ヒト胚腎２９３細胞からのマンマグロビンＭ／Ｈ及びＢＵ１０１ Ｍ／Ｈを含む複合体の安定なトランスフェクションと発現
Ａ．安定な細胞系統、ＨＥＫ２９３−ＭＢ８の生産
クローン６０３１４８又はクローン２０８３５７８を使用したＢＵ１０１ ｍｙｃ／ｈｉｓ（Ｍ／Ｈ）発現プラスミドの作製、及びクローン８９９８９５を使用したマンマグロビンＭ／Ｈ発現プラスミドの作製を述べている、１９９７年８月１５日出願の米国特許願通し番号第０８／９１２，２７６号のために放棄された、１９９６年９月１９日出願の米国特許願通し番号第０８／６９７，１０５号、及び１９９７年８月１５日出願の米国特許願通し番号第０８／９１２，１４９号のために放棄された、１９９６年８月１９日出願の米国特許願通し番号第０８／６９７，１０６号は、参照してここに組み込まれる。これらの発現プラスミドを、ＤＨ５α細胞に再形質転換し、ＬＢ／アンピシリン寒天に塗布して、ＬＢ／アンピシリン肉汁１０ｍｌ中で増殖させた。ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ（商標）Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いてプラスミドを精製し、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした［Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．３６：５９−７２（１９７７）］。
上述したように、精製発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした［Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．３６：５９−７２（１９７７）］。これらの細胞は、アクセス番号ＣＲＬ １５７３の下にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０より入手可能である。Ｐ．Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎら、Ｆｏｃｕｓ １５．７３（１９９３）によって述べられているカチオンリポフェクタミンを介した方法を用いてマンマグロビンＭ／Ｈ及びＢＵ１０１ Ｍ／Ｈ発現プラスミドのトランスフェクションを実施した。特に、ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）及び必須アミノ酸を添加したＤＭＥＭ培地１０ｍｌで培養し、６０ｍｍ培養平板に９×１０６細胞／平板の密度で新鮮接種した。トランスフェクションのために細胞を３７℃で７０％から８０％の集密度に増殖させた。マンマグロビンＭ／ＨプラスミドＤＮＡ２μｇ及びＢＵ１０１ Ｍ／ＨプラスミドＤＮＡ２μｇを無添加ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）８００μｌに加えた。Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）８μｌをこの溶液に加え、手早く混合した。リポフェクタミン（ＬＴＩ）１２μｌを無添加ＤＭＥＭ培地の第二の８００μｌポーションに加えた。１５分間のインキュベーション後、２つの溶液を混合し、室温でさらに１５分から３０分間インキュベートした。この時間中に、ＨＥＫ２９３細胞を含む平板から培地を取り出した。次に、Ｐｌｕｓ試薬：リポフェクタミン：プラスミドＤＮＡ複合体を含むＤＭＥＭを細胞上にかぶせた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で５時間インキュベートし、その後２０％ＦＢＳを添加したさらなるＤＭＥＭ ２ｍＬから８ｍＬを加えた。１８時間から２４時間後、古い培地を吸引し、細胞に４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む５％ＦＢＳを添加した新鮮ＤＭＥＭ５ｍＬをかぶせ、７２時間が経過するまでインキュベーションを続けた。ウエスタンブロット分析により、上清をマンマグロビンＭ／Ｈ及びＢＵ１０１Ｍ／Ｈポリペプチド発現に関して分析した。
トランスフェクション後７２時間目に、限定トリプシン化によって細胞を皿から遊離させ、１：１００、１：１０００及び１：１００００の希釈で、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８中、１００ｍｍ培養皿に再接種した。これらの培養を、十分に分離した細胞巣が顕微鏡によって特定されるまで、５日から７日間増殖させた。これらの細胞巣をクローニングシリンダーによって単離し、細胞を限定トリプシン化によって遊離させて、個々の巣を、やはりＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８中、２４穴皿の別々のウエルに移した。７日から１０日間の増殖後、各々のウエルの上清を、下記で述べるように、ウエスタンブロット分析によってマンマグロビンＭ／Ｈ及びＢＵ１０１ Ｍ／Ｈ発現に関して分析した。ＭＢ８と命名したクローン系統は、上清においてマンマグロビンＭ／Ｈ及びＢＵ１０１ Ｍ／Ｈの両方を発現することが認められた。この系統を７５ｃｍ２フラスコに拡大し、１：３０で３回継代した後、挿入事象の安定性を保証するためにマンマグロビンＭ／Ｈ及びＢＵ１０１Ｍ／Ｈの発現を再び確認した。この手順の最終産物は、我々がＭＢ８（ＨＥＫ−２９３−ＭＢ８）と命名した、マンマグロビンＭ／Ｈ及びＢＵ１０１ Ｍ／Ｈを発現する、ＨＥＫ２９３細胞系から誘導される細胞系統であった。
Ｂ．培地の分析
ＭＢ８細胞からの上清のアリコートを、マンマグロビンＭ／Ｈ及びＢＵ１０１ Ｍ／Ｈ組換えタンパク質の両方の存在に関して分析した。還元試料緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ｗ／ｖ）、２％β−メルカプトエタノール（ｖ／ｖ）、０．０１％ブロモフェノールブルー（ｗ／ｖ）の最終濃度）中でアリコートを調製し、この技術分野で既知の標準的な方法及び試薬を使用してＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で電気泳動した（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）。詳細には、試料４０μｌを試料緩衝液（５Ｘ）１０μｌに加え、その混合物を５分から１０分間煮沸した。その調製した試料１５μｌを厚さ１ｍｍの１０％から２０％Ｔｒｉｃｉｎｅゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に充填し、１１０Ｖで約９０分間電気泳動した。次にこれらのゲルを２０Ｖでニトロセルロースなどの固体媒体に一晩ブロットし、ｍｙｃエピトープを認識するモノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）若しくはＢＵ１０１又はマンマグロビンのいずれかを認識するポリクローナル抗血清によるウエスタンブロット手法を用いてマンマグロビンＭ／Ｈ及びＢＵ１０１ Ｍ／Ｈタンパク質バンドを視覚化した。詳細には、ニトロセルロースブロットを取り出し、０．２％Ｉ−ｂｌｏｃｋ（登録商標）（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）により室温で６０分間遮断した。次に適切な量の一次抗体を加えた。例えば、前記ポリクローナル抗血清を１：５０００の希釈で使用し、抗ｍｙｃエピトープモノクローナル抗体を１：５０００の希釈で使用した。一次抗体溶液を、振とうしながら室温で６０分間ブロットに暴露した。その後ブロットをＩ−ｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液で３回洗った。ビオチニル化ヤギ抗ウサギＩｇＧ又はビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇＧのいずれかを含む二次抗体を、適切な希釈（１：５０００）でＩ−ｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液中で調製し、振とうしながら室温で６０分間ブロットに暴露した。その後ブロットをＩ−ｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液で３回洗った。次に、コンジュゲートであるアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを、適切な希釈（１：１０，０００）でＩ−ｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液中で調製し、振とうしながら室温で３０分間ブロットに暴露した。その後ブロットをＩ−ｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液で３回、次いでアッセイ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．８）／１ｍＭ塩化マグネシウム）で２回洗った。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート、ＢＣＩＰ ２５ｍｇをジメチルホルムアミド０．５ｍＬに溶解した。次にこのＢＣＩＰ溶液１００μｌをアッセイ緩衝液３０ｍＬと混合し、このＢＣＩＰ基質溶液を、バンドが可視となるまでブロットに暴露した。その後ブロットを基質溶液から取り出し、空気中で乾燥した。乾燥ブロットを走査してブロットの電子コピーを得た。
図４は、安定にトランスフェクトされたクローン、ＭＢ８の増殖から採集した上清の３つのウエスタンブロットを含む。ｍｙｃエピトープを認識するモノクローナル抗体（図４、ブロット１）、ＢＵ１０１を認識するポリクローナル抗血清（図４、ブロット３）、又はマンマグロビンを認識するポリクローナル抗血清（図４、ブロット３）を用いて還元条件下で分画タンパク質を検出した。レーン２は、Ｔ７５フラスコから採集した上清３５ｍＬを示す。レーン３及び４は、各々Ｔ１５０フラスコから採集した上清３０ｍＬを示す。図からわかるように、マンマグロビンＭ／Ｈ及びＢＵ１０１ Ｍ／Ｈタンパク質濃度は、レーン３及び４ではレーン２で認められるものの約２倍であり、上清容量：増殖面積比に一致する。
図４、ブロット２は、ＢＵ１０１を認識するポリクローナル抗血清で視覚化した、上述したようなウエスタンブロットを示す。示されているように、ＭＢ８細胞増殖からの培地は、２つの非常に密接であるが別個の約１１ｋＤのバンドとして認められる、ＢＵ１０１ Ｍ／Ｈを含む。
図４、ブロット３は、マンマグロビンを認識するポリクローナル抗血清で視覚化した、上述したようなウエスタンブロットを示す。示されているように、ＭＢ８細胞増殖からの上清は、約２０ｋＤと３０ｋＤの大きさの２種として認められる、マンマグロビンＭ／Ｈを含む。これらの種は、ＢＵ１０１ Ｍ／Ｈ及びマンマグロビンＭ／Ｈの両方についてのプラスミドによるＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションを含む先の試験（１９９８ンン１２月１８日出願の米国特許願通し番号第０９／２１５，２１８号参照）から認められたものと一致する。２０ｋＤと３０ｋＤのバンドは、それぞれ１個のグリコシル化Ａｓｎ残基を有するマンマグロビンＭ／Ｈ及び２個のグリコシル化Ａｓｎ残基を有するマンマグロビンＭ／Ｈに帰せられる。ＭＢ８細胞系統からのマンマグロビンＭ／Ｈの主要形態は、より十分にグリコシル化された形態であることが認められた。
図４、ブロット１は、ｍｙｃエピトープを認識するモノクローナル抗体で視覚化した、上述したようなウエスタンブロットを示す。示されているように、ＭＢ８細胞増殖からの培地は、ｍｙｃ標識マンマグロビン及びＢＵ１０１を含む。
Ｃ．ニッケルキレート化クロマトグラフィー
上述したようなＭＢ８細胞増殖からの上清を、マンマグロビンＭ／Ｈ及びＢＵ１０１ Ｍ／Ｈの精製のためにニッケルを充填したＣｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。詳細には、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ４０ｍＬを１６ｍｍ×１０ｃｍカラムに注入した。水中の硫酸ニッケル（０．１Ｍ）４０ｍＬをカラムに通してカラムにニッケルを充填した。カラムを洗い、リン酸ナトリウム１０ｍＭ、塩化ナトリウム５００ｍＭ、ｐＨ７．４で平衡させた。ＭＢ８細胞の増殖からの上清２２０ｍＬを平衡カラムに適用し、イミダゾールの直線勾配を用いてヒスチジン標識タンパク質を溶出した。流速は２ｍＬ／分であった；勾配は緩衝液ミリリットル当り６．２５Ｍイミダゾールであった；及び溶出時間は８０分間で、０から５００ｍＭイミダゾールへの溶出プロフィールを創造した。各々４ｍＬの分画を採取した。各々の分画１００μｌをドットブロット装置のウエルに適用し、その容量をニトロセルロース片を通して吸引した。次に、ｍｙｃエピトープを認識するモノクローナル抗体を使用して、実施例７Ｂで上述したウエスタンブロットを視覚化するための同じ手順でニトロセルロースフィルターを視覚化した。図５（上のブロット）は視覚化したドットブロットを例示し、抗ｍｙｃモノクローナル抗体による分画２０−３５中の物質の免疫認識を示している。これらの分画は２５０ｍＭから４３８ｍＭイミダゾールの溶出条件に対応し、ヒスチジン標識タンパク質のニッケルカラムへの結合の成功及びヒスチジン類似体によるそれらの溶出を示唆する。分画２０−３５をプールし、Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｓｅｒｓ（３５００ ＭＷＣＯ）を用いて、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、５０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）２×４Ｌに対して各々少なくとも４時間透析した。プールして透析した半精製ＭＢ８上清を、ウエスタンブロットによってマンマグロビンＭ／Ｈ及びＢＵ１０１ Ｍ／Ｈ組換えタンパク質の両方の存在に関して分析した。
比較のために、マンマグロビンＭ／Ｈを同様に調製した。マンマグロビンＭ／Ｈを含む上清を、クローン８９９８９５を使用してマンマグロビンＭ／Ｈ発現プラスミドでのＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションによって生成した。この手順のための方法と試薬は、１９９７年８月１５日出願の米国特許願通し番号第０８／９１２，１４９号のために放棄された、１９９６年８月１９日出願の米国特許願通し番号第０８／６９７，１０６号に述べられている。そのような上清１２５ｍｌを、上述した４０ｍＬのニッケル充填Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムに適用した。カラムクロマトグラフィー及び分画の分析を上述したように実施した。図５（下のブロット）は視覚化したドットブロットを例示し、抗ｍｙｃモノクローナル抗体による分画１９−３６中の物質の免疫認識を示している。分画１９−３６をプールし、Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｓｅｒｓ（３５００ ＭＷＣＯ）を用いて、リン酸緩衝食塩水２×４Ｌに対して各々少なくとも４時間透析した。
２つの試料（半精製ＭＢ８及びマンマグロビンＭ／Ｈ上清）を還元試料緩衝液中で調製し、電気泳動して、ニトロセルロースに移し、実施例７Ｂで上述したようにモノクローナル及びポリクローナル抗血清で視覚化した。図６のパネル１−８において、レーン１はマンマグロビンＭ／Ｈの一過性トランスフェクションからプールして透析した半精製上清を表わし、及びレーン２はプールして透析した半精製ＭＢ８上清を表わす。パネル１、２、３及び４は、それぞれＢＵ１０１（１０９１８、１０９２３及び１１５４３）又はマンマグロビン（１０９３１）を認識するポリクローナル抗血清で視覚化した。パネル１、２及び３は、ＭＢ８上清（レーン２）においてのみＢＵ１０１を示した。パネル４は、マンマグロビンＭ／Ｈ上清（レーン１）及びＭＢ８上清（レーン２）の両方でマンマグロビンを示した。
パネル５、６、７及び８は、それぞれＢＵ１０１（Ｈ８５、Ｈ６８）、マンマグロビン（Ｈ１１１）又はｍｙｃのいずれかを認識するモノクローナル抗体で視覚化した。やはり、抗ＢＵ１０１モノクローナル抗体はＭＢ８上清（パネル５及び６、レーン２）においてのみＢＵ１０１を示した。パネル７は、マンマグロビンＭ／Ｈ上清（レーン１）及びＭＢ８上清（レーン２）の両方でマンマグロビンを示した。パネル８は、ＭＢ８上清（レーン２）においてＢＵ１０１ Ｍ／Ｈを示し、両方のレーンでマンマグロビンＭ／Ｈを示した。
第二のセットのウエスタンブロットを、同じ試料（ＭＢ８上清及びマンマグロビンＭ／Ｈ上清）に関して上述したように実施した。この実験では、非還元試料緩衝液中で試料を調製し、電気泳動して、ニトロセルロースに移し、上述したようにモノクローナル及びポリクローナル抗血清で視覚化した。パネル９−１６において、レーン１はマンマグロビンＭ／Ｈの一過性トランスフェクションからプールして透析した半精製上清を表わし、及びレーン２はプールして透析した半精製ＭＢ８上清を表わす。パネル９、１０、１１及び１２は、それぞれＢＵ１０１（１０９１８、１０９２３及び１１５４３）又はマンマグロビン（１０９３１）を認識するポリクローナル抗血清で視覚化した。抗ＢＵ１０１ポリクローナル抗体で視覚化したパネル９、１０及び１１は、ＭＢ８上清（レーン２）において２つのバンドを特定し、マンマグロビンＭ／Ｈ上清（レーン１）ではバンドを特定しなかった。抗マンマグロビンポリクローナル抗体で視覚化したパネル１２は、３つの抗ＢＵ１０１ポリクローナル抗体で特定されていた、ＭＢ８上清（レーン２）における同じ２つのバンドを特定した。抗マンマグロビン抗体は、マンマグロビンＭ／Ｈ上清（パネル１２、レーン１）においていくつかのバンドを特定した。
パネル１３、１４、１５及び１６は、それぞれＢＵ１０１（Ｈ８５、Ｈ６８）、マンマグロビン（Ｈ１１１）又はｍｙｃのいずれかを認識するモノクローナル抗体で視覚化した。やはり、抗ＢＵ１０１モノクローナル抗体はＭＢ８上清（パネル１３及び１４、レーン２）において２つのバンドを特定した。抗マンマグロビンモノクローナル抗体は、ＭＢ８上清（パネル１５、レーン２）における同じ２つのバンドならびにマンマグロビンＭ／Ｈ上清（レーン１）におけるいくつかのバンドを特定した。抗ｍｙｃモノクローナル抗体も、ＭＢ８上清（レーン２）における同じ２つのバンドならびにマンマグロビンＭ／Ｈ上清（レーン１）におけるいくつかのバンドを特定した。
ＭＢ８上清は、非還元条件下で、抗ＢＵ１０１ポリクローナル及びモノクローナル抗血清、抗マンマグロビンポリクローナル及びモノクローナル抗血清、ならびに抗ｍｙｃモノクローナル抗体で特定される２つの種を含んだ。パネル１−８より、これらの試薬（抗ＢＵ１０１及び抗マンマグロビンポリクローナル及びモノクローナル抗体）が非交差反応性であることが示された。抗ＢＵ１０１試薬はマンマグロビンＭ／Ｈを認識せず、抗マンマグロビン試薬はＢＵ１０１ Ｍ／Ｈを認識しなかった。それ故、抗ＢＵ１０１試薬と抗マンマグロビン試薬の両方によってＭＢ８上清中で検出された２つのバンドは、マンマグロビンＭ／Ｈ及びＢＵ１０１ Ｍ／Ｈの両方を含んだ。この２つのバンドは、ＢＵ１０１ Ｍ／Ｈ及びマンマグロビンＭ／Ｈの両方を含む複合体に帰せられ、それによりマンマグロビンＭ／Ｈは異なるグリコシル化状態を有しうる。さらに、β−メルカプトエタノールなどの還元剤をウエスタンブロットのための非還元試料緩衝液に添加することにより、この複合体を解離させた。使用しうる他の還元剤は、例えばジチオトレイトール、β−メルカプトエチルアミン及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）を含む。
Ｄ．等電点電気泳動
対象タンパク質の等電点を、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）の等電関数を用いて測定した。等電点はすべてのタンパク質の性質であり、タンパク質がゼロの正味電荷を有するｐＨである。Ｔｈｏｍａｓ Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編集、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，第２版、Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ（１９９３）。表４は対象タンパク質ｐＩを列挙している：
Figure 2005524053
プールして透析した半精製ＭＢ８上清（ニッケルキレート化クロマトグラフィーから）及びプールして透析した半精製マンマグロビンＭ／Ｈ上清（ニッケルキレート化クロマトグラフィーから）を、ＩＥＦ３−１０ゲル、陰極緩衝液ｐＨ３−１０、正極緩衝液、及び試料緩衝液ｐＨ３−１０（Ｎｏｖｅｘ）を製造者の指示に従って使用する等電点電気泳動のために調製した。簡単に述べると、上清５０μＬを試料緩衝液５０μＬに加えた。３０μＬをゲルの各々のウエルに充填した。ゲルを１００Ｖで１時間、次に２００Ｖで１時間、最後に５００Ｖで３０分間電気泳動した。そのゲルを２２Ｖの定電圧で一晩ニトロセルロースにブロットした。ウエスタンブロットを、抗ｍｙｃモノクローナル抗体により実施例７Ｂで上述したように視覚化した。図７は生じたウエスタンブロットを示す。マンマグロビンＭ／Ｈ上清はレーン１、ＭＢ８上清はレーン２である。免疫反応性物質は、ゲルの陰極（上部）末端（ｐＨ１０）から離れた、ゲルの正極（底）末端（ｐＨ３）で認められた。これらの結果はタンパク質の算定ｐＩと一致した。マンマグロビンＭ／ＨのｐＩは４．６と算定され、マンマグロビンＭ／ＨとＢＵ１０１Ｍ／Ｈを合わせたｐＩは５．９と算定された。実際に、マンマグロビンＭ／Ｈ（レーン１）はＭＢ８上清（レーン２）よりも低いｐＨで収束した。
Ｅ．イオン交換クロマトグラフィー
ニッケルキレート化クロマトグラフィー後、ＭＢ８細胞の増殖からの半精製上清を、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてさらに精製した。詳細には、実施例７Ｃで上述したように、ニッケル精製ＭＢ８上清１０ｍＬを２０ｍＭピペラジン、ｐＨ６．０ ２Ｌに対して透析した。この物質を、２０ｍＭピペラジン、ｐＨ６．０で平衡させたＭｏｎｏ Ｑ ５／５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。塩化ナトリウムの直線勾配を用いてタンパク質を溶出した。流速は１ｍＬ／分であった；勾配は緩衝液ミリリットル当り２０ｍＭ塩化ナトリウムであった；及び溶出時間は５０分間で、０から１０００ｍＭ塩化ナトリウムへの溶出プロフィールを創造した。試料充填時間は、溶出勾配の適用の３０分前であった。各々１ｍＬの分画を採取した。各々の分画１００μｌを０．１％β−メルカプトエタノールの存在下で煮沸し、冷却して、その後ドットブロット装置のウエルに適用し、その容量をニトロセルロース片を通して吸引した。次に、ｍｙｃエピトープを認識するモノクローナル抗体を使用して、実施例７Ｂで上述したウエスタンブロットを視覚化するための同じ手順でニトロセルロースフィルターを視覚化した。図８（上のブロット）は視覚化したドットブロットを例示し、抗ｍｙｃモノクローナル抗体による分画３６−４７中の物質の免疫認識を示している。免疫反応性物質は１２０ｍＭから３４０ｍＭ塩化ナトリウムの間で溶出し、ピークの中心は１８０ｍＭ塩化ナトリウムで溶出する。これらの結果は、前記物質がｐＨ６．０の陰イオン交換カラムに弱く結合したという点で、マンマグロビンＭ／ＨとＢＵ１０１ Ｍ／Ｈを合わせた場合の５．９という算定等電点に合致する。ＢＵ１０１ Ｍ／Ｈ単独の等電点は７．６と算定され、正味正電荷を持たないので、このタンパク質はｐＨ６．０の陰イオン交換カラムに結合しないと予想される。ＢＵ１０１ Ｍ／Ｈは、試料の充填中（最初の３０分画）カラムを通って流出すると予想される。しかし、これらの３０流出分画中に抗ｍｙｃ免疫反応性物質は認められなかった。これらの結果は、ＢＵ１０１ Ｍ／ＨがマンマグロビンＭ／Ｈとの共有結合のために変化した等電特性を有することと一致する。
比較のために、マンマグロビンＭ／Ｈ上清を、上述したのと同じ条件下で同じ陰イオン交換カラムでのクロマトグラフィーにかけた。各々１ｍＬの分画を上述したように分析した。図８（下のブロット）は視覚化したドットブロットを例示し、抗ｍｙｃモノクローナル抗体による分画３８−４７中の物質の免疫認識を示している。免疫反応性物質は１６０−３４０ｍＭ塩化ナトリウムの間で溶出した。ドットブロットでの溶出プロフィールは、ＭＢ８上清からの物質と異なって、２００ｍＭ塩化ナトリウム（分画４０）及び３００ｍＭ塩化ナトリウム（分画４５）を中心とする２つのピークを示唆した。これらの結果は、前記物質がｐＨ６．０の陰イオン交換カラムに中等度に結合したという点で、マンマグロビンＭ／Ｈについての４．６という算定等電点に合致する。
Ｆ．ゲルろ過クロマトグラフィー
ニッケルキレート化クロマトグラフィー後、ＭＢ８細胞の増殖からの半精製上清を、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いてさらに精製した。詳細には、上述したようなニッケル精製ＭＢ８上清４．６５ｍＬを６５０μＬに濃縮し、濃縮物２００μＬをＳｕｐｅｒｏｓｅ １２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の１０ｍｍ×３０ｃｍカラムに適用した。カラムに０．４ｍＬ／分の流速でＰＢＳ（５０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）の単一緩衝液を通過させた。Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能な分子量標準品でカラムを検定した。生じた分子量測定に関する標準曲線が図９に示されており、その図は分子量と溶出量の関係を明らかにしている。
Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムからのｍｙｃ−ｈｉｓ標識マンマグロビン及びＢＵ１０１タンパク質の溶出を、抗ｍｙｃモノクローナル抗体での免疫認識によって追跡した。各々０．４ｍＬの分画を採取した。各々の分画１００μｌを０．１％β−メルカプトエタノールの存在下で煮沸し、冷却して、その後ドットブロット装置のウエルに適用し、その容量をニトロセルロース片を通して吸引した。次に、ｍｙｃエピトープを認識するモノクローナル抗体を使用して、実施例７で上述したウエスタンブロットを視覚化するための同じ手順でニトロセルロースフィルターを視覚化した。図１０は視覚化したドットブロットを例示し、抗ｍｙｃモノクローナル抗体による分画３３−３６中の物質の免疫認識を示している。分画３３、３４、３５及び３６は、それぞれ１３．２ｍＬ、１３．６ｍＬ、１４．０ｍＬ及び１４．４ｍＬの溶出量を有する。このピークの中心（１３．８ｍＬ）は５６ｋＤの分子量に対応する。これらの結果は、マンマグロビンＭ／ＨとＢＵ１０１ Ｍ／Ｈの間の結合に合致する。図６に示すように、ＢＵ１０１ Ｍ／ＨとマンマグロビンＭ／Ｈは、個別の種として、大きく異なる分子量を有する（〜１１ｋＤと及び〜３０ｋＤ）。図９は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムの性能及びそのような個別の種を分離する能力を明らかにした。その代わりに、溶出プロフィールは、非還元条件下でＭＢ８上清において特定された種と一致して（図６、パネル９−１６）、５６ｋＤの平均分子量の単一ピークを示した。
ヒト組織からの多量体ポリペプチド複合体の特定
Ａ．組織抽出物の調製
−７０℃で急速凍結して保存しておいた乳癌組織１グラムの１０分の２をウエスタンブロット分析のために調製した。組織試料を０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５％（ｗ／ｖ）グリセロール、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍｌロイペプチン及び１．０ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド中で均質化することによってタンパク質抽出物を調製した。Ｓ．Ｒ．Ｋａｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７：９８２（１９９４）。均質化後、ホモジネートを４℃で５分間遠心分離して、デブリから上清を分離した。タンパク質の定量のために、上清２μＬから５μＬをクマシータンパク質試薬（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）１．５ｍＬに加え、吸光度を５９５ｎｍで読み取った。
Ｂ．組織抽出物の分析
上述したように、乳癌組織抽出物をウエスタンブロットで分析した。他の試料は、組換えマンマグロビンＭ／ＨとＢＵ１０１ Ｍ／Ｈ及び下記で述べるようなもう１つの乳癌組織抽出物を含んだ。還元試料緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ｗ／ｖ）、２％β−メルカプトエタノール（ｖ／ｖ）、０．０１％ブロモフェノールブルー（ｗ／ｖ）の最終濃度）及び非還元試料緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ｗ／ｖ）、及び０．０１％ブロモフェノールブルー（ｗ／ｖ）の最終濃度）の両方において試料を調製し、次にこの技術分野で既知の標準的な方法及び試薬を使用してＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で電気泳動した（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）。詳細には、試料４０μｌを試料緩衝液（５Ｘ）１０μｌに加え、その混合物を５分から１０分間煮沸した。その調製した試料１５μｌを厚さ１ｍｍの１０％から２０％Ｔｒｉｃｉｎｅゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に充填し、１１０Ｖで約９０分間電気泳動した。次にこれらのゲルを２０Ｖでニトロセルロースなどの固体媒体に一晩ブロットし、ＢＵ１０１又はマンマグロビンのいずれかを認識するモノクローナル又はポリクローナル抗血清によるウエスタンブロット手法を用いてマンマグロビン及びＢＵ１０１タンパク質バンドを視覚化した。詳細には、ニトロセルロースブロットを取り出し、０．２％Ｉ−ｂｌｏｃｋ（登録商標）（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）により室温で６０分間遮断した。次に適切な量の一次抗体を加えた。例えば、前記ポリクローナル抗血清を１：５０００の希釈で使用し、モノクローナル培養上清を１：５０の希釈で使用した。一次抗体溶液を、振とうしながら室温で６０分間ブロットに暴露した。その後ブロットをＩ−ｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液で３回洗った。ビオチニル化ヤギ抗ウサギＩｇＧ又はビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇＧのいずれかを含む二次抗体を、適切な希釈（１：５０００）でＩ−ｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液中で調製し、振とうしながら室温で６０分間ブロットに暴露した。その後ブロットをＩ−ｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液で３回洗った。次に、コンジュゲートであるアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを、適切な希釈（１：１０，０００）でＩ−ｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液中で調製し、振とうしながら室温で３０分間ブロットに暴露した。その後ブロットをＩ−ｂｌｏｃｋ（登録商標）溶液で３回、次いでアッセイ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．８）／１ｍＭ塩化マグネシウム）で２回洗った。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート、ＢＣＩＰ ２５ｍｇをジメチルホルムアミド０．５ｍＬに溶解した。次にこのＢＣＩＰ溶液１００μｌをアッセイ緩衝液３０ｍＬと混合し、このＢＣＩＰ基質溶液を、バンドが可視となるまでブロットに暴露した。その後ブロットを基質溶液から取り出し、空気中で乾燥した。乾燥ブロットを走査してブロットの電子コピーを得た。
図１１は、乳癌組織抽出物及び組換えｍｙｃ−ｈｉｓ標識マンマグロビン及びＢＵ１０１タンパク質のウエスタンブロットを示す。上のブロットはＢＵ１０１を認識するモノクローナル抗体で視覚化し、下のブロットはマンマグロビンを認識するモノクローナル抗体で視覚化した。４つの試料を２つのブロットで分析した。レーン４−７の試料は還元試料緩衝液で調製し（実施例７Ｃで上述したように）、レーン１０−１３の試料は非還元試料緩衝液で調製した。最初の試料は、侵襲性でほとんど分化していない腺癌（乳房）を有する患者からの組織標本であり、レーン４−１０に示されている。２番目の試料は、一過性発現されたｍｙｃ−ｈｉｓ標識マンマグロビン及びＢＵ１０１タンパク質複合体であり、レーン５と１１に示されている。３番目の試料は、ＭＢ８細胞からの安定発現されたｍｙｃ−ｈｉｓ標識マンマグロビン及びＢＵ１０１タンパク質複合体であり、レーン６と１２に示されている。４番目の試料は、腺癌（乳房）を有するもう１名の別の患者からの組織標本であり、レーン７と１３に示されている。
上のブロットをＢＵ１０１に対するモノクローナル抗体で視覚化した。レーン４−７では、試料を還元しており、レーン１０−１３では、試料を還元していなかった。還元条件下で、ＢＵ１０１はレーン４と７の組織標本において認められ、組換えＢＵ１０１ Ｍ／Ｈはレーン５と６において（弱く）認められた。ｍｙｃ−ｈｉｓ標識はＢＵ１０１の分子量に約３ｋＤを付加し、この影響はウエスタンブロットでわずかにより高いバンドとして現われた。ＢＵ１０１は４つの試料すべてにおいて単一種として検出されたが、多少バックグラウンド染色が認められた。非還元条件下では（レーン１０−１３）、ＢＵ１０１は、試料を還元したときよりもはるかに高い分子量で認められた。レーン１０と１３の組織標本は、抗ＢＵ１０１モノクローナル抗体でプローブしたとき１つの支配的種（図１１中の１本の線によって示される）を示した。これに対し、レーン１１と１２の組換えＢＵ１０１ Ｍ／Ｈは多数の種（図１１中の複数の線によって示される）を示した。ｍｙｃ−ｈｉｓ標識タンパク質に関する多数の種の所見は、図１１の下のブロットで認められる、この組換え系におけるマンマグロビンの多グリコシル化状態に帰せられる。
下のブロットをマンマグロビンに対するポリクローナル抗血清で視覚化した。レーン４−７では試料を還元しており、レーン１０−１３では試料を還元しなかった。還元条件下で、マンマグロビンはレーン４と７の組織標本において認められ、組換えマンマグロビンＭ／Ｈはレーン５と６で認められた。ｍｙｃ−ｈｉｓ標識はマンマグロビンの分子量に約３ｋＤを付加し、この影響はウエスタンブロットでわずかにより高いバンドとして現われた。マンマグロビンは、組織標本では単一種として検出されたが、組換え系では多数の種として検出された。組換え系におけるこれらの多数のバンドは、マンマグロビンタンパク質の多グリコシル化状態に帰せられる（参照してここに組み込まれる、１９９８年１２月１８日出願の米国特許願通し番号第０９／２１５，８１８号に述べられているように）。簡単に述べると、マンマグロビンは、グリコシル化できる２個のＡｓｎ残基を含む。３つのバンドは、両方のＡｓｎ残基がグリコシル化されているか、又は１個のＡｓｎ残基がグリコシル化されているか、又はどちらのＡｓｎ残基もグリコシル化されていないマンマグロビンに帰せられる。安定な細胞系統（ＭＢ８、レーン６）は、一過性発現系（レーン５）よりも十分にグリコシル化されたマンマグロビンを生産することが認められた。非還元条件下では（レーン１０−１３）、マンマグロビンは、試料を還元したときよりもわずかに高い分子量で認められた。レーン１０と１３の組織標本は、抗マンマグロビンポリクローナル抗体でプローブしたとき１つの支配的種（図１１中の１本の線によって示される）を示した。これに対し、レーン１１と１２の組換えマンマグロビンＭ／Ｈは多数の種（図１１中の複数の線によって示される）を示した。
上と下のブロットを直接比較すると、同じバンドが非還元条件下で（レーン１０と１３）抗ＢＵ１０１と抗マンマグロビン抗体の両方によって乳癌組織標本において検出されることが認められた。これらの結果は、ＢＵ１０１とマンマグロビンの間の結合が還元試薬で除去できることと合致する。そのような結合は２つの種の間のジスルフィド結合であると考えられる。
Ｃ．イオン交換クロマトグラフィー
侵襲性のほとんど分化していない腺癌（乳房）を有する患者から誘導した乳癌組織抽出物（図１１、レーン４と１０）を、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した。詳細には、前記抽出物８００μＬを、２０ｍＭピペラジン、ｐＨ６．０で平衡させたＭｏｎｏ Ｑ ５／５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。塩化ナトリウムの直線勾配を用いてタンパク質を溶出した。流速は１ｍＬ／分であった；勾配は緩衝液ミリリットル当り２０ｍＭ塩化ナトリウムであった；及び溶出時間は５０分間で、０から１０００ｍＭ塩化ナトリウムへの溶出プロフィールを創造した。試料充填時間は、溶出勾配の適用の３０分前であった。各々１ｍＬの分画を採取した。各々の分画１００μｌを０．１％β−メルカプトエタノールの存在下で煮沸し、その後ドットブロット装置のウエルに適用して、その容量をニトロセルロース片を通して吸引した。次に、ＢＵ１０１又はマンマグロビンのいずれかを認識するポリクローナル抗血清を使用して、実施例７Ｂで上述したウエスタンブロットを視覚化するための同じ手順でニトロセルロースフィルターを視覚化した。図１２は視覚化したドットブロットを例示し、抗マンマグロビンポリクローナル抗血清及び抗ＢＵ１０１ポリクローナル抗血清による分画４１−４８中の物質の免疫認識を示している。分画４１−４８は２２０ｍＭから３６０ｍＭ塩化ナトリウムの塩濃度に対応する。これらの結果は４．６未満の等電点に合致する。表５は、陰イオン交換カラムからの溶出条件を、溶出したタンパク質又はタンパク質複合体の対応するｐＩと共に要約している。
Figure 2005524053
ＢＵ１０１（Ｍ／Ｈ標識なし）の等電点は８．４と算定された（表４）。マンマグロビン（Ｍ／Ｈ標識なし）の等電点は３．８と算定された（表４）。１個のＢＵ１０１ポリペプチドと１個のマンマグロビンポリペプチドを含む複合体の等電点は４．４と算定され、観察されたクロマトグラフィー特性と一致する値であった。さらに、１個のＢＵ１０１ポリペプチドと１個のマンマグロビンポリペプチドを含む複合体は、抗ＢＵ１０１ポリクローナル抗血清と抗マンマグロビンポリクローナル抗血清の両方が分画４１−４８を認識した、分画のドットブロット分析と一致する。
前記物質をさらに分析するために、各々の陽性分画（分画４１−４８）を還元条件下と非還元条件下でウエスタンブロットに供した。抗マンマグロビンポリクローナル抗血清又は抗ＢＵ１０１ポリクローナル抗血清のいずれかで視覚化するために２つの同じブロットを作製した。図１３において、上のブロットは抗ＢＵ１０１ポリクローナル抗血清で視覚化し、下のブロットは抗マンマグロビンポリクローナル抗血清で視覚化した。
抗ＢＵ１０１ポリクローナル抗血清で視覚化した上のブロットでは、分画を還元状態（ブロットの左側）と非還元状態（ブロットの右側）の両方で移動させた。還元状態では、ＢＵ１０１は各々の分画において低分子量（〜７ｋＤ）の単一バンドとして認められた。非還元条件下では、単一の広いバンドがより高い分子量（〜２３−３４ｋＤ）で検出された。
抗マンマグロビンポリクローナル抗血清で視覚化した下のブロットでは、分画を還元状態（ブロットの左側）と非還元状態（ブロットの右側）の両方で移動させた。還元状態では、マンマグロビンは分子量１７−２３ｋＤの単一の広いバンドとして各々の分画中に認められた。非還元条件下では、単一の広いバンドがより高い分子量（〜２３−３４ｋＤ）で検出された。２つのブロットの比較は、抗ＢＵ１０１及び抗マンマグロビンポリクローナル抗血清が非還元条件下で同じバンドを検出したことを明らかにした。非還元種の分子量は、１個のＢＵ１０１ポリペプチドと１個のマンマグロビンポリペプチドの合計に相関した。これらのデータは、ジスルフィド結合しているマンマグロビンとＢＵ１０１を含む複合体と一致する。
Ｄ．ゲルろ過クロマトグラフィー
上述したような半精製乳癌組織抽出物を、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いてさらに精製した。詳細には、上述したようなイオン交換クロマトグラフィーからの分画４１−４８を、３０００×ｇで２５分間回転させたＣｅｎｔｒｉｐｌｕｓ ３０濃縮器を用いて１００μＬに濃縮した。残留物をＳｕｐｅｒｏｓｅ １２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の１０ｍｍ×３０ｃｍカラムに適用した。カラムに０．４ｍＬ／分の流速でＰＢＳ（５０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）の単一緩衝液を通過させた。Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能な分子量標準品でカラムを検定した。生じた分子量測定に関する標準曲線が図９に示されており、その図は分子量と溶出量の関係を明らかにしている。
Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムからのマンマグロビン及びＢＵ１０１の溶出を、抗ＢＵ１０１及び抗マンマグロビンポリクローナル抗血清での免疫認識によって追跡した。各々０．４ｍＬの分画を採取した。各々の分画１００μｌを０．１％β−メルカプトエタノールの存在下で煮沸し、その後ドットブロット装置のウエルに適用して、その容量をニトロセルロース片を通して吸引した。２つのドットブロットをこのようにして調製した。次に、一方のニトロセルロースフィルター上の抗ＢＵ１０１ポリクローナル抗血清と他方のニトロセルロースフィルター上の抗マンマグロビンポリクローナル抗血清を使用して、実施例７Ｂで上述したウエスタンブロットを視覚化するための同じ手順でニトロセルロースフィルターを視覚化した。図１４はこれらの視覚化したドットブロットを例示し、抗マンマグロビン及び抗ＢＵ１０１ポリクローナル抗血清の両方による分画３４−３９中の物質の免疫認識を示している。分画３４、３５、３６、３７、３８及び３９は、それぞれ１３．６、１４．０、１４．４、１４．８、１５．２及び１５．６ｍＬの溶出量を有する。これらの分画についての分子量範囲は〜６３ｋＤ−〜２０ｋＤに対応する。このピークの中心は〜４０ｋＤの分子量に対応する。
ゲルろ過クロマトグラフィーからのマンマグロビンと同じ分画におけるＢＵ１０１の検出は、ＢＵ１０１とマンマグロビンの両方を含む複合体と一致する。図１３に示すように、ＢＵ１０１とマンマグロビンは、個別の種として、大きく異なる分子量を有する（〜７ｋＤ及び〜２３ｋＤ）。図９は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムの性能及びそのような個別の種を分離する能力を明らかにした。その代わりに、溶出プロフィールは、非還元条件下で乳癌組織抽出物において特定された種と一致して、４０ｋＤの平均分子量の単一ピークを示した（図１３）。このデータは、ＢＵ１０１とマンマグロビンが単離ポリペプチドとし存在しないことを裏付ける。さらに、乳癌組織からＢＵ１０１とマンマグロビンの両方を含む複合体が特定されることは、ヒト組織及び疾患におけるその生物学的関連性を示唆する。
前処理プロトコールを使用したマンマグロビンＭ／Ｈ及びＢＵ１０１ Ｍ／Ｈを含む複合体の免疫認識の増強
ＨＥＫ２９３−ＭＢ８細胞の増殖及びマンマグロビンＭ／Ｈの一過性トランスフェクションからの半精製上清（実施例７Ｃで述べたようなニッケルキレート化クロマトグラフィー後）を、加熱を伴う又は伴わない、非イオン性界面活性剤、陰イオン界面活性剤、又は還元剤を含む種々の前処理プロトコールに供した。詳細には、Ｔｗｅｅｎ ２０、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、又はβ−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）を、添加物の最終濃度を０．１％、０．２５％、０．５％、１．０％、２．０％及び４．０％として、上述した半精製上清１００μＬに加えた。２組の試料を５分間加熱処理して、冷却した。次に、処理した試料をドットブロット装置に充填し、その容量をニトロセルロース片を通して吸引した。その後、抗ｍｙｃモノクローナル抗体を使用して、実施例７Ｂで上述したウエスタンブロットを視覚化するための同じ手順でニトロセルロースフィルターを視覚化した。
マンマグロビンＭ／Ｈを含む半精製上清の前処理は、ＨＥＫ２９３−ＭＢ８細胞からの半精製上清の前処理で得られたのと同様の結果を生じた（図１５）。抗ｍｙｃモノクローナル抗体に関する該ポリペプチドの免疫認識は、一部の前処理プロトコールによって増強された。加熱処理を伴う又は伴わないＴｗｅｅｎ ２０は、ｍｙｃ−ｈｉｓ標識ポリペプチドに対する抗ｍｙｃモノクローナル抗体の免疫認識に作用を及ぼさなかった。ＳＤＳ処理は、高い濃度（＞０．５％）よりも０．１％及び０．２５％という低い濃度でより良好に、ｍｙｃ−ｈｉｓ標識ポリペプチドに対する抗ｍｙｃモノクローナル抗体の免疫認識を改善した。この作用は加熱の存在下と不在下の両方で認められた。β−メルカプトエタノール処理は、すべての濃度でｍｙｃ−ｈｉｓ標識ポリペプチドに対する抗ｍｙｃモノクローナル抗体の免疫認識を改善し、その作用は加熱の存在下と不在下の両方で認められた。従って、該ポリペプチドの免疫認識が一部の前処理プロトコールによって増強されることが示された。
乳癌パネルの増強
Ａ．背景
高度に組織又は疾患特異的に発現される遺伝子は、治療、癌の早期検出、及び治療中と治療後の疾患症状の監視のための可能性のある標的を提供する。さらに、分泌又は流出タンパク質をコードするこの種の遺伝子は、我々がすべての状況で癌を特異的に検出する能力を助ける、その産物の血清中での検出を可能にしうる。
このために、本発明者らは、乳房上皮で特異的に発現されるそのような遺伝子の特定と特徴づけを目指した。その発現が乳房上皮に高度に限定されている２個の新しい遺伝子が、Ｉｎｃｙｔｅ ＬｉｆｅＳｅｑ Ｄｅｔａｂａｓｅの指定スクリーニングから明らかになった。これらの１個は、ＢＵ１０１と称される新たに発見されたウテログロビンであり、他方は、ＢＳ１０６と称されるムチン様特異性を有する新規遺伝子である。これらの遺伝子の両方の発現は、主として正常及び新生物性乳房上皮に限定されている。
今回の試験において、本発明者らは、乳房上皮を検出するための他の２つの候補マーカー、マンマグロビン及びサイトケラチン１９（ＣＫ）と比較して、これら２つのマーカーの発現を測定した。マンマグロビンは乳房特異的遺伝子として提示されてきたが、サイトケラチンは、眼窩リンパ節、骨髄及び末梢血において上皮を検出するために広汎に使用されてきた。半定量的エンドポイントＰＣＲ及び定量的リアルタイムＰＣＲの両方を使用して、一連の原発性乳癌及び無関係なリンパ節におけるこれらの４個の遺伝子の発現を比較した。
予想されたように、ＣＫはすべての乳癌を検出する上で高度に感受性であった。しかし、非癌患者からのリンパ節からも特異的産物の増幅が見られた。３つの乳房マーカー、マンマグロビン、ＢＵ１０１及びＢＳ１０６はＣＫよりも特異的であった。しかし、これらのマーカーの各々も、乳癌の小さな部分重複サブセットを検出することはできなかった。それ故、これらのマーカーのいずれも、すべての乳癌を効率的に検出するわけではないが、２個又はそれ以上の組合せは循環又は潜伏乳癌細胞を検定する上で非常に高い感受性を達成しうる。骨髄及び循環中の腫瘍細胞の検出のためのこれらのマーカーの開発をさらに論じる。
Ｂ．原発癌におけるマーカー発現
本発明者らは、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、１０１の原発性乳癌及び乳癌を有していない患者からの１７のリンパ節のシリーズにおいて３つの乳房特異的マーカー（ＢＵ１０１、マンマグロビン及びＢＳ１０６）の発現を測定した。すべての癌が、この同じアッセイによりサイトケラチン１９に関して陽性であった。
２０の癌の代表的な群の発現を図１９Ａ−Ｃに示す。各々のマーカーに関して、小さな分画の癌はこのアッセイでは検出不能レベルのｍＲＮＡを有していた。しかし、すべての癌が少なくとも１個のマーカーの検出可能なレベルを含んでいた。これはおそらく、いずれのアッセイにおいても２個又はそれ以上のマーカーを組み合わせることの必要性を示唆している。正常リンパ節の３つは検出可能なＣＤ１９発現を有していた。
「相対発現」についての尺度が３つのマーカーの間で有意に異なることに留意しなければならない。マーカーの各々について発現レベルの広い変動が認められた。３個のマーカーすべてに関する標的ｍＲＮＡ定量は５次数の範囲にわたった（１００，０００倍）。正しいサイズのバンドの存在を確認するためにすべてのＰＣＲ反応をアガロースゲル上で実施した。我々は１０５の範囲にわたってｍＲＮＡレベルを測定することができたが、本当のＰＣＲ産物はｑＲＴ−ＰＣＲにより非ゼロ値ですべての試料において検出された。
Ｃ．一般的アッセイ方法
各々の癌からの全ＲＮＡの等量を単離し、ランダムプライミングによってｃＤＮＡに変換した。各々のマーカーに特異的なプライマーをＡＢＩ ７７００サイクラーでのＰＣＲ増幅において使用して、各々の反応にＳｙｂｒ Ｇｒｅｅｎを添加した。発現値は、内蔵の交点解析ソフトウエアを用いて誘導し、乳癌細胞系、ＳＫＢＲ−３における各マーカーの発現レベルに基準化した。
乳房組織から抽出したタンパク質を、ｐＨ６のＭｏｎｏ Ｑカラムを用いて分画し、漸増塩勾配を使用して溶出した。特異的ペプチドに対して惹起したポリクローナル抗血清を使用して分画をＢＵ１０１及びマンマグロビンに関して検定した。両方のタンパク質に対するシグナルが分画４２−４８において認められた（図２０Ａ及びＢ）。次にこれらの分画を、還元又は非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ゲルをブロットし、（図２０Ａ及びＢ）におけるのと同じポリクローナル抗体でプローブした。両方の抗体を非還元条件下で使用してＭａｍＢｕ複合体を検出する（図２０Ｃ及びＤ）。さらなる試験は、これらのタンパク質が同じ細胞内で発現されるとき、ＭａｍＢｕ複合体が分泌される主要形態であることを示唆する。
高いＢＳ１０６発現とＨＥＲ２／ｎｅｕＩＨＣ染色上昇の間に有意の結びつきが認められた。また、先に述べたように、高いレベルのＢＵ１０１を発現する癌は、典型的には、マンマグロビンも高いレベルで同時発現する。ＥＲ／ＰＲ陰性と高いレベルのマンマグロビンの間にはより弱い相関が存在する。
結論として、本発明者らは２つの新しい乳房特異的発現マーカー―ＢＵ１０１及びＢＳ１０６を特定した。ＢＵ１０１はウテログロビンファミリーの成員であり、分泌されるマンマグロビンとの複合体中に認められる。ＢＵ１０１及びマンマグロビンは、典型的には乳癌において同時発現される。ＢＳ１０６はムチン様タンパク質をコードする新規遺伝子であり、発現の乳房組織特異性を示す。
予備試験は、ＢＳ１０６発現がＨＥＲ２／ｎｅｕ発現と相関することを示唆する。３つのマーカーすべての発現レベルが、腫瘍の大きさ、病期及びホルモン受容体状態とは無関係である。これらのマーカーの１つ又はそれ以上の発現は、実質的にすべての原発性乳癌において存在する。しかし、必ずしもすべての癌が各々のマーカーを発現するわけではなく、すべての乳癌を検出するためにはこれらのマーカーの２つ又はそれ以上の組合せが必要であることを示唆する。
図１は、実施例７Ｃに従って作製した、組換えポリペプチド複合体を認識したモノクローナル抗体の３つの結合曲線を示す。 図２は、モノクローナル抗体Ｈ９Ｃ６５による２つの悪性乳房切片、１つの正常乳房切片、及びＨＥＫ２９３−ＭＢ８細胞系の免疫組織化学的染色の結果を示す。 図２は、モノクローナル抗体Ｈ９Ｃ６５による２つの悪性乳房切片、１つの正常乳房切片、及びＨＥＫ２９３−ＭＢ８細胞系の免疫組織化学的染色の結果を示す。 図２は、モノクローナル抗体Ｈ９Ｃ６５による２つの悪性乳房切片、１つの正常乳房切片、及びＨＥＫ２９３−ＭＢ８細胞系の免疫組織化学的染色の結果を示す。 図２は、モノクローナル抗体Ｈ９Ｃ６５による２つの悪性乳房切片、１つの正常乳房切片、及びＨＥＫ２９３−ＭＢ８細胞系の免疫組織化学的染色の結果を示す。 図３は、モノクローナル抗体Ｊ９５Ｃ３０による２つの悪性乳房切片、１つの正常乳房切片、及びＨＥＫ２９３−ＭＢ８細胞系の免疫組織化学的染色の結果を示す。 図３は、モノクローナル抗体Ｊ９５Ｃ３０による２つの悪性乳房切片、１つの正常乳房切片、及びＨＥＫ２９３−ＭＢ８細胞系の免疫組織化学的染色の結果を示す。 図３は、モノクローナル抗体Ｊ９５Ｃ３０による２つの悪性乳房切片、１つの正常乳房切片、及びＨＥＫ２９３−ＭＢ８細胞系の免疫組織化学的染色の結果を示す。 図３は、モノクローナル抗体Ｊ９５Ｃ３０による２つの悪性乳房切片、１つの正常乳房切片、及びＨＥＫ２９３−ＭＢ８細胞系の免疫組織化学的染色の結果を示す。 図４は、ＨＥＫ２９３−ＭＢ８細胞の増殖から採集した３つの上清を示す３つのウエスタンブロットのスキャンを示す。ブロット１は抗ｍｙｃ抗体で視覚化した。ブロット２は抗ＢＵ１０１ポリクローナル抗血清で視覚化した。ブロット３は抗Ｍａｍポリクローナル抗血清で視覚化した。 図４は、ＨＥＫ２９３−ＭＢ８細胞の増殖から採集した３つの上清を示す３つのウエスタンブロットのスキャンを示す。ブロット１は抗ｍｙｃ抗体で視覚化した。ブロット２は抗ＢＵ１０１ポリクローナル抗血清で視覚化した。ブロット３は抗Ｍａｍポリクローナル抗血清で視覚化した。 図４は、ＨＥＫ２９３−ＭＢ８細胞の増殖から採集した３つの上清を示す３つのウエスタンブロットのスキャンを示す。ブロット１は抗ｍｙｃ抗体で視覚化した。ブロット２は抗ＢＵ１０１ポリクローナル抗血清で視覚化した。ブロット３は抗Ｍａｍポリクローナル抗血清で視覚化した。 図５は、抗ｍｙｃモノクローナル抗体による物質の免疫認識を示す２つのドットブロットのスキャンである。上のブロットは、ニッケルキレート化カラムから溶出するＭＢ８細胞の上清からの分画を示す。下のブロットは、ニッケルキレート化カラムから溶出するＨＥＫ２９３細胞のＭａｍ Ｍ／Ｈ一過性トランスフェクションの上清からの分画を示す。 図５は、抗ｍｙｃモノクローナル抗体による物質の免疫認識を示す２つのドットブロットのスキャンである。上のブロットは、ニッケルキレート化カラムから溶出するＭＢ８細胞の上清からの分画を示す。下のブロットは、ニッケルキレート化カラムから溶出するＨＥＫ２９３細胞のＭａｍ Ｍ／Ｈ一過性トランスフェクションの上清からの分画を示す。 図６は、１６のパネルを含む４つのウエスタンブロットのスキャンである。ＭＢ８細胞及びＭａｍ Ｍ／ＨプラスミドによるＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションからの上清を抗ＢＵ１０１、抗Ｍａｍ、及び抗ｍｙｃポリクローナル及びモノクローナル抗体によって分析している。 図６は、１６のパネルを含む４つのウエスタンブロットのスキャンである。ＭＢ８細胞及びＭａｍ Ｍ／ＨプラスミドによるＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションからの上清を抗ＢＵ１０１、抗Ｍａｍ、及び抗ｍｙｃポリクローナル及びモノクローナル抗体によって分析している。 図６は、１６のパネルを含む４つのウエスタンブロットのスキャンである。ＭＢ８細胞及びＭａｍ Ｍ／ＨプラスミドによるＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションからの上清を抗ＢＵ１０１、抗Ｍａｍ、及び抗ｍｙｃポリクローナル及びモノクローナル抗体によって分析している。 図６は、１６のパネルを含む４つのウエスタンブロットのスキャンである。ＭＢ８細胞及びＭａｍ Ｍ／ＨプラスミドによるＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションからの上清を抗ＢＵ１０１、抗Ｍａｍ、及び抗ｍｙｃポリクローナル及びモノクローナル抗体によって分析している。 図７は等電点ゲル電気泳動（ｐＨ３−１０）からのウエスタンブロットのスキャンである。 図８は、抗ｍｙｃモノクローナル抗体による物質の免疫認識を示す２つのドットブロットのスキャンである。上のブロットは、Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５カラムから溶出するＭＢ８細胞の上清からの分画を示す。下のブロットは、Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５カラムから溶出するＨＥＫ２９３細胞のＭａｍ Ｍ／Ｈ一過性トランスフェクションの上清からの分画を示す。 図８は、抗ｍｙｃモノクローナル抗体による物質の免疫認識を示す２つのドットブロットのスキャンである。上のブロットは、Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５カラムから溶出するＭＢ８細胞の上清からの分画を示す。下のブロットは、Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５カラムから溶出するＨＥＫ２９３細胞のＭａｍ Ｍ／Ｈ一過性トランスフェクションの上清からの分画を示す。 図９は、溶出量とタンパク質標準品の分子量の関係を示すＳｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムついての標準曲線である。 図１０は、抗ｍｙｃモノクローナル抗体による物質の免疫認識を示すドットブロットのスキャンである。このブロットは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムから溶出するＭＢ８細胞の上清からの分画を示す。 図１１は、組換えｍｙｃ−ｈｉｓ標識Ｍａｍ及びＢＵ１０１で２つの組織抽出物及び２つの上清を分析したウエスタンブロットのスキャンである。上のブロットは抗ＢＵ１０１モノクローナル抗体で視覚化し、下のブロットは抗Ｍａｍポリクローナル抗体で視覚化した。 図１１は、組換えｍｙｃ−ｈｉｓ標識Ｍａｍ及びＢＵ１０１で２つの組織抽出物及び２つの上清を分析したウエスタンブロットのスキャンである。上のブロットは抗ＢＵ１０１モノクローナル抗体で視覚化し、下のブロットは抗Ｍａｍポリクローナル抗体で視覚化した。 図１２は、抗ＢＵ１０１ポリクローナル抗体（上のブロット）又は抗Ｍａｍポリクローナル抗体（下のブロット）による物質の免疫認識を示す２つのドットブロットのスキャンである。両方のブロットが、Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５カラムから溶出する乳癌組織抽出物からの分画を示す。 図１２は、抗ＢＵ１０１ポリクローナル抗体（上のブロット）又は抗Ｍａｍポリクローナル抗体（下のブロット）による物質の免疫認識を示す２つのドットブロットのスキャンである。両方のブロットが、Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５カラムから溶出する乳癌組織抽出物からの分画を示す。 図１３は、抗ＢＵ１０１ポリクローナル抗体（上のブロット）又は抗Ｍａｍポリクローナル抗体（下のブロット）による物質の免疫認識を示す２つのウエスタンブロットのスキャンである。両方のブロットが、Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５カラムから溶出する乳癌組織抽出物からの分画を示す。 図１３は、抗ＢＵ１０１ポリクローナル抗体（上のブロット）又は抗Ｍａｍポリクローナル抗体（下のブロット）による物質の免疫認識を示す２つのウエスタンブロットのスキャンである。両方のブロットが、Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５カラムから溶出する乳癌組織抽出物からの分画を示す。 図１４は、抗ＢＵ１０１ポリクローナル抗体（上のブロット）又は抗Ｍａｍポリクローナル抗体（下のブロット）による物質の免疫認識を示す２つのドットブロットのスキャンである。両方のブロットが、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムから溶出する乳癌組織抽出物からの分画を示す。 図１４は、抗ＢＵ１０１ポリクローナル抗体（上のブロット）又は抗Ｍａｍポリクローナル抗体（下のブロット）による物質の免疫認識を示す２つのドットブロットのスキャンである。両方のブロットが、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムから溶出する乳癌組織抽出物からの分画を示す。 図１５は、前処理プロトコールを用いたｍｙｃ−ｈｉｓ標識ポリペプチドの免疫認識の増強を示すドットブロットのスキャンである。 図１６は、ＢＵ１０１アミノ酸配列である。 図１７は、個々に発現されたタグからのＢＳ１０６の構築物である。 図１８ＡはＢＳ１０６ポリヌクレオチド配列（配列番号７）であり、１８ＢはＢＳ１０６ポリペプチド配列（配列番号８）である。 図１８ＡはＢＳ１０６ポリヌクレオチド配列（配列番号７）であり、１８ＢはＢＳ１０６ポリペプチド配列（配列番号８）である。 図１９Ａ、１９Ｂ及び１９Ｃは、それぞれＢＵ１０１、マンマグロビン及びＢＳ１０６の相対的発現を示す。 図１９Ａ、１９Ｂ及び１９Ｃは、それぞれＢＵ１０１、マンマグロビン及びＢＳ１０６の相対的発現を示す。 図１９Ａ、１９Ｂ及び１９Ｃは、それぞれＢＵ１０１、マンマグロビン及びＢＳ１０６の相対的発現を示す。 図２０Ａ−Ｄは、マンマグロビンと複合したＢＵ１０１を示す。 図２０Ａ−Ｄは、マンマグロビンと複合したＢＵ１０１を示す。 図２０Ａ−Ｄは、マンマグロビンと複合したＢＵ１０１を示す。 図２０Ａ−Ｄは、マンマグロビンと複合したＢＵ１０１を示す。 図２１は、マーカー発現と臨床及び分子パラメータの相関を示す。
【配列表】
Figure 2005524053
Figure 2005524053
Figure 2005524053

Claims (5)

  1. 次の乳癌マーカーであるマンマグロビン、ＢＵ１０１及びＢＳ１０６の少なくとも２つを含む、乳癌を検出するためのアッセイ。
  2. （ａ）患者から被験試料を得る段階、
    （ｂ）前記被験試料を、マンマグロビン、ＢＵ１０１及びＢＳ１０６から成る群より選択される少なくとも２つのポリペプチドと接触させる段、及び
    （ｃ）段階（ｂ）のポリペプチドの１つ又はそれ以上の存在を乳癌に相関させる段階、
    を含む、乳癌を検出するための方法。
  3. （ａ）患者から試料を得る段階、
    （ｂ）前記試料を、ＢＳ１０６、マンマグロビン、ＢＵ１０１及び多量体抗原（ＭＰＡ）に特異的な少なくとも２つの抗体と接触させる段階、
    但し、前記多量体抗原は、少なくとも１つのＢＵ１０１ポリペプチド及び少なくとも１つのマンマグロビンポリペプチドを含み、
    前記接触は、抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で行われ、及び
    （ｃ）前記複合体の存在が前記患者における癌の存在を指示する、前記複合体を検出する段階、
    を含む、乳癌の存在を検出する方法。
  4. （ａ）患者から切除した腫瘍から誘導される組織切片又は細胞培養を調製する段階、
    （ｂ）前記組織切片又は細胞培養を、次のポリペプチド：ＢＳ１０６、マンマグロビン及びＢＵ１０１の少なくとも２つに特異的な抗体に、抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で接触させる段階、及び
    （ｃ）前記複合体の存在が前記患者における癌の存在を指示する、前記組織切片又は細胞培養における前記複合体の存在の場所を特定する段階、
    を含む、患者において乳癌を診断する方法。
  5. （ａ）患者から被験試料を得る段階、
    （ｂ）前記被験試料を、マンマグロビン、ＢＵ１０１、ＢＳ１０６及びＭＰＡから成る群より選択される少なくとも２つのポリペプチドと接触させる段階、及び
    （ｃ）段階（ｂ）のポリペプチドの１又はそれ以上の存在を乳癌に相関させる段階、
    を含む、乳癌を検出するための方法。
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