JP2003523171A - 乳房の疾患を検出するために有用な試薬と方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＢＵ１０１と称し、乳房組織から転写される、一連の隣接し、部分的に重複するｃＤＮＡ配列およびそれにコードされるポリペプチドについて記載する。これらの配列は乳房の疾患および症状、例えば乳癌の検出、診断、病期決定、モニター観察、予知、インビボイメージング、予防もしくは処置、または個体の素因決定に有用である。またＢＵ１０１にコードされるポリペプチドまたはタンパク質に特異的に結合する抗体、および組織特異的ＢＵ１０１ポリペプチドの作用を防御するアゴニストまたは阻害因子をも提供し、これらの分子は乳房疾患、腫瘍または転移の治療的処置に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （関連出願との前後参照） 本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．β１２０に従って出願優先権を主張する、１９９６
年８月１９日出願の米国特許願通し番号第０８／６９７，１０５号の一部継続出
願である、１９９７年８月１５日出願の米国特許願通し番号第０８／９１２，，
２７６号の一部継続出願であり、前記出願はそれらの全体が参照してここに組み
込まれる。

【０００２】 （発明の背景） 本発明は一般に乳房の疾患の検出に関する。さらに、本発明はまた、乳房の疾
患を検出するための試薬と方法に関する。より特定すると、本発明はポリヌクレ
オチド配列及びそれらによってコードされるポリペプチド配列のような試薬、な
らびにこれらの配列を用いる方法に関する。ポリヌクレオチド及びポリペプチド
配列は、乳癌のような乳房の疾患又は状態を検出する、診断する、病期分類する
、監視する、予後判定する、生体内で画像化する、予防する又は治療する、ある
いは乳房の疾患又は状態への素因を判定するのに有用である。

【０００３】 乳癌は米国では女性において発生する最も一般的な形態の癌である。米国にお
ける乳癌の発生率は、１９９８年の間に乳癌と診断された症例が１８０，３００
例、乳癌に関連する死亡が４３，９００例と報告されている（米国癌協会（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ）統計）。世界的に見ると、乳癌
の発生数は１９８５年の７００，０００から１９９０年には約９００，０００に
増加した。Ｇ．Ｎ．Ｈｏｒｔｏｂａｇｙｉら、ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉ
ｎ ４５：１９９−２２６（１９９５）。

【０００４】 乳癌のような乳房の疾患又は状態を検出する、診断する、病期分類する、監視
する、予後判定する、生体内で画像化する、予防する又は治療する、あるいは乳
房の疾患又は状態への素因を判定するために使用される手順は、患者の結果にと
って決定的な重要性を持つ。例えば、早期乳癌と診断された患者は５年間の相対
生存率が９０％以上であるのに比べて、遠隔転移乳癌と診断された患者について
は約２０％の生存率である。（米国癌協会統計）。現在、早期乳癌の最良の初期
指標は乳房の理学的検査とマンモグラフィである。Ｊ．Ｒ．Ｈａｒｒｉｓら、「
Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎ
ｃｏｌｏｇｙ」、第４版より、ｐ．１２６４−１３３２，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈ
ｉａ，ＰＡ：Ｊ／Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．（１９９３）。マンモグラ
フィは理学的検査で検出できるよりも前に乳癌を検出しうるが、限界がある。例
えば、マンモグラフィの予測的価値は観察者の技術と乳房Ｘ線像（マンモグラム
）の質に依存する。さらに、疑わしいマンモグラムの８０から９３％が偽陽性で
あり、乳癌を有する女性の１０から１５％がマンモグラムで偽陰性である。Ｃ．
Ｊ．Ｗｒｉｇｈｔら、Ｌａｎｃｅｔ ３４６：２９−３２（１９９５）。明らか
に、早期乳癌を検出するためのより感受性の高い特異的な新しい診断方法が求め
られている。

【０００５】 乳癌患者は、初期治療後及び補助療法の間、治療に対する応答を調べ、存続又
は再発疾患、あるいは遠隔転移を検出するために厳重に監視される。乳癌を監視
するための現在の診断方法は、マンモグラフィ、骨スキャン、胸部Ｘ線写真、肝
機能検査及び血清マーカーに関する検査を含む。患者を監視するために最も一般
的に使用される血清腫瘍マーカーは、癌胎児抗原（ＣＥＡ）及びＣＡ １５−３
である。ＣＥＡの限界として、転移性疾患を有する女性の約４０％において血清
レベルの上昇がないことが含まれる。さらに、補助療法中のＣＥＡ上昇は再発に
は相関せず、臨床的に重要でない他の因子に相関すると考えられる。ＣＡ １５
−３も、かなりの数の進行性疾患の患者において陰性の場合があり、それ故転移
を予測することができない。ＣＥＡ及びＣＡ １５−３のいずれも、悪性ではな
い良性状態でも上昇することがあり、偽陽性の結果をもたらす。それ故、癌の再
発を検出する上でより感受性が高く、特異的な乳房関連マーカーを発見すること
は臨床的に有益であろう。Ｊ．Ｒ．Ｈａｒｒｉｓら、前出。Ｍ．Ｄ．Ｓｃｈｗａ
ｒｔｚ：Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏ
ｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，第１巻、第４版、ｐ．５３１−５４２，Ｐｈｉｌａｄｅ
ｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｊ／Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．１９９３。

【０００６】 乳癌を管理する際のもうひとつの重要なステップは患者の疾患の病期を判定す
ることである。というのは病期判定は潜在的な予後的価値を持ち、至適治療をデ
ザインするための判定基準を提供するからである。現在、乳癌の病理学的病期分
類は、より正確な予後判定をもたらすことから、臨床的病期分類よりも好ましい
。Ｊ．Ｒ．Ｈａｒｒｉｓら、前出。他方で、臨床的病期分類は、病理学的評価の
ために組織を採取するという観血的手順に依存しないため、病理学的病期分類と
少なくとも同程度に正確であれば好ましいであろう。浸潤の異なる段階を識別で
きる血清中又は尿中の新しいマーカーを検出することにより、乳癌の病期分類を
改善できるであろう。そのようなマーカーは、乳房の原発腫瘍に由来するが、血
中、骨髄又はリンパ節に存在する細胞によって発現されるｍＲＮＡ又はタンパク
マーカーであり、これらの遠位器官への転移に関する感受性の高い指標として用
いることができる。例えば、乳房上皮細胞に関連する特異的タンパク抗原及びｍ
ＲＮＡは、免疫組織化学的手法及びＲＴ−ＯＣＲにより、それぞれ乳癌患者の骨
髄、リンパ節及び血液において検出され、転移を示唆した。Ｋ．Ｐａｎｔｅｌら
、Ｏｎｋｏｌｏｇｉｅ １８：３９４−４０１（１９９５）。

【０００７】 そのような診断方法はまた、最小限に侵襲的な手順で得られる血液、血漿、血
清又は尿などの試験サンプルにおける、免疫学的方法によって検出しうる様々な
疾患マーカーの発現に基づいた免疫学的アッセイを含みうる。これらの診断方法
は、医師が乳癌患者を管理する助けとなる情報を、患者にとっては低いコストで
提供するであろう。前立腺特異抗原（ＰＳＡ）やヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈ
ＣＧ）のようなマーカーが存在し、それぞれ前立腺癌と精巣癌に関して患者をス
クリーニングするために臨床的に使用される。例えば、ＰＳＡは通常前立腺によ
って高いレベルで精液中に分泌されるが、正常な前立腺を有する男性の血液中に
も非常に低いレベルで存在する。血清中の高レベルのＰＳＡタンパクは、無症候
男性における前立腺癌又は前立腺疾患の早期検出に用いられる。例えば、Ｇ．Ｅ
．Ｈａｎｋｓら、「Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔ
ｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」第１巻、第４版より、ｐ．１０７３−１１１
３，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｊ．Ｐ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．
１９９３、Ｍ．Ｋ．Ｓｃｈｗａｒｔｚら、「Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ
ｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」第１巻、第４版より
、ｐ．５３１−５４２，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｊ．Ｐ．Ｌｉｐｐｉ
ｎｃｏｔｔ Ｃｏ．１９９３参照。同様に、通常は乳房で発現されるが、乳房疾
患の結果として不適切な体画分において高い量で認められる新しいマーカーを使
用することにより、乳癌の管理を改善することができるであろう。

【０００８】 さらに、早期乳癌の生物学的挙動を予測しうる新しいマーカーも重要な価値を
持つであろう。患者の生活を脅かす又は将来脅かすことになる早期乳癌は、脅威
ではない又はその恐れのないものよりも臨床的に重要である。Ｇ．Ｅ．Ｈａｎｋ
ｓ，前出。リンパ節が組織学的に陰性である患者が癌の再発を経験することにな
るかどうかを予測するため、また原位置での腺管癌の症例が侵襲性乳癌に進行す
るかどうかを予測するために、そのようなマーカーが必要とされる。より正確な
予後マーカーは、臨床医が、乳房に限局されているが、攻撃的治療を行わなけれ
ば進行して転移するであろう早期癌を正確に同定することを可能にする。さらに
、患者に攻撃的癌についてのマーカーが存在しなければ、その患者は費用がかか
って恩恵のない治療を免れることができるであろう。Ｊ．Ｒ．Ｈａｒｒｉｓら、
前出。Ｅ．Ｒ．Ｆｒｙｋｂｅｒｇら、Ｃａｎｃｅｒ ７４：３５０−３６１（１
９９４）。

【０００９】 それ故、乳房の疾患又は状態を検出する、診断する、病期分類する、監視する
、予後判定する、生体内で画像化する、予防する又は治療する、あるいは乳房の
疾患又は状態への素因を判定するために有用な特異的方法と試薬を提供すること
は有益であろう。そのような方法は、癌を含めて、乳房に関連する疾患及び状態
において過剰発現される遺伝子産物に関して試験サンプルを検定することを含む
。そのような方法はまた、癌を含めて、乳房に関連する疾患及び状態によって変
化した遺伝子産物に関して試験サンプルを検定することを含みうる。そのような
方法はさらに、癌を含めて、乳房に関連する疾患及び状態によって体内の様々な
組織及び画分における分布が変化した遺伝子産物に関して試験サンプルを検定す
ることを含みうる。そのような方法は、試験サンプル中のｍＲＮＡからｃＤＮＡ
を作製し、必要に応じて遺伝子又はその断片に対応するｃＤＮＡの部分を増幅し
て、癌を含めた疾患又は状態が存在する指標としてｃＤＮＡ産物を検出する、あ
るいは疾患が存在する指標として遺伝子配列を含むｍＲＮＡの翻訳産物を検出す
ることを含むであろう。有用な試薬は、生検組織、血液又は他の試験サンプルか
ら抽出されたｍＲＮＡの逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、
ＰＣＲ、又はハイブリダイゼーションアッセイのような診断方法において使用し
うるポリヌクレオチド又はその断片；あるいはそのようなｍＲＮＡの翻訳産物で
あるタンパク質；あるいはこれらのタンパク質に対する抗体を含む。そのような
アッセイは、遺伝子産物に関してサンプルを検定し、乳房疾患の指標としてかか
る産物を検出するための方法を含むであろう。癌を含めた乳房の疾患及び状態の
ための薬物治療及び遺伝子治療は、これらの同定された遺伝子配列又はそれらが
発現するタンパク質に基礎づけることができ、個々の治療の効果をモニターする
ことができる。さらに、癌のような初期段階の乳房疾患を検出することができる
使用可能な代替的、非外科的診断法が得られることは有益であろう。

【００１０】 （発明の概要） 本発明は、試験サンプルを少なくとも１個のＢＵ１０１特異的ポリヌクレオチ
ドに接触させ、試験サンプル中の標的ＢＵ１０１ポリヌクレオチドの存在を検出
することを含む、試験サンプルにおいて標的ＢＵ１０１ポリヌクレオチドを検出
する方法を提供する。ＢＵ１０１特異的ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列
番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及びそれらの断片
又は相補体から成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも５０％の同
一性を持つ。また、ＢＵ１０１特異的ポリヌクレオチドは、当該方法を実施する
前に固相に結合することもできる。

【００１１】 本発明はまた、ｃＤＮＡを作製するために少なくとも１個のプライマーで逆転
写（ＲＴ）を実施し、ＢＵ１０１オリゴヌクレオチドをセンス及びアンチセンス
プライマーとして用いて、そのようにして得たｃＤＮＡを増幅してＢＵ１０１ア
ンプリコン（増幅単位）を入手し、そして試験サンプル中のＢＵ１０１ｍＲＮＡ
の存在の指標としてＢＵ１０１アンプリコンの存在を検出することを含み、前記
ＢＵ１０１オリゴヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列
番号４、配列番号５、配列番号６、及びそれらの断片又は相補体から成る群から
選択される配列と少なくとも５０％の同一性を持つ、試験サンプルにおいてＢＵ
１０１ｍＲＮＡを検出するための方法を提供する。増幅はポリメラーゼ連鎖反応
によって実施することができる。また、当該方法を実施する前、増幅の前又は検
出の前に試験サンプルを固相と反応させることもできる。この反応は直接又は間
接反応のいずれでもよい。さらに、検出段階は、測定可能なシグナルを生じるこ
とができる検出可能標識を利用することを含みうる。検出可能標識は固相に結合
することができる。

【００１２】 本発明はさらに、次の事柄を含む、標的ＢＵ１０１ポリヌクレオチドを含むこ
とが疑われる試験サンプルにおいて標的ＢＵ１０１ポリヌクレオチドを検出する
方法を提供する：（ａ）センスプライマーとして少なくとも１個のＢＵ１０１オ
リゴヌクレオチドとアンチセンスプライマーとして少なくとも１個のＢＵ１０１
オリゴヌクレオチドに試験サンプルを接触させ、それを増幅して第一段階反応産
物を得る；（ｂ）他のＢＵ１０１オリゴヌクレオチドが（ａ）段階で使用される
ＢＵ１０１オリゴヌクレオチドの３’側に位置し、第一段階反応産物に相補的で
あることを条件として、第一段階反応産物を少なくとも１個の他のＢＵ１０１オ
リゴヌクレオチドに接触させて第二段階反応産物を得る；そして（ｃ）試験サン
プルにおける標的ＢＵ１０１ポリヌクレオチドの存在の指標として第二段階反応
産物を検出する。当該方法において試薬として選択されるＢＵ１０１オリゴヌク
レオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、
配列番号６、及びそれらの断片又は相補体から成る群から選択される配列と少な
くとも５０％の同一性を持つ。増幅はポリメラーゼ連鎖反応によって実施するこ
とができる。試験サンプルを、当該方法を実施する前、増幅の前又は検出の前に
固相と直接又は間接的に反応させることができる。検出段階はまた、測定可能な
シグナルを生じることができる検出可能標識を利用することを含む；さらに、検
出可能標識を固相に結合することができる。

【００１３】 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６
、及びそれらの断片又は相補体から成る群から選択される少なくとも１個のＢＵ
１０１特異的ポリヌクレオチドが入った容器を含む、試験サンプルにおいて標的
ＢＵ１０１ポリヌクレオチドを検出するために有用な試験キットも提供する。こ
れらの試験キットはさらに、試験サンプル（例えば、血液、尿、唾液及び便など
）を採集するために有用なツールが入った容器を含む。そのようなツールは、血
液を採集し、安定させるためのランセット及び吸収紙又は布；唾液を採集し、安
定させるための綿棒；及び尿又は便のサンプルを採集し、安定させるコップを含
む。紙、布、綿棒、コップ等のような採集材料は、サンプルの変性又は不可逆的
吸着を避けるため任意に処理してもよい。採集材料はまた、標本の完全性を維持
するのを助けるために保存剤、安定剤又は抗菌剤で処理する又はそれらを含むこ
とができる。

【００１４】 本発明はまた、ＢＵ１０１遺伝子から誘導される精製ポリヌクレオチド又はそ
の断片を提供する。精製ポリヌクレオチドはＢＵ１０１遺伝子の核酸又はその相
補体に選択的にハイブリダイズすることができる。当該ポリヌクレオチドは、配
列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及
びそれらの断片又は相補体から成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なく
とも５０％の同一性を持つ。さらに、精製ポリヌクレオチドは組換え及び／又は
合成手法によって作製することができる。精製組換えポリヌクレオチドを組換え
ベクター内に組み込むことができる。本発明はさらに、組換えベクターでトラン
スフェクションした宿主細胞を含む。

【００１５】 本発明はさらに、ＢＵ１０１から誘導されるオープンリーディングフレームを
含む核酸配列を包含する組換え発現系を提供する。核酸配列は、配列番号１、配
列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及びそれらの断
片又は相補体から成る群から選択される配列と少なくとも５０％の同一性を持つ
。核酸配列は所望する宿主と適合性である制御配列に機能的に連結される。この
組換え発現系でトランスフェクションされた細胞も提供する。

【００１６】 本発明はまた、ＢＵ１０１によってコードされるポリペプチドを提供する。ポ
リペプチドは、精製形態で提供される、組換えテクノロジーによって作製するか
、又は合成手法によって作製することができる。当該ポリペプチドは、配列番号
２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２
５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９（配列番号２０
−２９）、及びそれらの断片から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくと
も５０％の同一性を持つアミノ酸配列を含む。

【００１７】 また、少なくとも１個のＢＵ１０１エピトープに特異的に結合する、抗体のよ
うな特異的結合分子を提供する。当該エピトープは、配列番号２０−２９及びそ
れらの断片から成る群から選択されるアミノ酸配列から誘導される。試験サンプ
ルにおけるＢＵ１０１抗原又は抗ＢＵ１０１抗体の存在を判定するためのアッセ
イキットも包含される。１つの実施形態では、アッセイキットは、配列番号２０
−２９及びそれらの断片から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５
０％の同一性を持つ少なくとも１個のＢＵ１０１ポリペプチドが入った容器を含
む。さらに、試験キットは、試験サンプル（血液、尿、唾液及び便など）を採集
するために有用なツールが入った容器を含みうる。そのようなツールは、血液を
採集し、安定させるためのランセット及び吸収紙又は布；唾液を採集し、安定さ
せるための綿棒；及び尿又は便のサンプルを採集し、安定させるコップを含む。
紙、布、綿棒、コップ等のような採集材料は、サンプルの変性又は不可逆的吸着
を避けるため任意に処理してもよい。これらの採集材料はまた、標本の完全性を
維持するのを助けるために保存剤、安定剤又は抗菌剤で処理する又はそれらを含
むことができる。また、ポリペプチドは固相に結合することができる。

【００１８】 本発明のもう１つの実施形態では、ＢＵ１０１に対する抗体又はその断片のよ
うな特異的結合分子を使用して、疾患又は状態を検出する又は診断するために患
者における抗原の局在を検出する又は画像化することができる。そのような抗体
は、ポリクローナル又はモノクローナルであるか、若しくは分子生物学手法によ
って作製することができ、放射性同位元素及び常磁性金属を含むが、これらに限
定されない、様々な検出可能標識で標識することができる。さらに、モノクロー
ナル、ポリクローナル、又は分子生物学手法によって作製される抗体又はその断
片は、ＢＵ１０１抗原の発現を特徴とする疾患の治療のための治療薬として使用
することができる。治療適用の場合には、抗体は誘導体化せずに使用するか、若
しくは放射性同位元素、酵素、毒素、薬剤、プロドラッグ等のような細胞傷害性
物質で誘導体化することができる。

【００１９】 試験サンプル中のＢＵ１０１抗原又は抗ＢＵ１０１抗体の存在を調べるための
もう１つのアッセイキットは、ＢＵ１０１抗原に特異的に結合する抗体が入った
容器を含み、かかるＢＵ１０１抗原は少なくとも１個のＢＵ１０１コードエピト
ープを含む。ＢＵ１０１抗原は、配列番号２０−２９及びそれらの断片から成る
群から選択されるＢＵ１０１コード抗原の配列と少なくとも約５０％の配列類似
性を持つ。これらの試験キットはさらに、試験サンプル（血液、尿、唾液及び便
など）を採集するために有用なツールが入った容器を含みうる。そのようなツー
ルは、血液を採集し、安定させるためのランセット及び吸収紙又は布；唾液を採
集し、安定させるための綿棒；及び尿又は便のサンプルを採集し、安定させるコ
ップを含む。紙、布、綿棒、コップ等のような採集材料は、サンプルの変性又は
不可逆的吸着を避けるため任意に処理してもよい。これらの採集材料はまた、標
本の完全性を維持するのを助けるために保存剤、安定剤又は抗菌剤で処理する又
はそれらを含むことができる。当該抗体は固相に結合することができる。

【００２０】 発現ベクターでトランスフェクションした宿主細胞をインキュベーションする
ことを含む、ＢＵ１０１の少なくとも１個のエピトープを含むポリペプチドを作
製するための方法を提供する。このベクターはポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド配列を含み、かかるポリペプチドは、配列番号２０−２９及びそれら
の断片から成る群から選択されるＢＵ１０１アミノ酸配列と少なくとも約５０％
の同一性を持つアミノ酸配列を含む。

【００２１】 ＢＵ１０１抗原を含むことが疑われる試験サンプルにおいてＢＵ１０１抗原を
検出するための方法も提供する。かかる方法は、ＢＵ１０１抗原の少なくとも１
個のエピトープに特異的に結合する抗体又はその断片に、抗体／抗原複合体を形
成するのに十分な時間と条件下で試験サンプルを接触させ、試験サンプル中にＢ
Ｕ１０１抗原が存在することの指標としてそのような抗体を含む複合体の存在を
検出することを含む。抗体は固相に結合することができ、モノクローナル又はポ
リクローナル抗体のいずれでもよい。さらに、当該抗体は、配列番号２０−２９
及びそれらの断片から成る群から選択される少なくとも１個のＢＵ１０１抗原に
特異的に結合する。

【００２２】 これらの抗体を含むことが疑われる試験サンプルにおいて、ＢＵ１０１抗原に
特異的に結合する抗体を検出するもう１つの方法を提供する。かかる方法は、少
なくとも１個のＢＵ１０１エピトープを含むポリペプチドに試験サンプルを接触
させることを含み、かかるＢＵ１０１エピトープは、ＢＵ１０１ポリヌクレオチ
ドによってコードされるアミノ酸配列又はその断片と少なくとも５０％の同一性
を持つアミノ酸配列を含む。接触は、抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時
間と条件下で実施される。当該方法はさらに、ポリペプチドを含む複合体を検出
することを必要とする。ポリペプチドは固相に結合することができる。さらに、
ポリペプチドは、配列番号２０−２９及びそれらの断片から成る群から選択され
るアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を持つ組換えタンパク又は合成ペプ
チドでありうる。

【００２３】 本発明は、ＢＵ１０１抗原の少なくとも１個のエピトープ又はその断片をコー
ドするＢＵ１０１核酸配列でトランスフェクションした細胞を提供する。核酸配
列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番
号６、及びそれらの断片又は相補体から成る群から選択される。

【００２４】 ＢＵ１０１抗原に対する抗体を産生するための方法も提供する。かかる方法は
単離した免疫原性ポリペプチド又はその断片を個体に投与することを含み、前記
の単離した免疫原性ポリペプチドは少なくとも１個のＢＵ１０１エピトープを含
む。免疫応答を生じるのに十分な量で免疫原性ポリペプチドを投与する。単離し
た免疫原性ポリペプチドは、配列番号２０−２９及びそれらの断片から成る群か
ら選択されるアミノ酸配列を含む。

【００２５】 ＢＵ１０１抗原に特異的に結合する抗体を産生するためのもう１つの方法も開
示する。かかる方法は、配列番号２０−２９及びそれらの断片から成る群から選
択されるアミノ酸から誘導される、少なくとも１個のＢＵ１０１エピトープをコ
ードする核酸配列を含むプラスミドを個体に投与することを含む。プラスミドは
、プラスミドが個体内で細胞によって取り込まれ、免疫応答を生じるのに十分な
レベルで発現されるような量で投与する。

【００２６】 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６
、及びそれらの断片又は相補体から成る群から選択されるポリヌクレオチドと少
なくとも５０％の同一性を持つ、少なくとも約１０−１２個のヌクレオチドから
成るＢＵ１０１ポリヌクレオチドを含む組成物も提供する。ＢＵ１０１ポリヌク
レオチドは、少なくとも１個のＢＵ１０１エピトープを持つアミノ酸配列をコー
ドする。本発明によって提供されるもう１つの組成物は、約８−１０個のアミノ
酸から成る少なくとも１個のＢＵ１０１エピトープを持つポリペプチドを含む。
当該ポリペプチドは、配列番号２０−２９及びそれらの断片から成る群から選択
されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を持つアミノ酸配列を含む。ま
た、配列番号２０と少なくとも５０％の同一性を持つＢＵ１０１ポリペプチドを
コードする遺伝子又はその断片、及び配列番号４、配列番号５、又は配列番号６
と少なくとも５０％の同一性を持つＤＮＡを含む遺伝子又はその断片も提供する
。

【００２７】 （図面の簡単な説明） 図１は、クローン２０８３５７８Ｈ１（配列番号１）、６０３１４８Ｈ１（配
列番号２）、６０４２９０Ｈ１（配列番号３）のヌクレオチド整列化、クローン
２０８３５７８Ｈ１及び６０３１４８Ｈ１の完全長配列［それぞれ、２０８３５
７８ｉｎｈ（配列番号４）及び６０３１４８ｉｎｈ（配列番号５）と称される］
、及びそれらから誘導されるコンセンサス配列（配列番号６）を示す。

【００２８】 図２は、オーバーラップクローン２０８３５７８Ｈ１（配列番号１）、６０３
１４８ＨＩ（配列番号２）、６０４２９０Ｈ１（配列番号３）、２０８３５７８
ｉｎｈ（配列番号４）、６０３１４８ｉｎｈ（配列番号５）のヌクレオチド整列
化からのコンセンサスヌクレオチド配列（配列番号６）の形成を表わすコンティ
グ地図を示す。

【００２９】 図３Ａは、乳房組織と非乳房組織抽出物からのＲＮＡのエチジウムブロマイド
染色アガロースゲルのスキャンを示す。図３Ｂは、ＢＵ１０１放射性同位元素標
識プローブとのハイブリダイゼーション後の対応するＲＮＡのノーザンブロット
である。

【００３０】 図４は、正常乳房、乳癌、結腸及び肺組織のＲＮＡをテンプレートとして使用
した、ＢＵ１０１ ＲＮＡ特異的ＲＴ−ＰＣＲ増幅産物のＳＹＢＲ（登録商標）
Ｇｒｅｅｎ染色アガロースゲルのスキャンである。

【００３１】 図５は、ＢＵ１０１ ＲＮＡ特異的ＲＴ−ＰＣＲ増幅産物のＳＹＢＲ（登録商
標）Ｇｒｅｅｎ染色アガロースゲルのスキャンである。この図は、胎盤ＤＮＡを
ＲＮＡ対照とし、水を試薬対照として使用した、ＭＤＡ ３６１細胞系のＲＮＡ
による２６８塩基対のＢＵ１０１特異的アンプリコンを示す。

【００３２】 図６は、ＢＵ１０１アンプリコンが、ＬＣｘ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ系
（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬよ
り入手可能）を用いて、ＭＤＡ ３６１細胞系からの２００フェムトグラム（ｆ
ｇ）のＲＮＡで容易に検出されたことを示す。

【００３３】 図７は、ＬＣｘ（登録商標）系を用いてＢＵ１０１活性に関して検定した正常
乳房、乳癌、正常結腸、結腸癌、正常肺及び肺癌組織からの１０ピコグラム（ｐ
ｇ）のＲＮＡの結果を示す。

【００３４】 図８は、ＢＵ１０１合成ペプチド（配列番号２８）に対する抗血清でプローブ
した一連の組織タンパク抽出物に関して実施したウエスタンブロットの結果を示
す。

【００３５】 （発明の詳細な説明） 本発明は、配列番号２０と少なくとも約５０％の同一性を持つＢＵ１０１ポリ
ペプチドをコードする遺伝子又はその断片を提供する。本発明はさらに、配列番
号４、配列番号５、又は配列番号６と少なくとも５０％の同一性を持つＤＮＡを
含むＢＵ１０１遺伝子又はその断片を包含する。

【００３６】 本発明はまた、試験サンプル中のｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、乳房組織遺
伝子ＢＵ１０１の存在の指標としてｃＤＮＡを検出することを含む、ＢＵ１０１
と称される乳房組織遺伝子の産物に関して試験サンプルを検定するための方法を
提供する。かかる方法は、当該遺伝子又はその断片に対応する、ＢＵ１０１から
のｍＲＮＡの１つ又はそれ以上の部分を増幅する増幅段階を含みうる。また、Ｂ
Ｕ１０１の翻訳産物に関して検定するための方法も提供する。ここで提供する方
法によって検定しうる試験サンプルは、組織、細胞、体液及び分泌物を含む。本
発明はまた、これらの方法を実施する上で有用な、オリゴヌクレオチドプライマ
ー及びポリペプチドのような試薬を提供する。

【００３７】 ここで開示する核酸配列の部分は、ＲＮＡの逆転写又はｃＤＮＡの増幅のため
のプライマーとして、あるいは試験サンプルにおける特定ｍＲＮＡ配列の存在を
調べるためのプローブとして有用である。また、診断的免疫測定法における標準
又は試薬として、製薬的スクリーニングアッセイのための標的として及び／又は
様々な治療のための成分又は標的部位として有用な、コードポリペプチド配列を
作製することを可能にする核酸配列も開示する。これらのポリペプチド配列内に
含まれる少なくとも１個のエピトープに対して特異的なモノクローナル及びポリ
クローナル抗体は、ＢＵ１０１に関連する疾患又は状態、特に乳癌のための治療
薬の送達物質として、ならびに診断試験のため及びスクリーニングのために有用
である。当該遺伝子の他の部分の配列の単離は、これらの核酸配列から誘導され
るプローブ又はＰＣＲプライマーを利用して実施できる。このことは、目的とす
るｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの付加的なプローブを作製すること、ならびに対応する
コードポリペプチド配列を確立することを可能にする。これらの付加的な分子は
、ここで開示するような、ＢＵ１０１によって特徴づけられる乳癌のような乳房
の疾患又は状態を検出する、診断する、病期分類する、監視する、予後判定する
、生体内で画像化する、予防する又は治療する、あるいは乳房の疾患又は状態へ
の素因を判定する上で有用である。

【００３８】 ここで述べる組成物及び方法は、乳房組織の疾患又は状態の指標としていくつ
かのマーカーの同定を可能にし、そこから得られる情報は、ＢＵ１０１に関連す
る疾患又は状態、特に乳癌を検出する、診断する、病期分類する、監視する、予
後判定する、生体内で画像化する、予防する又は治療する、あるいは判定するの
を助けるであろう。試験方法は、例えば、ここで提供される配列を使用し、同時
にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）及びハイブリ
ダイゼーションのような核酸増幅方法が使用できる、プローブアッセイを含む。

【００３９】 さらに、ここで提供するヌクレオチド配列は、免疫原性エピトープが見出され
るオープンリーディングフレームを含む。このエピトープは、ＢＵ１０１に関連
する疾患又は状態にユニークであると考えられる。また、ＢＵ１０１遺伝子によ
ってコードされるポリヌクレオチド又はポリペプチド及びタンパクはマーカーと
して有用であると思われる。このマーカーは、乳癌のような疾患では上昇又は変
化するか、あるいは正常タンパクとして存在するが不適切な体画分に現われる。
エピトープの独自性は、（ｉ）ＢＵ１０１遺伝子によってコードされるタンパク
及びポリペプチドに対する抗体との免疫学的反応性及び特異性、及び（ｉｉ）他
のいかなる組織マーカーとも反応性がないことによって判定されうる。免疫学的
反応性を測定するための方法は周知であり、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）
、酵素結合免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ）、血球凝集反応（ＨＡ）、蛍光偏光
免疫測定法（ＦＰＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）及びその他を含むが
、これらに限定されない。適当な方法のいくつかの例をここで述べる。

【００４０】 特に異なる記載がないかぎり、下記の用語は下記の意味を持つものとする： 指定配列「から誘導される」又は「に特異的な」ポリヌクレオチドは、指定ヌ
クレオチド配列の領域に対応する、すなわち指定ヌクレオチド配列と同一又は相
補的な、一般に少なくとも約６個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８個
のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０−１２個のヌクレオチド、さ
らに一層好ましくは少なくとも約１５−２０個のヌクレオチドの隣接配列を含む
ポリヌクレオチド配列を指す。かかる配列は、当分野において既知の手法によっ
て決定されるような特定ポリヌクレオチド配列に独自の配列に相補的又は同一で
ありうる。指定配列の独自性を判定するための方法として、例えば、データバン
ク中の配列との比較が使用できる。配列を誘導しうる領域は、特異的エピトープ
をコードする領域、ならびに非翻訳及び／又は非転写領域を含むが、これらに限
定されない。

【００４１】 誘導ポリヌクレオチドは、必ずしも検討下にある目的のヌクレオチド配列から
物理的に誘導されるわけではなく、ポリヌクレオチドが由来する領域の塩基配列
によって提供される情報に基づいた、化学合成、複製、逆転写又は転写を含むが
これらに限定されない方法で生成されうる。それ自体で、もとのポリヌクレオチ
ドのセンス又はアンチセンス方向を表わしうる。さらに、指定配列の領域に対応
する領域の組合せは、意図する用途に一致するように当分野において既知の方法
で改変しうる。

【００４２】 特定のポリヌクレオチドの「断片」は、特定ヌクレオチド配列の領域に対応す
る、すなわち特定ヌクレオチド配列と同一又は相補的な、一般に少なくとも約６
個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８個のヌクレオチド、より好ましく
は少なくとも約１０−１２個のヌクレオチド、さらに一層好ましくは少なくとも
約１５−２０個のヌクレオチドの隣接配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。

【００４３】 「プライマー」という用語は、標的ヌクレオチド配列に相補的であり、標的ヌ
クレオチド配列にハイブリダイズするために使用される特異的オリゴヌクレオチ
ド配列を意味する。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ又
は逆転写酵素によって触媒されるヌクレオチド重合のための開始点として働く。

【００４４】 「プローブ」という用語は、相補的配列を担う、サンプル中に存在する特異的
ポリヌクレオチドを同定するために使用できる規定された核酸セグメント（又は
ヌクレオチドアナログセグメント、例えば下記に定義されるようなＰＮＡ）を意
味する。

【００４５】 「によってコードされる」は、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を指し
、かかるポリペプチド配列又はその部分は、当該核酸配列によってコードされる
ポリペプチドからの少なくとも３−５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも
８−１０個のアミノ酸、さらに一層好ましくは少なくとも１５−２０個のアミノ
酸を含む。また、当該配列によってコードされるポリペプチドで免疫学的に同定
可能なポリペプチド配列も包含される。それ故、「ポリペプチド」、「タンパク
」又は「アミノ酸」配列は、ＢＵ１０１アミノ酸配列と少なくとも約５０％の同
一性、好ましくは約６０％の同一性、より好ましくは約７５−８５％の同一性、
最も好ましくは約９０−９５％又はそれ以上の同一性を持つ。さらに、ＢＵ１０
１「ポリペプチド」、「タンパク」又は「アミノ酸」配列は、ＢＵ１０１のポリ
ペプチド又はアミノ酸配列と少なくとも約６０％の類似性、好ましくは少なくと
も約７５％の類似性、より好ましくは約８５％の類似性、最も好ましくは約９５
％又はそれ以上の類似性を持つと考えられる。このアミノ酸配列は、配列番号２
０−２９及びそれらの断片から成る群から選択できる。

【００４６】 ここでは交換可能に使用しうる語である「組換えポリペプチド」、「組換えタ
ンパク」又は「組換え手法によって生成されるポリペプチド」は、その由来又は
操作によって、天然において結合しているポリペプチドの全部又は一部に結合し
ていない及び／又は天然において連結している以外のポリペプチドに連結してい
るポリペプチドを表わす。組換え又はコードポリペプチド又はタンパクは、必ず
しも指定核酸配列から翻訳されるわけではない。化学合成又は組換え発現系の発
現を含めた何らかの方法によっても生成されうる。

【００４７】 ここで使用するとき、「合成ペプチド」という用語は、当業者に周知の方法に
よって化学合成されうる、あらゆる長さのポリマー形態のアミノ酸を意味する。
これらの合成ペプチドは様々な適用において有用である。

【００４８】 ここで使用するとき、「ポリヌクレオチド」という用語は、あらゆる長さのポ
リマー形態のヌクレオチド、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドの
いずれかを意味する。この用語は分子の一次構造だけを指す。従って、この用語
は、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡを含む。また、
メチル化又はキャップ構造のような修飾形態及び非修飾形態のポリヌクレオチド
も包含する。「ポリヌクレオチド」、「オリゴマー」、「オリゴヌクレオチド」
及び「オリゴ」という用語はここでは交換可能に使用される。

【００４９】 「ｃＤＮＡに対応する配列」は、当該配列が、指定ＤＮＡ中の配列と同一又は
相補的であるポリヌクレオチド配列を含むことを意味する。ｃＤＮＡとの同一性
又は相補性の度合（又は「パーセント」）は、約５０％又はそれ以上、好ましく
は少なくとも約７０％又はそれ以上、より好ましくは少なくとも約９０％又はそ
れ以上である。同定されたｃＤＮＡに対応する配列は、少なくとも約５０ヌクレ
オチドの長さ、好ましくは少なくとも６０ヌクレオチドの長さ、より好ましくは
約７０ヌクレオチドの長さである。目的とする遺伝子又は遺伝子断片とｃＤＮＡ
間の対応性は当分野において既知の方法によって決定することができ、例えば配
列決定された物質と上記ｃＤＮＡの直接比較、又はハイブリダイゼーションと一
本鎖ヌクレアーゼによる消化、それに続く消化断片のサイズ決定を含む。

【００５０】 アミノ酸配列の「類似性」を決定するための手法は当分野において周知である
。一般に「類似性」は、アミノ酸が同一であるか若しくは電荷又は疎水性のよう
な類似した化学的及び／又は物理的特性を有する適当な部位での、２個又はそれ
以上のポリペプチドの正確なアミノ酸対アミノ酸の比較を意味する。その後、比
較したポリペプチド配列間でいわゆる「パーセント類似性」を決定することがで
きる。核酸とアミノ酸配列の同一性を決定するための手法も当分野において周知
であり、その遺伝子に関するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定し（通常はｃＤ
ＮＡ中間体を通して）、それによってコードされるアミノ酸配列を決定して、こ
れを第二のアミノ酸配列と比較することを含む。一般に「同一性」という用語は
、それぞれ２個のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の正確なヌクレオチド
対ヌクレオチド又はアミノ酸対アミノ酸の対応性を指す。２個又はそれ以上のポ
リヌクレオチド配列は、それらの「パーセント同一性」を決定することによって
比較できる。２個又はそれ以上のアミノ酸配列は、同様にそれらの「パーセント
同一性」を決定することによって比較できる。核酸又はペプチド配列のいずれで
も、２つの配列のパーセント同一性は、２つの整列化した配列間の正確な一致数
を短い方の配列の長さで割って、１００を掛けたものである。核酸配列に関する
およその整列化は、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の
局所相同性アルゴリズムによって提供される。Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏ
ｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．
Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編集、補遺５、３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂ
ｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎ
ｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発され、Ｇｒｉｂｕｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ
．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）によって
規格化されたスコアリングマトリックスを用いて、このアルゴリズムをペプチド
配列に関して使用するように拡大することができる。核酸及びペプチド配列に関
するこのアルゴリズムの実施は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏ
ｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により、そのＢｅｓｔＦｉｔ ｕｔｉｌｉｔｙ適
用において提供される。この方法についてのデフォルトパラメータがＷｉｓｃｏ
ｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ Ｐｒｏｇｒ
ａｍ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃ
ｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩより入手可能）の中に述べ
られている。配列間のパーセント同一性又は類似性を算定するための他の同等に
適切なプログラムは、当分野において一般的に知られている。

【００５１】 「精製ポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドが自然の状態で結合している
タンパク質を基本的に含まない、例えば約５０％未満、好ましくは約７０％未満
、より好ましくは約９０％未満含む目的ポリヌクレオチド又はその断片を指す。
目的とするポリヌクレオチドを精製するための手法は当分野において周知であり
、例えば、カオトロピック剤によるポリヌクレオチド含有細胞の破壊、及びイオ
ン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及び密度に従っ
た沈降によるポリヌクレオチドとタンパクの分離を含む。

【００５２】 「精製ポリペプチド」又は「精製タンパク」は、目的のポリペプチドが自然の
状態で結合している細胞成分を基本的に含まない、例えば約５０％未満、好まし
くは約７０％未満、より好ましくは約９０％未満含む目的のポリペプチド又はそ
の断片を意味する。目的とするポリペプチドを精製するための方法は当分野にお
いて既知である。

【００５３】 「単離」という用語は、物質をそのもとの環境（例えば、物質が天然に生じる
場合には天然環境）から取り出すことを意味する。例えば、生体動物中に存在す
る、天然に生じるポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていないが、自
然系において共存する物質の一部又は全部から切り離された同じポリヌクレオチ
ド又はＤＮＡ又はポリペプチドは、単離されている。そのようなポリヌクレオチ
ドがベクターの一部である及び／又はそのようなポリヌクレオチド又はポリペプ
チドが組成物の一部である場合あり、かかるベクター又は組成物はその自然環境
の一部ではないという意味で、さらに単離することができる。

【００５４】 「ポリペプチド」及び「タンパク」はここでは交換可能に使用され、共有及び
／又は非共有結合を通して連結されたアミノ酸の少なくとも１つの分子鎖を表わ
す。かかる用語は特定の長さの物質を意味しない。それ故、ペプチド、オリゴペ
プチド及びタンパクはポリペプチドの定義内に包含される。かかる用語は、ポリ
ペプチドの翻訳後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等を含む。
さらに、タンパク断片、アナログ、突然変異タンパク又は変異体タンパク、融合
タンパク等もポリペプチドの意味の中に包含される。

【００５５】 特定ポリペプチドの「断片」は、特定ポリペプチドから誘導される少なくとも
約３−５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約８−１０個のアミノ酸、さ
らに一層好ましくは少なくとも約１５−２０個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を
指す。

【００５６】 「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養」及
び単細胞単位として培養される微生物又は高等真核細胞系を表わす他のそのよう
な用語は、組換えベクター又は他のＤＮＡ導入のためのレシピエントとして使用
されうる又は使用されてきた細胞を指す。

【００５７】 ここで使用されるとき「レプリコン（複製単位）」は、細胞内でのポリヌクレ
オチド複製の自律単位として働くプラスミド、染色体又はウイルスのような何ら
かの遺伝的要素を意味する。

【００５８】 「ベクター」は、結合されたセグメントの複製及び／又は発現をもたらすよう
に、もう１つ別のポリヌクレオチドセグメントが結合されているレプリコンであ
る。

【００５９】 「制御配列」という用語は、それがライゲーションされているコード配列の発
現を生じさせるために必要なポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列
の性質は宿主生物に依存して異なる。原核生物では、そのような制御配列は一般
にプロモーター、リボソーム結合部位及びターミネーターを含む；真核生物では
、そのような制御配列は一般にプロモーター、ターミネーター及び、一部の場合
には、エンハンサーを含む。従って「制御配列」という用語は、最小限として、
その存在が発現のために必要であるすべての成分を含むことが意図されており、
同時にその存在が有益である付加的な成分、例えばリーダー配列も含みうる。

【００６０】 「機能的に連結された」は、記述されている成分が意図されているように機能
することができる関係にある状況を指す。それ故、例えば、コード配列に「機能
的に連結された」制御配列は、制御配列と適合性である条件下でコード配列の発
現が実現されるようにライゲーションされている。

【００６１】 「オープンリーディングフレーム」又は「ＯＲＦ」という用語は、ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド配列の領域を指す。この領域は、コード配列の
一部又はコード配列全体でありうる。

【００６２】 「コード配列」は、適切な調節配列の制御下においたときｍＲＮＡに転写され
、ポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は
、５’末端の翻訳開始コドンと３’末端の翻訳終止コドンによって決定される。
コード配列は、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及び組換えポリヌクレオチド配列を含むが、
これらに限定されない。

【００６３】 「に関して／として免疫学的に同定可能」という用語は、指定ポリペプチド中
にも存在し、指定ポリペプチドに独自であるエピトープ及びポリペプチドの存在
を指す。免疫学的同一性は、抗体結合及び／又は結合における競合によって決定
されうる。これらの手法は当業者には既知であり、またここでも説明する。エピ
トープの独自性はまた、当該エピトープをコードするポリヌクレオチド配列に関
してＧｅｎＢａｎｋのような既知のデータバンクをコンピュータ検索することに
よって、及び他の既知のタンパクとのアミノ酸配列比較によっても決定できる。

【００６４】 ここで使用するとき、「エピトープ」は、ポリペプチド又はタンパクの抗原決
定基を意味する。推定上、エピトープは、当該エピトープに独自の空間コンフォ
メーションに３個のアミノ酸を含むと考えられる。一般に、エピトープは少なく
とも５個のそのようなアミノ酸から成り、より一般的には少なくとも８−１０個
のアミノ酸から成る。空間コンフォメーションを調べる方法は当分野において既
知であり、例えば、ｘ線結晶構造解析及び二次元核磁気共鳴を含む。

【００６５】 「配座エピトープ」は、免疫学的に認識可能な構造のアミノ酸の特異的近位か
ら成るエピトープであり、そのようなアミノ酸は隣接する又は隣接しない順序で
同じポリペプチド上に又は異なるポリペプチド上に存在する。

【００６６】 ポリペプチド内に含まれる特異的エピトープの抗体認識によって抗体に結合す
るとき、ポリペプチドは抗体と「免疫学的に反応性」である。免疫学的反応性は
抗体結合によって、より明細には抗体結合の動態によって、及び／又は抗体が特
異的であるエピトープを含む既知のポリペプチドを競合物質として使用した結合
における競合によって、決定しうる。ポリペプチドが抗体と免疫学的に反応性で
あるかどうかを決定するための方法は当分野において既知である。

【００６７】 ここで使用するとき、「目的のエピトープを含む免疫原性ポリペプチド」とい
う用語は、天然に生じる目的のポリペプチド又はその断片、ならびに他の手段に
よって、例えば化学合成又は組換え生物におけるポリペプチドの発現によって調
製されるポリペプチドを意味する。

【００６８】 「トランスフェクション」という用語は、導入のために使用する方法に関わり
なく、原核又は真核宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの導入を指す。「トラ
ンスフェクション」という用語はポリヌクレオチドの安定な導入と一過性導入の
両方を指し、ポリヌクレオチドの直接取り込み、形質転換、形質導入、及びｆ交
配を包含する。ひとたび宿主細胞に導入されると、外因性ポリヌクレオチドは、
統合されないレプリコン、例えばプラスミドとして保持されるか、又はその代わ
りに宿主ゲノム内に組み込まれうる。

【００６９】 「治療」は、予防及び／又は療法を指す。

【００７０】 ここで使用するとき、「個体」という用語は、脊椎動物、特に哺乳動物種のメ
ンバーを指し、家畜、競技用動物、霊長類及びヒトを含むがこれらに限定されな
い；より特定すると、かかる語はヒトを指す。

【００７１】 ここで使用するとき、「センス鎖」又は「プラス鎖」（又は「＋」）は、ポリ
ペプチドをコードする配列を含む核酸を表わす。「アンチセンス鎖」又は「マイ
ナス鎖」（又は「−」）は、「プラス」鎖の配列に相補的な配列を含む核酸を表
わす。

【００７２】 「試験サンプル」という用語は、分析物（目的とする抗体又は目的とする抗原
など）の供給源である個体の身体の成分を指す。これらの成分は当分野において
周知である。試験サンプルは、典型的には標的配列を含むことが疑われる何らか
のものである。試験サンプルは、個体から標本を採取し、必要に応じてそれに含
まれる細胞を破壊して標的核酸を放出させることのような、当分野において周知
の方法を用いて調製できる。これらの試験サンプルは、ここで述べる本発明の方
法によって試験することができる生物学的サンプルを含み、全血、血清、血漿、
脳脊髄液、痰、気管支洗浄液、気管支吸引液、尿、リンパ液のようなヒト及び動
物の体液、ならびに気道、腸管及び泌尿生殖管の様々な外分泌物、涙、唾液、乳
汁、白血球、骨髄腫等；細胞培養上清のような生物学的液体；固定されうる組織
標本；及び固定されうる細胞標本を包含する。

【００７３】 「精製産物」は、当該産物が正常に結合している細胞成分から、及び目的サン
プル中に存在しうる他の細胞型から分離された産物の試料を指す。

【００７４】 「ＰＮＡ」は、標的の存在を調べるためにここで述べたアッセイのような手順
において使用できる「ペプチド核酸アナログ」を意味する。「ＭＡ」は、標的の
存在を調べるためのここで述べたアッセイのような手順において使用できる「モ
ルホリンアナログ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ａｎａｌｏｇ）」を意味する。例え
ば、参照してここに組み込まれる米国特許第５，３７８，８４１号参照。ＰＮＡ
は、ＲＮＡ標的又はＤＮＡに対して特異的でありうる中性荷電成分である。例え
ば、本発明のＤＮＡプローブの代わりにアッセイにおいて使用されるＰＮＡプロ
ーブは、ＤＮＡプローブを使用するときに達成できない利益を提供する。これら
の利益は、大量製造の可能性、大規模標識化、再現性、安定性、イオン強度の変
化に対して感受性がないこと、ならびにＤＮＡ又はＲＮＡを使用する方法におい
て存在する酵素的分解への抵抗性を含む。これらのＰＮＡは、フルオレセイン、
放射性ヌクレオチド、化学発光化合物等のようなシグナルを生じる化合物で標識
する（化合物「に結合する」）ことができる。ＰＮＡ又はＭＡのような他の核酸
アナログは、それ故、ＤＮＡ又はＲＮＡの代わりにアッセイ法において使用する
ことができる。ここではＤＮＡプローブを使用するアッセイが記述されているが
、アッセイ試薬に必要に応じて適切な変更を加えて、ＤＮＡ又はＲＮＡをＰＮＡ
又はＭＡに置き換えることは当業者の範囲内である。

【００７５】 ここで使用するとき、「分析物」は、試験サンプル中に存在する可能性のある
、検出すべき物質である。分析物は、それに対して天然に生じる特異的結合メン
バー（抗体のような）が存在する、又はそれに対する特異的結合メンバーを調製
することができる物質でありうる。従って、分析物は、アッセイにおいて１つ又
はそれ以上の特異的結合メンバーに結合しうる物質である。「分析物」はまた、
抗原性物質、ハプテン、抗体及びそれらの組合せも含む。特異的結合対のメンバ
ーとして、分析物は、ビタミンＢ１２を測定するための特異的結合対のメンバー
としての内性因子タンパクの使用、葉酸を測定するための葉酸結合タンパクの使
用、あるいは炭水化物を測定するための特異的結合対のメンバーとしてのレクチ
ンの使用のような、天然に生じる結合パートナー（対）によって検出することが
できる。分析物はタンパク、ポリペプチド、アミノ酸、ヌクレオチド標的等を含
みうる。分析物は、血液、血漿又は血清、尿等のような体液に可溶性でありうる
。分析物は、細胞表面上又は細胞内のいずれかで組織中に存在しうる。分析物は
、血液、尿、乳房吸引液のような体液中に分散しているか、又は生検サンプルと
して得られる、細胞上又は細胞中に存在しうる。

【００７６】 「乳房の疾患」、「乳房疾患」及び「乳房の状態」という用語は、非定型過形
成、線維腺腫、嚢胞性乳房疾患及び癌を含むがこれらに限定されない、乳房の何
らかの疾患又は状態を表わすためにここでは交換可能に使用される。

【００７７】 ここで使用するとき、「乳癌」は、上皮内腺管癌、上皮内小葉癌、浸潤性腺管
癌、管状腺癌、粘液性癌腫、浸潤性小葉癌及び炎症性乳癌を含むがこれらに限定
されない、乳房の何らかの悪性疾患を指す。

【００７８】 「発現配列標識（ＴＡＧ）」又は「ＥＳＴ」は、組織から抽出されたｍＲＮＡ
の逆転写とそれに続くベクターへの挿入によって作製されたｃＤＮＡ挿入物の部
分配列を指す。

【００７９】 「転写産物像」は、ライブラリーにおけるＥＳＴの量的分布を示す表又はリス
トを指し、ライブラリーが作製された組織において活性な遺伝子を表わす。

【００８０】 本発明は、特異的結合メンバーを使用するアッセイを提供する。ここで使用す
るとき「特異的結合メンバー」とは特異的結合対のメンバーである。すなわち、
分子の１つが化学的又は物理的手段を通して第二の分子に特異的に結合する、２
つの異なる分子である。それ故、一般的な免疫測定法における抗原と抗体の特異
的結合対に加えて、他の特異的結合対としてビオチンとアビジン、炭水化物とレ
クチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクターとレセプター分子、補因子と酵
素、酵素阻害因子と酵素、等を含みうる。さらに、特異的結合対は、もとの特異
的結合メンバーのアナログであるメンバー、例えば分析物−アナログを含みうる
。免疫反応性特異的結合メンバーは、組換えＤＮＡ分子によって形成されるもの
を含めて、抗原、抗原断片、モノクローナルとポリクローナルの両方の抗体と抗
体断片及びそれらの複合体を含む。

【００８１】 特異的結合メンバーは「特異的結合分子」を含む。「特異的結合分子」はあら
ゆる特異的結合メンバー、特に免疫反応性特異的結合メンバーを意図する。それ
自体で、「特異的結合分子」という用語は、抗体分子（ポリクローナルとモノク
ローナルの両方の標本から得られる）ならびに次のものを包含する：ハイブリッ
ド（キメラ）抗体分子（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９
３−２９９（１９９１）、及び米国特許第４，８１６，５６７号参照）；Ｆ（ａ
ｂ’）２及びＦ（ａｂ）断片；Ｆｖ分子（非共有結合ヘテロダイマー）（例えば
、Ｉｎｂａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２６
５９−２６６２（１９７２）、及びＥｈｒｌｉｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９：
４０９１−４０９６（１９８０）参照）；一本鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば、
Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８
７９−５８８３（１９８８）参照）；人体抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎ
ｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙａ
ｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）、及び１９９
４年９月２１日公開の英国特許公開第ＧＢ２，２７６，１６９号参照）；ならび
に、そのような分子から得られる機能的断片、但し、かかる断片は親抗体分子の
免疫結合特性を保持する。

【００８２】 ここで使用するとき「ハプテン」という用語は、抗体に結合することができる
が、キャリアタンパクに結合しなければ抗体産生を惹起することができない部分
抗原又は非タンパク結合メンバーを指す。

【００８３】 ここで使用するとき「捕獲試薬」は、サンドイッチアッセイにおけるように分
析物に対して、競合アッセイにおけるように指示試薬又は分析物に対して、若し
くは間接アッセイにおけるようにそれ自体が分析物に特異的である補助的な特異
的結合メンバーに対して特異的である、標識していない特異的結合メンバーを指
す。捕獲試薬は、アッセイを実施する前又はアッセイの実施中に直接又は間接的
に固相物質に結合することができ、それによって固定化された複合体を試験サン
プルから分離することを可能にする。

【００８４】 「指示試薬」は、特異的結合メンバーに複合した（「結合した」）、外的手段
によって検出しうる測定可能なシグナルを生じることができ、且つそのようなシ
グナルを発する「シグナル発生化合物」（「標識」）を含む。特異的結合対の抗
体メンバーであることに加えて、指示試薬は同時に、ビオチン又は抗ビオチン、
アビジン又はビオチン、炭水化物又はレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフ
ェクター又はレセプター分子、酵素補因子及び酵素、酵素阻害因子又は酵素、等
のようなハプテン−抗ハプテン系を含めて、何らかの特異的結合対のメンバーで
もありうる。免疫反応性特異的結合メンバーは、サンドイッチアッセイにおける
ように目的のポリペプチドに結合する、競合アッセイにおけるように捕獲試薬に
結合する、若しくは間接アッセイにおけるように補助の特異的結合メンバーに結
合することができる抗体、抗原、又は抗体／抗原複合体でありうる。プローブ及
びプローブアッセイについて述べるとき、「レポーター分子」という用語を使用
することがある。レポーター分子は、カルバゾール又はアダマンタンのような、
特異的結合対の特異的結合メンバーに複合した、上述したようなシグナル発生化
合物を含む。

【００８５】 想定される様々な「シグナル発生化合物」（標識）は、色原体、酵素のような
触媒、フルオレセインやローダミンのような発光化合物、ジオキセタン、アクリ
ジニウム、フェナントリジニウム及びルミノールのような化学発光化合物、放射
性元素及び直接眼に見える標識を含む。酵素の例は、アルカリホスファターゼ、
ホースラディシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、等を含む。個々の
標識の選択は決定的に重要ではないが、それ自体であるいは１つ又はそれ以上の
付加物質と組み合わせて、シグナルを生じることができなければならない。

【００８６】 「固相」（「支持体」）は当業者には既知であり、反応トレーのウエルの壁、
試験管、ポリスチレンビーズ、磁性又は非磁性ビーズ、ニトロセルロースストリ
ップ、膜、ラテックス粒子のような微粒子、ヒツジ（又は他の動物の）赤血球及
びＤｕｒａｃｙｔｅＲ（ピルビン酸アルデヒドとホルムアルデヒドによって「固
定された」赤血球、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ
Ｐａｒｋ，ＩＬより入手可能）その他を含む。「固相」は決定的に重要ではなく
、当業者によって選択されうる。それ故、ラテックス粒子、微粒子、磁性又は非
磁性ビーズ、膜、プラスチックチューブ、マイクロタイターウエルの壁、ガラス
又はシリコンチップ、ヒツジ（又は他の適当な動物の）赤血球及びＤｕｒａｃｙ
ｔｅ（登録商標）は、すべて適当な例である。ペプチドを固相に固定するための
適当な方法は、イオン性、疎水的、共有結合性相互作用等を含む。ここで使用す
るとき、「固相」は、不溶性であるか、若しくはその後の反応によって不溶性に
することができる物質を指す。固相は、捕獲試薬を誘引して固定するその内在能
力によって選択することができる。その代わりに、固相は、捕獲試薬を誘引して
固定する能力を持つ付加レセプターを保持しうる。付加レセプターは、捕獲試薬
そのものに関して又は捕獲試薬に複合した荷電物質に関して反対の電荷を持つ荷
電物質を含みうる。さらにもう１つの選択肢として、レセプター分子は、固相に
固定されて（結合されて）おり、特異的結合反応を通して捕獲試薬を固定する能
力を持つ、何らかの特異的結合メンバーでありうる。レセプター分子は、アッセ
イの実施前又はアッセイの実施中に捕獲試薬が固相材料に間接結合することを可
能にする。従って固相は、プラスチック、誘導体化されたプラスチック、磁性又
は非磁性金属、試験管のガラス又はシリコン表面、マイクロタイターウエル、シ
ート、ビーズ、微粒子、チップ、ヒツジ（又は他の適当な動物の）赤血球、Ｄｕ
ｒａｃｙｔｅ（登録商標）及び当業者に既知の他の構造でありうる。

【００８７】 固相はまた、検出抗体によるアクセスを可能にする十分な多孔度と抗原に結合
するための適切な表面親和性を備えた適当な多孔性材料も含みうることが想定さ
れ、それは本発明の範囲内である。一般に微小孔構造が好ましいが、水和状態で
ゲル構造を持つ物質も使用しうる。そのような有用な支持体は、ニトロセルロー
ス及びナイロンを含むがこれらに限定されない。ここで述べるそのような多孔性
支持体は、好ましくは、厚さ約０．０１−０．５ｍｍ、好ましくは約０．１ｍｍ
のシートの形態である。孔の大きさは広い範囲で変化しうるが、好ましくは約０
．０２５−１５ミクロン、特に好ましくは約０．１５−１５ミクロンである。そ
のような支持体の表面は、支持体への抗原又は抗体の共有結合を生じさせる化学
的プロセスによって活性化されうる。しかしながら、一般に、十分には理解され
ていない疎水性の力による多孔性物質への吸着によって、抗原又は抗体の不可逆
的結合が得られる。他の適当は支持体は当分野において既知である。

【００８８】 試薬 本発明は、目的とする、ＢＵ１０１と称される乳房組織から誘導されるポリヌ
クレオチド配列、それによってコードされるポリペプチド、及びそれらのポリペ
プチドに特異的な抗体のような試薬を提供する。本発明はまた、開示されるポリ
ヌクレオチド及びこれらのポリヌクレオチドに相補的な核酸配列から誘導される
オリゴヌクレオチド断片のような試薬を提供する。本発明のポリヌクレオチド、
ポリペプチド又は抗体は、乳癌のような乳房の疾患及び状態の検出、診断、病期
分類、監視、予後判定、生体内での画像化、予防又は治療、あるいは乳房の疾患
及び状態に対する素因の判定を導く情報を提供するために使用しうる。ここで開
示する配列は、アッセイにおいて、又は遺伝子転写活性の特異的プロフィールを
作製するために使用できるユニークポリヌクレオチドである。そのようなアッセ
イは、参照してここに組み込まれる、欧州特許第０３７３２０３Ｂ１号及び国際
特許公開ＷＯ９５／１１９９５号に開示されている。

【００８９】 選択したＢＵ１０１由来のポリヌクレオチドは、正常な又は変化した遺伝子発
現を検出するためのここで述べる方法において使用できる。そのような方法は、
ＢＵ１０１ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド、それらの断片又は誘導体
、あるいはそれらに相補的な核酸配列を使用しうる。

【００９０】 ここで開示するポリヌクレオチド、それらの相補的配列、又はそのいずれかの
断片は、関連する乳房組織の疾患及び状態に関する遺伝子、核酸、ｃＤＮＡ又は
ｍＲＮＡを検出する、増幅する又は定量するためのアッセイにおいて使用できる
。それらはまた、ＢＵ１０１ポリペプチドの全体又は部分的コード領域を同定す
るために使用できる。それらはさらに、個々の容器においてアッセイ用のキット
の形態で、又は個々の組成物として提供されうる。アッセイ用のキットとして提
供される場合には、緩衝剤、複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）等のような他の適当
な試薬も含みうる。

【００９１】 当該ポリヌクレオチドはＲＮＡ又はＤＮＡの形態をとりうる。ＤＮＡ、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡ、核酸アナログ及び合成ＤＮＡの形態のポリヌクレオチドは本
発明の範囲内である。ＤＮＡは二本鎖又は一本鎖のいずれでもよく、また一本鎖
の場合には、コード（センス）鎖又は非コード（アンチセンス）鎖のいずれでも
よい。ポリペプチドをコードするコード配列は、ここで提供するコード配列と同
一であってもよく、あるいは遺伝子コードの重複又は縮退の結果として、コード
配列がここで提供するＤＮＡと同じポリペプチドをコードする異なるコード配列
であってもよい。

【００９２】 このポリヌクレオチドは、当該ポリペプチドのコード配列だけ、あるいは当該
ポリペプチドのコード配列とリーダー又は分泌配列又はプロタンパク配列のよう
な付加コード配列、あるいは当該ポリペプチドのコード配列（及び任意に付加コ
ード配列）とポリペプチドのコード配列の５’側及び／又は３’側非コード配列
のような非コード配列を含みうる。

【００９３】 さらに、本発明は、ポリヌクレオチドの欠失、置換又は付加のような修飾を含
む変異体ポリヌクレオチド、及び変異体ポリヌクレオチド配列から生じるポリペ
プチド修飾を包含する。本発明のポリヌクレオチドはまた、ここで提供するコー
ド配列の天然に生じる対立遺伝子変異体であるコード配列を持ちうる。

【００９４】 さらに、ポリペプチドのコード配列を同じ読み枠内で、宿主細胞からのポリペ
プチドの発現と分泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば細胞からのポリペプ
チドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列に融合するこ
とができる。リーダー配列を持つポリペプチドはプロタンパクであり、宿主細胞
によって開裂されてポリペプチドを産生するリーダー配列を持ちうる。ポリヌク
レオチドはまた、タンパクプラス付加的な５’アミノ酸残基であるプロタンパク
をコードしうる。プロ配列を持つタンパクはプロタンパクであり、一部の場合に
は、タンパクの不活性形態でありうる。ひとたびプロ配列が開裂されれば、活性
タンパクが残存する。従って本発明のポリヌクレオチドは、タンパク、又はプロ
配列を持つプロタンパク、又はプレ配列（リーダー配列）とプロ配列の両方を持
つタンパクをコードしうる。

【００９５】 本発明のポリヌクレオチドはまた、フレーム内で、本発明のポリペプチドの精
製を可能にするマーカー配列に融合したコード配列を持ちうる。マーカー配列は
、細菌宿主の場合にはマーカーに融合したポリペプチドの精製を提供するための
ｐＱＥ−９によって供給されるヘキサヒスチジン標識でありうる、又は例えば、
哺乳類宿主、例えばＣＯＳ−７細胞系を使用するときにはマーカー配列は血球凝
集素（ＨＡ）でありうる。ＨＡ標識は、インフルエンザ血球凝集素タンパクから
誘導されるエピトープに相当する。例えば、Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３
７：７６７（１９８４）参照。

【００９６】 ポリヌクレオチドと配列間に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％
、より好ましくは少なくとも９０％の同一性が存在する場合、ポリヌクレオチド
をここで提供する配列にハイブリダイズすると見なされるであろう。

【００９７】 ２つの核酸分子間の配列同一性の度合は、そのような分子間のハイブリダイゼ
ーション事象の効率と強さに大きく影響する。部分的に同一な核酸配列は、完全
に同一な配列が標的分子にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する
配列である。完全同一配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当分野において
周知のハイブリダイゼーションアッセイを用いて評価できる（例えば、サザンブ
ロット、ノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション、原位置（ｉｎ ｓｉ
ｔｕ）ハイブリダイゼーション、等、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、（１９
８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．参照）。そのようなア
ッセイは、様々な度合の選択性、例えば低ストリンジェンシーから高ストリンジ
ェンシーまでにわたる条件を用いて実施できる。低ストリンジェンシー条件を用
いる場合には、非特異的結合事象が存在しなければ第二プローブが標的にハイブ
リダイズしないように、部分的な度合の配列同一性さえも持たない第二プローブ
（例えば、標的分子と約３０％未満の配列同一性を持つプローブ）を用いて、非
特異的結合が存在しないことを評価できる。

【００９８】 ハイブリダイゼーションに基づく検出系を用いるときには、標的核酸配列に相
補的である核酸プローブを選択し、次に適当な条件を選択することによってプロ
ーブと標的配列を「選択的にハイブリダイズする」又は互いに結合させてハイブ
リッド分子を形成する。本発明の１つの実施形態では、核酸分子は、中等度に厳
密なハイブリダイゼーション条件下で標的配列に選択的にハイブリダイズするこ
とができる。本発明に関して、中等度ストリンジェンシーのハイブリダイゼーシ
ョン条件は、選択した核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を
持つ、少なくとも１４ヌクレオチドの長さの標的核酸配列を検出することが可能
である。もう１つの実施形態では、厳密なハイブリダイゼーション条件下でその
ような選択的ハイブリダイゼーションを実施する。厳密なハイブリダイゼーショ
ン条件は、選択した核酸プローブの配列と９０％以上の配列同一性を持つ、少な
くとも１４ヌクレオチドの長さの標的核酸配列を検出することができる。プロー
ブと標的が特定の度合の配列同一性を持つ場合、プローブ／標的ハイブリダイゼ
ーションに有用なハイブリダイゼーション条件は、当分野において知られている
ように決定できる（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ
ｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓとＳ
．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集、（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ
，ＤＣ；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）。ハイブリッド分子は、例えば、支持体上、溶液
中、及び組織切片中に形成されうる。ハイブリッドの形成は、レポーター分子、
典型的にはプローブ内への取込みによってモニターできる。そのようなレポータ
ー分子又は検出可能要素は、放射性元素、蛍光マーカー、及び酵素複合リガンド
が結合しうる分子を含むが、これらに限定されない。

【００９９】 ハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件に関して、数多くの
等価条件を用いて、例えば次の因子を変化させることにより、特定のストリンジ
ェンシーを確立できることは当分野において周知である：プローブの長さと性質
、様々な配列の塩基組成物、塩及び他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度
、ハイブリダイゼーション溶液中の遮断剤（例えば、ホルムアミド、硫酸デキス
トラン、及びポリエチレングリコール）の存在又は不在、ハイブリダイゼーショ
ン反応の温度及び時間パラメータ、ならびに様々な洗浄条件。ハイブリダイゼー
ション条件の特定セットの選択は十分に当業者の技術範囲内である（例えば、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．参照）。

【０１００】 本発明はまた、ポリペプチドの少なくとも一部がここで提供されるポリヌクレ
オチドから選択されるＢＵ１０１ポリヌクレオチドによってコードされる、精製
ＢＵ１０１ポリペプチドを使用することによって産生される抗体を提供する。こ
れらの抗体は、試験サンプル中のＢＵ１０１抗原を検出するためのここで提供さ
れる方法において使用しうる。試験サンプル中にＢＵ１０１抗原が存在すること
は、乳房の疾患又は状態が存在することの指標である。抗体はまた、治療のため
、例えば発現の変化又は異常に関連する状態においてＢＵ１０１ポリペプチドの
活性を中和する際に使用しうる。

【０１０１】 本発明はさらに、ここで提供するような推定アミノ酸配列を持つＢＵ１０１ポ
リペプチド、ならびにそのようなポリペプチドの断片、アナログ及び誘導体に関
する。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然精製ポリペプチド又
は合成ポリペプチドでありうる。ＢＵ１０１ポリペプチドの断片、誘導体又はア
ナログは、１個又はそれ以上のアミノ酸残基が保存された又は保存されないアミ
ノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸残基）で置換されているものでありう
るが、そのような置換されたアミノ酸残基は遺伝子コードによってコードされる
もの又はそうでないもののどちらでもよい；あるいは、１個又はそれ以上のアミ
ノ酸残基が置換基を含むものであってもよい；あるいは、ポリペプチドが、ポリ
ペプチドの半減期を延長させる化合物（例えばポリエチレングリコール）のよう
なもう１つの化合物と融合しているものであってもよい；あるいは、リーダー又
は分泌配列あるいはポリペプチド又はプロタンパク配列の精製のために用いられ
る配列のような、付加的なアミノ酸がポリペプチドに融合しているものであって
もよい。そのような断片、誘導体及びアナログは本発明の範囲内である。本発明
のポリペプチド及びポリヌクレオチドは、好ましくは分離形態で、且つ好ましく
は精製されて提供される。

【０１０２】 それ故、本発明のポリペプチドは、天然に生じるポリペプチドと同一であるか
、又は１個又はそれ以上のアミノ酸置換による小さな変化によって異なるアミノ
酸配列を持ちうる。変化は、典型的には約１−５個のアミノ酸の範囲の「保存的
置換」であって、置換アミノ酸は類似した構造又は化学特性を持ち、例えばイソ
ロイシンによるロイシンの置換又はセリンによるトレオニンの置換でありうる。
これに対し、変化は非保存的変化、例えばトリプトファンによるグリシンの置換
を含みうる。同様の小さな変化はまた、アミノ酸の欠失又は挿入、又はその両方
を含みうる。生物学的又は免疫学的活性を変化させずに、いずれのアミノ酸残基
がどの程度の数まで置換、挿入又は欠失されうるかを決定する上での指針は、当
分野において周知のコンピュータプログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウエ
ア（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて見出すことが
できる。

【０１０３】 本発明のポリヌクレオチド配列に従って構築されるプローブは、様々な種類の
分析を提供する様々なアッセイ法において使用できる。例えば、そのようなプロ
ーブは、染色体分析を実施するための蛍光原位置ハイブリダイゼーション（ＦＩ
ＳＨ）テクノロジーにおいて、また染色体の拡大によって眼に見える、あるいは
ＰＣＲで作製した及び／又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ、対
立遺伝子特異的増幅を用いて又は直接配列決定によって検出しうる欠失又は転座
のような、染色体における癌特異的構造変化を同定するために使用できる。プロ
ーブはまた、放射性標識、直接又は間接的に検出可能なハプテン、又は蛍光分子
で標識することができ、組織標本又は細胞においてポリヌクレオチドを含む遺伝
子のｍＲＮＡ発現を評価するための原位置ハイブリダイゼーション試験のために
利用できる。

【０１０４】 本発明はまた、ここで提供するポリヌクレオチドとポリペプチドの製造に関す
る教示も提供する。

【０１０５】 プローブアッセイ ここで提供する配列は、試験サンプル中の核酸を検出するためのアッセイにお
いて使用できるプローブを作製するために使用しうる。プローブは、目的とする
ポリヌクレオチドの保存ヌクレオチド領域から、又は目的とするポリヌクレオチ
ドの非保存ヌクレオチド領域から設計することができる。アッセイに至適化する
ようにそのようなプローブを設計することは常套的技術の範囲内である。一般に
、核酸プローブは、最大の特異性を所望するときには非保存又はユニーク領域か
ら開発され、また例えば、多遺伝子ファミリーの異なるメンバーに緊密に関連す
るヌクレオチド領域に関して又はマウスとヒトのような関連種においてアッセイ
するときには保存領域から開発される。

【０１０６】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、核酸又はその混合物に含まれる所望核酸
配列（標的）を増幅するための手法である。ＰＣＲでは、１組のプライマーを過
剰に使用して標的核酸の相補鎖にハイブリダイズする。プライマーは、標的核酸
をテンプレートとして用いてポリメラーゼによって各々伸長される。伸長産物は
、もとの標的鎖から分離したあと、それ自体が標的配列となる。その後新しいプ
ライマーがハイブリダイズされてポリメラーゼによって伸長され、そのサイクル
を繰り返して標的配列分子の数が幾何学的に増加する。ＰＣＲは、参照してここ
に組み込まれる米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号
に開示されている。

【０１０７】 リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は核酸増幅のための代替法である。ＬＣＲでは、
２個の一次（第一及び第二）プローブと２個の二次（第三及び第四）プローブを
含むプローブ対を使用し、これらはすべて標的に対して過剰モルで用いられる。
第一プローブは標的鎖の第一セグメントにハイブリダイズし、第二プローブは標
的鎖の第二セグメントにハイブリダイズして、第一と第二セグメントは、一次プ
ローブが５’リン酸−３’ヒドロキシル関係で互いに接するように、そしてリガ
ーゼが共有結合によって２つのプローブを融合産物に融合する又はライゲートす
ることができるように、隣接している。さらに、同様に隣接するように、第三（
二次）プローブは第一プローブの一部にハイブリダイズすることができ、第四（
二次）プローブは第二プローブの一部にハイブリダイズすることができる。言う
までもなく、標的がもともと二本鎖であれば、第二プローブも最初の時点で同時
に標的相補体にハイブリダイズする。ひとたび一次プローブのライゲートされた
鎖が標的鎖から分離されれば、それを第三と第四プローブにハイブリダイズし、
それらをライゲートして相補的な第二のライゲーション産物を形成することがで
きる。ライゲーション産物は標的又はその相補体のいずれかと機能的に等しいこ
とを認識することが重要である。ハイブリダイゼーションとライゲーションのサ
イクルの繰り返しによって標的配列の増幅が達成される。この手法は、１９８９
年６月１６日公開のＫ．ＢａｃｋｍａｎへのＥＰ−Ａ−３２０ ３０８号及び１
９９１年７月３１日公開のＫ．ＢａｃｋｍａｎらへのＥＰ−Ａ−４３９ １８２
号の中でより詳細に記述されており、これらはいずれも参照してここに組み込ま
れる。

【０１０８】 ｍＲＮＡの増幅に関しては、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写して、その後ポリメ
ラーゼ連鎖反応を実施すること（ＲＴ−ＰＣＲ）；あるいは、参照してここに組
み込まれる米国特許第５，３２２，７７０号に述べられているように、両方の段
階に単一の酵素を使用すること；あるいは、やはり参照してここに組み込まれる
Ｒ．Ｌ．Ｍａｒｓｈａｌｌら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ ４：８０−８４（１９９４）に述べられているように、ｍＲＮＡ
をｃＤＮＡに逆転写したあと非対称ギャップリガーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＡＧＬＣ
Ｒ）を実施することは、本発明の範囲内である。

【０１０９】 ここで使用できる他の既知の増幅法は、Ｊ．Ｃ．Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８（１９９
０）が述べた、またＪ．Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３５０（６３１３号）
：９１−９２（１９９１）によっても記述されている、いわゆる「ＮＡＳＢＡ」
又は「３ＳＲ」手法；公開欧州特許願（ＥＰＡ）第４５４４６１０号に述べられ
ているようなＱ−β増幅；鎖置換増幅（Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｃ
ｈｅｍ．４２：９−１３［１９９６］及び欧州特許願第６８４３１５号に述べら
れているような）；ならびに国際特許願公開第ＷＯ９３／２２４６１号に述べら
れているような標的仲介増幅を含むが、これらに限定されない。

【０１１０】 ＢＵ１０１の検出は、現在当分野において周知の検出方法ならびに将来考案さ
れるかもしれない検出戦略を含めて、何らかの適当な検出方法を用いて実施でき
る。前記の現在既知の検出方法の例は、参照してここに組み込まれる。例えば、
Ｃａｓｋｅｙら、米国特許第５，５８２，９８９号、Ｇｅｌｆａｎｄら、米国特
許第５，２１０，０１５号参照。そのような検出方法の例は、標的増幅法ならび
にシグナル増幅テクノロジーを含む。現在既知の検出方法の例は、ＰＣＲ、ＬＣ
Ｒ、ＮＡＳＢＡ、ＳＤＡ、ＲＣＲ及びＴＭＡと称される核酸増幅テクノロジーを
含むであろう。例えば、Ｃａｓｋｅｙら、米国特許第５，５８２，９８９号、Ｇ
ｅｌｆａｎｄら、米国特許第５，２１０，０１５号参照。前記はすべて参照して
ここに組み込まれる。検出はまた、Ｓｎｉｔｍａｎら、米国特許第５，２７３，
８８２号に開示されているようなシグナル増幅を用いて実施しうる。標的又はシ
グナルの増幅は現時点では好ましいが、増幅を必要としない超高感度検出法がこ
こで使用できることが想定され、それは本発明の範囲内である。

【０１１１】 増幅を行う検出と増幅を行わない検出はいずれも、多様な異質及び均質検出様
式を用いて実施できる。異質検出様式の例は、Ｓｎｉｔｍａｎら、米国特許第５
，２７３，８８２号、Ａｌｂａｒｅｌｌａら、ＥＰ−８４１１４４４１．９号よ
り、Ｕｒｄｅａら、米国特許第５，１２４，２４６号、Ｕｌｌｍａｎら、米国特
許第５，１８５，２４３号及びＫｏｕｒｉｌｓｋｙら、米国特許第４，５８１，
３３３号に開示されている。前記はすべて参照してここに組み込まれる。均質検
出様式の例は、参照してここに組み込まれる、Ｃａｓｋｅｙら、米国特許第５，
５８２，９８９号、Ｇｅｌｆａｎｄら、米国特許第５，２１０，０１５号に開示
されている。その使用によってＢＵ１０１シグナルの感受性と増幅が改善される
、ハイブリダイゼーションアッセイでの複数プローブの使用も想定され、本発明
の範囲内である。例えば、参照してここに組み込まれる、Ｃａｓｋｅｙら、米国
特許第５，５８２，９８９号、Ｇｅｌｆａｎｄら、米国特許第５，２１０，０１
５号参照。

【０１１２】 １つの実施形態では、本発明は一般に、標的ポリヌクレオチド配列を含むこと
が疑われる試験サンプルを、増幅プライマー及びアンプリコン配列の内部領域と
ハイブリダイズすることができる検出プローブを含む増幅反応試薬と接触させる
段階を含む。ここで提供する方法に従って用いられるプローブとプライマーは捕
獲及び検出標識で標識されるが、但し、プローブはある１つの種の標識で標識さ
れ、プライマーはもう１つ別の種類の標識で標識される。さらに、プライマーと
プローブは、プローブ配列がプライマー配列よりも低い融解温度を持つように選
択される。増幅試薬、検出試薬及び試験サンプルを増幅条件下に置くと、それに
よって、標的配列の存在下では標的配列のコピー（アンプリコン）が産生される
。通常の場合、プライマーは標的配列とその相補鎖を増幅するように提供される
ので、アンプリコンは二本鎖である。次に二本鎖アンプリコンを熱変性させて一
本鎖アンプリコンメンバーを生成する。一本鎖アンプリコンメンバーが生成され
れば、混合物を冷却してプローブと一本鎖アンプリコンメンバーとの間に複合体
を形成させる。

【０１１３】 一本鎖アンプリコン配列とプローブ配列を冷却すると、プローブ配列は一本鎖
アンプリコンメンバーに選択的に結合する。プローブ配列は一般にプライマー配
列よりも短くなるように選択され、それ故プライマーよりも低い融解温度を持つ
と考えられるので、この所見は反直観的である。そこで、プライマーによって作
製されるアンプリコンもプローブより高い融解温度を持つはずである。それ故、
混合物を冷却すると、二本鎖アンプリコンの再形成が予想される。しかし先に述
べたように、実際にはそうならない。プローブは一本鎖アンプリコンメンバーに
選択的に結合することが認められる。さらに、このプローブ／一本鎖アンプリコ
ン結合の選択性は、プライマー配列をプローブより過剰に加えたときでも存在す
る。

【０１１４】 プローブ／一本鎖アンプリコンメンバーのハイブリッドが形成されたあと、そ
れらを検出する。プライマーとプローブ上に存在する検出標識と捕獲標識を使用
する標準均質アッセイ様式がハイブリッドを検出するに適している。ハイブリッ
ドは捕獲標識によって固相試薬に結合され、検出標識によって検出することがで
きる。検出標識が直接検出可能である場合には、必要に応じて標識に検出可能な
シグナルを生じさせ、そのシグナルを検出することによって固相上のハイブリッ
ドの存在を検出することができる。標識が直接検出できない場合には、捕獲した
ハイブリッドを、一般に直接検出可能な標識に結合した結合メンバーを含むコン
ジュゲートに接触させることができる。コンジュゲートは複合体に結合し、複合
体上のコンジュゲートの存在を直接検出可能標識で検出することができる。この
ようにして、固相試薬上のハイブリッドの存在を判定することができる。当業者
は、洗浄段階を用いてハイブリダイズしていないアンプリコン又はプローブなら
びに結合していないコンジュゲートを除去しうることを認識するであろう。

【０１１５】 １つの実施形態では、核酸分子の整列（アレー）を有する固相支持体を用いて
均質アッセイを好都合に実施することができる。そのようなアレーは高収量及び
／又は多重アッセイ様式のために有用である。あらかじめ生成した核酸分子から
そのようなアレーを作製するための方法、又はインサイチュ合成手法を用いてア
レーを生成する方法は、当分野において一般的に知られている［例えば、Ｄａｔ
ｔａｇｕｐｔａら、ＥＰ特許公開第０２３４，７２６Ａ３号；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
、米国特許第５，７００，６３７号；Ｐｉｒｒｕｎｇら、米国特許第５，１４３
，８５４号；ＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ９２／１００９２号；及びＦｏｄｏｒら
、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７７（１９９１）参照］。

【０１１６】 標的配列は一本鎖と記述されているが、標的配列が実際には二本鎖であるが増
幅プライマー配列とのハイブリダイゼーションの前に単にその相補体から分離さ
れるケースも含むと想定される。この方法においてＰＣＲを用いる場合、標的配
列の末端は通常既知である。好ましい方法においてＬＣＲ又はその修正を用いる
場合には、標的配列全体が通常既知である。典型的には、標的配列は、例えばＲ
ＮＡ又はＤＮＡのような核酸配列である。

【０１１７】 ここで提供する方法は、熱サイクル反応混合物を含む周知の増幅反応、特にＰ
ＣＲ及びギャップＬＣＲ（ＧＬＣＲ）において使用することができる。増幅反応
は、典型的にはプライマーを用いて標的核酸配列のコピーを繰り返し生成させる
が、標的配列は通常、はるかに大きな核酸配列の小さな領域である。プライマー
は、それ自体が標的配列の領域に相補的な核酸配列である。増幅条件下で、これ
らのプライマーは標的配列の相補的領域にハイブリダイズする又は結合する。標
的配列のコピーは、典型的には、ポリメラーゼ又はリガーゼ活性を持つ酵素を別
々に又は組み合わせて使用して、ハイブリダイズしたプライマーにヌクレオチド
を付加する及び／又は隣接プローブ対をライゲートする、プライマー伸長及び／
又はライゲーションのプロセスによって生成される。モノマーとして又は前形成
されたオリゴマーとしてプライマー又はプローブに付加されるヌクレオチドは、
標的配列に対しても相補的である。ひとたびプライマー又はプローブが十分に伸
長される及び／又はライゲーションされれば、例えば、相補的核酸鎖が解離する
温度である「融解温度」まで反応混合物を加熱することによって、それらを標的
配列から分離する。このようにして、標的配列に相補的な配列が形成される。

【０１１８】 その後新しいアンプリコンサイクルが起こり、二本鎖配列を分離することによ
って標的配列の数がさらに増幅され、プライマー又はプローブをそれぞれの標的
にハイブリダイズさせて、ハイブリダイズしたプライマー又はプローブを伸長及
び／又はライゲートし、再び分離することができる。増幅サイクルによって生成
される相補的配列は、標的配列の数をさらに増幅するためのプライマー伸長又は
２つのプローブのギャップ充填のテンプレートとして用いることができる。典型
的には反応混合物を２０−１００回循環させ、より典型的には反応混合物を２５
−５０回循環させる。サイクル数は当業者が決定できる。このようにして、標的
配列とその相補的配列の多数のコピーが作製される。従って、プライマーは、増
幅条件下で存在するときには標的配列の増幅を開始させる。

【０１１９】 一般に、ＰＣＲでは標的鎖とその相補体の一部に相補的である２個のプライマ
ーが用いられる。ＬＣＲについては、一般に４個のプローブが使用され、その内
の２個は標的配列に相補的であり、他の２個は標的の相補体に対して同様に相補
的である。先に述べたプライマーセットと酵素に加えて、核酸増幅反応混合物は
また、周知であって、次のものを含むがそれらに限定されない、他の試薬を含む
こともできる：マンガンのような酵素補因子；マグネシウム；塩；ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）；及び、例えばデオキシアデニン三リン酸
、デオキシグアニン三リン酸、デオキシシトシン三リン酸及びデオキシチミン三
リン酸のようなデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）。

【０１２０】 増幅プライマーは標的配列の増幅を開始させるが、検出（又はハイブリダイゼ
ーション）プローブは増幅に関与しない。検出プローブは一般に核酸配列、又は
、例えば国際特許公開第ＷＯ９２／２０７０２号に開示されているペプチド核酸
；米国特許第５，１８５，４４４号、同第５，０３４，５０６号及び同第５，１
４２，０４７号に述べられているモルホリンアナログ等のような荷電していない
核酸アナログである。プローブが担う標識の種類に依存して、増幅反応によって
生成されるアンプリコンを捕獲又は検出するためにプローブを利用する。プロー
ブは標的配列の増幅には関与せず、それ故、余分なｄＮＴＰがプローブに付加す
ることができないように、「伸長不能」にしておかねばならないと考えられる。
それ自体で、アナログは通常伸長不能であり、核酸プローブは、ヒドロキシル基
が伸長に関わることができないようにプローブの３’末端を修飾することによっ
て伸長不能にすることができる。例えば、プローブの３’末端を捕獲又は検出標
識で官能基化し、それによってヒドロキシル基を消費又は遮断することができる
。その代わりに、３’ヒドロキシル基を単に開裂する、置換する又は修飾するこ
ともできる。参照してここに組み込まれる、１９９３年４月１９日出願の米国特
許出願番号第０７／０４９，０６１号は、プローブを伸長不能にするために使用
できる修飾を記述している。

【０１２１】 プライマーとプローブの比率は重要ではない。すなわち、プローブ又はプライ
マーを反応混合物に過剰に加えることができ、それによって一方の濃度が他方の
濃度よりも高くなる。その代わりに、プライマーとプローブを等しい濃度で用い
ることもできる。好ましくは、しかしながら、プライマーをプローブよりも過剰
に反応混合物に加える。従って、プライマー対プローブの比率は、例えば５：１
及び２０：１が好ましい。

【０１２２】 プライマー及びプローブの長さは変化しうるが、プローブの配列はプライマー
配列よりも低い融解温度を持つように選択される。それ故、プライマー配列は一
般にプローブ配列よりも長い。典型的には、プライマー配列は２０−５０ヌクレ
オチドの範囲の長さ、より典型的には２０−３０ヌクレオチドの範囲の長さであ
る。典型的なプローブは１０−２５ヌクレオチドの範囲の長さである。

【０１２３】 プライマーとプローブを合成するための様々な方法が当分野において周知であ
る。同様に、プライマー又はプローブに標識を結合するための方法も当分野で周
知である。例えば、従来のヌクレオチドホスホルアミダイト化学とＡｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、Ｄｕ
Ｐｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）又はＭｉｌｌｉｇｅｎ（Ｂｅｄｆｏｒ
ｄ，ＭＡ）から入手しうる装置を用いて所望する核酸プライマー又はプローブを
合成することは常套事象である。本発明のプライマー又はプローブのようなオリ
ゴヌクレオチドに標識するための多くの方法が記述されている。Ｅｎｚｏ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）及びＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌ
ｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）はどちらも、プローブ標識手法を記述し、市販している。
例えば、第一アミンは３’−Ａｍｉｎｅ−ＯＮ ＣＰＧ^ＴＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて３’オリゴ末端に結合することができる
。同様に、第一アミンはＡｍｉｎｏｍｏｄｉｆｉｅｒ ＩＩ（登録商標）（Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ）を使用して５’オリゴ末端に結合することができる。アミンは、
従来の活性化と結合化学を用いて様々なハプテンと反応させることができる。さ
らに、それぞれ参照してここに組み込まれる、共同審理中の１９９０年１２月１
１日出願の米国特許願通し番号第６２５，５６６号及び１９９０年１２月２０日
出願の同第６３０，９０８号は、それぞれ５’末端と３’末端でプローブを標識
する方法を教示している。１９９２年６月２５日公開の国際特許公開第ＷＯ９２
／１０５０５号及び１９９２年７月９日公開の同第ＷＯ９２／１１３８８号は、
それぞれ５’末端と３’末端でプローブを標識する方法を教示している。オリゴ
ヌクレオチドを標識するための既知の方法に従って、標識ホスホルアミダイト試
薬を調製し、使用して、オリゴヌクレオチドの合成の間に標識を付加する。例え
ば、Ｎ．Ｔ．Ｔｈｕｏｎｇら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ２９（４６）：５９０
５−５９０８（１９８８）；又はＪ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎら、公開米国特許願０７／
２４６，６８８号（ＮＴＩＳ ＯＲＤＥＲ番号ＰＡＴ−ＡＰＰＬ−７−２４６，
６８８）（１９８９）参照。好ましくは、プローブをその３’末端と５’末端で
標識する。

【０１２４】 捕獲標識はプライマー又はプローブに結合され、固相試薬の特異的結合メンバ
ーと結合対を形成する特異的結合メンバーでありうる。プライマー又はプローブ
自体が捕獲標識として働きうることは明白である。例えば、固相試薬の結合メン
バーが核酸配列である場合には、プライマー又はプローブの相補的部分に結合し
て、プライマー又はプローブを固相に固定するように選択することができる。プ
ローブ自体が結合メンバーとして働く場合には、当業者は、プローブが一本鎖ア
ンプリコンメンバーに相補的でない配列又は「テール」を含むことを認識するで
あろう。プライマー自体が捕獲標識として働く場合には、プローブがプライマー
配列に完全に相補的ではないように選択されるので、少なくともプライマーの一
部は固相上の核酸に自由にハイブリダイズする。

【０１２５】 一般に、プローブ／一本鎖アンプリコンメンバー複合体は、均質免疫測定法を
実施するのに一般的に用いられる手法を使用して検出できる。好ましくは、この
実施形態では、市販されているＡｂｂｏｔｔ ＬＣｘ（登録商標）装置（Ａｂｂ
ｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）によって
使用されるプロトコールに従って検出が行われる。

【０１２６】 ここで開示するプライマーとプローブは、試験サンプルを１対のプライマーに
接触させ、増幅を行って、ハイブリダイゼーションプローブを加えて検出を実施
する、典型的ＰＣＲアッセイにおいて有用である。

【０１２７】 本発明によって提供されるもう１つの方法は、少なくとも１個のポリヌクレオ
チドがここで述べたようなＢＵ１０１分子である、複数のポリヌクレオチドに試
験サンプルを接触させ、試験サンプルを複数のポリヌクレオチドとハイブリダイ
ズして、ハイブリダイゼーション複合体を検出することを含む。ハイブリダイゼ
ーション複合体を同定し、定量して、乳癌のような乳房組織疾患の指標であるプ
ロフィールを収集する。発現されたＲＮＡ配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）を含めた当分野において周知の手法による逆転写とＤＮＡ産物の増幅によっ
てさらに検出しうる。

【０１２８】 薬剤スクリーニングと遺伝子治療 本発明はまた、乳房組織疾患又は状態、特に乳癌に関連したポリヌクレオチド
の異常発現に結びつく状態を有する患者に、本発明のポリヌクレオチド又はオリ
ゴヌクレオチドのようなアンチセンスＢＵ１０１由来分子を導入するための遺伝
子治療法の使用を包含する。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ断片及びリボザイム
を含めたこれらの分子は、ＢＵ１０１ ｍＲＮＡの翻訳を阻害するように設計さ
れ、ＢＵ１０１ポリヌクレオチド発現の変化又は異常に結びつく状態の処置にお
いて治療的に使用しうる。

【０１２９】 その代わりに、上述したオリゴヌクレオチドを、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮ
Ａが上述したように生体内で発現されてＢＵ１０１ポリヌクレオチドの産生を阻
害するように、当分野において既知の手法によって細胞に送達することができる
。ＢＵ１０１ポリヌクレオチドに対するアンチセンス構築物は、それ故、ＢＵ１
０１転写産物の作用を逆転させ、乳癌のような乳房組織疾患状態を治療するため
に使用できる。これらのアンチセンス構築物はまた、腫瘍転移を治療するために
も使用しうる。

【０１３０】 本発明はまた、ＢＵ１０１ポリペプチドに特異的に結合する少なくとも１つの
化合物を同定するために、ＢＵ１０１ポリペプチド又はその断片への特異的結合
に関して複数の化合物をスクリーニングする方法を提供する。そのような方法は
、少なくとも１つの化合物を提供し；適当な条件下で、結合を生じさせるのに十
分な時間、ＢＵ１０１ポリペプチドを各々の化合物と組み合わせ；そして各化合
物へのＢＵ１０１ポリペプチドの結合を検出する、という段階を含む。

【０１３１】 そのような試験で用いるポリペプチド又はペプチド断片は、溶液中に遊離して
いるか、支持体に固定されている、細胞表面に付着している、又は細胞内に位置
する場合がありうる。スクリーニングの１つの方法は、ポリペプチド又はペプチ
ド断片を発現しうる組換え核酸で安定にトランスフェクションされた真核又は原
核宿主細胞を使用する。薬剤、化合物、又は他の何らかの作用物質を、競合結合
アッセイにおいてそのようなトランスフェクション細胞に対してスクリーニング
することができる。例えば、ポリペプチドと試験する作用物質間の複合体形成を
生存細胞又は固定細胞のいずれかで測定することができる。

【０１３２】 本発明は、それ故、ＢＵ１０１に関連する疾患を治療するために使用できる薬
剤、化合物、又は他の作用物質に関するスクリーニングの方法を提供する。これ
らの方法は、作用物質をポリペプチド又はその断片に接触させ、作用物質とポリ
ペプチド間の複合体の存在に関して、又はポリペプチドと細胞間の複合体の存在
に関して検定することを含む。適当なインキュベーション後、遊離（又は複合体
化していない）ポリペプチド又はその断片を結合形態で存在するものから分離し
、遊離又は複合体化していない標識の量を、個々の作用物質がポリペプチドに結
合する又はポリペプチド／細胞複合体に干渉する能力の測定として使用する。

【０１３３】 本発明はまた、ポリペプチドに結合することができる中和抗体が、ポリペプチ
ド又はその断片への結合に関して試験作用物質と特異的に競合する、競合的スク
リーニングアッセイの使用を包含する。このようにすると、抗体を使用して、こ
こで提供するようなＢＵ１０１ポリペプチドと１つ又はそれ以上の抗原決定基を
共有する試験サンプル中のポリペプチドの存在を検出することができる。

【０１３４】 スクリーニングのためのもう１つの手法は、ここで開示するＢＵ１０１の少な
くとも１個のポリペプチドに対して適当な結合親和性を有する化合物についての
高流量スクリーニングを提供する。簡単に述べると、多数の異なる小さなペプチ
ド試験化合物を、プラスチックピン又は他の何らかの表面のような固相上で合成
する。ペプチド試験化合物をポリペプチドと反応させ、洗浄する。その後固相に
結合したポリペプチドを当分野において周知の方法によって検出する。精製ポリ
ペプチドはまた、ここで述べるスクリーニング手法で使用するためにプレート上
に直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体を使用してポリペプチドを捕
獲し、固相上に固定することができる。例えば、参照してここに組み込まれる、
１９８４年９月１３日公開のＥＰ８４／０３５６４号参照。

【０１３５】 合理的な薬剤デザインの目標は、目的とする生物活性ポリペプチド又はそれら
と相互作用する作用物質、拮抗物質又は阻害因子を含めた小分子の構造アナログ
を生成することである。そのような構造アナログを使用して、より活性な又は安
定な形態のポリペプチドである、又は生体内でポリペプチドの機能を高める又は
機能に干渉する薬剤をデザインすることができる。参照してここに組み込まれる
、Ｊ．Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１９−２１（１９
９１）。

【０１３６】 例えば、１つのアプローチでは、ポリペプチド又はポリペプチド−阻害因子複
合体の三次元構造を、ｘ線結晶構造解析、コンピュータモデリング、又は最も典
型的には２つのアプローチの組合せによって決定する。分子の構造を解明し、活
性部位を決定するためには、ポリペプチドの形状と電荷の両方が確認されねばな
らない。それらより頻度は低いが、相同タンパクの構造に基づくモデリングによ
ってポリペプチドの構造に関する有用な情報が得られることもある。どちらの場
合も、類似ポリペプチド様分子をデザインするため、又は効率的な阻害因子を同
定するために適切な情報が使用される。

【０１３７】 合理的薬剤デザインの有用な例は、参照してここに組み込まれる、Ｓ．Ｂｒａ
ｘｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：７７９６−７８０１（１９９２
）が示したような改善された活性又は安定性を持つ分子、あるいはＳ．Ｂ．Ｐ．
Ａｔｈａｕｎｄａら、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１１３（６）：７４
２−７４６（１９９３）が示したような天然ペプチドの阻害因子、作用物質又は
拮抗物質として働く分子を含みうる。

【０１３８】 また、上述したようなアッセイによって選択された標的特異的抗体を単離して
、その後その結晶構造を決定することも可能である。原則として、このアプロー
チはその後の薬剤デザインの基礎となりうるファーマコフォア（ｐｈａｒｍａｃ
ｏｐｈｏｒｅ）を生じる。さらに、機能的な、薬理学的活性抗体に対する抗イデ
ィオタイプ抗体（「抗ｉｄ」）を生成することによってタンパクの結晶構造解析
を回避することも可能である。鏡像の鏡像のように、抗ｉｄの結合部位はもとの
レセプターのアナログである。そこで抗ｉｄを使用して、化学的又は生物学的に
産生されたペプチドのバンクからペプチドを同定し、単離することができる。単
離されたペプチドはその後ファーマコフォア（すなわち基本型薬剤）として働く
ことができる。

【０１３９】 Ｘ線結晶構造解析のような分析試験を実施するのに十分な量の本発明の組換え
ポリペプチドを使用可能にすることができる。さらに、ここで提供する核酸配列
から誘導しうるポリペプチドアミノ酸についての知識は、ｘ線結晶構造解析の代
わりに又はそれに加えて、コンピュータモデリング手法を使用する分析試験への
指針を提供する。

【０１４０】 ＢＵ１０１ポリペプチドに特異的な抗体（例えば、抗ＢＵ１０１抗体）は、さ
らに、ポリペプチドに結合することによってポリペプチドの生物学的作用を阻害
するために使用しうる。このように、抗体は治療において、例えば乳癌とその転
移を含めた乳房組織疾患を治療するために使用できる。

【０１４１】 さらに、そのような抗体は、試験サンプル中にＢＵ１０１ポリペプチドの存在
又は非存在を検出でき、それ故、乳房組織疾患又は状態、特に乳癌の診断のため
の診断マーカーとして有用である。そのような抗体はまた、乳癌のような乳房組
織疾患状態のための診断マーカーとしても機能しうる。

【０１４２】 本発明はまた、本発明のポリペプチドの拮抗物質及び阻害因子を対象とする。
かかる拮抗物質及び阻害因子は、ポリペプチドの機能を阻害する又は排除するも
のである。それ故、例えば、拮抗物質は本発明のポリペプチドに結合して、その
機能を阻害する又は排除することができる。拮抗物質は、例えば、ＢＵ１０１ポ
リペプチドに結合することによってＢＵ１０１ポリペプチドの活性を排除する、
ポリペプチドに対する抗体でありうる、又は一部の場合には拮抗物質はオリゴヌ
クレオチドでありうる。小分子阻害因子の例は、小ペプチド又はペプチド様分子
を含むがこれらに限定されない。

【０１４３】 拮抗物質及び阻害因子は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセ
ロール、エタノール及びそれらの組合せを含めて、製薬上許容される担体と共に
組成物として使用されうる。ＢＵ１０１ポリペプチド阻害因子の投与は好ましく
は全身性である。本発明はまた、そのようなポリペプチドの作用を阻害する抗体
を提供する。

【０１４４】 アンチセンステクノロジーを使用して、三重らせんの形成又はアンチセンスＤ
ＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を低減することができ、前記の方法はいずれ
もＤＮＡ又はＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、本発明のポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード領域を使用して、１
０−４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドがデザインされ
る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関わる遺伝子の領域に相補的であるよ
うに設計され、それによってＢＵ１０１ポリペプチドの転写と産生を妨げる。三
重らせんについては、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６：３
０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９
８８）；及びＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３６０（１９９１）
参照。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは生体内でｍＲＮＡにハイブリダ
イズして、ｍＲＮＡ分子のＢＵ１０１ポリペプチドへの翻訳を遮断する。アンチ
センスについては、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６
０（１９９１）；及びＯｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａ
ｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９８８）参照
。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、分子を核溶解性開裂に対して耐性にする
、人工的ヌクレオチド間結合を含むように改変したとき、より高い効率で作用す
る。そのような人工的ヌクレオチド間結合は、メチルホスホネート、ホスホロチ
オレート及びホスホロアミデートヌクレオチド間結合を含むが、これらに限定さ
れない。

【０１４５】 組換えテクノロジー 本発明は、本発明のＢＵ１０１ポリヌクレオチドを含む宿主細胞と発現ベクタ
ー、及びそれらがコードするポリペプチドの産生のための方法を提供する。その
ような方法は、ＢＵ１０１ポリヌクレオチドの発現に適した条件下で宿主細胞を
培養し、細胞培養からＢＵ１０１ポリペプチドを回収することを含む。

【０１４６】 本発明はまた、本発明のＢＵ１０ポリヌクレオチドを含むベクター、本発明の
ベクターで遺伝学的に構築された宿主細胞、及び組換え手法による本発明のポリ
ペプチドの産生を提供する。

【０１４７】 宿主細胞は、クローニングベクター又は発現ベクターである本発明のベクター
で遺伝学的に構築される（トランスフェクション、形質導入又は形質転換される
）。ベクターはプラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形態でありうる。構築
された宿主細胞は、プロモーターを活性化する、トランスフェクションされた細
胞を選択する、又はＢＵ１０１遺伝子を増幅するために適宜修正した従来の栄養
培地で培養できる。温度、ｐＨ等のような培養条件は、発現のために選択した宿
主細胞に関してこれまで使用されているものであり、当業者には明白である。

【０１４８】 本発明のポリヌクレオチドは、組換え手法によってポリペプチドを産生するた
めに使用できる。すなわち、ポリヌクレオチド配列はポリペプチドを発現するた
めの様々な発現媒体のいずれか１つ、特にベクター又はプラスミドに組み込まれ
うる。そのようなベクターは、染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列、例えばＳ
Ｖ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；酵母プラスミド；プラスミ
ドとファージＤＮＡの組合せから誘導されるベクター；ワクシニアウイルス、ア
デノウイルス、鶏痘ウイルス及び仮性狂犬病ウイルスのようなウイルスＤＮＡを
含む。しかし、他のどのようなプラスミド又はベクターも、宿主細胞において複
製可能であり且つ生存可能であるかぎり使用できる。

【０１４９】 適切なＤＮＡ配列は様々な手順によってベクターに挿入しうる。一般に、ＤＮ
Ａ配列は、当分野において既知の手順によって適切な制限エンドヌクレアーゼ部
位に挿入される。そのような手順その他は当業者の範囲内であると考えられる。
発現ベクター内のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を指令する適切な発現制御配列（
プロモーター）に機能的に連結される。そのようなプロモーターの代表的な例は
、ＬＴＲ又はＳＶ４０プロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃ又はｔｒｐ
、ファージλＰサブＬプロモーター、及び原核又は真核細胞又はそれらのウイル
スにおいて遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターを含む
が、これらに限定されない。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム
結合部位及び転写タミネーターを含む。ベクターはまた、発現を増幅するための
適切な配列を含みうる。さらに、発現ベクターは、好ましくはジヒドロ葉酸レダ
クターゼ又は真核細胞培養のためのネオマイシン耐性のような、又は大腸菌にお
けるテトラサイクリン又はアンピシリン耐性のような、トランスフェクションさ
れた宿主細胞の選択のための表現型特性を提供する遺伝子を含む。

【０１５０】 上述したような適切なＤＮＡ配列ならびに適切なプロモーター又は制御配列を
含むベクターは、適切な宿主をトランスフェクションして、宿主にタンパクを発
現させるために使用しうる。適切な宿主の代表的な例として、次のものが挙げら
れるであろう：大腸菌、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍ
ｕｒｉｕｍ）；ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）；酵
母のような真菌細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）及びＳｆ９の
ような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ又はバウズ（Ｂｏｗｅｓ）黒色腫のような動物
細胞；植物細胞、等々。適切な宿主の選択は、ここで提供する教示から当業者の
範囲内であると考えられる。

【０１５１】 より特定すると、本発明はまた、ここで広く述べたような配列の１つ又はそれ
以上を含む組換え構築物を含む。構築物は、正方向又は逆方向に、本発明の配列
が挿入された、プラスミド又はウイルスベクターのようなベクターを含む。この
実施形態の好ましい態様では、構築物はさらに、当該配列に機能的に連結された
、例えばプロモーターを含めた調節配列を含む。多数の適当なベクター及びプロ
モーターが当業者に既知であり、市販されている。例として、下記のベクターが
提供される。細菌：ｐＩＮＣＹ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
ｓ Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐＳＰＯＲＴ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ｐＱＥ７０、ｐＱ
Ｅ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢｓ、ファージスクリプト、ｐｓｉＸ
１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓＫｓ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１８
ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−
３ｐＫＫ２３３−３ｐＤＲ５４０ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；Ｅｕｋａ
ｒｙｏｔｉｃ；ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）。しかし、他のいかなるプラスミド又はベクターも、宿主におい
て複製可能であり、生存可能であるかぎり使用しうる。

【０１５２】 プラスミドｐＩＮＣＹは、一般に、ポリリンカー（マルチクローニングサイト
）に２つの修飾を持つことを除いて、プラスミドｐＳＰＯＲＴ１（Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤより入手可能）と同
一である。これらの修飾は、（１）ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を欠く、そして（２
）そのＥｃｏＲＩ制限部位が異なる位置にある、ことである。ｐＩＮＣＹは、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩの両方でｐＳＰＯＲＴ１を開裂し、ポリリンカーの切
り出した断片を合成ＤＮＡ断片（配列番号７及び配列番号８）で置換することに
よって、ｐＳＰＯＲＴ１から創造される。この置換は当業者に既知のどのような
方法で行ってもよい。例えば、２個のヌクレオチド配列、配列番号７と配列番号
８を５’末端リン酸で合成的に作製し、一緒に混合して、ねじれ末端（ｓｔａｇ
ｇｅｒｅｄ ｅｎｄ）ライゲーションを実施するための標準条件下で、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断したｐＳＰＯＲＴ１プラスミドにライゲートすること
ができる。次に適当な宿主細胞（大腸菌ＤＨ５μ細胞など）をライゲートしたＤ
ＮＡでトランスフェクションし、組換えクローンをアンピリシン耐性に関して選
択する。その後個々のクローンからプラスミドＤＮＡを調製して、正しい方向に
挿入配列が存在することを確認するため、制限酵素分析又はＤＮＡ塩基配列決定
に供する。当業者に既知の他のクローニング戦略も使用しうる。

【０１５３】 ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクター又は選択可能マ
ーカーを持つ他のベクターを用いて、所望する遺伝子からプロモーター領域を選
択することができる。２つの適当なベクターはｐＫＫ２３２−８とｐＣＭ７であ
る。個々に命名されている細菌プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｓ
Ｐ６、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰサブＲ、ＰサブＬ及びｔｒｐを含む。真核プロモータ
ーは、即時初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳ
Ｖ）チミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルスからのＬＴＲ及
びマウスメタロチオネイン−Ｉを含む。適切なベクターとプロモーターの選択は
、十分に当分野における通常技術のレベル内である。

【０１５４】 さらなる実施形態では、本発明は上述した構築物を含む宿主細胞を提供する。
宿主細胞は、哺乳類細胞のような高等真核細胞又は酵母細胞のような下等真核細
胞であるか、又は細菌細胞のような原核細胞でありうる。宿主細胞への構築物の
導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介
トランスフェクション、又は電気穿孔法によって実施できる（Ｌ．Ｄａｖｉｓら
、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、
第２版、ＡｐｐｌｅｔｏｎとＬａｎｇ，Ｐａｒａｍｏｕｎｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇ，Ｅａｓｔ Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）］。

【０１５５】 宿主細胞中の構築物は、組換え配列によってコードされる遺伝子産物を生成す
るために従来のように使用することができる。その代わりに、本発明のポリペプ
チドを従来のペプチドシンセサイザーによって合成的に産生することもできる。

【０１５６】 組換えタンパクは、適切なプロモーターの制御下で哺乳類細胞、酵母、細菌、
又は他の細胞において発現されうる。細胞不含翻訳系も、本発明のＤＮＡ構築物
から誘導したＲＮＡを用いてそのようなタンパクを産生するために使用できる。
原核及び真核宿主に関して使用するための適切なクローニング及び発現ベクター
は、参照してここに組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、（Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）に記述されている。

【０１５７】 ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって、高等真核細胞による本
発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写が高められる。エンハンサーは通
常約１０−３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性要素であり、プロモーターに作用し
てその転写を高める。例としては、複製起点の後期側（塩基１００−２７０）の
ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、
複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが
含まれる。

【０１５８】 一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞のトランスフェクションを可能にす
る複製の起点と選択可能マーカー、例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子やビ
ール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＲＰ１遺伝子、及び下流構造配列の
転写を指令する高度発現遺伝子から誘導されるプロモーターを含む。そのような
プロモーターは、中でも特に、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、α
因子、酸性ホスファターゼ、又は熱ショックタンパクのような解糖酵素をコード
するオペロンから誘導できる。非相同構造配列を、適当なフェーズで、翻訳開始
及び終止配列、そして好ましくは翻訳されたタンパクのペリプラズム空隙又は細
胞外媒質中への分泌を指令することができるリーダー配列と共に構築する。任意
に、非相同配列は、所望する特性、例えば発現される組換え産物の安定化又は精
製の単純化をもたらすＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパクをコードしうる。

【０１５９】 細菌での使用のために有用な発現ベクターは、所望するタンパクをコードする
構造的ＤＮＡ配列を適当な翻訳開始及び終止シグナルと共に、機能的プロモータ
ーを持つ作動可能なリーディングフェーズに挿入することによって構築される。
ベクターは、１つ又はそれ以上の表現型選択可能マーカー、及びベクターの維持
を確保し、所望する場合には、宿主内での増幅を提供するための複製起点を含む
。トランスフェクションのための適当な原核宿主は、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙ
ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の様々な種を含むが、他のものも常套的選
択肢として使用しうる。

【０１６０】 細菌での使用のために有用な発現ベクターは、選択可能マーカーと、周知のク
ローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝的要素を含むプ
ラスミドから誘導される細菌複製起点を含む。他のベクターは、ＰＫＫ２２３−
３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓ
ｗｅｄｅｎ）及びＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，
ＷＩ）を含むが、これらに限定されない。これらのｐＢＲ３２２の「バックボー
ン」部分を適切なプロモーター及び発現される構造配列と組み合わせる。

【０１６１】 適当な宿主をトランスフェクションし、宿主を適切な細胞密度まで増殖させた
あと、選択したプロモーターを適当な手段（例えば温度変化又は化学誘導）によ
って抑制解除し、さらなる期間、細胞を培養する。細胞を典型的には遠心分離に
よって収集し、物理的又は化学的手段によって破壊して、生じた粗抽出物をさら
なる精製のために保持する。タンパクの発現において用いられる微生物細胞は、
凍結融解サイクル、音波破砕、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用を含めた何ら
かの高都合な方法によって破壊することができる。そのような方法は当業者には
周知である。

【０１６２】 様々な哺乳類細胞培養系も、組換えタンパクを発現するために使用できる。哺
乳類発現系の例は、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ ２３：１７５（１９８１）が述
べたサル腎線維芽細胞のＣＯＳ−７系統、及びＣ１２７、ＨＥＫ−２９３、３Ｔ
３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞系統のような、適合性ベクターを発現する
ことができる他の細胞系統を含む。哺乳類発現ベクターは、複製起点、適当なプ
ロモーターとエンハンサー、そして同時に何らかの必要なリボソーム結合部位、
ポリアデニル化部位、スプライス供与部位及び受容部位、転写終止配列及び５’
隣接非転写配列を含む。ＳＶ４０ウイルスゲノムから誘導されるＤＮＡ配列、例
えばＳＶ４０起点、早期プロモーター、エンハンサー、スプライス、及びポリア
デニル化部位を使用して、必要とされる転写されない遺伝的要素を提供すること
ができる。代表的な有用ベクターはｐＲｃ／ＣＭＶ及びｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含む。

【０１６３】 ＢＵ１０１ポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィー、硫酸アンモ
ニウム又はエタノール沈降、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフ
ィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィ
ー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー又はレクチンクロマトグラフィー
を含めた既知の方法によって組換え細胞培養から回収され、精製される。精製中
に存在するカルシウムイオンは低濃度（約０．１−５ｍＭ）であることが好まし
い［Ｐｒｉｃｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４：９１７（１９６９）］。
ポリペプチドの構造を完成させるために、必要に応じて、タンパクの再折りたた
み段階が使用できる。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が最終
精製段階に使用できる。

【０１６４】 本発明のポリペプチドは、高発現細胞系統から発現される天然精製産物、又は
化学合成手順の産物、あるいは原核又は真核宿主から組換え手法によって（例え
ば培養中の細菌、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳類細胞によって）産生される産
物でありうる。組換え製造法で用いる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは
哺乳類又は他の真核細胞の炭水化物でグリコシル化してもよく、又はグリコシル
化しなくてもよい。本発明のポリペプチドはまた、初期メチオニンアミノ酸残基
を含みうる。

【０１６５】 出発プラスミドは、公開されている既知の手法に従って入手可能なプラスミド
から構築できる。さらに、記述されているものと等価のプラスミドが当分野にお
いて既知であり、当業者には明白であろう。

【０１６６】 下記は、ｃＤＮＡクローンの単離と分析のための一般的手順である。ここで開
示する特定実施形態では、乳房組織からｍＲＮＡを単離して、ｃＤＮＡライブラ
リーを構築するために使用する。乳房組織は外科的切除によって患者から入手し
、病理学者が腫瘍又は非腫瘍組織として分類する。

【０１６７】 乳房組織ライブラリーのランダムな単離物からのｃＤＮＡインサートを部分的
に配列決定し、実施例で述べるように詳細に分析して、配列番号１、配列番号２
及び配列番号３として配列表に開示する。また、クローン２０８３５７８Ｈ１及
び６０３１４８ＨＩの完全長配列［それぞれ２０８３５７８ｉｎｈ（配列番号４
）及び６０３１４８ｉｎｈ（配列番号５）と称される］も、実施例で述べるよう
に詳細に分析して、配列表に開示する。これらのインサートのコンセンサス配列
を配列番号６として示す。これらのポリヌクレオチドは、特定遺伝子についての
関連調節配列を伴う又は伴わないオープンリーディングフレーム全体を含むこと
があり、又は目的遺伝子の一部だけをコードすることもある。これは、多くの遺
伝子が数百、時には数千塩基の長さであって、現在のテクノロジーでは、ベクタ
ーの制限、第一鎖の不完全な逆転写又は第二鎖の不完全な複製のためにその全体
をクローニングすることができないという事実に帰せられる。付加的ヌクレオチ
ド配列を含む隣接二次クローンは、当業者に既知の様々な方法を用いて入手しう
る。

【０１６８】 ＤＮＡ塩基配列決定のための方法は当分野において周知である。従来の酵素的
方法は、目的とするＤＮＡテンプレートにアニーリングしたオリゴヌクレオチド
プライマーからＤＮＡ鎖を伸長するために、ＤＮＡポリメラーゼ、クレノー断片
、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ，Ｃｌｅｖｅ
ｌａｎｄ，ＯＨ）又はＴａｑポリメラーゼを使用する。一本鎖及び二本鎖テンプ
レートの使用のための方法が開発されている。鎖停止反応産物を尿素／ポリアク
リルアミドゲル上で電気泳動し、オートラジオグラフィー（放射性ヌクレオチド
標識した前駆物質に関して）又は蛍光（蛍光標識した前駆物質に関して）によっ
て検出することができる。機械化された反応調製法、蛍光検出法を用いた配列決
定と分析にもたらされた最近の改善は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
３７７ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のような機器を使用して１日当りに決定で
きる配列数を拡大することを可能にした。

【０１６９】 ヌクレオチド配列の読み枠はいくつかの種類の分析によって確認できる。まず
最初に、コード配列内に含まれる読み枠は、開始コドンＡＴＧ及び終止コドンＴ
ＧＡ、ＴＡＡ又はＴＡＧの存在に関して分析できる。典型的には、１つの読み枠
がｃＤＮＡ配列の主要部分を通じて継続し、他の読み枠は多数の終止コドンを含
む傾向にある。そのような場合、読み枠の決定は容易である。他のより難しい場
合には、さらなる分析が必要である。

【０１７０】 各々の推定上のコドントリプレットでの個々のヌクレオチド塩基の発生を分析
するためのアルゴリズムが作り出された。例えば、Ｊ．Ｗ．Ｆｉｃｋｅｔｔ，Ｎ
ｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：５３０３（１９８２）参照。特定生物（細菌
、植物及び動物）についてのコードＤＮＡは、第三コドン位置でのピリミジンの
有意の選択性のように、特定トリプレット周期内に特定ヌクレオチドを含む傾向
がある。これらの選択性は、所与の長さのＤＮＡのコード潜在能（及びフレーム
）を決定するために使用できる、広く使用可能なソフトウエアに組み込まれてい
る。開始／停止コドン情報と組み合わせたアルゴリズム由来の情報を使用して、
正しいフレームを高い度合の確実性で決定することができる。このことによって
、今度は、正しい読み枠内の配列を適切な発現ベクターに容易にクローニングす
ることが可能となる。

【０１７１】 ここで開示する核酸配列は、十分に確立された組換えＤＮＡ手法によって様々
な他のポリヌクレオチド配列及び目的とするベクターに連結することができる。
Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出参照。目的ベクターは、プラスミド、コスミド、
ファージ誘導体、ファージミドのようなクローニングベクター、ならびに配列決
定、複製及び発現ベクター、等を含む。一般に、そのようなベクターは、少なく
とも１つの生物において機能性である複製起点、都合のよい制限エンドヌクレア
ーゼ消化部位及び個々の宿主細胞に適した選択可能マーカーを含む。ベクターは
当業者の既知の様々な手段によって適当な宿主細胞に移入され、その後かかる宿
主細胞が所望するＤＮＡ、ＲＮＡ又はポリペプチドを産生する。

【０１７２】 時として、配列決定又はランダム逆転写の誤りが適切なオープンリーディング
フレーム又は調節要素の存在を隠してしまうことがある。そのような場合には、
ポリペプチドを発現させることを試みて、標準的なペプチドマッピング及び配列
決定手法によってアミノ酸配列を決定することにより、正しい読み枠を決定する
ことが可能である。Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８９）参照。さらに、所与のヌク
レオチド配列の実際の読み枠を、３つの潜在的読み枠すべてを含むベクターで宿
主細胞をトランスフェクションすることによって決定できる。正しい読み枠内の
ヌクレオチド配列を持つ細胞だけが予想された長さのペプチドを産生する。

【０１７３】 ここで提供するヌクレオチド配列は、現在の技術水準の自動化された方法で調
製され、それ自体で、同定されていないヌクレオチドを含みうる。これらが、本
発明を実施しようとする当業者に問題を呈することはない。Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ（前出）又はその定期的最新化資料に述べられている標準的な組換え手法を用
いたいくつかの方法が、欠如している配列情報を完全にするために使用できる。
ここで述べるような完全長の配列を得るために使用される同じ手法が、ヌクレオ
チド配列を入手するために使用しうる。

【０１７４】 特定ｃＤＮＡの発現は、適切な発現ベクターにｃＤＮＡをサブクローニングし
、このベクターを適切な発現宿主にトランスフェクションすることによって実現
しうる。乳房組織ｃＤＮＡライブラリーの作製のために使用されるクローニング
ベクターが特定ｃＤＮＡのｍＲＮＡを転写するために使用でき、かかるベクター
は、β−ガラクトシダーゼのためのプロモーター、アミノ末端ｍｅｔ及びその後
のβ−ガラクトシダーゼの７個のアミノ酸残基を含む。これら８個の残基のすぐ
後は、人工的プライミングと転写のために有用な構築バクテリオファージプロモ
ーター、ならびにＥｃｏＲＩを含めたクローニングのための多数のユニーク制限
部位である。大腸菌の適切な宿主菌株にベクターをトランスフェクションするこ
とができる。

【０１７５】 標準的な方法を用いて単離された細菌株をイソプロピルチオガラクトシド（Ｉ
ＰＴＧ）で誘導すると、β−ガラクトシダーゼの最初の７個の残基、約１５残基
のリンカー及びｃＤＮＡ内にコードされるペプチドを含む融合タンパクが生成さ
れる。ｃＤＮＡクローンインサートは基本的にランダムなプロセスによって生成
されるので、組み込まれたｃＤＮＡが適切な翻訳のための正しいフレーム内に位
置する可能性は３回に１回である。ｃＤＮＡが正しい読み枠にない場合には、試
験管内突然変異誘発、エキソヌクレアーゼＩＩＩ又は大豆ヌクレアーゼによる消
化、又はオリゴヌクレオチドリンカーの組み込みを含めた周知の方法によって適
切な数の塩基を欠失又は挿入することにより、正しい読み枠を得ることができる
。

【０１７６】 上記のｃＤＮＡを、特異的宿主でのタンパクの発現に有用であることが知られ
る他のベクターにシャトルさせることができる。クローニング部位及び標的ｃＤ
ＮＡの両末端の伸長部にハイブリダイズするのに十分なＤＮＡのセグメントを含
むオリゴヌクレオチドプライマーは、標準的な方法によって化学合成できる。次
にこれらのプライマーを使用して、ＰＣＲにより所望する遺伝子セグメントを増
幅することができる。生じた新しい遺伝子セグメントを標準条件下で適切な制限
酵素を用いて消化し、ゲル電気泳動によって単離することができる。その代わり
に、ｃＤＮＡを適切な制限酵素で消化し、欠落している遺伝子セグメントに化学
合成したオリゴヌクレオチドを充填することによって類似した遺伝子セグメント
を作製することができる。１個以上の遺伝子からのコード配列のセグメントを相
互にライゲーションして、適切なベクターにクローニングし、組換え配列の発現
を至適化することができる。

【０１７７】 そのようなキメラ分子のための適当な発現宿主は、チャイニーズハムスターの
卵巣（ＣＨＯ）及びヒト胚の腎（ＨＥＫ）２９３細胞のような哺乳類細胞、Ｓｆ
９細胞のような昆虫細胞、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母細胞、及び大腸菌のような細菌を含むが、これら
に限定されない。これらの細胞系の各々に関して、有用な発現ベクターはまた、
細菌中での増殖を可能にする複製起点、及び細菌中での選択を可能にする、β−
ラクタマーゼ抗生物質耐性のような選択可能マーカーも含みうる。さらにベクタ
ーは、トランスフェクションした真核宿主細胞における選択を可能にするための
、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のような第二の選択可能マーカ
ーを含みうる。真核宿主細胞において使用するためのベクターは、目的配列がポ
リＡを欠く場合には３’ポリＡテールの添加を必要とする。

【０１７８】 さらに、当該ベクターは遺伝子発現を高めるプロモーター又はエンハンサーを
含みうる。そのようなプロモーターは宿主特異的であり、ＣＨＯ細胞に関するＭ
ＭＴＶ、ＳＶ４０又はメタロチオネインプロモーター；細菌宿主に関するｔｒｐ
、ｌａｃ、ｔａｃ又はＴ７プロモーター；あるいは酵母に関するα因子、アルコ
ールオキシダーゼ又はＰＧＨプロモーターを含むが、これらに限定されない。ラ
ウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーのような転写エンハンサーを持つ又は
持たないアデノウイルスベクターは、哺乳類細胞系におけるタンパク発現を推進
するために使用しうる。ひとたび組換え細胞の均質な培養が得られれば、順化培
地から大量の組換え産生タンパクを回収し、当分野で周知のクロマトグラフィー
法を使用して分析することができる。分泌タンパクを大量に生産するための代替
的な方法は、哺乳類の胚をトランスフェクションし、トランスジェニック雌ウシ
、ヤギ、ヒツジ等によって産生される乳から組換えタンパクを回収することを含
む。タンパクの精製を容易にするように、ポリペプチド及び緊密に関連する分子
を組換えによって発現することができる。１つのアプローチは、天然ではヒトポ
リペプチド上に存在しない１つ又はそれ以上の付加的なポリペプチドドメインを
含むキメラタンパクの発現を包含する。そのような精製促進ドメインは、固定化
された金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンドメインのよう
な金属キレート化ペプチド、固定化された免疫グロブリンでの精製を可能にする
プロテインＡドメイン、及びＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製系（Ｉｍｍｕ
ｎｅｘ Ｃｏｒｐ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）において使用されるドメインを含む
が、これらに限定されない。ポリペプチド配列と精製ドメイン間の、第ＸＡ因子
又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのエンテロキナー
ゼのような開裂可能なリンカー配列は、ポリペプチドを回収するために有用であ
ると考えられる。

【０１７９】 イムノアッセイ その断片、誘導体、およびアナログを含むＢＵ１０１ポリペプチド、またはか
かるポリペプチドを発現する細胞は乳房組織に対する抗体を検出するための種々
のアッセイにおいて利用でき、その多くを本明細書において記載する。またこれ
らを抗体を作るための免疫原としても用いることができる。これらの抗体は例え
ばポリクローナルまたはモノクローナル抗体、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体
並びにＦａｂ断片またはＦａｂ発現ライブラリーの生成物でよい。当該分野で周
知の種々方法を用いてかかる抗体および断片を作ることができる。

【０１８０】 例えば本発明の配列を含んでなるポリペプチドに対して生じた抗体を、ポリペ
プチドを動物、例えばマウス、ウサギ、ヤギまたはヒトに直接注射するか、また
はポリペプチドを動物に投与することにより得ることができる。マウス、ウサギ
またはヤギが好ましい。ポリペプチドおよびその断片は配列番号２０ないし２９
からなる群から選択される。このようにして得られた抗体はペプチドそのものに
結合する。このように、ポリペプチドの断片のみをコードする配列を用いて元来
のポリペプチドに結合する抗体を作ることさえできる。次いでかかる抗体を用い
て試験サンプル例えばそのポリペプチドを含有することが疑われる組織からポリ
ペプチドを単離できる。モノクローナル抗体を製造するために、連続細胞系統培
養により製造される抗体を提供するいずれかの技術を用いることができる。実例
を挙げると、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４
９５−４９７（１９７５）により記載されたハイブリドーマ技術、Ｋｏｚｂｏｒ
ら、Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ，４：７２（１９８３）により記載されたヒトＢ細
胞ハイブリドーマ技術、並びにＣｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（アラン・アール・リス・
インコーポレーティッド、ニューヨーク、ニューヨーク州）７７−９６頁（１９
８５）に記載されたヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶハイブリド
ーマ技術などがある。一本鎖抗体の製造に関して記載された技術を適用して本発
明の免疫原性ポリペプチド生成物に対する一本鎖抗体を製造できる。例えば米国
特許第４９４６７７８号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

【０１８１】 種々のアッセイ様式、例えば「サンドウィッチ」イムノアッセイおよびプロー
ブアッセイを本発明の抗体に利用できる。例えば本発明の抗体またはその断片を
種々のアッセイ系で用いて、試験サンプル中あるとすればＢＵ１０１抗原の存在
を決定できる。例えば、第１のアッセイ様式では、固相にコーティングしたポリ
クローナルもしくはモノクローナル抗体またはその断片、またはこれらの抗体の
組合わせを試験サンプルと接触させ、第１の混合物を形成する。抗原／抗体複合
体を形成するのに十分な時間および条件下、第１の混合物をインキュベートする
。次いでシグナル発生化合物を結合したモノクローナルもしくはポリクローナル
抗体またはその断片、またはその組合わせを含んでなる指示試薬を抗原／抗体複
合体と接触させて第２の混合物を形成する。次いで抗体／抗原／抗体複合体を形
成するのに十分な時間および条件下、第２の混合物をインキュベートする。ある
とすれば、固相上に捕捉された試験サンプル中のＢＵ１０１抗原の存在を、シグ
ナル発生化合物により生じる測定可能なシグナルを検出することにより決定する
。試験サンプル中に存在するＢＵ１０１抗原の量は生じたシグナルに比例する。

【０１８２】 別のアッセイ様式では（１）ＢＵ１０１抗原に特異的に結合するポリクローナ
ル抗体、モノクローナル抗体、もしくはその断片または固体支持体に結合するか
かる抗体の組み合わせ；（２）試験サンプル；および（３）シグナル発生化合物
が結合した異なるＢＵ１０１抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体、ポリ
クローナル抗体、もしくはその断片（またはこれらの抗体の組み合わせ）を接触
させることにより混合物を形成する。抗体／抗原／抗体複合体を形成するのに十
分な時間および条件下、この混合物をインキュベートする。あるとすれば、試験
サンプルに存在し、固相上に捕捉されたＢＵ１０１抗原の存在を、シグナル発生
化合物により生じた測定可能なシグナルを検出することにより決定する。試験サ
ンプル中に存在するＢＵ１０１抗原の量は生じたシグナルに比例する。

【０１８３】 別のアッセイ様式では少なくとも二つの本発明のモノクローナル抗体の一つま
たは組み合わせをＢＵ１０１抗原に対する抗体の検出用競合プローブとして用い
ることができる。例えばＢＵ１０１ポリペプチド例えば本明細書に開示する組換
え抗原を単独で、または組み合わせて固相をコーティングする。次いでＢＵ１０
１抗原に対する抗体を含有することが疑われる試験サンプルをシグナル発生化合
物および少なくとも一つの本発明のモノクローナル抗体を含んでなる指示試薬と
共に、固相に結合した試験サンプルおよび支持試薬か、または固相に結合した支
持試薬の抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件下でインキュベ
ートする。モノクローナル抗体の固相への結合の低下を定量的に測定できる。

【０１８４】 さらに別の検出法では、本発明のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を
免疫組織化学的分析による組織切片および細胞中のＢＵ１０１抗原の検出に用い
ることができる。凍結または化学的に固定した組織サンプルから組織切片を切り
取ることができる。細胞中で抗原を検出する場合、細胞を血液、尿、乳房吸引液
、またはその他の体液から単離できる。外科手術または針のいずれかによるバイ
オプシにより細胞を得ることができる。磁性粒子または鉄液で標識した後、遠心
または磁気引力により細胞を単離し、本発明の抗体で染色した細胞の特定の分画
を濃縮できる。これらの抗体を直接標識する（例えば蛍光、金コロイド、西洋ワ
サビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ等用いる）かまたは２次標識
抗種抗体を用いて標識（本明細書に実例を示す種々標識を用いる）して疾患の組
織病理学を追跡する細胞化学分析もまた本発明の範囲内である。

【０１８５】 加えて、これらのモノクローナル抗体をＣＮＢｒ−活性化セファロースに類似
するマトリックスに結合でき、細胞培養物または生物学的組織からの特異的ＢＵ
１０１ポリペプチドのアフィニティー精製に用い、例えば組換えおよび元来のＢ
Ｕ１０１タンパク質を精製できる。

【０１８６】 また本発明のモノクローナル抗体を用いて治療用またはその他の類似の適用の
ためのキメラ抗体を生成することもできる。

【０１８７】 モノクローナル抗体またはその断片をＢＵ１０１抗原を検出するために別個に
提供できる。本明細書において提供するモノクローナル抗体（およびその断片）
の組み合わせを、少なくとも一つの本発明のＢＵ１０１抗体をその他のＢＵ１０
１領域に特異的に結合する抗体と共に（各抗体は異なる結合特性を有している）
混合物または「カクテル」の構成成分として一緒に用いることもできる。このよ
うに、このカクテルは本明細書で開示するＢＵ１０１ポリペプチドを指向する本
発明のモノクローナル抗体、およびＢＵ１０１抗原またはその他の関連するタン
パク質のその他の抗原決定基に特異的なその他のモノクローナル抗体を含んでよ
い。

【０１８８】 アッセイ様式で用いることができるポリクローナル抗体またはその断片はＢＵ
１０１ポリペプチドまたはさらにアッセイで用いられる別のＢＵ１０１ポリペプ
チドに特異的に結合すべきである。好ましく用いられるポリクローナル抗体はＢ
Ｕ１０１ポリペプチドに結合する哺乳動物起源、例えばヒト、ヤギ、ウサギまた
はヒツジポリクローナル抗体である。最も好ましくはウサギ起源のポリクローナ
ル抗体である。アッセイで用いられるポリクローナル抗体は単独で、またはポリ
クローナル抗体のカクテルとしてのいずれかで用いることができる。アッセイ様
式で用いられるカクテルはＢＵ１０１ポリペプチドに対して異なる結合特異性を
有するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかから成るので、
これらは乳房の疾患および症状例えば乳癌の診断、病期決定、モニター観察、予
知、インビボイメージング、予防もしくは処置、または素因決定に有用である。

【０１８９】 組換え抗原の使用および、ペプチドがＢＵ１０１のアミノ酸配列を含んでなる
合成ペプチドまたは精製ペプチドの使用によりアッセイにおいてＢＵ１０１抗原
を検出できるのは本発明の範囲内であることを企図する。かかるポリペプチドお
よびその断片のアミノ酸配列は配列番号２０ないし２９からなる群から選択され
る。また異なるＢＵ１０１エピトープを同定する異なる合成、組換えまたは精製
ペプチドを組み合わせて乳房の疾患および症状例えば乳癌の診断、病期決定、モ
ニター観察、予知、インビボイメージング、予防もしくは処置、または素因決定
のためのアッセイに用いることができることも本発明の範囲内である。この場合
、これらのペプチド全てを一つの固相にコーティングでき；または各々別個のペ
プチドを別個の固相、例えば微粒子にコーティングでき、次いで組み合わせて後
にアッセイで用いることができるペプチド混合物を形成できる。さらに異なる抗
原のエピトープを規定する複数のペプチドを乳房の疾患および症状例えば乳癌の
診断、病期決定、モニター観察、予知、予防もしくは処置、または素因の決定に
用いることができることが企図される。次いで固相にコーティングされたまたは
検出可能な標識で標識されたペプチドを限定量の抗体に関して、（あるとすれば
）患者サンプル中に存在する抗原と競合させる。合成、組換えまたは精製ペプチ
ドと抗体（または複数の抗体）との結合の低下は患者サンプル中のＢＵ１０１抗
原の存在を示している。ＢＵ１０１抗原の存在により患者における乳房組織疾患
、とりわけ乳癌の存在が示される。種々のアッセイ様式が当業者に周知であり、
多くを本明細書後記にて論じる。

【０１９０】 別のアッセイ様式では抗ＢＵ１０１抗体および／またはＢＵ１０１抗原の存在
を以下に示す同時アッセイにおいて検出できる。試験サンプルを第１の分析物質
の捕捉試薬と同時に接触させ、ここで該捕捉試薬は、固相に結合した第１の分析
物質に特異的な第１の結合メンバーおよび第２の分析物質のための捕捉試薬を含
んでなり、ここで該捕捉試薬は第２の固相に結合した第２の分析物質のための第
１の結合メンバーを含んでなり、それにより混合物を形成する。この混合物を捕
捉試薬／第１分析物質および捕捉試薬／第２の分析物質複合体を形成するのに十
分な時間および条件下でインキュベートする。次いでこれらのこのように形成し
た複合体を、シグナル発生化合物で標識した第１の分析物質に特異的な結合ペア
のメンバーを含んでなる指示試薬、およびシグナル発生化合物で標識した第２の
分析物質に特異的な結合ペアのメンバーを含んでなる指示試薬と接触させて第２
の混合物を形成する。この第２の混合物を捕捉試薬／第１分析物質／指示試薬複
合体および捕捉試薬／第２の分析物質／指示試薬複合体を形成するのに十分な時
間および条件下でインキュベートする。試験サンプル中の一つまたはそれ以上の
分析物質の存在の指標としていずれかまたは両方の固相に形成された複合体に関
連して発生するシグナルを検出することにより、一つまたはそれ以上の分析物質
の存在を決定する。このアッセイ様式では本明細書に開示する発現系に由来する
組換え抗原、および本明細書に開示する発現系に由来するタンパク質から製造さ
れるモノクローナル抗体を利用する。例えばこのアッセイ系においてＢＵ１０１
抗原を第１の分析物質にできる。かかるアッセイ系についてはＥＰ公開番号０４
７３０６５においてより詳細に記載されている。

【０１９１】 さらに別のアッセイ様式では、本明細書に開示されるポリペプチドを利用して
試験サンプル中のＢＵ１０１抗原に対する抗体の存在を検出できる。例えば試験
サンプルを少なくとも一つのポリペプチド例えば組換えタンパク質または合成ペ
プチドが結合している固相と共にインキュベートする。ポリペプチドおよびその
断片は配列番号２０ないし２９からなる群から選択される。これらを抗原／抗体
複合体を形成するのに十分な時間および条件下で反応させる。インキュベーショ
ンの後、抗原／抗体複合体を検出する。選択したアッセイ系に応じ、指示試薬を
用いて検出を容易にできる。別のアッセイ様式では、試験サンプルを本明細書に
記載されるように生成された組換えタンパク質が結合している固相と接触させ、
また指示試薬で好ましく標識されているタンパク質に特異的なモノクローナルま
たはポリクローナル抗体とも接触させる。抗体／抗原複合体を形成するのに十分
な時間および条件下でインキュベートした後、遊離相から固相を分離し、固相ま
たは遊離相のいずれかにおいてＢＵ１０１抗原に対する抗体の存在の指標として
標識を検出する。本明細書に開示される組換え抗原を用いる別のアッセイ様式も
企図される。これらには試験サンプルを、第１の供給源に由来する少なくとも一
つの抗原が結合している固相と接触させ、固相および試験サンプルを、抗原／抗
体複合体を形成するのに十分な時間および条件下でインキュベートし、次いで固
相を、第１の供給源とは異なる第２の供給源に由来する、標識した抗原と接触さ
せる。例えば第１の供給源例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する組換えタン
パク質を捕捉用抗原として固相上で用い、試験サンプルをこのように調製した固
相に加え、続いて判断されるかまたは必要とされる場合、標準的なインキュベー
ションおよび洗浄工程を実施し、異なる供給源（すなわち大腸菌以外）に由来す
る組換えタンパク質を続いて検出される指示試薬の一部として用いる。同様に固
相上の組換え抗原および指示物質相の合成ペプチドの組み合わせもまた可能であ
る。捕捉抗原として第１の供給源から生成されるかまたは由来するＢＵ１０１に
特異的な抗原および異なる第２の供給源からのＢＵ１０１に特異的な抗原を利用
するいずれかのアッセイ様式が企図される。このように、組換え抗原の種々組み
合わせおよび合成ペプチド、精製タンパク質等の使用は本発明の範囲内である。
このおよびその他のアッセイのごときアッセイが米国特許第５２５４４５８号に
記載されており、これは所有権を共有し、参照により本明細書に組み込まれる。

【０１９２】 種々のその他の固相を利用するその他の態様もまた企図され、本発明の範囲内
である。例えば負に荷電した重合体（ＥＰ公開番号０３２６１００およびＥＰ公
開番号０４０６４７３）で固定化できる反応複合体を固定するためのイオン捕捉
法を本発明に従って用い、高速液相免疫化学反応を行うことができる。負に荷電
したポリアニオン／免疫複合体および予め処理した、正に荷電した多孔性マトリ
ックス間のイオン相互作用により、残りの反応混合物から固定可能な免疫複合体
を分離し、前記した種々シグナル発生系、例えばＥＰＯ公開番号０２７３１１５
に記載される化学ルミネサンスシグナル測定に記載されるものなどを用いて検出
する。

【０１９３】 また、本発明の方法を、固相が微粒子（磁性または非磁性）を含んでなる自動
および半自動システムなどの微粒子技術を利用する系に適用できる。かかる系に
は例えば各々公開ＥＰＯ出願番号ＥＰ０４２５６３３およびＥＰ０４２４６３４
に記載されるものなどがある。

【０１９４】 イムノアッセイのための走査プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）の使用もまた本発明の
モノクローナル抗体を容易に適用できる技術である。走査プローブ顕微鏡、とり
わけ原子力顕微鏡では、捕捉相例えば少なくとも一つの本発明のモノクローナル
抗体を固相に付着させ、走査プローブ顕微鏡を用いて固相表面に存在し得る抗原
／抗体複合体を検出する。トンネル顕微鏡の使用により抗原／抗体複合体を検出
するために通常多くのイムノアッセイ系において用いなければならない標識の必
要性が排除される。特異的結合反応をモニター観察するためにＳＰＭが多くの方
法において使用できる。一つの態様では、特異的結合パートナーの一つのメンバ
ー（本発明のモノクローナル抗体である分析物質特異的物質）を走査に適当な表
面に結合する。プラスティック性または金属性表面の固相からなる試験片に吸着
させることにより分析物質特異的物質を結合でき、続いて当業者に周知の方法を
実施する。または、特異的結合パートナー（分析物質特異的物質）の、誘導プラ
スティック、金属、シリコンもしくはガラスの固相からなる試験片への共有結合
を利用できる。共有結合法は当業者に周知であり、特異的結合パートナーを試験
片に非可逆的に結合する種々の手段を含む。試験片がシリコンまたはガラスであ
る場合、特異的結合パートナーに結合する前に表面を活性化しなければならない
。また、高分子電解質相互作用を用いる技術および化学により特異的結合パート
ナーを試験片表面に固定できる。好ましい結合方法は共有結合的手段による。特
異的結合メンバーの結合に続いて、表面をさらに血清、タンパク質または非特異
的結合を最低にするその他の遮断物質のごとき物質と反応させることができる。
またアッセイ目的でその適合性を変化させるために製品の部位または使用する点
のいずれかで表面をも走査できる。走査方法により試験片の特異的結合特性は変
化しないと予測される。

【０１９５】 本発明は固相の使用が好ましいことを開示しているが、試薬例えば本発明の抗
体、タンパク質およびペプチドを非固相アッセイ系において利用できることを企
図している。これらのアッセイ系は当業者に周知であり、本発明の範囲内である
と考えられる。

【０１９６】 アッセイに用いられる試薬を一つまたはそれ以上の容器例えばバイアルまたは
ビンを含む試験キットの形態で提供でき、各々の容器はアッセイで用いられる別
個の試薬例えばプローブ、プライマー、モノクローナル抗体もしくはモノクロー
ナル抗体のカクテル、またはポリペプチド（例えば組換えにより、合成的に製造
されたまたは精製された）を含有する。ポリペプチドおよびその断片は配列番号
２０ないし２９からなる群から選択される。その他の構成成分例えばバッファー
、対照等は当業者に周知であり、かかる試験キットに含んでよい。入手可能な体
液例えば血液、尿、唾液および便を含んでなる試験サンプルを収集する手段を有
する試験キットを提供することをも企図する。収集に有用なかかる手段（「収集
用材料」）には血液を収集および安定化するためのランセットおよび吸収用紙ま
たは布；唾液を収集および安定化するための綿棒；尿または便を収集および安定
化するためのカップなどがある。サンプルの変性または非可逆的な吸着を避ける
ために、収集用材料、紙、布、綿棒、カップ等を処理してもよい。また標本の完
全性の維持を補助するために、収集用材料は保存剤、安定化剤または抗菌剤で処
理されるか、またはこれらを含有できる。外科手術または針によるバイオプシで
得られる試験標本を収集、安定化および保存するために設計されたキットもまた
有用である。すべてのキットは別個に提供され得る二つの構成部分から構成され
ており；一つの構成部分は標本の収集および輸送のためのものであり、もう一つ
の構成部分は標本の分析のためのものである。例えば収集用の構成部分は一般市
場の利用者に提供され、一方分析用構成部分は分析物質の存在、不在または量を
決定する研究者などに提供される。さらに試験標本の収集、安定化および保存の
ためのキットは熟練者以外の人による使用のために構成され、家庭で使用し、続
いて試験サンプルの分析のために研究室に輸送されるためのもので、一般市場で
入手できる。

【０１９７】 インビボ抗体使用 本発明の抗体をインビボで用いることができる；すなわち、乳房の疾患を有す
ることが疑われるまたは乳房の疾患を有する患者に診断または治療用途でこれら
を注射できる。インビボ診断のための抗体の使用は当該分野で周知である。Ｓｕ
ｍｅｒｄｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，１７：２４７−２５４（１９
９０）では標識としてインジウムＩＩＩを用いる胎児性癌抗原（ＣＥＡ）発現腫
瘍の放射性免疫シンチグラフィーによる画像化のために最適化された抗体キレー
ト化剤について記載している。Ｇｒｉｆｆｉｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃ．，９
：６３１−６４０（１９９１）では再発性結腸直腸癌が疑われる患者の腫瘍の検
出におけるこの薬物の使用について記載している。磁気共鳴による画像化のため
の標識として常磁性イオンを有する類似の物質の使用は当該分野で周知である（
Ｒ．Ｂ．Ｌａｕｆｆｅｒ、Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅ，２２：３３９−３４２（１９９１））。ＢＵ１０１抗原に対して
指向する抗体を乳房の疾患例えば乳癌が疑われる患者に、患者の病態の診断また
は病期決定の目的で注射できる。用いる標識は選択した画像化様式に依存する。
放射性標識例えばインジウムＩＩＩ、テクネチウム９９ｍまたはイオダイン１３
１を平面走査または単光子放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣ）に用いるこ
とができる。陽電子放出標識例えばフルオリン１９を陽電子放出断層撮影（ＰＥ
Ｔ）に用いることもできる。ＭＲＩでは常磁性イオン例えばガドリニウム（ＩＩ
Ｉ）またはマンガネーゼ（ＩＩ）を用いることができる。乳房内または乳房外の
標識の局在により疾患の拡散を決定できる。乳房内の標識の量により乳癌の存在
または不在を決定できる。

【０１９８】 乳房の疾患を有することが解っている患者にＢＵ１０１抗原に対して指向する
抗体を注射するのは治療上有効である。抗体は組織または器官上または内に発現
するＢＵ１０１抗原に結合することにより結合物質を用いることなく抗体は効果
を奏することができる。また別に、治療効果を高めるために抗体を細胞毒例えば
薬物、毒素または放射性核種に結合できる。ＧａｒｎｅｔｔおよびＢａｌｄｗｉ
ｎ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６：２４０７−２４１２（１９８６）
では薬物−モノクローナル抗体結合体の調製について記載している。Ｐａｓｔａ
ｎら、Ｃｅｌｌ，４７：６４１−６４８（１９８６）では種々癌の治療のための
モノクローナル抗体に結合した毒素の使用について説明している。Ｇｏｏｄｗｉ
ｎおよびＭｅａｒｅｓ、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，８０：２６７５
−２６８０（１９９７）では、腫瘍に対する用量は最大であるが、正常組織毒性
を制限する種々ストラテジーにおけるイトリウム９０標識モノクローナル抗体の
使用について記載している。その他の周知の細胞毒性放射性核種にはコパー６７
、イオダイン１３１およびレニウム１８６などがあり、これらは全て乳癌の治療
のためのＢＵ１０１抗原に対して指向するモノクローナル抗体の標識に用いるこ
とができる。

【０１９９】 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（クローン６０３１４８Ｈ１および２０８３５７８Ｈ
１）を各々１９９６年１０月７日および１９９８年３月９日にアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）、１０８０１ユニバーシテ
ィー・ブールバード、マナサス、バージニア州に寄託した。寄託はブダペスト条
約のもとでなされ、寄託日から３０年間または寄託の最後の要請の後５年間、ま
たは米国特許の強制期間の間、いずれかの長い期間維持される。本明細書に記載
する寄託およびその他の寄託物質は便宜的にのみ提供されるものであって、本明
細書に提供される教示の観点で本発明の実施に必要ではない。寄託物質全てにお
けるｃＤＮＡ配列を参照により本発明書に組み込まれる。クローン６０３１４８
Ｈ１はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号９８１８５に一致する。クローン２０８３５７
８Ｈ１はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号９８６８４に一致する。

【０２００】 本発明をここで実施例により記載するが、これは説明を意味するものであり、
本発明の範囲を限定するものではない。

【０２０１】 実施例 実施例１：乳房組織ライブラリーＢＵ１０１遺伝子特異的クローンの同定 Ａ．発現配列タグ（ＥＳＴ）または転写イメージのライブラリー比較 ｃＤＮＡクローンインサートの部分配列、いわゆる「発現配列タグ」（ＥＳＴ
）を乳房腫瘍組織、乳房非腫瘍組織および腫瘍および非腫瘍の両方の多くのその
他の組織から作ったｃＤＮＡライブラリーから誘導し、遺伝子転写イメージとし
てデータベース（ライフセック（商標）データベース、インサイト・ファーマシ
ューティカルズ、パロアルト、カリフォルニア州より入手可能）に入力した。国
際公開番号ＷＯ９５／２０６８１を参照のこと。（転写イメージは所定の組織ラ
イブラリーにおける代表的な遺伝子の各々のＥＳＴの番号の一覧である。成熟配
列重複のＥＳＴ共有領域をクラスタに分類する。クラスタに代表的な５’ＥＳＴ
からクローン番号を割り当てる。しばしば、そのコンセンサス配列を自動クラス
タ化の基準に合致しなかったその他のＥＳＴの配列と比較することにより、目的
のクラスタを拡大できる。全ての可能なクラスタおよび単一のＥＳＴのアライン
メントはコンセンサス配列を誘導するコンティグを表す）。次いで転写イメージ
を評価して主に乳房組織ライブラリーを代表するＥＳＴ配列を同定する。次いで
標的ライブラリーにおける存在度（発生量）およびバックグラウンドライブラリ
ーの不在度に従ってこれらの標的クローンをランク分けした。バックグラウンド
の発生量が低い存在度の高いクローンを優先的に高次の研究に用いた。ＢＵ１０
１のコンセンサス配列に対応するＥＳＴは乳房組織ライブラリーの２５．６％（
３９のうち１０）に見出された。コンセンサス配列、配列番号６（またはその断
片）に対応するＥＳＴはデータベースのその他の非乳房ライブラリーの１．０６
％（７５４のうち８）にしか見出されなかった。従って、コンセンサス配列また
はその断片が非乳房組織よりも乳房組織において２４．１倍以上多く見出された
。重複クローン２０８３５７８Ｈ１（配列番号１）、６０３１４８Ｈ１（配列番
号２）、６０４２９０Ｈ１（配列番号３）の各々がさらなる研究のために同定さ
れた。これらは、コンティグを形成するのに必要な最低数のクローン（クローン
２０８３５７８Ｈ１および６０３１４８Ｈ１の配列全長［各々２０８３５７８ｉ
ｎｈ（配列番号４）および６０３１４８ｉｎｈ（配列番号５）と称する］に沿っ
て）を示し、そこから本明細書において提供されるコンセンサス配列（配列番号
６）が誘導された。

【０２０２】 Ｂ．コンセンサス配列の生成 クローン２０８３５７８Ｈ１のヌクレオチド配列（配列番号１）、６０３１４
８Ｈ１のヌクレオチド配列（配列番号２）、６０４２９０Ｈ１のヌクレオチド配
列（配列番号３）およびクローン２０８３５７８Ｈ１および６０３１４８Ｈ１の
ヌクレオチド配列の配列全長［各々２０８３５７８ｉｎｈ（配列番号４）および
６０３１４８ｉｎｈ（配列番号５）と称する］をシークエンチャー（商標）プロ
グラム（ジーン・コーズ・コーポレーョン、アンアボール、ミシガン州）に入力
してヌクレオチドアラインメントシ（コンティグマップ）を作成し、次いでその
コンセンサス配列（配列番号６）を作った。図１はこれらのクローンのヌクレオ
チド配列アラインメントおよび得られたヌクレオチドコンセンサス配列（配列番
号６）を示す。図２はクローン２０８３５７８Ｈ１（配列番号１）、６０３１４
８Ｈ１（配列番号２）、６０４２９０Ｈ１（配列番号３）およびクローン２０８
３５７８Ｈ１および６０３１４８Ｈ１の配列全長［各々２０８３５７８ｉｎｈ（
配列番号４）および６０３１４８ｉｎｈ（配列番号５）と称する］を示すコンテ
ィグマップを表し、グラフィックディスプレイでＢＵ１０１遺伝子の重複領域お
よびこれらのクローンの得られたコンセンサスヌクレオチド配列（配列番号６）
を形成する。これに従い、コンセンサス配列（配列番号６）で３フレーム翻訳を
実施した。第１の順行フレームは配列番号２０として表される９０残基のアミノ
酸配列をコードするオープン・リーディング・フレームを有することが見出され
た。オープン・リーディング・フレームは配列番号６のヌクレオチド９７ないし
３６６に対応する。当業者に周知のソフトウェアおよび技術を用いて配列番号２
０の９０残基アミノ酸配列を確立された配列と比較した。ラット前立腺ステロイ
ド結合タンパク質（ｐｓｃ．１．ｐｅｐ）のポリペプチド配列が配列番号２０の
ＢＵ１０１ポリペプチド配列に部分的に相同であることが見出された。このラッ
ト前立腺ステロイド結合タンパク質はＰａｒｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２９８：
９２−９４（１９８２）に記載されている。

【０２０３】 ライフセック（商標）データベースの分析によりコンセンサスヌクレオチド配
列（配列番号６）の２５４位置におけるＴ／Ｃ多型の可能性が示された。データ
ベースにおいてＣヌクレオチド変種が３３発生し、Ｔヌクレオチド変種が８発生
した。ヌクレオチド２５４におけるこの多型性の結果、プロリン（ＣＣＧ）およ
びロイシン（ＣＴＧ）間でアミノ酸がシフトする。

【０２０４】 実施例２：ＢＵ１０１ＥＳＴ特異的クローンのシークエンシング 周知の方法［Ｆ．Ｓａｎｇｅｒら、ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ．７４：５４６３（
１９７７）］に従って、色素ターミネーターを用いるジデオキシ終止シークエン
シングによりＢＵ１０１遺伝子コンティグのクローン２０８３５７８Ｈ１、６０
３１４８Ｈ１のＤＮＡ配列を決定した（各々配列番号４および配列番号５）。

【０２０５】 ベクター例えばｐＳＰＯＲＴ１（ライフ・テクノロジーズ・ガイザースブルグ
、メリーランド州）およびｐＩＮＣＹ（インサイト・ファーマシューティカルズ
・インコーポレーティッド、パロアルト、カリフォルニア州から入手可能）がイ
ンサートの３‘および５’ライゲーション接合部にちょうど隣接するユニバーサ
ル・プライミング部位を含有するので、ユニバーサルプライマー、配列番号９お
よび配列番号１０（各々ニューイングランド・バイオラブス、ベバリー、メリー
ランド州およびアプライド・バイオシステムズ・インコーポレーティッド、フォ
スター・シティー、カリフォルニア州）を用いて両方向でインサートをシークエ
ンシングした。ポリアクリルアミド変性ゲルにシークエンシング反応物を流し、
アプライド・バイオシステムズ３７７シークエンサー（アプライド・バイオシス
テムズ、フォスター・シティー、カリフォルニア州より入手可能）により配列を
決定した。コンセンサス配列、配列番号６の配列情報から別のシークエンシング
プライマー、配列番号１１および配列番号１２を設計した。次いで、前記するよ
うに、これらのプライマーを用いて各ＤＮＡ鎖からクローン化したインサートの
残りのＤＮＡ配列を決定した。

【０２０６】 実施例３：核酸 Ａ．組織からのＲＮＡ抽出 全ＲＮＡを乳房組織および乳房以外の組織から単離した。当該分野で周知のＫ
ａｔｏら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：２１８２−２１９１（１９８７））に記載さ
れている塩化リチウム／尿素技術およびトリゾール（商標）（ギブコ・ビー・ア
ール・エル、グランドアイランド、ニューヨーク州）など（これに限定するもの
ではない）の種々方法を用いることができる。

【０２０７】 簡単には、組織を滅菌コニカルチューブ中氷上に置き、３Ｍ ＬｉＣｌ、６Ｍ 尿素、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ メルカプトエタノール、５０ｍＭ トリ
スＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加えた。ポリトロン（登録商標）ホモジナイザー（ブ
リンクマン・インストラメンツ・インコーポレーティッド、ウェストベリー、ニ
ューヨーク州）で氷上３０ないし５０秒間、組織をホモジナイズした。溶液を１
５ｍｌプラスティック遠心チューブに移し、−２０℃で一晩放置した。チューブ
を９０００ｘｇ、０ないし４℃で９０分間遠心し、上澄を即座にデカンテーショ
ンした。３Ｍ ＬｉＣｌ１０ｍｌを加え、チューブを５秒間攪拌した。チューブ
を１１０００ｘｇ、０ないし４℃で４５分間遠心した。デカンテーション、Ｌｉ
Ｃｌ中への再懸濁および遠心を繰り返し、最終的に得られたペレットを空気乾燥
し、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ、１０ｍＭ トリス（ｐＨ７．５）２
ｍｌに懸濁した。プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）２０μｌを加え、溶液を
３７℃で３０分間時々混合しながらインキュベートした。３Ｍ ＮａＣｌの１０
分の１容量（０．２２ないし０．２５ｍｌ）を加え、溶液を攪拌し、その後フェ
ノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ＰＣＩ）２ｍｌを含有する別の
チューブに移した。チューブを１ないし３秒間攪拌し、３０００ｘｇ、１０℃で
２０分間遠心した。ＰＣＩ抽出を繰り返し、続いてクロロホルム／イソアミルア
ルコール（ＣＩ）で２回類似の抽出を行った。最終的に得られた水溶液を予め冷
却した、無水エタノール６ｍｌを含有する１５ｍｌコレックスガラスチューブに
移し、チューブをパラフィンで覆い、−２０℃で一晩放置した。チューブを１０
０００ｘｇ、０ないし４℃で３０分間遠心し、エタノール上澄を即座にデカンテ
ーションした。ＲＮＡペレットを７５％ 氷冷エタノール１０ｍｌで４回洗浄し
、最終的に得られたペレットを室温で１５分間空気乾燥した。ＲＮＡを１０ｍＭ
ＴＥ（ｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡ）０．５ｍｌに懸濁し、分光測光法によ
りその濃度を測定した。ＲＮＡサンプルを等分し、エタノール沈殿物として−７
０℃で保存した。

【０２０８】 ＲＮＡの品質をアガロースゲル電気泳動（実施例５、ノーザン・ブロット分析
を参照のこと）により決定し、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムで１時間染色し
た。完全なリボソームＲＮＡを含有しないＲＮＡサンプルはこの研究から排除し
た。

【０２０９】 別法として、ＲＴ−ＰＣＲ分析では、ウルトラスペックＲＮＡ試薬１ｍｌを２
．０ｍｌポリプロピレンマイクロヒュッジチューブ中の微粉砕した組織１２０ｍ
ｇに加え、ポリトロン（登録商標）ホモジナイザー（ブリンクマン・インストラ
メンツ・インコーポレーティッド、ウェストベリー、ニューヨーク州）で５０秒
間ホモジナイズし、氷上に５分間置いた。次いで各サンプルにクロロホルム０．
２ｍｌを加え、続いて１５秒間攪拌した。氷上にさらに５分間サンプルを置き、
続いて１２０００ｘｇ、４℃で１５分間遠心した。上層を収集し、別のＲＮアー
ゼ不含２．０ｍｌマイクロヒュッジチューブに移した。イソプロパノールの等容
量を各サンプルに加え、溶液を氷上に１０分間置いた。サンプルを１２０００ｘ
ｇ、４℃で１０分間遠心し、上澄を捨てた。残ったペレットを冷７５％ エタノ
ールで２回洗浄し、攪拌して再懸濁し、次いで再懸濁した物質を７５００ｘｇ、
４℃で５分間遠心してペレット化した。最後に、ＲＮＡペレットをスピードバッ
ク（サバント、ファーミングデール、ニューヨーク州）中５分間乾燥し、ＲＮア
ーゼ不含水中で再構築した。

【０２１０】 Ｂ．血液単核細胞からのＲＮＡ抽出 以下のとおりフィコール・ハイパークを用いて遠心により患者の血液サンプル
から単核細胞を単離する。全血１０ｍｌ容量を等容量のＲＰＭＩメジウム（ギブ
コ・ビー・アール・エル、グランドアイランド、ニューヨーク州）と混合する。
次いでこの混合物の下にフィコール・ハイパーク（ファルマシア、ピスカッタウ
ェイ、ニュージャージー州）１０ｍｌを層化し、２００ｘｇで３０分間遠心する
。単核細胞を含有するバッフィーコートを取り除き、ダルベッコＰＢＳ（ギブコ
・ビー・アール・エル、グランドアイランド、ニューヨーク州）で５０ｍｌに希
釈し、混合物を２００ｘｇで１０分間遠心する。２回洗浄した後、得られたペレ
ットをダルベッコＰＢＳに再懸濁し最終容量を１ｍｌにする。

【０２１１】 Ｎ．Ｋａｔｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６１：２１８２−２１９１（１９８
７）に記載されるように、単離された単核細胞からＲＮＡを調製する。簡単には
、ペレット化した単核細胞を最終容量１ｍｌにし、次いでＰＢＳ２５０μｌに再
懸濁し、３Ｍ ＬｉＣｌ、６Ｍ 尿素、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ２−メル
カプトエタノール、５０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）２．５ｍｌと混合す
る。得られた混合物をホモジナイズし、２０℃で一晩インキュベートする。ベッ
クマンＪ２−２１Ｍローター中ホモジネートを８０００ｒｐｍ、０ないし４℃で
９０分間遠心する。ペレットを３Ｍ ＬｉＣｌ１０ｍｌ中攪拌して再懸濁し、次
いでベックマンＪ２−２１Ｍローター中１００００ｒｐｍ、０ないし４℃で４５
分間遠心する。次いで再懸濁およびペレット化を繰り返す。ペレットを１ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ、１０ｍＭ トリス（ｐＨ７．５）および４００μ
ｇプロテイナーゼＫ２ｍｌに攪拌しながら再懸濁し、次いで振盪しながら３７℃
で３０分間インキュベートする。次いで３Ｍ ＮａＣｌの１０分の１容量を加え
、混合物を攪拌する。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ＰＣ
Ｉ）を用いて抽出サイクルを２回行い、続いてクロロホルム／イソアミルアルコ
ール（ＣＩ）を用いて１回抽出してタンパク質を除去する。無水エタノール６ｍ
ｌを添加してＲＮＡを沈殿させ、続いて−２０℃で一晩インキュベートする。遠
心により沈殿したＲＮＡを収集した後、ペレットを７５％エタノールで４回洗浄
する。次いでペレット化したＲＮＡを１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ トリスＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）を含有する溶液に溶解する。

【０２１２】 陰性対照として乳房以外の組織を用いる。市販により入手可能なキット例えば
ポリアデニル化ＲＮＡを単離するためのオリゴｄＴセルローススピンカラム（フ
ァルマシア、ウプサラ、スウェーデンのレディコール（商標））を用いることに
より全ＲＮＡからｍＲＮＡをさらに精製できる。リボヌクレアーゼ保護アッセイ
で分析するために、溶解バッファー（５Ｍ グアニジンチオシアネート、０．１
Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）に全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを溶解する。

【０２１３】 Ｃ．ポリソームからのＲＮＡ抽出 組織をセイライン中４℃で切り刻み、６ｍＭ ２−メルカプトエタノール含有
ＴＫ_１５０Ｍ（１５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ トリスＨ
Ｃｌ、ｐＨ７．４）溶液中０．８Ｍ スクロース２．５容量と混合する。Ｂ．Ｍ
ｅｃｈｌｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５２：２４１
−２４８（１９８７）に記載されるように、組織をテフロン（登録商標）・ガラ
ス・ポッター・ホモジナイザーで１００ないし２００ｒｐｍで５ストローク、続
いてドウンス・ホモジナイザーで６ストーロークでホモジナイズする。次いでホ
モジネートを１２０００ｘｇ、４℃で１５分間遠心し、核を沈殿させる。ＴＫ_１
５０Ｍ中２．５Ｍ スクロース６ｍｌで上澄２ｍｌを混合することによりポリソ
ームを単離し、３８ｍｌポリアロマーチューブ中ＴＫ_１５０Ｍ中２．５Ｍ スク
ロース４ｍｌの上にこの混合物を層化する。抽出物分画の上にさらに連続して２
回スクロースＴＫ_１５０Ｍ溶液を層化する；第１の層、２．０５Ｍスクロース１
３ｍｌ、続いて第２の層、１．３Ｍ スクロース６ｍｌ。９００００ｘｇ、４℃
で５時間グラジエントを遠心してポリソームを単離する。次いでシリコン処理し
たパスチュールピペットで１．３Ｍ スクロース／２．０５Ｍ スクローロス接
触面から分画を取り、等容量のＴＥ（１０ｍＭ トリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、１
ｍＭ ＥＤＴＡ）で希釈する。等容量の９０℃ ＳＤＳバッファー（１％ ＳＤ
Ｓ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリスＨＣｌ、ｐＨ７．４）を加え、沸
騰水浴中２分間溶液をインキュベートする。次にプロテイナーゼＫ消化（５０ｍ
ｇ／ｍｌ）を用いて３７℃で１５分間タンパク質を消化する。フェノール−クロ
ロホルム抽出物３等容量でｍＲＮＡを精製し、続いて２Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ５．２）０．１容量および１００％エタノール２容量で−２０℃で一晩沈殿さ
せる。１２０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心して沈殿したＲＮＡを回収する。Ｒ
ＮＡを乾燥し、ＴＥ（ｐＨ７．４）または蒸留水に再懸濁する。次いで再懸濁し
たＲＮＡをスロットブロットまたはドットブロットハイブリダイゼーションアッ
セイに用いてＢＵ１０１ ｍＲＮＡの存在を確認する（実施例６を参照のこと）
。

【０２１４】 核酸及びタンパク質の品質は用いる調製法に依存する。標的分子の単離効率を
最大にするために各サンプルに異なる調製技術が必要であろう。これらの調製技
術は通常の技術範囲内である。

【０２１５】 実施例４：リボヌクレアーゼ保護アッセイ Ａ．標識した相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブおよ
び標識していないセンス鎖の合成 キアゲン・プラスミド・精製キット（キアゲン、チャッツウォース、カリフォ
ルニア州）を用いて記載した、ＢＵ１０１遺伝子ｃＤＮＡ配列を含有し、対立す
るＳＰ６およびＴ７ポリメラーゼプロモーターでフランキングされたｐＰＯＲＴ
１プラスミド、クローン６０３１４８Ｈ１を精製した。次いでＤｄｅ Ｉ制限酵
素１０単位を用いて３７℃で１時間切断することによりプラスミド１０μｇを直
線化した。ＱＩＡプレップキット（キアゲン、チャッツウォース、カリフォルニ
ア州）を用いて直線化したプラスミドを精製し、これを用いて供給者の指示書に
記載されるように、リボプローブ（登録商標）インビトロ転写システム（プロメ
ガ・コーポレーション、マジソン、ウィスコンシン州）を用いてＳＰ６プロモー
ターから６．３μＭ（アルファ^３２Ｐ）ＵＴＰ（アマーシャム・ライフ・サイエ
ンシズ・インコーポレーティッド、アーリントン・ハイツ、イリノイ州）で標識
したアンチセンス転写物を合成した。センス鎖を作るために、精製プラスミド１
０μｇを制限酵素Ｘｂａ Ｉ １０単位およびＮｏｔＩ １０単位で切断し、前
記のようにＴ７プロモーターから転写した。センス鎖およびアンチセンス鎖の両
方をスピンカラムクロマトグラフィーにより単離した。２６０ｎｍにおけるＵＶ
吸収により未標識センス鎖を定量した。

【０２１６】 Ｂ．標識プローブの標的へのハイブリダイゼーション 液体窒素下凍結組織を粉末に粉砕し、１００ないし５００ｍｇを、ダイレクト
プロテクト（商標）ライゼートＲＮアーゼ保護キット（アンビオン・インコーポ
レーティッド、オースティン、テキサス州）の構成成分と同様に利用できる溶解
バッファー１ｍｌに溶解した。さらに組織ホモジナイザーを用いて溶解を達成し
た。加えて、陽性対照として使用するためにマウス肝臓ライゼートのセンス鎖の
既知の量からなる一連の希釈物を作った。最終的に、溶解した組織すなわち希釈
したセンス鎖４５μｌを溶解バッファー５μｌ中放射性標識プローブ１ｘ１０^５ ｃｐｍと直接混合した。３７℃で一晩ハイブリダイゼーションを進行させた。

【０２１７】 Ｃ．ＲＮアーゼ消化 ダイレクト・プロテクト（商標）プロトコルに従ってＲＮアーゼＡおよびＲＮ
アーゼＴ１の溶液を用いて３７℃で３０分間でプローブにハイブリダイズしなか
ったＲＮＡを反応物から除去し、続いてサルコシルナトリウムの存在下プロテイ
ナーゼＫ消化によりＲＮアーゼを除去した。次いで消化から保護されたハイブリ
ダイズされた断片を等容量のイソプロパノールを添加することにより沈殿させ、
−７０℃で３時間放置した。１２０００ｘｇで２０分間の遠心により沈殿物を収
集した。

【０２１８】 Ｄ．断片分析 染料（８０％ ホルムアミド、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１ｍｇ／
ｍｌ キシレンシアノール、１ｍｇ／ｍｌ ブロモフェノールブルー）を加えた
変性ゲルに沈殿物を溶解し、熱変性し、６％ ポリアクリルアミドＴＢＥ、８Ｍ
尿素変性ゲルで電気泳動した。ゲルを画像化し、ストーム（商標）保存蛍光体
オートラジオグラフィーシステム（モレキュラー・ダイナミクス、サニーベール
、カリフォルニア州）を用いて分析した。試験サンプルから得られたピーク面積
を陽性対照センス鎖の周知の希釈物（前記のセクションＢを参照のこと）から得
られたピーク面積と比較することによりフェムトグラム（ｆｇ）に現れた保護断
片のバンドを定量した。加えて、ライゼート中のＤＮＡ濃度を評価して試験サン
プルライゼート中の細胞数を推測した。結果をＢＵ１０１ ＲＮＡ分子／細胞の
画像評価スコアとして表した（表１）。

【０２１９】

【表１】 ^＊保護断片が検出されなかったサンプルを「−」と評し；保護断片が検出され
、そのｆｇ値が標準曲線内にあったサンプルを「＋」と評し；保護断片が検出さ
れ、そのｆｇ値が標準曲線の２ないし１０倍であったサンプルを「２＋」と評し
；保護断片が検出され、そのｆｇ値が標準曲線の１０倍またはそれ以上であった
サンプルを「３＋」と評した。

【０２２０】 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６
およびその断片または相補体からなる群から選択される配列からなる生成物の検
出はＢＵ１０１ ｍＲＮＡの存在を示すものであり、乳房組織疾患または症状例
えば乳癌の診断を示唆するものである。

【０２２１】 実施例５：ノーザンブロッティング ノーザンブロッティングは当該分野で周知の技術である。ノーザンブロット技
術を用いて、ゲル電気泳動および核酸ハイブリダイゼーションを用いてＲＮＡの
複合集団から規定の大きさのＲＮＡ断片を同定した。簡単には、全ＲＮＡ（実施
例３を参照のこと）５ないし１０μｇを４０ｍＭ モルフォリノプロパンスルフ
ォン酸（ＭＯＰＳ）（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、２．２Ｍ ホルムアルデヒド、５０容量／容量％ ホルムアミドを含有す
る溶液１５μｌ中６５℃で１５分間インキュベートした。変性ＲＮＡをローディ
ングバッファー（５０％ グリセロール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．４％ ブロム
フェノールブルー、０．４％ キシレンシアノール）２μｌと混合し、４０ｍＭ
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡおよ
び２．２Ｍ ホルムアルデヒドを含有する変性１．０％ アガロースゲルに装填
した。ゲルを６０Ｖで１．５時間電気泳動し、ＲＮＡアーゼ不含水ですすいだ。
下方アルカリ性キャピラリー移動法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、Ａｎａｌ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．２０１：１３４−１３９（１９９２））を用いてＲＮＡをゲルから
ナイロン膜（ブライトスター・プラス、アンビオン・インコーポレーティッド、
オースティン、テキサス州）に１．５時間移した。フィルターを１Ｘ ＳＳＣで
すすぎ、自動架橋化様式のストラッタリンカー（ストラッタジーン・インコーポ
レーティッド、ラジョーラ、カルフォルニア州）を用いてＲＮＡをフィルターに
架橋した。次いで予め加熱したプレハイブリダイゼーション溶液（５Ｘ ＳＳＣ
、５０％ ホルムアミド、５Ｘデンハーツ溶液、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子
ＤＮＡ）２０ｍｌを含有するハイブリダイゼーションチューブ内に膜を置き、４
２℃のハイブリダイゼーションオーブンで少なくとも３時間インキュベートした
。ブロットをプレハイブリダイズしたが、製造者の指示書に従って、ランダムプ
ライマーＤＮＡラベリングシステム（ライフ・テクノロジーズ・インコーポレー
ティッド、ガイザースブルグ、メリーランド州）を用いて、ＢＵ１０１インサー
ト断片（ＸｂａＩおよびＮｏｔＩでクローン６０３１４８Ｈ１を消化することに
より得られる）を用いて３２Ｐ標識ランダムプライムプローブを作った。プロー
ブの半分を１０分間煮沸し、氷上で迅速に冷却し、ハイブリダイゼーションチュ
ーブに加えた。４２℃で少なくとも１２時間ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション溶液を捨て、フィルターを３Ｘ ＳＳＣ、０．１％ Ｓ
ＤＳ３０ｍｌ中４２℃で１５分間洗浄し、続いて３Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤ
Ｓ３０ｍｌ中４２℃で１５分間洗浄した。フィルターをサランラップで包み、コ
ダックＸＡＲ−Ｏマットフィルムに８ないし９６時間暴露し、分析のためにフィ
ルムを現像した。

【０２２２】 臭化エチジウム染色アガロースゲルを用いるＲＮＡ品質分析並びに乳房組織お
よび非乳房組織からのＲＮＡにハイブリダイズするＢＵ１０１プローブを用いる
対応するノーザンブロットの結果を各々図３Ａおよび３Ｂに示す。ＲＮＡサイズ
標準の位置（キロ塩基対）をパネルの左に示す。ＢＵ１０１プローブはレーン１
の乳房サンプルにおいてのみ０．５キロ塩基対でＲＮＡバンドにハイブリダイズ
したが、レーン３の乳房組織のＲＮＡまたはレーン４ないし１０の７つの非乳房
サンプル（各々結腸、結腸、肺、肺、卵巣、前立腺および脾臓）（図３Ｂ）では
ハイブリダイズしなかった。レーン２はブランクである。

【０２２３】 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６
およびその断片または相補体に対応するｍＲＮＡの高レベルの発現はＢＵ１０１
ｍＲＮＡの存在を示すものであり、乳房組織疾患または症状、例えば乳癌の診
断を示唆するものである。

【０２２４】 実施例６：ドットブロット／スロットブロット ドットおよびスロットアッセイは核酸の複合混合物中の特定の核酸配列の存在
を評価するための迅速な方法である。かかるアッセイを実施するために、５０μ
ｇまでのＲＮＡを５０％ ホルムアミド、７％ ホルムアルデヒド、１Ｘ ＳＳ
Ｃ５０μｌと混合し、６８℃で１５分間インキュベートし、次いで氷上で冷却す
る。次いでＲＮＡ混合物に２０Ｘ ＳＳＣ１００μｌを加え、調製ニトロセルロ
ースまたはナイロン膜を有する多機能装置に真空下装填する。膜を水、２０Ｘ
ＳＳＣに１時間浸し、２０Ｘ ＳＳＣで予め湿らせた２枚のワットマン＃３フィ
ルターペーパー上に置き、スロットブロットまたはドットブロット真空多機能装
置に装填する。前記の実施例４に記載のとおりに調製および標識したプローブで
スロットブロットを分析する。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号
４、配列番号５、配列番号６およびその断片または相補体からなる群から選択さ
れる配列に対応するｍＲＮＡの検出はＢＵ１０１の存在の指標であり、乳房組織
疾患または症状、例えば乳癌の診断を示唆するものである。

【０２２５】 実施例５および６に記載の方法において利用できるその他の方法およびバッフ
ァーは、本明細書に特記したもの以外は周知であり、Ｊ．Ｓａｍｂｔｏｏｋら（
前記で引用）に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。

【０２２６】 実施例７：イン・シトゥ・ハイブリダイゼーション この方法は検出可能な核酸ハイブリダイゼーションプローブを用いて細胞にお
ける特異的標的核酸配列を直接検出するのに有用である。

【０２２７】 細胞性ＲＮＡの保持を最大にするために架橋固定剤例えばパラホルムアルデヒ
ドまたはグルタルアルデヒドで組織を調製する。Ｌ．Ａｎｇｅｒｅｒら、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３５：３７−７１（１９９１）を参照
のこと。簡単には、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）中１％ グルタ
ルアルデヒド５容量以上の中に組織を４℃で３０分間置く。溶液を新鮮なグルタ
ルアルデヒド溶液（５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）中１％ グルタ
ルアルデヒド）と交換してさらに３０分間固定する。固定溶液はおよそ０．３７
５％ ＮａＣｌのモル浸透圧を有していなければならない。組織を等張ＮａＣｌ
で１回洗浄し、リン酸塩を除去する。

【０２２８】 次いで以下のように固定した組織をパラフィンに包埋する。一連の漸増濃度の
エタノールで組織を各々１５分間脱水する：５０％（２回）、７０％（２回）、
８５％、９０％、次いで１００％（２回）。次に、組織をキシレンに、２回交換
して、室温で各２０分間浸す。次いで組織をキシレンおよびパラフィンの１：１
混合物に、２回交換して、６０℃で各２０分間浸し；次いでパラフィンに、最後
に３回交換して、各１５分間浸す。

【０２２９】 次に、標準的なミクロトームを用いて組織を５μｍ切片に切断し、予め組織付
着剤例えば３−アミノプロピルトリエトキシシランで処理したスライドに載せる
。

【０２３０】 １０分間２回のキシレン浸漬により組織からパラフィンを除去し、一連の漸減
濃度のエタノールで再水和する：９９％（２回）、９５％、８５％、７０％、５
０％、３０％、次いで蒸留水（２回）。切片を０．２Ｍ ＨＣｌで１０分間、前
処理し、２μｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫで３７℃で１５分間、浸透化する。

【０２３１】 ＢＵ１０１遺伝子プラスミドから転写した標識リボプローブ（実施例４を参照
のこと）を調製した組織切片にハイブリダイズさせ、３Ｘ 標準セイライン抽出
物および５０％ ホルムアミドルデヒド中５６℃で一晩インキュベートする。２
Ｘ標準セイラインクエン酸塩および５０％ ホルムアミドで洗浄することにより
過剰なプローブを除去し、続いて１００μｇ／ｍｌ ＲＮアーゼＡで３７℃で３
０分間消化する。顕微鏡下紫外（ＵＶ）光の照明により蛍光プローブを可視化す
る。細胞質中の蛍光はＢＵ１０１ ｍＲＮＡを示している。別法としてオートラ
ジオグラフィーにより切片を可視化できる。

【０２３２】 実施例８：逆転写ＰＣＲ Ａ．１工程ＲＴ−ＰＣＲアッセイ 当該分野で周知の方法を用いて逆転写ＰＣＲにより前記の標的配列を検出する
ための標的特異的プライマーを設計する。１工程ＲＴ−ＰＣＲは単一の反応混合
物においてＲＴおよびＰＣＲの両方を実施する連続的な方法である。５０ｍＭ（
Ｎ，Ｎ，−ビス［２−ヒドロキシエチル］グリシン）、ｐＨ８．１５、８１．７
ｍＭ ＫＯＡｃ、３３．３３ｍＭ ＫＯＨ、０．０１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アル
ブミン、０．１ｍＭ エチレンジアミンテトラ酢酸、０．０２ｍｇ／ｍｌ Ｎａ
Ｎ_３、８重量／容量％ グリセロール、１５０μＭ 各ｄＮＴＰ、０．２５μＭ
各プライマー、ｒＴｔｈポリメラーゼ５単位、３．２５ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ） _２ および標的ＲＮＡ（実施例３を参照のこと）５μｌを含有する反応混合物２０
０μｌでこの方法を実施する。ＲＮＡおよびｒＴｔｈポリメラーゼ酵素がＭｎ（
ＯＡｃ）_２の存在下不安定なので、Ｍｎ（ＯＡｃ）_２は標的を添加する直前に加
えるべきである。ｃＤＮＡ合成および熱循環に最適な条件は当業者に容易に決定
できる。反応物をパーキン−エルマー・サーマル・サイクラー４８０中でインキ
ュベートする。有用であることが解っている条件には、６０℃ないし７０℃、１
５ないし４５分間のｃＤＮＡ合成および９４℃、１分間；５５℃ないし７０℃、
１分間；７２℃、２分間の３０ないし４５増幅サイクルなどがある。またＴａｑ
ポリメラーゼおよび逆転写酵素例えばＭＭＬＶ（モロニー・ネズミ白血病ウイル
ス）またはＡＭＶ（鳥類の骨髄芽球症ウイルス）ＲＴ（逆転写）酵素を用いる二
重酵素法を用いて１工程ＲＴ−ＰＣＲを実施することもできる。

【０２３３】 Ｂ．従来のＲＴ−ＰＣＲ 別法として、Ｋ．Ｑ．Ｈｕら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８１：７２１−７２６（
１９９１）に記載されるように従来の２工程ＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。簡単
には、１Ｘ ＰＣＲＩＩバッファー（パーキン−エルマー）、５ｍＭ ＭｇＣｌ _２ 、１ｍＭ ｄＮＴＰ、ＲＮアシン ２０単位、２．５μＭ ランダムヘキサマ
ー、およびＭＭＬＶ ５０単位（モロニー・ネズミ白血病ウイルス）逆転写酵素
（ＲＴ）を含有する反応混合物２０μｌ中抽出したｍＲＮＡ（実施例３を参照の
こと）０．５μｇを逆転写した。ＭＪリサーチ・サイクラー・モデルＰＴＣ−２
００で４２℃、６０分間逆転写を実施し、続いて９５℃で５分間インキュベート
してＲＴを不活性化した。ｃＤＮＡ反応物２μｌを用いて、１０ｍＭ トリスＨ
Ｃｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭ ｄ
ＮＴＰ、０．５μＭ 各センスおよびアンチセンスプライマー、各々配列番号１
３および配列番号１４、並びにＴａｑポリメラーゼ ２．５単位を含有する最終
ＰＣＲ反応物５０μｌ容量中でＰＣＲを実施した。ＭＪリサーチモデルＰＴＣ−
２００で以下のとおり反応物をインキュベートした：増幅４０サイクル（９４℃
、２０秒間；５８℃、３０秒間；７２℃、３０秒間）；最終伸長（７２℃、１０
分間）；および４℃で浸漬。

【０２３４】 Ｃ．ＰＣＲ断片分析 ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩ蛍光インターカレーター（モレキュラー・プ
ローブズ、ユージーン、オレゴン州）を含むゲル電気泳動を用いてサイズ決定す
ることにより正確な生成物を確認し、ストーム・イメージングシステムを用いて
画像化した（図４）。図４は正常な乳房組織（レーン１ないし５）および乳癌組
織（レーン６ないし１０）の両方でＢＵ１０１特異的ＰＣＲ生成物の指標である
こと２０１を塩基でのＤＮＡバンドを示している。これはいずれの結腸組織（レ
ーン１２ないし１６）でも存在しない。５個の肺組織（レーン１７ないし２１）
のうち１個（レーン２０）でＢＵ１０１を示唆するバンドが観察された。

【０２３５】 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６
およびその断片または相補体からなる群から選択される配列を含んでなる生成物
の検出はＢＵ１０１ ｍＲＮＡの存在を示すものであり、乳房組織疾患または症
状、例えば乳癌の診断を示唆するものである。

【０２３６】 実施例９：ＯＨ−ＰＣＲ Ａ．プローブ選別および標識 オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションＰＣＲにより前記した標的配列を
検出するために、標的特異的プライマー（配列番号１５および配列番号１６）お
よびプローブ（配列番号１７）を設計した。国際公開番号ＷＯ９２／１０５０５
、１９９２年６月２５日公開、およびＷＯ９２／１１３８８、１９９２年７月９
日公開では各々５‘および３’末端でオリゴヌクレオチドを標識する方法を教示
している。標識ホスホラミダイト試薬を調製し、これを用いてオリゴヌクレオチ
ドの合成中にそこに標識を加える。［Ｎ．Ｔ．Ｔｈｕｏｎｇら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ
ｔｅｒｓ，２９（４６）：５９０５−５９０８（１９８８）；Ｊ．Ｓ．Ｃｏｈｅ
ｎら、公開米国特許出願０７／２４６６８８（ＮＴＩＳ受付番号ＰＡＴ−ＡＰＰ
Ｌ−７−２４６６８８）（１９８９）を参照のこと］。プローブを３‘末端で標
識し、ＰＣＲ中の沈殿および望ましくない伸長生成物の形成を防御した。１工程
ＯＨ−ＰＣＲではプローブは少なくとも１５℃でプライマーのＴＭ以下のＴＭを
有した。当業者に周知の標準的なホスホラミダイト化学および／または合成後標
識法を用いて検出標識を有するまたは有さない特異的結合メンバーとしてプライ
マーおよびプローブを利用した。

【０２３７】 Ｂ．１工程オリゴハイブリダイゼーションＰＣＲ ５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ_２、１ｍＭ ｄＧＴＰ、１ｍＭ ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＣＴＰ、１ｍＭ ｄＴ
ＴＰ、ＲＮアーゼ阻害因子 ０．５単位、２．５μＭ オリゴｄ（Ｔ）１６のバ
ッファー中ＭｕＬＶ逆転写酵素２．５単位を用いて４２℃で３０分間、続いて９
９℃で５分間、および４℃で５分間全ＲＮＡ（実施例３を参照のこと）からｃＤ
ＮＡを調製した。次いで５０ｍＭ Ｎ，Ｎ，−ビス［２−ヒロキシエチル］グリ
シン（ｐＨ８．１５）、８１．７ｍＭ ＫＯＡｃ、３３．３３ｍＭ ＫＯＨ、０
．０１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、０．１ｍＭ エチレンジアミンテトラ酢
酸、０．０２ｍｇ／ｍｌ ＮａＮ_３、８重量／容量％ グリセロール、１５０μ
Ｍ 各ｄＮＴＰ、０．２５μＭ 順行プライマー（配列番号１５）、０．５μＭ
逆行プライマー（配列番号１６）、１０．０ｎＭ プローブ（配列番号１７）
、ｒＴｔｈポリメラーゼ ５単位および１．６３ｍＭ Ｍｎ（Ｃｌ）_２、１９０
μｌを含有するＯＨ−ＰＣＲ反応物に調製したｃＤＮＡを加えた。ｒＴｔｈポリ
メラーゼ酵素はＭｎ（Ｃｌ）_２の存在下不安定であるので、Ｍｎ（Ｃｌ）_２は標
的を添加する直前に加えた。別法としてｃＤＮＡの代わりに標的として全ＲＮＡ
（実施例３）を用いることができる。パーキン−エルマー・サーマル・サイクラ
ー４８０中反応物をインキュベートした。ｃＤＮＡ合成および熱循環に最適な条
件は当業者に容易に決定できる。有用であると解っている条件にはＲＮＡで出発
した場合の、ｃＤＮＡ合成（６０℃、３０分間）、および４５増幅サイクル（９
４℃、４０秒間；６２℃、１００秒間）などがある。オリゴハイブリダイゼーシ
ョンの前にＳＹＢＲ（登録商標）グリーンで染色した２％ アガロースゲル上で
ＰＣＲ生成物を可視化した（図５）。増幅（９７℃、５分間；１２℃、５分間；
１２℃浸漬）の後、オリゴハイブリダイゼーションを実施した。正確な反応生成
物は少なくとも一つのＰＣＲ生成物の鎖および内的にハイブリダイズされたプロ
ーブを含有した。

【０２３８】 図５はＢＵ１０１ ＲＮＡ特異的ＰＣＲ増幅生成物のＳＹＢＲ（登録商標）グ
リーン染色アガロースゲルの走査である。この図はＭＤＡ３６１細胞系統ＲＮＡ
（レーン１）を有する２６８塩基対ＢＵ１０１特異的アンプリコンを示している
。ＭＤＡ３６１細胞系統（＃ＨＴＢ２７）は転移性ヒト乳房腺癌に由来する（Ａ
．Ｔ．Ｃ．Ｃ．、ロックビル、メリーランド州）。胎盤のＤＮＡ（レーン２）を
ＲＮＡ対照として用い、一方水（レーン３）を試薬対照として用いた。ヒト胎盤
ＤＮＡ対照は２６８塩基対のアンプリコンを示さず、これはレーン１で観察され
た２６８塩基対がＤＮＡではなくｍＲＮＡの増幅の結果であることを示唆してい
る。試薬対照はアンプリコンを全く生じず、ＯＨ−ＰＣＲ試薬自体が増幅された
のではないことを示した。

【０２３９】 Ｃ．ＯＨ−ＰＣＲ生成物分析 ＬＣｘ（登録商標）アナライザーシステム（アボット・ラボラトリーズ、アボ
ットパーク、イリノイ州から入手可能）で増幅反応生成物を検出した。簡単には
、ハイブリダイゼーションプローブの捕捉可能な部位で抗体標識微粒子により特
異的反応生成物を捕捉し、ＰＣＲ生成物に結合する検出可能な抗体の結合により
複合体を検出した。内部プローブとハイブリダイズするＰＣＲ鎖を含有する複合
体のみを検出できた。図６はＢＵ１０１アンプリコンがＭＤＡ３６１細胞系統の
ＲＮＡの２００フェムトグラムで容易に検出されたことを示している。正常なＰ
ＢＬのＲＮＡ抽出物を陰性対照として用い、１００ナノグラムでさえ検出されな
かった。

【０２４０】 ＬＣｘ（登録商標）システムを用いてＢＵ１０１活性に関して種々組織からの
ＲＮＡ１０ピコグラムを検定した。図７はＢＵ１０１マーカーの組織全体の分布
を示している。１１全ての正常な乳房および乳癌組織ＲＮＡ（カラム１ないし１
１）はＢＵ１０１ ＬＣｘ（登録商標）アッセイにおいて反応性であり、一方正
常な結腸および結腸癌組織並びに肺組織ＲＮＡ（カラム１２ないし１５）は非反
応性であった。この複合体の検出はＢＵ１０１ ｍＲＮＡの存在を示しており、
これは乳房疾患または症状例えば乳癌の診断を示唆している。多くのその他の検
出様式が存在し、当業者はこれを用いて、および／または修飾して増幅されたま
たは増幅されていないＢＵ１０１誘導核酸配列の存在を検出でき、例えばリガー
ゼ連鎖反応（ＬＣＲ、アボット・ラボラトリーズ、アボットパーク、イリノイ州
）；Ｑ−ベータレプリカーゼ（ジーン−トラック（商標）、ナッパービル、イリ
ノイ州）、分岐鎖反応（キロン、エメリービル、カリフォルニア州）および鎖置
換アッセイ（ベックトン・ディッキンソン、リサーチ・トライアングル・パーク
、ノースキャロライナ州）などがあるが、これらに限定するものではない。

【０２４１】 実施例１０：合成ペプチド生成 合成ペプチドをモデル化し、ＢＵ１０１ポリペプチドコンセンサス配列の予想
されるアミノ酸配列に基づいて製造した（実施例１を参照のこと）。とりわけ、
配列番号２０から誘導される多くのＢＵ１０１ペプチドが製造され、配列番号２
１ないし２９のペプチドなどがある。全てのペプチドをシンフォニー・ペプチド
・シンセサイザー（レイニン・インストラメント・カンパニー、エメリービル、
カリフォルニア州）、またはＦＭＯＣ化学、標準サイクルおよびイン・シトゥー
ＨＢＴＵ活性化を用いる類似の装置で合成した。切断および脱保護条件は以下の
とおりである：切断試薬（７７．５容量／容量％ トリフルオロ酢酸、１５容量
／容量％ エタンジチオール、２．５容量／容量％ 水、５容量／容量％ チオ
アニソール、１ないし２重量／容量％ フェノール）２．５ｍｌ容量を樹脂に加
え、室温で２ないし４時間攪拌した。次いで濾液を除去し、冷ジエチルエーテル
で切断試薬からペプチドを沈殿させた。各ペプチドを濾過し、水／アセトニトリ
ル／０．１％ ＴＦＡグラジエントを用いて逆相調製用ＨＰＬＣにより精製し、
凍結乾燥した。質量分析法により生成物を確認した。

【０２４２】 精製したペプチドを用いて動物を免疫した（実施例１４を参照のこと）。

【０２４３】 実施例１１ａ．プラスミド５７７を用いる細胞系統におけるタンパク質発現 Ａ．ＢＵ１０１発現プラスミドの構築 永久細胞系統で分泌される抗原を発現するために米国特許出願第０８／４７８
０７３号（１９９５年６月７日提出）（参照により本明細書に組み込まれる）に
記載のプラスミド５７７を構築した。このプラスミドは以下のＤＮＡセグメント
を含有する：（ａ）細菌性β−ラクタマーゼおよびＤＮＡ複製起点を含有するｐ
ＢＲ３２２の２．３キロ塩基対断片；（ｂ）ＨＳＶ−１チミジンキナーゼプロモ
ーターおよびポリＡ付加シグナルの調節下にあるネオマイシン抵抗性遺伝子の発
現を指向する１．８キロ塩基対のカセット；（ｃ）シミアンウイルス４０（ＳＶ
４０）プロモーターおよびポリＡ付加シグナルの調節下にあるジヒドロ葉酸レダ
クターゼ遺伝子の発現を指示する１．９キロ塩基対のカセット；（ｄ）シミアン
ウイルス４０Ｔ−Ａｇプロモーターおよび転写エンハンサー、ポリＡ付加シグナ
ルを提供する単純疱疹ウイルス１型（ＨＳＶ−１）ゲノムに続くＢ型肝炎ウイル
ス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）エンハンサーＩの調節下にある修飾Ｃ型肝炎ウイルス
（ＨＣＶ）Ｅ２タンパク質に融合したウサギ免疫グロブリン重鎖シグナル配列の
発現を指向する３．５キロ塩基対のカセット；および（ｅ）このプラスミドでは
機能を持たないＳＶ４０ゲノム後期領域の残りの０．７キロ塩基対の断片。ベク
ターの全てのセグメントは分生物学の当業者に周知の標準的な方法により組み立
てられた。

【０２４４】 以下のようにプラスミド５７７のＣ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質コーディン
グ配列を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配
列番号６およびその断片または相補体からなる群から選択されるＢＵ１０１ポリ
ヌクレオチド配列と置換して分泌可能なＢＵ１０１タンパク質を発現するための
プラスミドを構築する。プラスミド５７７をＸｂａＩで消化することによりＣ型
肝炎ウイルスＥ２遺伝子断片を放出する。得られたプラスミドバックボーンによ
り、発現したタンパク質を細胞の分泌経路に導くウサギ免疫グロブリン重鎖シグ
ナル配列の下流でＢＵ１０１ ｃＤＮＡインサートを挿入できるようになる。標
準的な方法を用いてＰＣＲによりＢＵ１０１ ｃＤＮＡ断片を生成する。センス
ＰＣＲプライマー配列でコードされるのはＸｂａＩ部位であり、アミノ酸配列Ｓ
ｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ（「ＳＮＥＬ」）をコードする１２個のヌクレオ
チド配列にすぐ続き、シグナルプロテアーゼプロセシング、効率的な分泌および
培養液中の最終生成物の安定性を促進する。この１２個のヌクレオチド配列にす
ぐ続いて、プライマーはＢＵ１０１遺伝子のアミノ酸をコードする鋳型配列に相
補的なヌクレオチドを含有する。アンチセンスプライマーは以下の８個のアミノ
酸をコードする配列を停止コドンの直前に組み込んでいる：Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号３０）。この配列内
でＢｕ１０１タンパク質生成物の分析および生成を助ける認識部位が組み込まれ
ている。すなわち抗フラッグＭ２（イーストマン・コダック・カンパニー、ニュ
ーヘブン、コネチカット州）と称する市販により入手可能なモノクローナル抗体
により認識される認識部位（「フラッグ」と称する）をその他の匹敵する配列お
よび対応する抗体と同様に利用できる。例えばパーキン−エルマー−セツスから
入手したジーンアンプ（登録商標）を供給者の指示書に指示されるように使用し
てＰＣＲを実施する。ＰＣＲプライマーは最終濃度０．５μＭで使用する。１０
０μｌ反応物中ＢＵ１０１プラスミド鋳型で３５サイクル（９４℃、３０秒間；
５５℃、３０秒間；７２℃、９０秒間）、続いて７２℃で１０分間伸長サイクル
でＰＣＲを実施する。

【０２４５】 Ｂ．ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞のトラ
ンスフェクション 前記したプラスミドをＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞［ＤＸＢ−１１１、Ｕｒｉａｃ
ｉｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４４５１−４
４６６（１９８０）］にトランスフェクトさせる。これらの細胞はＡ．Ｔ．Ｃ．
Ｃ．、１０８０１ユニバーシティー・ブールバード、マナサス、バージニア州か
ら受け入れ番号ＣＲＬ９０９６で入手可能である。Ｐ．Ｌ．Ｆｅｌｇｎｅｒら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３−７４１４（１
９８７）に記載されるカチオン性リポソーム媒介法を用いてトランスフェクショ
ンを実施する。とりわけ１０％ ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン（１ｍＭ）を補
充したハムＦ−１２培地でＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を培養し、フラスコあたり５
ないし８ｘ１０^５セルの密度でフラスコに新たに播種する。細胞をトランスフェ
クションに関して全面成長の６０から８０％まで成長させる。プラスミドＤＮＡ
２０μｇをオプティ−ＭＥＭ Ｉ培地１．５ｍｌに加え、リポフェクチン試薬（
ギブコ・ビー・アール・エル；グランドアイランド、ニューヨーク州）１００μ
ｌをオプティ−ＭＥＭ Ｉ培地の第２の１．５ｍｌ部分に加える。二つの溶液を
混合し、室温で２０分間インキュベートする。細胞から培養培地を除去した後、
オプティ−ＭＥＭＩ培地５ｍｌで３回細胞をすすぐ。次いでオプティ−ＭＥＭＩ
−リポフェクチン−プラスミドＤＮＡ溶液を細胞上に積層する。細胞を３７℃で
３時間インキュベートし、その後、選別前にさらに２４時間オプティ−ＭＥＭＩ
−リポフェクチン−ＤＮＡ溶液を培養培地と置換する。

【０２４６】 Ｃ．選別および増幅 トランスフェクションの１日後、細胞を１：３で継代培養し、ｄｈｆｒ／Ｇ４
１８選別培地（以後「Ｆ−１２マイナス培地Ｇ」）と共にインキュベートする。
選別培地はＬ−グルタミンを含有、ヒポキサンチン、チミジンおよびグリシン不
含ハムＦ−１２（ジェイ・アール・エッチ・バイオサイエンシズ、レネクサ、カ
ンサス州）、および３００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（ギブコ−ビー・アール・エル
；グランドアイランド、ニューヨーク州）である。表面面積に対する培地容量の
比率は２５ｃｍ^２あたり５ｍｌを維持する。およそ２週間後、ＤＨＦＲ／Ｇ１４
１８細胞を広げて継代培養させ、Ｆ−１２マイナス培地Ｇでさらに維持し続ける
。

【０２４７】 トランスフェクトされたＢＵ１０１ ｃＤＮＡ配列の各々を、メトトレキセー
トを用いてＤＨＦＲ^＋、Ｇ４１８^＋細胞を段階的に選別することにより増幅する
（Ｒ，Ｓｃｈｉｍｋｅ、Ｃｅｌｌ，３７：７０５−７１３（１９８４）に概説さ
れている）。１５０ｎＭ メトトレキセート（ＭＴＸ）（シグマ、セントルイス
、ミズーリー州）含有Ｆ−１２マイナス培地Ｇと共に細胞をおよそ２週間、抵抗
性コロニーが出現するまでインキュベートする。１５０ｎＭ 適合細胞を５μＭ ＭＴＸにより選別することによりさらに遺伝子を増幅する。

【０２４８】 Ｄ．抗原生成 ５μＭ ＭＹＸを補充したＦ−１２マイナス培地Ｇを５％ ＣＯ_２中３７℃で
１２ないし２４時間、ちょうど全面成長した単層の上に積層する。成長培地を除
去し、ダルベッコ・リン酸バッファーセイライン（ＰＢＳ）（カルシウムおよび
マグネシウム含有）（ギブコ−ビー・アール・エル；グランドアイランド、ニュ
ーヨーク州）で３回すすぎ、存在し得る残留培地／血清を除去する。次いで細胞
をＶＡＳカスタム培地（Ｌ−グルタミン含有、ＨＥＰＥＳ含有、フェノールレッ
ド不含のＶＡＳカスタム処方、ジェイ・アール・エッチ・バイオサイエンス；レ
ネクサ、カンサス州より入手可能、製品番号５２−０８６７８Ｐ）と共に５％
ＣＯ２中、３７℃で１時間インキュベートする。次いでＴフラスコあたり５ｍｌ
の生成物に関して細胞をＶＡＳで積層する。インキュベーションの７日後、培地
を取り出し、保持し、次いで回収物２、３および４と共に精製するまで凍結する
。単層をＶＡＳで、７日回収より３多く積層する。

【０２４９】 Ｅ．乳房組織遺伝子ＢＵ１０１抗原発現の分析 当該分野で周知の標準的な方法および試薬を用いるＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（ラエムリ非連続性ゲル）によるか、または
質量分析法により、ＢＵ１０１タンパク質構築物を発現する細胞のＶＡＳ上澄の
アリコートを分析する。

【０２５０】 Ｆ．精製 ハイブリダイズされた結合によりアガロースに共有結合している抗フラッグＭ
２モノクローナル抗体を含んでなるアフィニティーマトリックスを用いて、イム
ノアフィニティークロマトグラフィーによりフラッグ配列を含有するＢＵ１０１
タンパク質の精製を実施する（イーストマン・コダック・カンパニー、ニューヘ
ブン、コネティカット州）。アフィニティ精製の前に、ローラーボトルから回収
した、プールしたＶＡＳ培地中タンパク質をセファデックスＧ−２５（ファルマ
シア・バイオテック・インコーポレーティッド、ウプサラ、スウェーデン）カラ
ムを用いて５０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌバッ
ファーに交換する。このバッファー中のタンパク質を抗フラッグＭ２抗体アフィ
ニティーカラムに適用する。５０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌバッファーを用いてカラム洗浄することにより非結合性タンパク質
を溶出する。５０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中
過剰のフラッグペプチドを用いて結合性タンパク質を溶出する。ゲル電気泳動ま
たはＨＰＬＣにより精製されたＢＵ１０１タンパク質から過剰のフラッグペプチ
ドを除去できる。

【０２５１】 プラスミド５７７をこの実施例で利用するが、その他の適合する発現系例えば
ＣＭＶを試薬および／または技術を適当に修飾して本発明において利用できるこ
とは当業者に周知であり、通常の技術範囲内である。

【０２５２】 ＢＵ１０１遺伝子のコーディング領域を含有する最大のクローン化インサート
を次いで（ｉ）例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよび／ま
たはタンパク質発現および検出を補助する可融性タンパク質配列を含有できる真
核生物発現ベクター、または（ｉｉ）スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）
およびＣＭＰ−ＫＤＯシンセターゼ（ＣＫＳ）またはその他のタンパク質配列の
発現のためのタンパク質融合遺伝子を含有する細菌性発現ベクターのいずれかに
サブクローニングする。ＳＯＤの融合配列を含有するポリペプチドの生成に有用
な方法およびベクターはＥＰＯ ０１９６０５６（１９８６年１０月１日公開）
に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれ、ＣＫＳの融合配列
を含有するものはＥＰＯ公開番号０３３１９６１（１９８９年９月１３日公開）
に記載されており、これもまた参照により本明細書に組み込まれる。このように
精製したタンパク質を動物免疫研究、固相イムノアッセイ等（これらに限定する
ものではない）の種々の技術に用いることができる。

【０２５３】 実施例１１ｂ：ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓを用いる細胞系統における
タンパク質発現 Ａ．ＢＵ１０１発現プラスミドの構築 従来はたいていの哺乳動物の細胞系統により分泌抗原を発現するために、プラ
スミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ｃａｔ．＃Ｖ８５５−２０、インビ
トローゲン、カールスバッド、カリフォルニア州）を構築していた。発現された
タンパク質インサートをｍｙｃ−ｈｉｓペプチドタグに融合する。ｍｙｃ−ｈｉ
ｓタグ（配列番号３１）は抗ｍｙｃもしくは抗ｈｉｓアフィニティーカラム、ま
たはメタロプロテイン結合カラムのいずれかを用いて発現した融合タンパク質を
精製するのに有用なｃ−ｍｙｃオンコプロテインエピトープおよびポリヒスチジ
ン配列を含んでなる。

【０２５４】 クローン６０３１４８Ｈ１（配列番号２）からｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈ
ｉｓベクターへのＢＵ１０１ポリヌクレオチド配列を挿入して分泌可能なＢＵ１
０１タンパク質を発現するためのプラスミドを構築した。（このプラスミドをｐ
ｃ−６０３１４８Ｍ／Ｈと称する）。ｐｃ−６０３１４８Ｍ／Ｈの構築の前に、
以下のようにＢＵ１０１ ｃＤＮＡ配列を最初にｐＣＲ（登録商標）−ブラント
・ベクターにクローニングした：標準的な方法を用いるＰＣＲによりＢＵ１０１
ｃＤＮＡ断片を作った。ＰＣＲプライマーは最終濃度０．５μＭで用いた。ｐ
ｆｕポリメラーゼ ５単位（ストラッタジーン、ラジョーラ、カリフォルニア州
）を用いるＰＣＲを、５０μｌ反応物中ＢＵ１０１プラスミド鋳型（実施例２を
参照のこと）に関して３０サイクル（９４℃、１分間；６５℃、１．５分間；７
２℃、３分間）、続いて７２℃で８分間の伸長サイクルで実施した。センスＰＣ
Ｒプライマー配列、配列番号１８はＢＵ１０１遺伝子インサートのすぐ上流でｐ
ＳＰＯＲＴベクターに同一であるヌクレオチドを含んでなる。アンチセンスプラ
イマー、配列番号１９はたいてい３’のインフレーム停止コドンのちょうど上流
で５’ＮｏｔＩ制限配列およびＢＵ１０１ ｃＤＮＡインサートの３’末端に相
補的な配列を組み込んでいた。得られたブラント末端ＰＣＲ生成物５μｌを直線
化ｐＣＲ（登録商標）ブラントベクター（インビトローゲン、カールスバード、
カリフォルニア州）２５ｎｇにライゲートし、ベクターの致死ｃｃｄＢ遺伝子を
妨害した。ワンショット（商標）形質転換キット（インビトローゲン、カールス
バード、カリフォルニア州）を用いて、製造者の指示書に従い、得られたライゲ
ートされたベクターをＴＯＰ１０大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（インビトローゲン、
カールスバッド、カリフォルニア州）に形質転換した。形質転換した細胞をＬＢ
−Ｋａｎ（５０μｇ／ｍｌ カナマイシン）選別プレート上３７℃で成長させた
。形質転換後妨害されたｃｃｄＢ遺伝子を有するプラスミドを含有する細胞のみ
を成長させる（Ｇｒａｎｔ，Ｓ．Ｇ．Ｎ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，８７：４６４５−４６４９（１９９０））。形質転換されたコロ
ニーを採り、ＬＢ−Ｋａｎブロス３ｍｌ中３７℃で成長させる。ＱＩＡプレップ
（登録商標）（キアゲン・インコーポレーティッド、サンタクラリタ、カリフォ
ルニア州）法を用いて、製造者の指示に従い、プラスミドＤＮＡを単離した。Ｅ
ｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限酵素でＤＮＡを消化し、ＢＵ１０１インサート断片
を遊離した。断片を１％ シーケム（登録商標）ＬＥアガロース／０．５μｇ／
ｍｌ 臭化エチジウム／ＴＥゲルの電気泳動に供し、ＵＶ照射により可視化し、
切り取り、ＱＩＡクイック（商標）（キアゲン・インコーポレーティッド、サン
タクラリタ、カリフォルニア州）法を用いて製造者に指示されるように精製した
。

【０２５５】 ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−ＨｉｓプラスミドＤＮＡをプラスミドＤＮＡのポ
リリンカー領域においてＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化することにより直線化
した。哺乳動物細胞のタンパク質の発現を指示するＣＭＶプロモーターの下流で
、前記のＢＵ１０１精製ｃＤＮＡ断片を得られたプラスミドＤＮＡバックボーン
にライゲートした。ライゲートされたプラスミドを製造者に指示されるように、
ＤＨ５アルファ（商標）細胞（ギブコ・ビー・アール・エル、グランドアイラン
ド、ニューヨーク州）に形質転換した。簡単には、ＢＵ１０１インサートを含有
するｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ １０ｎｇをコンピテントＤＨ５アルフ
ァ細胞５０μｌに加え、内容物を穏やかに混合した。混合物を氷上で３０分間イ
ンキュベートし、３７℃で２０秒間熱ショックを与え、さらに２分間氷上に置い
た。ＬＢ培地０．９５ｍｌを添加したときに、混合物を２２５ｒｐｍで振盪しな
がら３７℃で１時間インキュベートした。次いで形質転換した細胞を１００ｍｍ
ＬＢ／Ａｍｐ（５０μｇ／ｍｌ アンピシリン）プレートに載せ、３７℃で成長
させた。コロニーを取り、ＬＢ／Ａｍｐブロス３ｍｌ中で成長させた。ＱＩＡプ
レップキットを用いてプラスミドＤＮＡを精製した。当該分野で周知の技術、例
えば制限消化およびゲル分析など（これらに限定するものではない）を用いてイ
ンサートの存在を確認する。（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前記で引用）。

【０２５６】 Ｂ．ヒト胎児腎細胞２９３細胞のトランスフェクション 前記のセクションＡで記載したＢＵ１０１発現プラスミドをＤＨ５アルファ細
胞に形質転換し、ＬＢ／アンピシリン寒天に載せ、前記するようにＬＢ／アンピ
シリンブロス１０ｍｌ中で成長させた。ＱＩＡフィルター（商標）マキシキット
（キアゲン、チャッツウォース、カリフォルニア州）を用いてプラスミドを精製
し、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした（Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．
Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．３６：５９−７２（１９７７））。これらの細胞はＡ．Ｔ．Ｃ
．Ｃ．、１０８０１ ユニバーシティー・ブールバード、マナサス、バージニア
州から、受け入れ番号ＣＲＬ１５７３で入手できる。Ｐ．Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌ
ｓｏｎら、Ｆｏｃｕｓ，１５：７３（１９９３）に記載されているカチオン性リ
ポフェクタミン媒介法を用いてトランスフェクションを実施した。１０％ ウシ
胎児血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）を補充したＤＭＥＭ培地１０ｍ
ｌ中ＨＥＫ２９３細胞を培養し、プレートあたり９ｘ１０^６セルの密度で１００
ｍｍ培養プレートに新たに播種した。３７℃でトランスフェクションに関して全
面成長の７０％から８０％まで細胞を成長させた。プラスミドＤＮＡ８μｇをオ
プティＭＥＭＩ（登録商標）培地（ギブコ−ビー・アール・エル、グランドアイ
ランド、ニューヨーク州）８００μｌに加え、リポフェクトアミン（商標）試薬
（ギブコ−ビー・アール・エル、グランドアイランド、ニューヨーク州）４８な
いし９６μｌをＤＭＥＭ血清不含培地の第２の８００μｌ部分に加えた。二つの
溶液を混合し、室温で１５ないし３０分間インキュベートした。細胞から培養培
地を除去した後、細胞を血清不含ＤＭＥＭ１０ｍｌで１回洗浄した。オプティＭ
ＥＭＩ−リポフェクトアミン−プラスミドＤＮＡ溶液を血清不含ＤＭＥＭ６．４
ｍｌで希釈し、次いで細胞の上に積層した。細胞を３７℃で５時間インキュベー
トし、その後さらに２０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ８ｍｌを加えた。１８ないし
２４時間後、古い培地を吸引し、５％ＦＢＳを含む新鮮ＤＭＥＭ５ｍｌで細胞を
積層した。トランスフェクションの７２時間後、ＢＵ１０１遺伝子活性に関して
上澄および細胞抽出物を分析した。

【０２５７】 Ｃ．乳房組織遺伝子ＢＵ１０１抗原発現の分析 前記の培養上澄をサイトチューブに移し、氷上で保存した。冷ダルベッコＰＢ
Ｓ１０ｍｌで２回洗浄してＨＥＫ２９３細胞を回収し、ＣＡＴ溶解バッファー（
ベーリンガー・マンハイム、インディアナポリス、インディアナ州）１．５ｍｌ
を添加して溶解し、続いて室温で３０分間インキュベートした。ライゼートを１
．７ｍｌポリプロピレンマイクロヒュッジチューブに移し、１０００ｘｇで１０
分間遠心する。上澄を新しいサイトチューブに移し、氷上で保存する。ＢＵ１０
１タンパク質構築物を発現する細胞の上澄および細胞のライゼートのアリコート
をＢＵ１０１組換えタンパク質の存在に関して分析する。当該分野で周知の標準
的な方法および試薬を用いてアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に流すことができる。（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前記
で引用）。次いでこれらのゲルを固体培地例えばニトロセルロース、ニトラン等
にブロットし、ＢＵ１０１タンパク質のバンドを抗ｍｙｃエピトープまたは抗ヒ
スチジンモノクローナル抗体（インビトローゲン、カールスバッド、カリフォル
ニア州）または抗ＢＵ１０１ポリクローナル血清を用いるウェスタンブロッティ
ング技術を用いて可視化できる（実施例１４を参照のこと）。別法として、発現
されたＢＵ１０１組換えタンパク質を質量分析法により分析できる（実施例１２
を参照のこと）。

【０２５８】 Ｄ．精製 ｍｙｃ−ｈｉｓ配列を含有するＢＵ１０１組換えタンパク質を、ポリヒスチジ
ン残基に特異的に結合するニッケル荷電アガロース樹脂を含有するエクスプレス
（登録商標）アフィニティークロマトグラフィーシステム（インビトローゲン、
カールスバッド、カリフォルニア州）を用いて精製する。前記のように調製した
１０ｘ１００ｍｍプレートの上澄をプールし、ニッケル荷電カラムを通す。５０
ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１５０ｍＭ ＮａＣｌバッファーでカラム
を洗浄することにより非結合性タンパク質を溶出し、ｍｙｃ−ｈｉｓ融合タンパ
ク質のみを残す。次いで過剰のイミダゾールもしくはヒスチジン、または低ｐＨ
バッファーのいずれかを用いて結合性ＢＵ１０１組換えタンパク質をカラムから
溶出する。別法として、ｍｙｃ−ｈｉｓ配列でヒドラジドまたはその他の結合に
よりアガロース樹脂に結合した抗ｍｙｃかまたは抗ヒスチジンモノクローナル抗
体からなるアフィニティーカラムに結合させ、各々過剰のｍｙｃペプチドまたは
ヒスチジンで溶出することにより組換えタンパク質を精製することもできる。

【０２５９】 次いで精製した組換えタンパク質を供給者の指示書に従って固相、例えばＮ−
ヒドロキシサクシンイミド活性化セファロースカラム（ファルマシア・バイオテ
ック、ピスカッタウェイ、ニュージャージー州）に共有結合的に架橋できる。次
いで共有結合したＢＵ１０１組換えタンパク質を含有するこれらのカラムを用い
て、ウサギまたはマウス血清から抗ＢＵ１０１抗体を精製できる（実施例１３お
よび１４を参照のこと）。

【０２６０】 Ｅ．ＢＵ１０１発現タンパク質でのマイクロタイタープレートのコーティング 前記するように、１００ｍｍプレートからの上澄をＰＢＳで１：３に希釈した
。次いで得られた混合物をリアクチ−バインド（商標）金属キレートマイクロタ
イタープレート（ピアース、ロックフォード、イリノイ州）の各ウェルに入れ、
室温でインキュベートし、続いて脱イオン水で４回洗浄した。次いで調製したマ
イクロタイタープレートを用いてＢＵ１０１抗体の存在に関してポリクローナル
抗血清をスクリーニングした（実施例１７を参照のこと）。

【０２６１】 未精製細胞上澄に加え、精製ＢＵ１０１（前記のように調製）をも用いてポリ
クローナル抗血清をスクリーニングした（実施例１７を参照のこと）。簡単には
、精製ＢＵ１０１を５０ｍＭ 炭酸塩バッファー、ｐＨ９．６で１：３に希釈し
、この溶液１００μｌを用いてマイクロタイタープレートをコーティングした（
実施例１７）。これらの実験ではポリクローナル抗血清を試験用に１：５００に
希釈した。

【０２６２】

【表２】

【０２６３】 実施例１２：乳房組織タンパク質の化学的分析 Ａ．ＭＳを用いるトリプシンペプチド断片の分析 乳房疾患、例えば乳癌の患者の血清、乳房疾患のない患者の血清、乳房疾患、
例えば乳癌の患者の乳房組織または細胞の抽出物、乳房疾患のない患者の乳房組
織または細胞の抽出物、およびその他の疾患のないまたは疾患のある患者の器官
の組織または細胞の抽出物を標準的な方法を用いてポリアクリルアミドゲルに流
し、クーマシーブルーで染色する。未知のポリペプチドを含有している疑いのあ
るゲルの部分を切除し、インゲル還元、アセトアミド化およびトリプシン消化に
供した。Ｐ．Ｊｅｎｏら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏ．２２４：４５１−４５５（１９９
５）およびＪ．Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏ．２０３：１７３−１
７９（１９９２）。ゲル切片を１００ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３およびアセトニトリ
ルで洗浄する。縮んだゲル片を消化バッファー（５０ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３、５
ｍＭ ＣａＣｌ２および１２．５μｇ／ｍｌトリプシン）中４℃で４５分間膨張
させる。上澄を吸引し、トリプシン不含の消化バッファー５ないし１０μｌと置
換し、３７℃で一晩インキュベートした。５％葉酸およびアセトニトリルで３回
変換してペプチドを抽出し、蒸発乾固する。ペプチドをポロスＲ２ソルベント（
ペルセプティブ・バイオシステムズ、フラミングハム、マサチューセッツ州）お
よそ０．１μｌに吸収させ、５％ 葉酸１０μｌに溶解することにより吸引ガス
クロマトグラフィーキャピラリーチューブのチップに捕捉し、それをキャピラリ
ーに通す。吸収したペプチドを水で洗浄し、６０％ メタノール中５％ 葉酸で
溶出する。ナノエレクトロスプレイ質量分析法により分析するために、溶出液を
ＡＰＩ ＩＩＩ質量分析器（パーキン−エルマー・サイエックス、ソーンヒル、
オンタリオ、カナダ）のスプレイキャピラリーに直接通す。Ｍ．Ｗｉｌｍら、Ｉ
ｎｔ．Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ，１３６：１
６７−１８０（１９９４）およびＭ．Ｗｉｌｍら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６６
：１−８（１９９４）。第１の４極子から得られた質量スペクトルからトリプシ
ンペプチドの質量を決定する。予測したペプチドに対応する質量をさらにＭＳ／
ＭＳモードで分析し、ペプチドのアミノ酸配列を得る。

【０２６４】 Ｂ．ＬＣ／ＭＳを用いるペプチド断片分析 過形成疾患組織で見出されるｍＲＮＡ配列から予測されるポリペプチドの存在
もまた液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用
いて確認できる。Ｄ．Ｈｅｓｓら、ＭＥＴＨＯＤＳ．Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ
ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６：２２７−２３８（１
９９４）。患者の血清標本または腫瘍抽出物をＳＤＳで変性し、ジチオスレイト
ール（１．５ｍｇ／ｍｌ）で９０℃、３０分間還元し、続いてヨードアセタミド
（４ｍｇ／ｍｌ）で２５℃、１５分間アルキル化する。アクリルアミド電気泳動
の後、ポリペプチドをカチオン性膜にエレクトロブロッティングし、クーマシー
ブルーで染色する。染色後、膜を洗浄し、未知ポリペプチドを含有すると考えら
れる部分を切除し、細片に切断する。膜を５００μｌマイクロ遠心管中に置き、
タンパク質溶解消化バッファー（０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０％ アセトニトリル
、２ｍＭ ＣａＣｌ_２および５μｇ／ｍｌ トリプシンを含有する１００ｍＭ
トリスＨＣｌ、ｐＨ８．２）（シグマ、セントルイス、ミズーリー州）１０ない
し２０μｌに浸す。３７℃で１５時間の後、飽和尿素３μｌおよび１００μｇ／
ｍｌトリプシン１μｌを加え、３７℃でさらに５時間インキュベートする。消化
混合物を１０％ トリフルオロ酢酸３μｌで酸性にし、遠心して膜から上澄を分
離する。上澄をマイクロボア逆相ＨＰＬＣカラムに直接注入し、０．０５％ ト
リフルオロ酢酸中アセトニトリルの直線グラジエントで溶出する。溶出液をエレ
クトロスプレイ質量分析器に直接供給し、分流器に通した後必要であれば物質の
容量を調整する。実施例１２、セクションＡに示した方法に従ってデータを分析
する。

【０２６５】 実施例１３：遺伝子免疫プロトコル Ａ．インビボ抗原発現 遺伝子免疫では適当な発現ベクターを接種した後、インビボ抗原を直接発現す
ることによりタンパク質精製工程を回避する。また、この方法による抗原生成で
は、タンパク質を哺乳動物組織において生成するので、正確なタンパク質のフォ
ールディングおよびグリコシル化が可能である。この方法では遺伝子配列のＣＭ
Ｖプロモーターを含有するプラスミドへの挿入、プラスミドの伸長および精製、
並びにプラスミドＤＮＡの動物筋肉組織への注射を行う。好ましい動物にはマウ
スおよびウサギなどがある。例えばＨ．Ｄａｖｉｓら、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２：１８４７−１８５１（１９９３）を参照のこ
と。１回または２回ブースター免疫の後、次いで動物を出血させ、腹水を収集す
ることができるか、またはハイブリドーマ生成のために動物の脾臓を回収できる
。

【０２６６】 Ｂ．プラスミド調製および精製 実施例１１に記載される方法に従って、適切な５’制限部位を含有する適当な
ＰＣＲプライマーを用いて、ＢＵ１０１ ｃＤＮＡ含有ベクターからＢＵ１０１
ｃＤＮＡ配列を作る。適当な制限酵素でＰＣＲ生成物を切断し、ＣＭＶプロモ
ーターを含有するベクター（例えば、インビトローゲン、サンディエゴ、カリフ
ォルニア州のｐＲｃ／ＣＭＶまたはｐｃＤＮＡ３ベクター）に挿入する。次いで
このプラスミドを適当な細菌性株で伸長し、ＣｓＣｌグラジエントまたはキアゲ
ンプラスミドＤＮＡ精製カラムを用いて細胞ライゼートから精製する。これらの
技術は全て分子生物学の分野の通常の技術者に周知である。

【０２６７】 Ｃ．免疫プロトコル 麻酔した動物をＰＢＳで希釈した精製プラスミドまたはその他のＤＮＡ取り込
みエンハンサー（カルディオトキシン、２５％ スクロース）０．１ないし１０
０μｇで免疫する。例えばＨ．Ｄａｖｉｓら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ
ａｐｙ，４：７３３−７４０（１９９３）；およびＰ．Ｗ．Ｗｏｌｆｆら、Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１１：４７４−４８５（１９９１）を参照のこと。ブ
ースター注射を月間隔で１ないし２回行う。

【０２６８】 Ｄ．抗血清の試験および使用 動物を出血させ、既知遺伝子配列（実施例１６を参照のこと）から合成したペ
プチドを用いて当該分野で周知の技術例えばウェスタンブロッティングまたはＥ
ＩＡ技術により、抗体に関して得られた血清を試験する。次いでこの方法により
生成した抗血清を用いて、実施例１５ないし１８に記載の技術のごときＥＬＩＳ
Ａまたはウェスタンブロッティング技術により患者組織もしくは細胞抽出物中ま
たは患者血清中の抗原の存在を検出できる。

【０２６９】 実施例１４：ＢＵ１０１に対する抗体の生成 Ａ．ポリクローナル抗血清の生成 ＢＵ１０１コンセンサスヌクレオチド配列（配列番号６）の予測アミノ酸配列
から誘導されたペプチドでウサギに注射することによりＢＵ１０１に対する抗血
清を調製した。ペプチド配列番号２１ないし２９の合成については実施例１０に
記載されている。免疫原として用いたペプチドは本明細書において後記するよう
に調製した担体タンパク質例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）
に結合していたか、または結合していなかった（すなわちＫＬＨのごとき担体に
結合していない）。

【０２７０】 １．ペプチド結合 ペプチドをマレイミド活性化キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、イ
ムジェクト（登録商標）として市販により入手可能、ピヤース・ケミカル・カン
パニー、ロックフォード、イリノイ州から入手可能）に結合させた。イムジェク
ト（登録商標）はヘモシアニンのモルあたり約２５０モルの反応性マレイミド基
を含有する。活性化ＫＬＨを約７．７ｍｇ／ｍｌの濃度でリン酸塩緩衝セイライ
ン（ＰＢＳ、ｐＨ８．４）に溶解した。ペプチドはペプチド配列に生じたシステ
インを介してか、または点結合を提供するために合成されたペプチドに予め加え
られたシステインに結合した。ペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、シ
グマ・ケミカル・カンパニー、セントルイス、ミズーリー州）に溶解し、ＫＬＨ
に結合した反応性マレイミドのモルあたりペプチド約１．５モルのモル比で活性
化ＫＬＨと反応させた。ペプチド配列番号２１ないし２７および配列番号２９の
結合方法は本明細書において後記する。かかる方法の量、時間および条件を変化
させてペプチド結合を最適化できることは当業者に周知である。

【０２７１】 本明細書において後記する結合反応は、約０．７７マイクロモルの反応性マレ
イミド基を含有するＫＬＨペプチド結合体（「結合ペプチド」）３ｍｇを得るこ
とに基づいている。このペプチド結合体の品質は通常、ウサギにおいてポリクロ
ーナル抗血清を生成するための１回の初回注射および４回のブースター注射に十
分であった。簡単にはペプチド（配列番号２１ないし２７および配列番号２９）
をＤＭＳＯ１００μｌあたり１．１６マイクロモルの濃度でＤＭＳＯに溶解した
。ＤＭＳＯ溶液１００μｌを前記のように調製した活性化ＫＬＨ溶液３８０μｌ
に加え、ＰＢＳ（ｐＨ８．４）２０μｌを加えて５００μｌの容量にした。反応
物を攪拌しながら室温で一晩インキュベートした。反応混合物中の未反応チオー
ルの量を測定することにより反応の程度を決定した。チオールの出発濃度と最終
濃度の差を活性化ＫＬＨに結合したペプチド濃度と仮定した。エルマン試薬（５
，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、ピヤース・ケミカル・カンパニー
、ロックフォード、イリノイ州）を用いて残存するチオールの量を測定する。シ
ステインＨＣｌ（ピヤース・ケミカル・カンパニー、ロックフォード、イリノイ
州）３５ｍｇをＰＢＳ（ｐＨ７．２）１０ｍｌに溶解し、保存溶液を望ましい濃
度に希釈することにより、０、０．１、０．５、２、５および２０ｍＭの濃度の
システイン標準を作った。イムロン２（登録商標）マイクロウェルプレート（ダ
イネックス・テクノロジーズ、チャンティリー、バージニア州）の各ウェルにＰ
ＢＳ（ｐＨ８．４）２００μｌを入れることにより、光度測定法でチオール濃度
を決定した。次に標準または反応混合物１０μｌを各ウェルに加えた。最後にＰ
ＢＳ（ｐＨ８．４）中１ｍｇ／ｍｌの濃度のエルマン試薬２０μｌを各ウェルに
加えた。ウェルを室温で１０分間インキュベートし、マイクロプレート・リーダ
ー（例えばバイオラッド・モデル３５５０、バイオラッド、リッチモンド、カリ
フォルニア州）を用いて赤色４１５ｎｍで全ウェルの吸光度を測定した。標準の
吸光度を用いて標準曲線を構築し、標準曲線から反応混合物のチオール濃度を決
定した。遊離チオールの濃度の減少により連続的な結合反応が示された。室温で
６時間ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に対して透析することにより未反応ペプチドを除去
した。すぐに使用する場合は結合体を２ないし８℃で保存し、そうでない場合は
−２０℃以下で保存した。

【０２７２】 ２．動物免疫 体重２ｋｇまたはそれ以上の雌白色ニュージーランドウサギを用いてポリクロ
ーナル抗血清を上昇させた。１匹の動物を結合（配列番号２１ないし２７および
配列番号２９）ペプチドまたは結合していない（配列番号２６ないし２９）ペプ
チドにより免疫した。第１回の免疫の１週間前に動物から血液５ないし１０ｍｌ
を採り、非免疫出血前サンプルとして供した。

【０２７３】 結合ペプチド（配列番号２１ないし２７および配列番号２９）および非結合ペ
プチド（配列番号２６ないし２９）を用いて、完全フロイントアジュバント（Ｃ
ＦＡ）（ディフコ、デトロイト、ミシガン州）０．５ｍｌを含有するＰＢＳ（ｐ
Ｈ７．２）中２ｍｇ／ｍｌの濃度でペプチド０．５ｍｌを乳化することにより１
次免疫原を調製した。皮下、腹腔内および筋肉内の投与経路により動物のいくつ
かの部位に免疫原を注射した。１次免疫の４週間後、ブースター免疫を行った。
ブースター免疫用量に用いる免疫原を、今度はペプチドを不完全フロイントアジ
ュバント（ＩＦＡ）（ディフコ、デトロイト、ミシガン州）０．５ｍｌで１ｍｇ
／ｍｌに希釈した以外は１次免疫原に用いたのと同一の結合または結合していな
いペプチド０．５ｍｌを乳化することにより調製した。再度、ブースター用量を
皮下、腹腔内および筋肉内型の注射によりいくつかの部位に投与した。ブースタ
ー免疫の２週間後、動物を出血させ（５ｍｌ）、各血清を以下に記載するように
ペプチドに対する免疫反応性に関して試験した。ブースターおよび出血スケジュ
ールを４週間隔で十分な力価が得られるまで繰り返した。以下の実施例１７に記
載するように、マイクロタイターＥＩＡにおいて非結合ペプチドを用いることに
より抗血清の力価または濃度を決定した。１：５００またはそれ以上の抗体力価
はさらに使用および研究するのに十分な力価であると考えられた。加えて、いく
つかのペプチド抗血清に関して見かけの親和性［Ｋｄ（ａｐｐ）］（以下の実施
例１７に記載）をも決定した（表３）。

【０２７４】

【表３】

【０２７５】 Ｂ．モノクローナル抗体の生成 １．免疫プロトコル マウス（６ないし８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃ）を担体例えばＫＬＨに結合してい
る（前記のように調製）かまたは結合していない（すなわちＫＬＨのごとき担体
に結合していない）のいずれかのペプチドを用いて免疫したが、マウスにおいて
モノクローナル抗体生成するための非結合、または結合ペプチドの量はウサギに
おいてポリクローナル抗血清を生成するために用いた量のおよそ１０分の１であ
った。このように、１次免疫原はＣＦＡ乳剤０．１ｍｌ中非結合または結合ペプ
チド１００μｇからなり、一方ブースター免疫で用いる免疫原はＩＦＡ０．１ｍ
ｌ中非結合または結合ペプチド２５μｇからなる。標準的な技術を用いてモノク
ローナル抗体を作るためのハイブリドーマを調製およびスクリーニングした。モ
ノクローナル抗体を発達させるために用いられる方法はＫｏｈｌｅｒおよびＭｉ
ｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９４（１９７５）に詳記される方法の
ごとき当該分野で周知の方法に従い、Ｊ．Ｇ．Ｒ．Ｈｕｒｒｅｌ編、Ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、シー・アール・シー・プレス・インコ
ーポレーティッド、ボッカラートン、フロリダ州（１９８２）に概説されている
。ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ法に基づくモノクローナル抗体を発達さ
せるための別の方法はＬ．Ｔ．Ｍｉｍｍｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７６：６０
４−６１９（１９９０）の方法であり、これは参照により本明細書に組み込まれ
る。

【０２７６】 免疫レジュメ（マウスによる）は１次免疫にさらにブースター免疫を加えたも
のからなる。１次免疫に用いられる１次免疫原は予めＣＦＡ５０μｌで乳化した
ＰＢＳ（ｐＨ７．２）５０μｌ中非結合または結合ペプチド１００μｇからなる
。ブースター免疫は１次免疫後およそ４週に実施され、ＩＦＡ５０μｌで乳化し
たＰＢＳ（ｐＨ７．２）５０μｌ中非結合または結合ペプチド２５μｇからなる
。この免疫原全１００μｌを各マウスに腹腔内接種した。３回めの免疫のおよそ
４週後に実施例１７に記載されるようにマイクロタイタープレート酵素イムノア
ッセイ（ＥＩＡ）により免疫応答に関して個々のマウスをスクリーニングした（
表４）。

【０２７７】

【表４】

【０２７８】 ３回めの免疫のおよそ１５週後、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中非結合または結合ペ
プチド２５μｇでマウスを静脈内接種した。この静脈内ブースター投与の３日後
、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法を用いて脾細胞を、Ｓｐ２／０−Ａｇ１
４ミエローマ細胞（ミルステイン・ラボラトリーズ英国）と融合した。１０％
ウシ胎児血清（ＦＣＳ）Ｓｐ２／０−Ａｇ１４ミエローマ細胞（ミルステイン・
ラボラトリーズ＋１％ ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡ
Ｔ）を含有するダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中融合体を培養した。
実施例１７のプロトコルに従ってマイクロタイタープレートＥＩＡによりバルク
培養物をスクリーニングした。免疫原として用いたペプチドと反応するクローン
およびその他のペプチド（すなわち免疫原として用いなかったＢＵ１０１ペプチ
ド）と反応しないクローンを最終的な伸長のために選別した。このように選別し
たクローンを伸長し、等分し、１０％ ＦＣＳおよび１０％ ジメチルスルフォ
キシドを含有するＤＭＥＭ中凍結した。

【０２７９】 ２．モノクローナル抗体を含有する腹水の生成 前記のように調製した凍結ハイブリドーマを解凍し、伸長培地に置いた。生存
ハイブリドーマ細胞をプリスタン処理したマウスの腹腔内に接種した。マウスか
ら腹水を除去し、プールし、０．２μフィルターを通して濾過し、免疫グロブリ
ンＧクラス（ＩｇＧ）分析に供し、精製に必要なプロテインＡカラムの容量を決
定した。

【０２８０】 ３．腹水からのモノクローナル抗体の精製 簡単には、濾過し、解凍した腹水をプロテインＡセファロース結合バッファー
（１．５Ｍ グリシン、３．０Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．９）の等容量と混合し、
０．２μフィルターを通して再度濾過した。腹水に存在するＩｇＧの量によりプ
ロテインＡカラムの容量を決定する。次いで溶出液をＰＢＳ（ｐＨ７．２）に対
して２ないし８℃で一晩透析する。透析したモノクローナル抗体を除菌し、アリ
コートに分配する。このように調製した精製された抗ＢＵ１０１モノクローナル
を２ないし８℃で短期保存かまたは−８０℃で長期保存する。モノクローナル抗
体のさらなる特性化。前記のように生成したモノクローナル抗体のアイソタイプ
およびサブタイプを実施例１７に記載のＥＩＡマイクロタイタープレートアッセ
イを用いて決定した。簡単には、マイクロタイタープレートをペプチドでコーテ
ィングし、ハイブリドーマ細胞培養上澄と反応させる。アルカリ性ホスファター
ゼヤギ抗マウスアイソタイプ試薬（抗ＩｇＧ１、抗ＩｇＧ２ａ、抗ＩｇＧ２ｂ、
および抗ＩｇＧ３）（サザン・バイオテック、バーミンガム、アラバマ州）を用
いて結合抗体を特異的に検出した。アイソタイプの決定に加えて、モノクローナ
ル抗体をペプチドマッピングしてさらに特性化した。再度、実施例１７に記載さ
れるＥＩＡマイクロタイタープレートアッセイを用いてマイクロタイタープレー
トを各々の合成ペプチド（配列番号２１ないし２９）でコーティングし、モノク
ローナル抗体の結合を決定した。アイソタイプ化およびペプチド特異性の結果を
表５にまとめる。

【０２８１】

【表５】

【０２８２】 モノクローナル抗体のアリコートを２ないし８℃で連続保存し、所定の期間中
の光学密度（ＯＤ）の値評価することにより、モノクローナル抗体において安定
性試験を実施することもできる。

【０２８３】 Ｃ．免疫原としての組換えタンパク質の使用 本明細書に記載するように作った組換えタンパク質を免疫原として用いて、当
業者に周知の試薬および技術に相応の変化を加えてポリクローナルおよびモノク
ローナル抗体を生成するのは本発明の範囲内である。

【０２８４】 実施例１５：ＢＵ１０１ペプチドに特異的に結合する血清抗体の精製 実施例１３および／または１４で前記するように得られた免疫血清を実施例１
０に記載されるように調製された固定合成ペプチド、または実施例１１に記載さ
れるように調製された組換えタンパク質を用いてアフィニティー精製する。抗血
清のＩｇＧ分画は希釈した粗製抗血清をプロテインＡカラム（アフィ−ゲル・プ
ロテインＡ、バイオラッド、ヘルクレス、カリフォルニア州）に通すことにより
得られる。バッファー（結合バッファー、製造者により供給）で溶出することに
より、免疫グロブリンでない全てのタンパク質が実質的に除去される。０．１Ｍ
緩衝グリシン（ｐＨ３）で溶出することにより、実質的にアルブミンおよびそ
の他の血清タンパク質を含まない免疫グロブリン調製物が得られる。

【０２８５】 免疫アフィニティークロマトグラフィーを実施して特異的抗原結合抗体のより
高度な分画を有する調製物が得られる。抗血清を上昇させるために用いられるペ
プチドをクロマトグラフィー樹脂に固定し、そのエピトープを指向する特異的抗
体を樹脂に吸着する。非結合性構成成分を洗い流した後、０．１Ｍ グリシンバ
ッファー、ｐＨ２．３で特異的抗体を溶出する。抗体分画を即座に１．０Ｍ ト
リスバッファー（ｐＨ８．０）で中和し、免疫反応性を維持する。クロマトグラ
フィー樹脂の選択はペプチドに存在する反応基に依存する。ペプチドがアミノ基
を有する場合、アフィ−ゲル１０またはアフィ−ゲル１５（バイオ−ラッド、ヘ
ルクレス、カリフォルニア州）のごとき樹脂を用いる。カルボキシ基を介してペ
プチドに結合するのが望ましい場合、アフィ−ゲル１０２を用いることができる
（バイオ−ラッド、ヘルクレス、カリフォルニア州）。ペプチドが遊離のスルフ
ヒドリル基を有する場合、有機水銀樹脂例えばアフィ−ゲル５０１を用いること
ができる（バイオ−ラッド、ヘルクレス、カリフォルニア州）。

【０２８６】 別法として、脾臓を回収し、ハイブリドーマ生成に用いて本明細書に前記する
ように当該分野で周知の常法に従ってモノクローナル抗体を生成できる。

【０２８７】 実施例１６：組織サンプルのウェスタンブロッティング ０．１Ｍ トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５重量／容量％ グリセロール、
０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１．０ｍＭ １，４−ジチオスレイトール、１０μｇ／
ｍｌ ロイペプチンおよび１．０ｍＭ フッ化フェニルメチルスルフォニル中組
織サンプルをホモジナイズすることによりタンパク質抽出物を調製した（Ｋａｉ
ｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７：９８２（１９９４））。ホモジナイ
ズした後、ホモジネートを４℃で５分間遠心し、破片から上澄を分離した。タン
パク質を定量するために上澄３ないし１０μｌをビシンコニン酸試薬（シグマ、
セントルイス、ミズーリー州）１．５ｍｌに加え、５６２ｎｍで得られる吸光度
を測定した。

【０２８８】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、トリシンバッファー（ノベックス、サンディエゴ
、カリフォルニア州）でサンプルを望ましいタンパク質濃度に調整し、等容量の
２Ｘトリシンサンプルバッファー（ノベックス、サンディエゴ、カリフォルニア
州）と混合し、サーマル・サイクラーで１００℃、５分間加熱した。次いでサン
プルを電気泳動用のノベックス１０−２０％プレキャスト／トリシン・ゲルに供
した。電気泳動の後、ノベックス・トリス−グリシン・トランスファーバッファ
ー中サンプルをゲルからニトロセルロース膜に移した。次いでウェスタン・ライ
ツ・プラスまたはウェスタン・ライツ（トロピックス、ベッドフォード、マサチ
ューセッツ州）化学発光検出キットで提供される試薬および方法を用いて特異的
抗ペプチド抗体で膜をプロービングした。展開した膜をハイパーフィルムＥＣＬ
（アマーシャム、アーリントンハイツ、イリノイ州）に暴露することにより化学
発光バンドを可視化した。

【０２８９】 フィルム上でバンドを可視化した後、発色性基質５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドールホスフェート（ＢＣＩＰ）を添加し、展開することによりバンドを
膜上で直接可視化することもできた。この発色性溶液は１００ｍＭ ＮａＣｌ、
５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１００ｍＭ トリスＨＣｌ、ｐＨ９．５を含有する溶
液中０．０１６％ ＢＣＩＰを含有する。バンドが望ましい強度に展開されるま
で（１ないし２日間）、フィルターを溶液中室温でインキュベートした。ライト
ボックスで徹照し、アルファ・イメージャー２０００（アルファ・イノテック・
コーポレーション、サンレアンドロ、カリフォルニア州）で画像を記録すること
により画像を捕捉した。予め染色した分子量標準（ノベックス、サンディエゴ、
カリフォルニア州）およびビオチン化分子量標準（トロピックス、ベッドフォー
ド、マサチューセッツ州）の可動性に基づいて分子量を決定した。

【０２９０】 図８はＢＵ１０１合成ペプチド、配列番号２８（実施例１４を参照のこと）に
対する抗血清を用いて組織タンパク質抽出物のパネルで実施したウェスタンブロ
ッティングの結果を示している。図８の各レーンは異なる組織タンパク質抽出物
を示している：１、胃；２、ブランク；３、心臓；４、胎盤；５、脾臓；６、脳
；７、腎臓；８、乳癌；９、肺；１０、肝臓；１１、卵巣；１２、マーカー分子
量（キロダルトン）。６．５キロダルトン近くのバンド（矢印）は、タンパク質
サイズマーカー（レーン１２）により決定されるように、乳房組織抽出物（レー
ン８）においてのみ検出され、その他のいずれの組織抽出物においても検出され
なかった。その他のウェスタンブロッティングでは（データは示していない）、
また９個の乳癌組織タンパク質抽出物のうち５個で、および６個の正常乳房組織
タンパク質抽出物のうち１個で６．５キロダルトンのバンドが観察された。

【０２９１】 １次抗体（抗ペプチドポリクローナル抗血清）はニトロセルロースフィルター
に暴露する前にペプチド免疫原の濃度を変化させて、室温で３０分間プレインキ
ュベートする以外は前記と類似の方法で競合実験を実施した。前記のようにウェ
スタンの展開を続ける。乳房サンプルでは６．５キロダルトンのバンドに結合す
る抗体はＢＵ１０１ペプチド配列番号２３１００ｎＭの濃度で阻害された。

【０２９２】 実施例１７：ＥＩＡマイクロタイタープレートアッセイ 実施例１４に記載されるように好ましくはウサギおよびマウスから得た抗血清
の免疫反応性を以下のようにマイクロタイターＥＩＡにより決定した。簡単には
実施例１０に記載されるように調製した合成ペプチド、配列番号２１ないし２９
を炭酸塩バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ９．６）に溶解し、最終濃度２μｇ／ｍｌ
にした。次にペプチドまたはタンパク質溶液１００μｌをイムロン２（登録商標
）マイクロタイタープレート（ダイネックス・テクノロジーズ、チャンティリー
、バージニア州）の各ウェルに入れた。プレートを室温で一晩インキュベートし
、次いで脱イオン水で４回洗浄した。適当なタンパク質遮断剤、例えばスーパー
ブロック（登録商標）（ピヤース・ケミカル・カンパニー、ロックフォード、イ
リノイ州）１２５μｌを各ウェルに添加することによりウェルを遮断し、次いで
溶液を即座に捨てた。この遮断方法を３回実施した。前記のように調製した免疫
したウサギおよびマウスから得られた抗血清を０．０５％ トゥィーン−２０（
登録商標）（モノラウレート・ポリオキシエチレンエーテル）（シグマ・ケミカ
ル・カンパニー、セントルイス、ミズーリー州）および０．０５％ アジドナト
リウムを含有するＰＢＳ中タンパク質遮断剤（例えば３％ スーパーブロック（
登録商標）溶液）に１：１００、１：５００、１：２５００、１：１２５００お
よび１：６２５００の希釈で希釈し、コーティングしたマイクロタイタープレー
トの各ウェルに入れた。次いでウェルを室温で３時間インキュベートした。各ウ
ェルを脱イオン水で４回洗浄した。アルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギ
ＩｇＧまたはヤギ抗マウスＩｇＧ抗血清（サザン・バイオテック、バーミンガム
、アラバマ州）１００μｌを０．０５％ トゥィーン２０（登録商標）および０
．０５％ アジドナトリウムを含有するリン酸塩緩衝セイライン中３％ スーパ
ーブロック（登録商標）溶液で１：２０００に希釈し、各ウェルに加えた。ウェ
ルを室温で２時間インキュベートした。次に各ウェルを脱イオン水で４回洗浄し
た。次いでパラニトロフェニルホスフェート基質（キルケガード・アンド・ペリ
ー・ラボラトリーズ、ガイザースブルグ、メリーランド州）１００μｌを各ウェ
ルに加えた。ウェルを室温で３０分間インキュベートした。各ウェルで４０５ｎ
ｍの吸光度は赤色であった。試験ウェルでは４０５ｎｍにおける吸光度が非免疫
血清（陰性対照）により得られる吸光度以上に上昇することにより陽性反応を同
定した。陽性反応は検出可能な抗ＢＵ１０１抗体が存在していることを示した。
抗ペプチド抗血清の力価は前記した抗血清の希釈から算出し、Ａ４０５ｎｍ＝０
．５ＯＤである算出希釈として定義した。

【０２９３】 力価に加え、見かけの親和性［Ｋｄ（ａｐｐ）］をもいくつかの抗ペプチド抗
血清に関して決定した。ＥＩＡマイクロタイタープレートアッセイの結果を用い
てミカエリス・メンテンの等式に類似の等式に基づいて見かけの解離定数（Ｋｄ
）を誘導した（Ｖ．Ｖａｎ Ｈｅｙｎｉｎｇｅｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：４７２（１９８６）およびさらにＸ．Ｑｉｕら、Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５６：３３５０（１９９６）に
記載）：

【０２９４】

【数１】 式中、［Ａｇ−Ａｂ］は抗原−抗体複合体濃度、［Ａｇ−Ａｂ］_ｍａｘは最大複
合体濃度、［Ａｂ］は抗体濃度、およびＫ_ｄは解離定数である。曲線が適合する
間は［Ａｇ−Ａｂ］は所定のＡｂ濃度におけるＯＤ４０５ｎｍの値からバックグ
ランドを減じたもので置き換えた。Ｋｄおよび［Ａｇ−Ａｂ］_ｍａｘに対応する
［ＯＤ４０５ｎｍ］_ｍａｘを適合パラメーターとして処理した。ソフトウェアプ
ログラムオリジン（商標）（マイクロカル・ソフトウェア・インコーポレーティ
ッド、ノーザンプトン、メリーランド州）を曲線適合に用いた。

【０２９５】 実施例１８：固相粒子のコーティング Ａ．ＢＵ１０１抗原に特異的に結合する抗体での微粒子のコーティング ＢＵ１０１タンパク質（実施例１５を参照のこと）に特異的に結合するアフィ
ニティ精製した抗体で、半径が０．１ないし２０μｍの範囲であるポリスチレン
、カルボキシル化ポリスチレン、ポリメチルアクリレートの微粒子または類似の
粒子をコーティングする。微粒子を受動的または能動的のいずれかでコーティン
グできる。あるコーティング法は、以下に示すように、ＥＤＡＣ（塩酸１−（３
−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド）（アルドリッヒ・ケ
ミカル・カンパニー、ミルウォーキー、ウィスコンシン州）活性化カルボキシル
化ラテックス微粒子をＢＵ１０１タンパク質に特異的に結合する抗体でコーティ
ングすることからなる。簡単には、適当な容器中で樹脂洗浄カルボキシル化ラテ
ックス微粒子（バングズ・ラボラトリーズ、カーメル、インディアナ州またはセ
ロディン、インディアナポリス、インディアナ州）の最終０．３７５％ 固体懸
濁液を５０ｍＭ ＭＥＳバッファー、ｐＨ４．０および１５０ｍｇ／ｌのアフィ
ニティー精製した抗ＢＵ１０１抗体（実施例１４を参照のこと）を含有する溶液
中１５分間混合する。ＥＤＡＣカップリング剤を最終濃度５．５μｇ／ｍｌで混
合物に加え、室温で２．５時間混合する。

【０２９６】 次いで０．２μｍ マイクロゴン濾過モジュールを用いる接線流濾過（ｔａｎ
ｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により８容量のトゥィーン
２０（登録商標）／リン酸ナトリウム洗浄バッファー（ｐＨ７．２）で微粒子を
洗浄した。洗浄した微粒子を通常希釈した表面活性剤および遮断剤として無関係
のタンパク質を含有する適当なバッファー中必要時まで保存する。

【０２９７】 Ｂ．１／４インチビーズのコーティング またＢＵ１０１抗原に特異的に結合する抗体を当該分野で周知の常法に従って
１／４インチポリスチレンビーズの表面にコーティングし（Ｓｎｉｔｍａｎら、
米国特許第５２７３８８２号、参照により本明細書に組み込まれる）、競合結合
またはＥＩＡサドウィッチアッセイにおいて使用することもできる。

【０２９８】 最初にポリスチレンビーズを１０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３バッファー（ｐＨ８．０
）中約１５秒間超音波処理することにより清浄する。次いで全ての微細物質が除
去されるまでビーズを脱イオン水で洗浄する。次いで１０ｍＭ 炭酸塩バッファ
ー（ｐＨ８ないし９．５）の抗体溶液中にビーズを浸す。抗体溶液は高親和性モ
ノクローナル抗体の場合の１μｇ／ｍｌほどの希釈に、またはアフィニティー精
製しなかったポリクローナル抗体では約５００μｇ／ｍｌほどの濃度にできる。
ビーズを室温で少なくとも１２時間コーティングし、次いで脱イオン水で洗浄す
る。ビーズを空気乾燥するか、またはぬれた状態（ＰＢＳ中、ｐＨ７．４）で保
存してもよい。またこれらをタンパク質安定剤（例えばスクロース）または非特
異的結合遮断剤として用いられるタンパク質遮断剤（例えば無関係のタンパク質
、カルナチオン・スキムミルク、スーパーブロック（登録商標）等）で保護コー
ティングしてもよい。

【０２９９】 実施例１９：微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ） 標準抗原競合ＥＩＡまたは抗体サンドウィッチＥＩＡを実施し、固相例えば微
粒子を利用することにより（ＭＥＩＡ）、患者の試験サンプル中のＢＵ１０１抗
原を検出する。アッセイは自動分析器例えばＩＭｘ（登録商標）アナライザー（
アボット・ラボラトリーズ、アボットパーク、イリノイ州）で実施できる。

【０３００】 Ａ．抗体サンドウィッチＥＩＡ 簡単には、ＢＵ１０１抗原を含有することが疑われるサンプルを抗ＢＵ１０１
抗体コーティング微粒子（実施例１７に記載のように調製）の存在下インキュベ
ートして抗原／抗体複合体を形成させる。次いで微粒子を洗浄し、シグナル発生
化合物（すなわちアルカリ性ホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ
のごとき酵素）に結合した抗体を含んでなる指示試薬を抗原／抗体複合体または
微粒子に加え、インキュベートする。微粒子を洗浄し、シグナル発生化合物と反
応して測定可能なシグナルを生じる基質（例えば各々、４−メチルアンベリフェ
リルホスフェート（ＭＤＰ）、またはＯＰＤ／パーオキサイド）を添加すること
により結合抗体／抗原／抗体複合体を検出する。陰性対照で生じたシグナルと比
較して、試験サンプル中のシグナル上昇によりＢＵ１０１抗原の存在が検出され
る。試験サンプル中のＢＵ１０１抗原の存在は乳房疾患または症状例えば乳癌の
診断の指標である。

【０３０１】 Ｂ．競合結合アッセイ 競合結合アッセイでは、標識ペプチドが抗ペプチド抗体コーティング微粒子と
接触した場合に、測定可能なシグナルを発生するペプチドまたはタンパク質を使
用する。このアッセイをＩＭｘ（登録商標）アナライザー（アボット・ラボラト
リーズ、アボットパーク、イリノイ州より入手可能）で実施できる。ＢＵ１０１
抗原を含有することが疑われる試験サンプルの存在下、標識ペプチドをＢＵ１０
１抗体コーティング微粒子（実施例１７に記載されるように調製）に加え、標識
ＢＵ１０１ペプチド（または標識タンパク質）／結合抗体複合体および／または
患者のＢＵ１０１抗原／結合抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件下
でインキュベートする。試験サンプル中のＢＵ１０１抗原は標識ＢＵ１０１ペプ
チド（またはＢＵ１０１タンパク質）と、微粒子上の結合部位に関して競合する
。アッセイにおいて、試験サンプル中の抗原およびＢＵ１０１ペプチドまたはＢ
Ｕ１０１タンパク質は抗体結合部位に関して競合するので、試験サンプル中のＢ
Ｕ１０１抗原は標識ペプチドおよび抗体コーティング微粒子の結合を低下させる
。低下したシグナル（対照と比較して）試験サンプル中のＢＵ１０１抗原の存在
を示している。ＢＵ１０１抗原の存在は乳房疾患または症状、例えば乳癌の診断
を示唆している。

【０３０２】 前記で提供され、論じられたＢＵ１０１ポリヌクレオチドおよびそれによりコ
ードされるタンパク質は乳房組織疾患、とりわけ乳癌のマーカーとして有用であ
る。試験は試験サンプル例えば血液、血漿または血清におけるこのマーカーの出
現に基づき、低コスト、非侵害的に医師が癌の診断をし、治療プロトコルを選択
するか、または選択した治療の有効性をモニター観察する助けとなる診断情報を
提供できる。このマーカーは容易に入手できる体液例えば血液、尿または便中に
疾患組織に由来する抗原として出現し、免疫学的方法により検出できる。このマ
ーカーは疾病状態で上昇し、疾病状態で変化するか、または不適切な身体部分に
おいて出現する乳房の正常タンパク質である。

【０３０３】 実施例２０：ＢＵ１０１タンパク質の免疫組織化学的検出 前記の実施例１４で記載された配列番号２３に対する抗血清を用いて、標準的
な方法により種々の正常および疾患組織を免疫組織化学的に染色した。簡単には
、組織の凍結塊を６ミクロンの切片に切断し、顕微鏡スライドに載せた。冷アセ
トンで固定した後、切片を室温で乾燥し、次いでリン酸塩緩衝セイラインで洗浄
し、遮断した。スライドを１：１００希釈した配列番号２３に対する抗体と共に
インキュベートし、洗浄し、ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体と共にインキュベート
し、再度洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したアビジンと共にインキ
ュベートした。最後の洗浄の後、スライドを赤色の色素を提供する３−アミノ−
９−エチルカルバゾール基質と共にインキュベートした。スライドをヘマトキシ
リンで対比染色し、マウントして、病理学者が顕微鏡により試験した。

【０３０４】 良性および悪性の上皮細胞を含む全ての乳房標本の上皮細胞においてドット様
から広汎性のパターンで中程度から強度の免疫反応性が観察された。実際には全
ての細胞が染色された。間質細胞では免疫反応性はほとんどまたは全く認められ
なかった。散在する好中球および組織球もまた陽性であった。陰性対照では適当
な結果が得られた。結腸の上皮細胞では中程度から強度の免疫反応性であった。
間質細胞では低から中程度の免疫反応性をも示した。単球は、結腸の固有筋層お
よび脈管中膜などのたいていの器官で中程度の免疫反応性を示した。マクロファ
ージは通常中程度の免疫反応性であった。

【０３０５】 試験した全ての組織の結果を表６にまとめる。縦軸の「＃陽性／全数」表示は
標本の全数のうちの陽性標本の数を意味する。縦軸の「％」表示は試験した全組
織に対して平均化した陽性細胞のパーセントを意味する。

【０３０６】

【表６】

【図面の簡単な説明】

【図１】 クローン２０８３５７８Ｈ１（配列番号１）、６０３１４８Ｈ１（配列番号２
）、６０４２９０Ｈ１（配列番号３）のヌクレオチド整列化、クローン２０８３
５７８Ｈ１及び６０３１４８Ｈ１の完全長配列［それぞれ、２０８３５７８ｉｎ
ｈ（配列番号４）及び６０３１４８ｉｎｈ（配列番号５）と称される］、及びそ
れらから誘導されるコンセンサス配列（配列番号６）を示す。

【図２】 オーバーラップクローン２０８３５７８Ｈ１（配列番号１）、６０３１４８Ｈ
Ｉ（配列番号２）、６０４２９０Ｈ１（配列番号３）、２０８３５７８ｉｎｈ（
配列番号４）、６０３１４８ｉｎｈ（配列番号５）のヌクレオチド整列化からの
コンセンサスヌクレオチド配列（配列番号６）の形成を表わすコンティグ地図を
示す。

【図３Ａ】 図３Ａは、乳房組織と非乳房組織抽出物からのＲＮＡのエチジウムブロマイド
染色アガロースゲルのスキャンを示す。

【図３Ｂ】 図３Ｂは、ＢＵ１０１放射性同位元素標識プローブとのハイブリダイゼーショ
ン後の対応するＲＮＡのノーザンブロットである。

【図４】 正常乳房、乳癌、結腸及び肺組織のＲＮＡをテンプレートとして使用した、Ｂ
Ｕ１０１ ＲＮＡ特異的ＲＴ−ＰＣＲ増幅産物のＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅ
ｎ染色アガロースゲルのスキャンである。

【図５】 ＢＵ１０１ ＲＮＡ特異的ＲＴ−ＰＣＲ増幅産物のＳＹＢＲ（登録商標） Ｇ
ｒｅｅｎ染色アガロースゲルのスキャンである。この図は、胎盤ＤＮＡをＲＮＡ
対照とし、水を試薬対照として使用した、ＭＤＡ ３６１細胞系のＲＮＡによる
２６８塩基対のＢＵ１０１特異的アンプリコンを示す。

【図６】 図６は、ＢＵ１０１アンプリコンが、ＬＣｘ（登録商標） Ａｎａｌｙｚｅｒ
系（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ
より入手可能）を用いて、ＭＤＡ ３６１細胞系からの２００フェムトグラム（
ｆｇ）のＲＮＡで容易に検出されたことを示す。

【図７】 ＬＣｘ（登録商標）系を用いてＢＵ１０１活性に関して検定した正常乳房、乳
癌、正常結腸、結腸癌、正常肺及び肺癌組織からの１０ピコグラム（ｐｇ）のＲ
ＮＡの結果を示す。

【図８】 ＢＵ１０１合成ペプチド（配列番号２８）に対する抗血清でプローブした一連
の組織タンパク抽出物に関して実施したウエスタンブロットの結果を示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 35/00 ４Ｃ０８４ Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｃ０８５ Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 ４Ｃ０８６ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｎ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/574 Ｚ 33/58 Ａ 33/574 37/00 １０２ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 37/00 １０２ 5/00 Ａ (72)発明者 コーエン，モーリス アメリカ合衆国、イリノイ・60035、ハイ ランド・パーク、デイアフイールド・ロー ド・2026 (72)発明者 コルピツツ，トレイシー・エル アメリカ合衆国、イリノイ・60073、ラウ ンド・レイク、ノース・サークル・ドライ ブ・34365 (72)発明者 フリードマン，ポーラ・エヌ アメリカ合衆国、イリノイ・60015、デイ アフイールド、カムノー・コート・462 (72)発明者 ゴードン，ジユリアン アメリカ合衆国、イリノイ・60044、レイ ク・ブラフ、イースト・シエリダン・ロー ド・307 (72)発明者 グラナドス，エドワード・エヌ アメリカ合衆国、イリノイ・60061、バー ノン・ヒルズ、モンゴメリー・レイン・19 (72)発明者 ホツジス，ステイーブン・シー アメリカ合衆国、イリノイ・60089、バツ フアロー・グローブ、ストーンゲイト・ロ ード・169 (72)発明者 クラス，マイケル・アール アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバ テイビル、マルベリイ・ドライブ・1606 (72)発明者 クラトクビル，ジヨン・デイー アメリカ合衆国、ミズーリ・63088、ワイ ルドウツド、カントリートツプ・コート・ 1706 (72)発明者 ロバーツ−ラツプ，ライザ アメリカ合衆国、イリノイ・60031、ガー ニー、ウエストフイールド・ドライブ・ 2090 (72)発明者 ラツセル，ジヨン・シー アメリカ合衆国、ウイスコンシン・53158、 プレザント・プレイリイ、シツクステイフ オース・コート・8275 (72)発明者 シエツフエル，クリステイ・ピー アメリカ合衆国、イリノイ・60060、マン デライン、バンバリー・ロード・925 (72)発明者 ストロープ，ステイーブン・デイー アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバ テイビル、ウイルシヤー・ドライブ・945 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 BA14 CA25 CA26 CB03 CB04 CB07 DA12 DA13 DA14 DA36 FA16 FB02 FB03 FB07 JA04 4B024 AA12 BA80 CA03 DA02 DA03 EA04 GA11 HA12 HA15 4B063 QA19 QQ43 QR08 QR36 QR42 QR56 QS25 QS34 QX01 4B064 AG01 AG26 AG27 CA10 CA19 CA20 CC24 DA13 DA14 4B065 AA91X AA93X AB01 BA02 CA46 4C084 AA13 AA17 MA01 NA14 ZB262 4C085 AA13 AA14 CC32 EE01 GG01 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB26 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 CA40 DA75 DA76 EA50 EA51 FA72 FA74

Claims (51)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試験サンプル中の標的ＢＵ１０１ポリヌクレオチドの存在を
   検出する方法であって： （ａ）試験サンプルを少なくとも一つのＢＵ１０１特異的ポリヌクレオチドま
   たはその相補体と接触させること、ここで該ＢＵ１０１特異的ポリヌクレオチド
   は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６
   およびその断片または相補体からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少な
   くとも５０％の同一性を有する；および （ｂ）試験サンプルから該ＢＵ１０１特異的ポリヌクレオチドと結合する標的
   ＢＵ１０１ポリヌクレオチドの存在を検出すること； を含む方法。
2. 【請求項２】 工程（ａ）を実施する前に該標的ＢＵ１０１ポリヌクレオチ
   ドが固相に結合される請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 工程（ａ）を実施する前に該ＢＵ１０１特異的ポリヌクレオ
   チドが固相に結合される請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 試験サンプル中のＢＵ１０１ ｍＲＮＡを検出する方法であ
   って： （ａ）少なくとも一つのプライマーを用いて該サンプルで逆転写を実施し、ｃ
   ＤＮＡを生成すること； （ｂ）ＢＵ１０１オリゴヌクレオチドをセンスおよびアンチセンスプライマー
   として用いて工程（ａ）から得られたｃＤＮＡを増幅し、ＢＵ１０１アンプリコ
   ンを得ること；および （ｃ）該ＢＵ１０１アンプリコンの存在を検出すること、ここで工程（ａ）お
   よび（ｂ）で用いたＢＵ１０１オリゴヌクレオチドは配列番号１、配列番号２、
   配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６およびその断片または相補体
   からなる群から選択される配列と少なくとも５０％の同一性を有する； を含む方法。
5. 【請求項５】 工程（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の一つを実施する前に該試
   験サンプルを固相と反応させる請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 該検出工程が測定可能なシグナルを発生することができる検
   出可能な標識を利用することからなる請求項４に記載の方法。
7. 【請求項７】 標的ＢＵ１０１ポリヌクレオチドを含有することが疑われる
   試験サンプル中の該標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって： （ａ）試験サンプルをセンスプライマーとして少なくとも一つのＢＵ１０１オ
   リゴヌクレオチドとまたはアンチセンスプライマーとして少なくとも一つのＢＵ
   １０１オリゴヌクレオチドと接触させ、増幅して第１段階の反応生成物を得るこ
   と； （ｂ）該第１段階の反応生成物を少なくとも一つの別のＢＵ１０１オリゴヌク
   レオチドと接触させて第２段階の反応生成物を得ること、但し、別のＢＵ１０１
   オリゴヌクレオチドは工程（ａ）で用いたＢＵ１０１オリゴヌクレオチドの３‘
   に位置し、該第１段階反応生成物に相補的であることを条件とし；および （ｃ）該第２段階反応生成物を標的ＢＵ１０１ポリヌクレオチドの存在の指標
   として検出すること、ここで工程（ａ）および（ｂ）で用いたＢＵ１０１オリゴ
   ヌクレオチドは配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５
   、配列番号６およびその断片または相補体からなる群から選択される配列と少な
   くとも５０％の同一性を有する； を含む方法。
8. 【請求項８】 工程（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の一つを実施する前に該試
   験サンプルを固相と反応させる請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 該検出工程が測定可能なシグナルを発生することができる検
   出可能な標識を利用することを含む請求項７に記載の方法。
10. 【請求項１０】 該検出可能な標識が固相と反応する請求項９に記載の方法
    。
11. 【請求項１１】 試験サンプル中のＢＵ１０１ポリヌクレオチドを検出する
    のに有用な試験キットであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番
    号４、配列番号５、配列番号６およびその断片または相補体からなる群から選択
    される配列と少なくとも５０％の同一性を有する少なくとも一つのＢＵ１０１ポ
    リヌクレオチドを含有する容器を含む該試験キット。
12. 【請求項１２】 ＢＵ１０１核酸分子から誘導される精製されたポリヌクレ
    オチドであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号
    ５、配列番号６およびその断片または相補体からなる群から選択される配列と少
    なくとも５０％の同一性を有するポリヌクレオチド。
13. 【請求項１３】 該ポリヌクレオチドがＢＵ１０１核酸配列に特異的にハイ
    ブリダイズする請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
14. 【請求項１４】 該ポリヌクレオチドが約２０ないし約５０個のヌクレオチ
    ドの全長を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
15. 【請求項１５】 該ポリヌクレオチドが約１０ないし約２５個のヌクレオチ
    ドの全長を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
16. 【請求項１６】 該ポリヌクレオチドが組換え技術により生成された請求項
    １２に記載のポリヌクレオチド。
17. 【請求項１７】 該ポリヌクレオチドが合成技術により生成された請求項１
    ２に記載のポリヌクレオチド。
18. 【請求項１８】 該ポリヌクレオチドが少なくとも一つのＢＵ１０１エピト
    ープをコードする配列を含んでなる請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
19. 【請求項１９】 該ポリヌクレオチドが固相に結合している請求項１２に記
    載のポリヌクレオチド。
20. 【請求項２０】 該固相がそこに結合したポリヌクレオチド分子のアレイを
    含んでなる請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
21. 【請求項２１】 ＢＵ１０１ポリヌクレオチドに由来するオープン・リーデ
    ィング・フレームを含む核酸配列を含んでなる組換え発現系であって、ここで該
    オープン・リーディング・フレームは望ましい宿主に適合する調節配列に機能的
    に連結されており、該核酸配列は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番
    号４、配列番号５、配列番号６およびその断片または相補体からなる群から選択
    される配列と少なくとも５０％の同一性を有する組換え発現系。
22. 【請求項２２】 請求項２１に記載の組換え発現系でトランスフェクトされ
    た細胞。
23. 【請求項２３】 配列番号２０ないし２９およびその断片からなる群から選
    択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するＢＵ１０１ポリペプ
    チド。
24. 【請求項２４】 該ポリペプチドが組換え技術により製造される請求項２３
    に記載のポリペプチド。
25. 【請求項２５】 該ポリペプチドが合成技術により製造される請求項２３に
    記載のポリペプチド。
26. 【請求項２６】 配列番号２０ないし２９およびその断片からなる群から選
    択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列に由来
    するＢＵ１０１エピトープの少なくとも一つに結合する特異的結合分子。
27. 【請求項２７】 特異的結合分子が抗体分子である請求項２６に記載の特異
    的結合分子。
28. 【請求項２８】 試験サンプル中のＢＵ１０１抗原または抗ＢＵ１０１抗体
    の存在を検出するための試験キットであって、配列番号２０ないし２９およびそ
    の断片からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有
    するＢＵ１０１ポリペプチドを含有する容器を含む該試験キット。
29. 【請求項２９】 該ＢＵ１０１ポリペプチドが固相に結合している請求項２
    ８に記載のキット。
30. 【請求項３０】 試験サンプル中のＢＵ１０１抗原の存在を検出するための
    キットであって、少なくとも一つのＢＵ１０１エピトープを有するＢＵ１０１抗
    原に結合する特異的結合分子を含有する容器を含むキット。
31. 【請求項３１】 該特異的結合分子が固相に結合している請求項３０に記載
    のキット。
32. 【請求項３２】 少なくとも一つのＢＵ１０１エピトープを含んでなるポリ
    ペプチドを製造する方法であって、配列番号２０ないし２９およびその断片から
    なる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ
    酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含有する
    発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞をインキュベートすることを含
    む該方法。
33. 【請求項３３】 該ＢＵ１０１抗原を含有することが疑われる試験サンプル
    中のＢＵ１０１抗原を検出する方法であって： （ａ）試験サンプルを配列番号２０ないし２９およびその断片からなる群から
    選択されるＢＵ１０１抗原の少なくとも一つのエピトープに結合する特異的結合
    分子と接触させること、該接触は結合分子／抗原複合体を形成するのに十分な時
    間および条件下で実施する；および （ｂ）該ＢＵ１０１抗原の存在の指標である該複合体存在を検出すること； を含む方法。
34. 【請求項３４】 該特異的結合分子が抗体分子またはその断片である請求項
    ３３に記載の方法。
35. 【請求項３５】 該特異的結合分子が固相に結合している請求項３３に記載
    の方法。
36. 【請求項３６】 かかる抗体を含有することが疑われる試験サンプル中のＢ
    Ｕ１０１抗原に特異的な抗体の存在を検出する方法であって： （ａ）試験サンプルを配列番号２０ないし２９およびその断片からなる群から
    選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列に由
    来する少なくとも一つのＢＵ１０１エピトープを含有するＢＵ１０１ポリペプチ
    ドと接触させること、該接触は抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間およ
    び条件下で実施する；および （ｂ）該ＢＵ１０１抗原に特異的な抗体の存在の指標として該複合体の存在を
    検出すること； を含む方法。
37. 【請求項３７】 該ＢＵ１０１ポリペプチドが固相に結合している請求項３
    ６に記載の方法。
38. 【請求項３８】 少なくとも一つのＢＵ１０１エピトープをコードする核酸
    配列であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５
    、配列番号６およびその断片または相補体からなる群から選択される核酸配列で
    トランスフェクトされた細胞。
39. 【請求項３９】 免疫応答を引き起こすのに十分な量の単離された免疫原性
    ポリペプチドまたはその断片を個体に投与することを含むＢＵ１０１抗原に特異
    的に結合する抗体を製造する方法であって、ここで該免疫原性ポリペプチドは少
    なくとも一つのＢＵ１０１エピトープを含んでなり、配列番号２０ないし２９お
    よびその断片からなる群から選択される配列と少なくとも５０％の同一性を有す
    る方法。
40. 【請求項４０】 配列番号２０ないし２９およびその断片からなる群から選
    択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに由来する少なくとも一つのＢＵ１
    ０１エピトープをコードする配列を含んでなるプラスミドを個体に投与すること
    を含むＢＵ１０１抗原に特異的に結合する抗体を製造する方法。
41. 【請求項４１】 ランセット、吸収ペーパー、布、綿棒およびカップからな
    る群から選択される、該サンプルを収集するのに有用な手段を有する容器をさら
    に含んでなる請求項１１に記載の試験キット。
42. 【請求項４２】 ランセット、吸収ペーパー、布、綿棒およびカップからな
    る群から選択される、該サンプルを収集するのに有用な手段を有する容器をさら
    に含んでなる請求項２８に記載の試験キット。
43. 【請求項４３】 ランセット、吸収ペーパー、布、綿棒およびカップからな
    る群から選択される、該サンプルを収集するのに有用な手段を有する容器をさら
    に含んでなる請求項３０に記載の試験キット。
44. 【請求項４４】 該特異的結合分子が抗体またはその断片である請求項３０
    に記載の試験キット。
45. 【請求項４５】 該ポリヌクレオチドが配列番号２０に少なくとも５０％の
    同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるＢＵ１０１タンパク質をコードする請
    求項１２に記載のポリヌクレオチド。
46. 【請求項４６】 該ポリヌクレオチドが配列番号４、配列番号５または配列
    番号６と少なくとも５０％の同一性を有するＤＮＡを含んでなる請求項１２に記
    載のポリヌクレオチド。
47. 【請求項４７】 試験サンプル中該標的ＢＵ１０１ポリヌクレオチドの存在
    が乳房疾患の指標である請求項１に記載の方法。
48. 【請求項４８】 該アンプリコンが乳房疾患の指標である請求項４に記載の
    方法。
49. 【請求項４９】 該第２段階の反応生成物が乳房疾患の指標である請求項７
    に記載の方法。
50. 【請求項５０】 該複合体の検出が乳房疾患の指標である請求項３３に記載
    の方法。
51. 【請求項５１】 該複合体の検出が乳房疾患の指標である請求項３６に記載
    の方法。