JP2005523903A - アミロイド斑の生体内撮像用のベンゾチアゾール誘導体 - Google Patents

Abstract

【課題】 アルツハイマー病を撮像するための新規な薬剤を提供する。
【解決手段】 本発明は、アミロイド関連疾患、特にアルツハイマー病の生体内診断又は撮像用の放射性医薬品の製造のための、下記式（Ｉ）の化合物又はその塩の使用を提供する。
【化１】

式中、Ｒ^１は^１２５Ｉ、^１２４Ｉ、^１２３Ｉ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ又は^１８Ｆであり、Ｒ^２はＣ_１−６アルキルであり、Ｒ^３は水素、Ｃ_１−６アルキル、−Ｃ(Ｏ)Ｃ_１−６アルキル、−Ｃ(Ｏ)Ｃ_１−６ハロアルキル及び−Ｃ(Ｏ)ＣＨ(Ｒ^４)ＮＨ_２（式中、Ｒ^４は水素、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６ヒドロキシアルキル及びＣ_１−６アミノアルキルから選択される。）から選択される。

Description

本発明は、アルツハイマー病の診断撮像の分野に関し、かかる診断撮像に有用な化合物を提供する。

アルツハイマー病は、西洋では、心臓病、癌及び脳卒中に続いて４番目に多い死因である。米国では、約４百万人がアルツハイマー病に罹患しており、年間医療費は１千億ドルにのぼる。したがって、米国での１人当たりの医療費は年間２５０００ドルである。現在、世界には２千万人の痴呆症患者がいる。２０２５年には６５歳の人口が現在の３億９千万人から８億人に倍増するので、患者数は２０２５年までに４千万人に倍増することになる。これら４千万人のうち、約５６％がアルツハイマー病に罹患し、その数は２２２０万人にのぼると予想される。

現在使用されている生体内撮像技術では、すべての場合にアルツハイマー病を他の形態の痴呆症から識別して診断を下すことができるわけではない。利用できる治療法は増えると予想されるので、患者の識別診断はますます重要になるであろう。予防的処置を可能にするとともに、病気の進行を監視するため、病気の初期段階でアルツハイマー患者の撮像を行うための造影剤も必要となるであろう。

現在のところ、アルツハイマー病に関する唯一の決定的な試験は、剖検時に脳を検査して特有の生理学的病変の有無を調べることである。これらの生理学的病変のうちで最も広く認められているものの１つは、脳組織中に老人斑が存在することである。老人斑は、β−アミロイドタンパク質と呼ばれるアミノ酸残基数４０〜４３のタンパク質の沈着物である。これらはこの病気の初期における不変の態様であり、β−アミロイドの沈着は臨床的症状の発生に先立つある時期に起こると考えられている。

アルツハイマー病の可能な造影剤として、アミロイド特異的放射性トレーサーが提唱されている。コンゴーレッドはβ−アミロイドの効果的な結合剤であることが証明されているが、血液脳関門（ＢＢＢ）をうまく通過しない（Ｋｌｕｎｋ他，１９９４，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇ， Ｖｏｌ．１５， ｐｐ．６９１−６９８）。アルツハイマー病ではＢＢＢの異常が確かに存在するという説得力のある機能的証拠はない（Ｋａｌａｒｉａ， １９９２， Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｒａｉｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｒｅｖｉｅｗｓ， Ｖｏｌ．４， ｐ．２２６）。したがって、アルツハイマー病用造影剤の重要な性質は、それがＢＢＢを通過することである。

国際公開公報第０１／１４３５４号には、広範な部類の置換２−アリールベンゾアゾール化合物及びそれらの抗癌剤としての使用が記載されている。
国際公開公報第０１／１４３５４号 Ｋｌｕｎｋ他，１９９４，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇ， Ｖｏｌ．１５， ｐｐ．６９１−６９８ Ｋａｌａｒｉａ， １９９２， Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｒａｉｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｒｅｖｉｅｗｓ， Ｖｏｌ．４， ｐ．２２６

本発明の目的は、アルツハイマー病を撮像するための新規な薬剤を提供することである。アルツハイマー病をうまく撮像できるようにするには、薬剤はＢＢＢを通過するとともにβ−アミロイドに結合することができるものでなければならない。

第一の態様では、本発明は、アミロイド関連疾患、特にアルツハイマー病の生体内診断又は撮像用の放射性医薬品の製造のための、下記式（Ｉ）の化合物又はその塩の使用を提供する。

式中、
Ｒ¹は¹²⁵Ｉ、¹²⁴Ｉ、¹²³Ｉ、⁷⁵Ｂｒ、⁷⁶Ｂｒ又は¹⁸Ｆであり、
Ｒ²はＣ_1-6アルキルであり、
Ｒ³は水素、Ｃ_1-6アルキル、−Ｃ(Ｏ)Ｃ_1-6アルキル、−Ｃ(Ｏ)Ｃ_1-6ハロアルキル及び−Ｃ(Ｏ)ＣＨ(Ｒ⁴)ＮＨ₂（式中、Ｒ⁴は水素、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_1-6ヒドロキシアルキル及びＣ_1-6アミノアルキルから選択される。）から選択される。

特定の態様では、本発明は、アミロイド関連疾患、特にアルツハイマー病の生体内診断又は撮像用の放射性医薬品の製造のための、下記式（Ｉ）の化合物又はその塩の使用を提供する。

式中、
Ｒ¹は¹²⁵Ｉ、¹²⁴Ｉ、¹²³Ｉ、⁷⁵Ｂｒ、⁷⁶Ｂｒ又は¹⁸Ｆであり、
Ｒ²はＣ_1-6アルキルであり、
Ｒ³は水素、Ｃ_1-6アルキル、−Ｃ(Ｏ)Ｃ_1-6アルキル及び−Ｃ(Ｏ)Ｃ_1-6ハロアルキルから選択される。

別の態様では、被検者（好ましくはヒト）におけるアミロイド関連疾患の生体内診断又は撮像のための方法であって、式（Ｉ）の化合物又はその塩の投与を含んでなる方法が提供される。この方法は、アルツハイマー病の生体内診断又は撮像に特に好ましい。

「アミロイド関連」疾患には、アルツハイマー病、家族性アルツハイマー病、II型糖尿病、ダウン症候群、アポリポタンパク質Ｅ４対立遺伝子のホモ接合体、慢性間接リューマチ、全身性アミロイドーシス（原発性及び続発性）並びに出血性発作が包含される。

単独で又は別の基（例えば、ハロアルキル）の一部として使用される「アルキル」は、本明細書中では任意の直鎖又は枝分れＣ_nＨ_2n+1基（式中、特記しない限り、ｎは１〜６である。）として定義される。

「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードから選択される基を意味する。

式（Ｉ）の化合物の好適な塩には、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸及び硫酸のような鉱酸から導かれるもの、又は酒石酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、メタンスルホン酸及びアリールスルホン酸（例えば、ｐ−トルエンスルホン酸）のような有機酸から導かれるもののような酸付加塩がある。

本発明のさらに別の態様では、アミロイド関連疾患、好ましくはアルツハイマー病の生体内診断又は撮像のための式（Ｉ）の化合物又はその塩が提供される。

式（Ｉ）の化合物又はその塩は、好ましくは本発明の化合物を含む放射性医薬品組成物中で投与される。本発明で「放射性医薬品組成物」は、ヒトへの投与に適した形態で式（Ｉ）の化合物又はその塩を含む組成物として定義され、好ましくは放射性医薬品組成物はさらに生理学的に許容し得る賦形剤を含む。投与は、好ましくは組成物を水溶液として注射することによって行われる。かかる組成物は、適宜、緩衝剤、薬剤学的に許容し得る可溶化剤（例えば、シクロデキストリン或いはＰｌｕｒｏｎｉｃ、Ｔｗｅｅｎ又はリン脂質のような界面活性剤）、薬剤学的に許容し得る安定剤又は酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、ゲンチジン酸又はｐ−アミノ安息香酸）のような追加の成分を含んでいてもよい。式（Ｉ）の化合物又はその塩の用量は、投与すべき正確な化合物、患者の体重、及び当技術分野に精通した医師に自明の他の変数に応じて変化する。一般に、用量は０．００１〜１０μｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１〜１．０μｇ／ｋｇの範囲内にある。

本発明の特定の態様では、式（Ｉ）の化合物中でＲ¹は¹²³Ｉである。かかる化合物は、アルツハイマー病のようなアミロイド関連疾患のＳＰＥＣＴ撮像に有用である。

本発明の別の特定の態様では、式（Ｉ）の化合物中でＲ¹は¹²⁵Ｉである。かかる化合物は、アルツハイマー病のようなアミロイド関連疾患のＳＰＥＣＴ撮像に有用である。

本発明の別の特定の態様では、式（Ｉ）の化合物中でＲ¹は¹⁸Ｆである。かかる化合物は、アルツハイマー病のようなアミロイド関連疾患の陽電子射出断層撮像（ＰＥＴ撮像）に有用である。

本発明の別の特定の態様では、式（Ｉ）の化合物中でＲ¹は¹²⁴Ｉである。かかる化合物は、アルツハイマー病のようなアミロイド関連疾患のＰＥＴ撮像に有用である。

好ましい式（Ｉ）の化合物には、
Ｒ¹が¹²⁵Ｉ、¹²⁴Ｉ、¹²³Ｉ又は¹⁸Ｆであり、
Ｒ²がメチルであり、
Ｒ³が水素及び−Ｃ(Ｏ)Ｃ_1-6ハロアルキル（好適には−Ｃ(Ｏ)Ｃ_1-6フルオロアルキル、最も好適には−Ｃ(Ｏ)ＣＦ₃）から選択されるものがある。

Ｒ³が−Ｃ(Ｏ)ＣＨ(Ｒ⁴)ＮＨ₂である場合、Ｒ⁴は好ましくはＣ_1-6アミノアルキルであり、さらに好ましくは−(ＣＨ₂)₄ＮＨ₂である。特に興味深いかかる化合物の１種 は、５−［¹⁸Ｆ］−フルオロ−２−（４’−アミノ−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾールリシルアミド又はその塩（例えば、二塩酸塩）である。

特に好ましい式（Ｉ）の化合物には、
５−［¹²⁵Ｉ］−ヨード−２−（４’−アミノ−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾール、
５−［¹²⁵Ｉ］−ヨード−２−（４’−トリフルオロメチルアミド−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾール、
５−［¹⁸Ｆ］−フルオロ−２−（４’−アミノ−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾール、
５−［¹⁸Ｆ］−フルオロ−２−（４’−トリフルオロメチルアミド−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾール、
又はその塩がある。

式（Ｉ）の化合物の幾つかは新規であり、したがって、本発明の独立の態様として下記式（Ｉａ）の化合物又はその塩が提供される。

式中、
Ｒ¹は¹²⁵Ｉ、¹²⁴Ｉ、¹²³Ｉ、⁷⁵Ｂｒ又は⁷⁶Ｂｒであり、
Ｒ²はＣ_1-6アルキルであり、
Ｒ³は水素、Ｃ_1-6アルキル、−Ｃ(Ｏ)Ｃ_1-6アルキル及び−Ｃ(Ｏ)Ｃ_1-6ハロアルキルから選択される。

式（Ｉ）の化合物は、Ｒ¹がトリ（Ｃ_1-6アルキル）スズ置換基（好適にはトリメチルスズ置換基）である対応前駆化合物のヨウ素化、臭素化又はフッ素化によって製造できる。これらの前駆物質は、国際公開公報第０１／１４３５４号（特に、その実施例４４）に記載の方法に従って製造できる。ヨウ素化反応は、酸化剤（好適にはＮ−クロロスクシンイミド、Ｎ−クロロトリルスルホンアミド（例えば、クロラミンＴ又はヨードゲン）或いは過酢酸）の存在下、穏和な温度（好ましくは周囲温度）、及び適当な溶媒（例えば、ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ７．４の水性緩衝液）中で、ヨウ化ナトリウムのようなヨウ素源を用いて実施できる。フッ素化反応は、国際公開公報第０１／１４３５４号（特に、その実施例４５）に記載の方法を用いて実施できる。臭素化反応は、酸化剤（好適にはＮ−クロロスクシンイミド、Ｎ−クロロトリルスルホンアミド（例えば、クロラミンＴ又はヨードゲン）或いは過酢酸）の存在下、穏和な温度（好ましくは周囲温度）、及び適当な溶媒（例えば、水性緩衝液）中で、臭化ナトリウムのような臭素源を用いて実施できる。

式（Ｉ）の［¹⁸Ｆ］−フッ素化化合物は、国際公開公報第０３／００２１５７号及び同第０３／００２４８９号に記載の固相フッ素化方法を用いて製造することもできる。

次に、以下の実施例で本発明を例証する。

実施例１：５−［ ¹²⁵ Ｉ］−ヨード−２−（４’−アミノ−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾール（化合物１）の合成
標記の化合物は、化合物２（実施例２）から、実施例３に記載した方法と類似の方法によって水酸化カリウムで処理することによって製造した。

実施例２：５−［ ¹²⁵ Ｉ］−ヨード−２−（４’−トリフルオロメチルアミド−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾール（化合物２）の合成
５−トリメチルスタニル−２−（４’−トリフルオロメチルアミド−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾール（この化合物は国際公開公報第０１／１４３５４号に記載の通り製造できる。）（１００μｇ）に、３００μｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を１０ｍＣｉの［¹²⁵Ｉ］−ヨウ化ナトリウム及び１００μｌのクロラミンＴ（水中１ｍｇ／ｍｌ）と一緒に添加した。この混合物を３０秒間反応させ、１００μｌのメタ重亜硫酸ナトリウムを添加して反応を停止させた。混合物をＣ４カラムにローディングし、溶出液Ａ：水＋０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及び溶出液Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡを用いた逆相ＨＰＬＣで分離した。生成物を回収し、メタノール溶液中で２５０μＣｉ／ｍｌに希釈し、４℃で貯蔵した。

ＨＰＬＣ ＱＣ分析によれば、生成物は９３％の放射化学純度（ＲＣＰ）及び０．５％のヨウ化物含有量を有することが判明した。

実施例３：５−［ ¹⁸ Ｆ］−フルオロ−２−（４’−アミノ−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾール（化合物３）の合成
¹⁸Ｏ（ｐ，ｎ）¹⁸Ｆ核反応で気体分子状フッ素（¹⁸Ｆ−Ｆ）として生成させたフッ素−１８を、５−トリメチルスタニル−２−（４’−トリフルオロメチルアミド−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾール（この化合物は国際公開公報第０１／１４３５４号に記載の通り製造できる。）（２０ｍｇ、４０μｍｏｌ）のアセトニトリル（１０ｍＬ）溶液中に吹き込み、溶媒を減圧下で除去した。残渣をエタノール（１ｍＬ）及び水酸化カリウム（１ｍＬ、０．２Ｍ）に溶解した後、８０〜９０℃で１０分間加熱した。得られた混合物をＨＰＬＣカラム（μ−Ｂｏｎｄａｐａｃｋ Ｃ₁₈、３０×０．７８ｃｍ内径）にローディングし、３ｍＬ／分の流量のアセトニトリル：水（５５：４５）混液で溶出した。溶出液の放射能及び２５４ｎｍでのＵＶ吸光度を監視した。１２〜１４分の同じ保持時間を有する放射性ピークを回収した。溶出液を減圧下で除去して標記化合物を得た。

実施例４：５−［ ¹⁸ Ｆ］−フルオロ−２−（４’−トリフルオロメチルアミド−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾール（化合物４）の合成
気体分子状フッ素（¹⁸Ｆ−Ｆ）又は［¹⁸Ｆ］−次亜フッ素酸アセチルとしてのフッ素−１８を、５−トリメチルスタニル−２−（４’−トリフルオロメチルアミド−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾール（２０ｍｇ、４０μｍｏｌ）のアセトニトリル（１０ｍＬ）溶液中に吹き込み、溶媒を減圧下で除去した。化合物４は、カラムクロマトグラフィーを用いて純粋な状態で単離される。

生物学的データ
Ａ．血液脳関門（ＢＢＢ）透過性
ＣＡＣＯ−２細胞の培養及び見掛け透過度（Ｐａｐｐ）の値の測定
７２歳男性の結腸直腸腺癌に由来するＣＡＣＯ−２細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−３７）を、まず、集密状態になるまで７５ｃｍ²細胞培養フラスコ（Ｃｏｓｔａｒ ３３７６）内で培養した。１０％ＦＣＳ、１０μｇ／ｍｌインスリン（ＨＹＢＲＩ−ＭＡＸ、Ｓｉｇｍａ ｌ−４０１１）、非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ、Ｍ７１４５）、グルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｐ０９０６）を含むＥＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ ４５２６）中でＣＡＣＯ−２細胞を増殖させた。すべての細胞を９５％空気／５％ＣＯ₂中で３７℃でインキュベートした。集密状態で、細胞を用いて１２ｍｍ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ−Ｃｏｌインサート（Ｃｏｓｔａｒ ３４９３）に播種した。

ＣＡＣＯ−２については、１２ｍｍ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの播種は次のように行った。集密状態の培養物のフラスコをトリプシン処理し、細胞を注意深く再懸濁して集塊や気泡が存在しないことを確かめた。１．５ｍｌの組織培養液をウェルの底部（アクセプター）チャンバーに入れ、２×１０⁵の細胞を含む０．５ｍｌをＴｒａｎｓｗｅｌｌ（ドナーチャンバー）に入れ、インキュベーター内に配置した。適正な経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）が得られるまで、ＥｎｄＯｈｍ組織抵抗測定チャンバー（ＷＰＩ）を用いて細胞を定期的に監視した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ内の細胞の以後の維持及び栄養補給は以下のように行った。ウェルへの栄養補給に際しては、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌのアクセプターチャンバー（基底外側）及びドナーチャンバー（頂点側）から培養液を除去した。フィルターに接触しないように注意しながら、真空ポンプに接続したピペットで培養液を吸い取った。次に、０．５ｍｌの増殖培養液をドナーチャンバーに入れ、１．５ｍｌの増殖培養液をアクセプターチャンバーに入れた。

Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ内のＣＡＣＯ−２細胞単層のＴＥＥＲ値がおよそ５００Ωｃｍ²（３００〜８００Ωｃｍ²を適格と見なした）になったとき、以下のようにして透過性実験を三重反復試験として実施した。すべての培養液を除去し、アクセプターチャンバー及びドナーチャンバーを３７℃のＥａｇｌｅｓ Ｂａｌａｎｃｅ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＥＢＳＳ）（Ｇｉｂｃｏ）で２回すすいだ。１．５ｍｌのＥＢＳＳをアクセプターチャンバーに加え、放射性標識化合物を含む０．５ｍｌのＥＢＳＳをドナーチャンバーに加えた。次に、Ｌａｂｎｅｔ Ｖｏｒｔｅｍｐを用い、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ内の培養物を２００ｒｐｍで２７℃で３０分間インキュベートした。３０分後、ドナーチャンバーから１００μｌアリコートを採取し、アクセプターチャンバーから７５０μｌアリコートを採取した。次いで、これらのアリコートの放射能を計数した。残りのＥＢＳＳをアクセプターチャンバー及びドナーチャンバーから除去し、次いでＴｒａｎｓｗｅｌｌをＥＢＳＳで３回十分にすすいだ。次に、メスを用いてＴｒａｎｓｗｅｌｌの膜（及び付随する細胞）を取り除き、それに付随する放射性標識の量を測定した。

化合物の透過性は、そのＰａｐｐ値を計算することで求めた。
Ｐａｐｐ＝ΔＱ／Δｔ・６０・Ａ・Ｃｏ （ｃｍ／秒）
式中、ΔＱ／Δｔは透過速度（μｇ／分）であり、Ｃｏは放射性標識化合物の初期濃度であり、Ａは膜の表面積である。存在する標識化合物の量は、化合物の比放射能（７４ＴＢｑ¹²⁵Ｉ／ｍｍｏｌ）から求めることができた。

結果及び考察
ＢＢＢを通しての透過性は受動拡散による可能性もあるが、受動拡散は化合物が小さく（＜５００Ｄａ）て親油性であることが要求される。このアッセイでは、透過性化合物は１×１０^-5を超えるＰａｐｐ値を有している。例えば、表１に示す通り、能動輸送に依存する¹⁴Ｃ−グルコース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は５．７９×１０^-5のＰａｐｐを有しており、小さくて親油性であることに依存する¹⁴Ｃ−ジアゼパム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は２．４４×１０^-5のＰａｐｐを有している。他方、¹⁴Ｃ−スクロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び¹⁴Ｃ−マンニトール（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）はそれぞれ４．０８×１０^-6及び３．６３×１０^-6のＰａｐｐ値を有しており、これらの化合物はいずれも小さいので、電荷が不透過性の一因であることを示している。化合物１は１．３７×１０^-5のＰａｐｐ値を有しており、それが使用したＣＡＣＯ−２細胞ＢＢＢモデルを透過し得ることを示唆している。化合物１は比較的親油性（ＬｏｇＰ＝１．７５）で小さく（４６２．３４Ｄａ）、しかもＨ結合の形成を起こしにくい（ΔＬｏｇＰ値＝−０．３８）が、これもＣＡＣＯ−２細胞障壁又はＢＢＢを通過する際に有益である。これらのデータは、化合物１が受動拡散で細胞障壁を通過することを示唆している。

Ｂ．脳取込み指数（ＢＵＩ）
方法
ここで用いた方法は、Ｃｏｒｎｆｏｒｄ他，“Ｍｅｔａｐｈａｌａｎ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｖｉａ ｔｈｅ ｎｅｕｔｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｉｎ ｔｕｍｏｕｒ ｂｅａｒｉｎｇ ｂｒａｉｎ．” Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ５２ ｐ．１３８−１４３（１９９２）で使用されたものであり、放射能のボーラスを頚動脈に直接注射する。１５秒後に動物を断頭し、脳を取り出し、自由拡散性標準（¹⁴Ｃ−ブタノール、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を基準にして試験化合物の取込み量を計算する。

ＢＵＩは次式に従って計算する。

各実験に関し、同じ試験溶液を用いて３頭の動物からＢＵＩを求めた。各化合物を二重反復試験で測定した。Ｃｅｒｅｔｅｃ（商標）及びＤａｔｓｃａｎ（商標）はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｈｅａｌｔｈから入手し、¹⁴Ｃ−ＦＤＧ及び¹⁴Ｃ−スクロースはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。

結果

結論
化合物１のＢＵＩは、血液脳関門を通過する他の化合物と同等であることがわかる。低いＣＮＳ浸透性を有する化合物と中位のＢＢＢ透過度を示す化合物との間の境界は２０％である。２０％を超える値は、造影剤として満足すべきＢＢＢ透過度であると思料される。したがって、化合物１は中位乃至高いＢＢＢ透過度を示し、アルツハイマー病の診断薬にとって十分な送入量を表している。

インシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）脳灌流
方法
化合物はゆっくりと脳に浸透することもあれば、末梢代謝を受けることもあり、これはＢＵＩが必ずしもＢＢＢ透過性を反映しない可能性があることを意味している。この理由から、インシトゥ脳灌流技術を使用した。この技術は、化合物のＢＢＢ透過性を評価するために広く用いられてきた。ここで用いた方法は、Ｗｉｌｌｉａｍｓ他，“Ｐａｓｓａｇｅ ｏｆ ａ ｄｅｌｔａ−ｏｐｉｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ， ［Ｄ−ｐｅｎｉｃｉｌｌａｍｉｎｅ２，５］ ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ， ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ−ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｂａｒｒｉｅｒｓ．” Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． １９９６ Ｍａｒ；６６（３）：１２８９−９９に記載されている。

試験化合物を含む生理食塩水溶液で脳を２分、５分、１５分、２０分及び３０分灌流し、脳内取込み量を灌流液中の試験物質の濃度に対する百分率として計算する（組織内Ｒ＝脳１ｇ当たりのｄｐｍ／灌流液１μｌ当たりのｄｐｍ×１００％）。

取込み量を時間に対してプロットすると、グラフの勾配は一方向性の脳流入定数Ｋ_inを表す。これは、ＣＮＳ内への化合物の侵入速度を反映している。

結果

結論
化合物１は高いＫ_in値を与える。これは、この化合物がＣＮＳに急速に浸透することを示唆し、高いＢＵＩ値を裏付けている。

毛細管除去
血液脳関門を通過するように見える化合物でも、脳実質に侵入するのではなく、脳内の血管系に付着していることがある。このような理由から、脳ホモジネートから毛細管を分離する毛細管除去法を使用した。

方法
Ｔｒｉｇｕｅｒｏ Ｄ他， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ １９９０ ５４（６）：１８８２−８ “Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．” 並びにＴｈｏｍａｓ ｎｅｅ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＳＡ， Ｓｅｇａｌ ＭＢ． “Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓａｔｕｒａｂｌｅ ｕｐｔａｋｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｔ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｂｌｏｏｄ−ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｂａｒｒｉｅｒｓ．” Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １９９６ Ｎｏｖ ２５；７４１（１−２）：２３０−９改変した。

体重１５０〜２５０ｇの雄ウィスターラットを、腹腔内注射による５５ｍｇ／ｋｇペントバルビタールナトリウム（Ｒｈｏｎｅ−Ｍｅｒｉａｕｘ）の投与で深く麻酔した。左総頚動脈をブラントディセクションで露出させ、３０Ｇ注射針及び１ｍｌ注射器を用いて１００μｌの試験溶液を頚動脈中に単一のボーラスとして注射した（注射時間約１秒）。注射液は、試験用／確認用化合物と非拡散性標準としての¹⁴Ｃ−又は³Ｈ−スクロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とを共に含んでいた。注射から１０秒後、動物を断頭して脳を取り出した。小脳を取り出し、皮質を左半球と右半球とに切り離した。両半球を秤量した後、ガラスホモジナイザーを用い、３．５倍重量のＫａｎｋｓ緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）中で１０〜１５ストロークでホモジナイズした。脳重量の４倍の２６％デキストラン溶液（ＨＢＳＳ中に分子量７３０００のデキストラン）を添加し、ガラスホモジナイザーを用いて脳をさらに３〜５ストロークでホモジナイズした。すべてのホモジナイズ操作は４℃で行い、１分以内に完了した。冷却遠心機により、ホモジネートを４℃で５４００ｇで１５分間遠心した。次いで、血管に富むペレットと上澄み液とを注意深く分離した。１０ｍｌのＨｉｏｎｉｃ Ｆｌｕｏｒシンチラント（Ｐａｃｋａｒｄ）の添加後、ペレット、上澄み液、及び注射液の試料をＲａｃｋｂｅｔａ Ｅｘｃｅｌシンチレーションカウンター上で計数した。¹⁴Ｃ／³Ｈ−スクロースは、ペレット中に含まれる血管の容積を補正すると共に、ホモジナイズ操作中に血管系から上澄み液に漏れ出た放射能を補正するために役立った。

ペレット及び上澄み液に関する分布容積を下記に示すようにして計算した。データは、上澄み液中の分布容積とペレット中の分布容積との比として表されている。

結果

結論
結果は、化合物１が主として脳実質中に含まれることを示唆している。ある割合の部分は血管系中に含まれる可能性がある（上澄み液とペレットの比は¹⁴Ｃ−ブタノールのような自由拡散性化合物ほど高くない）。

このことから、化合物１は血液脳関門を通過して脳実質に侵入し、そこでアルツハイマー病の病変部と相互作用し得るであろうと結論できる。血液脳関門を通過する放射性標識の量は、アルツハイマー病の病変部に結合して撮像するのに十分である。

Ｃ．アミロイド結合
化合物１のアミロイド結合の測定：
¹²⁵Ｉ−β−アミロイドタンパク質１〜４０（¹²⁵Ｉ−ＢＡＰ１〜４０、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＩＭ２９４）がアミロイド１〜４０フィブリルに結合する能力と比較して、化合物１（７４ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）の結合を測定した。アミロイド結合は、実質的に以下のように実施した。

実験用として、３種の新鮮な緩衝原液を調製した。それらは、緩衝液１（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．５）、緩衝液２（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．１％ＢＳＡ／４００μＭ ＺｎＣｌ₂、ｐＨ７．５）及び緩衝液３（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．１％ＢＳＡ／１００μＭ ＺｎＣｌ₂、ｐＨ７．５）であった。

ストレプトアビジン被覆シンチレーション近接アッセイビーズ（ＳＡ−ＳＰＡビーズ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてフィブリル状のβ−アミロイドタンパク質（ＢＡＰ１〜４０）を固定化した。アミロイド被覆ビーズ（ＳＰＡ−ＢＡＰ）は、２５０μｌのＳＡ−ＳＰＡビーズ（１００ｍｇ／ｍｌ）を２５０μｌの緩衝液２、４２５μｌの緩衝液１、５０μｌのビオチニル化ＢＡＰ１〜４０（０．５ｍｇ／ｍｌ、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ ０３−２４３）、２５μｌのＢＡＰ１〜４０（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ ０３−１３８）と共にインキュベートすることで調製した。ＢＡＰ１〜４０フィブリルの付随しないＳＰＡビーズに対する化合物の結合を評価するため、２５０μｌのＳＡ−ＳＰＡビーズ（１００ｍｇ／ｍｌ）を２５０μｌの緩衝液２、５００μｌの緩衝液１と共にインキュベートすることで非特異結合ＳＰＡビーズ（ＳＰＡ−ＮＳＢ）を調製した。

インキュベートしたＳＰＡ−ＢＡＰ及びＳＰＡ−ＮＳＢを室温で２４時間放置し、次いで１．５ｍｌチューブ（エッペンドルフ、Ｍｅｒｋ、３０６／０４２１／１２）に入れて１０００×ｇで２分間回転した。上澄み液を除去した後、ビーズを１ｍｌの緩衝液３に再懸濁し、次いで１０００×ｇで２分間遠心することで２回洗浄した。最後に、洗浄したＳＰＡ−ＢＡＰ及びＳＰＡ−ＮＳＢビーズを１ｍｌの緩衝液３に再懸濁した。

¹²⁵Ｉ−ＢＡＰ１〜４０及び化合物１のアミロイド結合を、２５μｌの緩衝液２及び２５μｌの標識化合物（¹²⁵Ｉ−ＢＡＰ１〜４０又は化合物１）に５０μｌのＳＰＡ−ＢＡＰビーズを添加することにより、０．５ｍｌチューブ（エッペンドルフ、Ｍｅｒｋ、３０６／０４２１／０２）中で三重反復試験として行った。次に、チューブを振盪しながら室温で１８０分間インキュベートし、次いで１０００×ｇで２分間遠心した。上澄み液を除去した後、１％のＴＷＥＥＮ−２０（Ｓｉｇｍａ、Ｐ７９４９）を含む３００μｌの緩衝液３でＳＰＡ−ＢＡＰペレットを２回洗浄した。ＳＰＡビーズに対する標識化合物の非特異結合は、ＳＰＡ−ＢＡＰビーズをＳＰＡ−ＮＳＢビーズで置き換えた点を除き、上述のインキュベーションを用いて測定した。次に、洗浄したＳＰＡビーズペレットの放射能を測定した。

フィブリル状ＢＡＰ１〜４０に対する標識化合物の親和性を、ＳＰＡ−ＢＡＰ関連カウント数からＳＰＡ−ＮＳＢ関連カウント数を引くことで推定した。次に、¹²⁵Ｉ−ＢＡＰの結合を１００％として、標識化合物の結合を比較した。

これらの実験では、¹²⁵Ｉ−ＢＡＰ１〜４０及び化合物１は等モル量（１〜５×１０^-11ミリモル／インキュベーション）で添加した。

結果及び考察
ＢＡＰ１〜４０は容易に自己凝集する。このアッセイでは、ＳＰＡビーズ上に固定化した一定量のアミロイドフィブリルに対する¹²⁵Ｉ−ＢＡＰ１〜４０の結合を他の化合物に対する基準として用いた。表１は、他のアミロイド結合剤及び非結合剤を¹²⁵Ｉ−ＢＡＰ１〜４０の結合と比較した結果を示している。化合物１は¹²⁵Ｉ−ＢＡＰ１〜４０の２７％の親和性でアミロイドフィブリルと結合するが、これは¹²⁵Ｉ標識ＢＡＰ１５〜２１配列（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（２１％）及び^99mＴｃ標識ＢＡＰ１５〜２１配列（９％）に比べて好ましい。ＢＡＰ１５〜２１配列の場合、アミロイドフィブリルの形成中にＢＡＰがそれ自体に結合することに原因がある。

Ｄ．薬物動態学
材料及び方法
Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓで製造した２５０μＣｉ／ｍｌ（比放射能２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の化合物１（ＩＭＱ１９６１）を新鮮希釈して、０．１ｍｌ容積当たり１μＣｉの注射ボーラスを得た。体重１５０〜１８０ｇの雄ウィスターラット１５頭（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を使用した。

化合物１の注射（１μＣｉ、尾静脈への０．１ｍｌボーラス）に先立ち、雄ウィスターラットを簡単に麻酔した。三重反復試験用の動物において、５つの時点（５分、１５分、３０分、６０分及び１２０分）で生体分布を調べた。この場合、脳、血液、筋肉、腎臓、脾臓、胃、小腸、大腸及び糞便、膀胱及び尿、脂肪、皮膚並びに甲状腺から組織を摘出し、Ｗａｌｌａｃ Ｗｉｚｚａｒｄガンマカウンターで計数して体内の化合物の分布を調べた。

Ｑｋ薬物動態学プログラムを用いてパーセント注射量の計算を行ってプロットし、ｔ^1/2α及び分布容積（Ｖ_D）を求めた。相対保持量（ＲＲ）及び脳：組織比を以下のようにして計算した。

結果及び考察
化合物１に関する生体分布データを示す（表２及び図１）。データは、正常ウィスターラットでの脳のパーセント注射量が２時間の実験中に変化することを示している。脳への初期送入量は０．９４％であるが、これは１２．４分のｔ^1/2値（α）で排除され、６０分後に０．２９％の取込み量に達する。甲状腺取込み量が低い（＜１％）のは、このヨウ素化化合物が生体内で非常に安定であり、他のヨウ素化分子でしばしば見られるように分解してヨウ化物を生じないことを表している。

この化合物の分布容積は、化合物１のような親油性化合物について予想される通りに高い（２．２７×１０⁴Ｌ／ｋｇ）。化合物１のＬｏｇＰ値（１．７５）及びΔＬｏｇＰ値（−０．３８）は、原形質膜を通してのその輸送を容易にする。その結果、脂肪組織及び（それより程度が低いが）皮膚で高い％ＩＤ値が認められる。

化合物の相対保持量は、生体の残部に対する脳組織中の保持量である。図２は、化合物１に対する相対保持量が５分後の初期値で１．０１であることを示しており、これは同様な値（１．０４）を有する血液と同等である。相対保持量の経時的減少は、化合物１が５分以内に最大限まで取り込まれ、次いで生体内の残りの組織からの排除よりも急速に排除されることを示唆している。脳：血液比（図３）は、１５〜３０分の間では化合物１が脳よりも血液から速く排除されることを表している。生体からの排除は、親油性化合物に関する薬物動態学的プロフィルに一致して大部分が肝臓胆汁系を通して行われ、泌尿系を通して行われるものはわずかしかない。

化合物１の脳内取込量を示すグラフ。 脳組織中での化合物１の相対保持量を示すグラフ。 化合物１の脳：血液組織比を示すグラフ。

Claims (9)

1. アミロイド関連疾患、特にアルツハイマー病の生体内診断又は撮像用の放射性医薬品の製造のための、下記式（Ｉ）の化合物又はその塩の使用。
   

   

   式中、
   Ｒ¹は¹²⁵Ｉ、¹²⁴Ｉ、¹²³Ｉ、⁷⁵Ｂｒ、⁷⁶Ｂｒ又は¹⁸Ｆであり、
   Ｒ²はＣ_1-6アルキルであり、
   Ｒ³は水素、Ｃ_1-6アルキル、−Ｃ(Ｏ)Ｃ_1-6アルキル、−Ｃ(Ｏ)Ｃ_1-6ハロアルキル及び−Ｃ(Ｏ)ＣＨ(Ｒ⁴)ＮＨ₂（式中、Ｒ⁴は水素、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_1-6ヒドロキシアルキル及びＣ_1-6アミノアルキルから選択される。）から選択される。
2. 請求項１記載の使用であって、アミロイド関連疾患、特にアルツハイマー病の生体内診断又は撮像用の放射性医薬品の製造のための、下記式（Ｉ）の化合物又はその塩の使用。
   

   

   式中、
   Ｒ¹は¹²⁵Ｉ、¹²⁴Ｉ、¹²³Ｉ、⁷⁵Ｂｒ、⁷⁶Ｂｒ又は¹⁸Ｆであり、
   Ｒ²はＣ_1-6アルキルであり、
   Ｒ³は水素、Ｃ_1-6アルキル、−Ｃ(Ｏ)Ｃ_1-6アルキル及び−Ｃ(Ｏ)Ｃ_1-6ハロアルキルから選択される。
3. 式（Ｉ）の化合物において、
   Ｒ¹が¹²⁵Ｉ、¹²⁴Ｉ、¹²³Ｉ又は¹⁸Ｆであり、
   Ｒ²がメチルであり、
   Ｒ³が水素及び−Ｃ(Ｏ)Ｃ_1-6ハロアルキルから選択される、請求項１又は請求項２記載の使用。
4. 式（Ｉ）の化合物が、
   ５−［¹²⁵Ｉ］−ヨード−２−（４’−アミノ−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾール、
   ５−［¹²⁴Ｉ］−ヨード−２−（４’−アミノ−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾール、
   ５−［¹²³Ｉ］−ヨード−２−（４’−アミノ−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾール、
   ５−［¹²⁵Ｉ］−ヨード−２−（４’−トリフルオロメチルアミド−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾール、
   ５−［¹²⁴Ｉ］−ヨード−２−（４’−トリフルオロメチルアミド−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾール、
   ５−［¹²³Ｉ］−ヨード−２−（４’−トリフルオロメチルアミド−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾール、
   ５−［¹⁸Ｆ］−フルオロ−２−（４’−アミノ−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾール、及び
   ５−［¹⁸Ｆ］−フルオロ−２−（４’−トリフルオロメチルアミド−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾール
   から選択される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の使用。
5. 被検者におけるアミロイド関連疾患の生体内診断又は撮像のための方法であって、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の式（Ｉ）の化合物又はその塩の投与を含んでなる方法。
6. 請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の式（Ｉ）の化合物又はその塩を含んでなる放射性医薬品組成物。
7. 下記式（Ｉａ）の化合物又はその塩。
   

   

   式中、
   Ｒ¹は¹²⁵Ｉ、¹²⁴Ｉ、¹²³Ｉ、⁷⁵Ｂｒ又は⁷⁶Ｂｒであり、
   Ｒ²はＣ_1-6アルキルであり、
   Ｒ³は水素、Ｃ_1-6アルキル、−Ｃ(Ｏ)Ｃ_1-6アルキル及び−Ｃ(Ｏ)Ｃ_1-6ハロアルキルから選択される。
8. Ｒ¹が¹²⁵Ｉ、¹²⁴Ｉ又は¹²³Ｉであり、
   Ｒ²がメチルであり、
   Ｒ³が水素及び−Ｃ(Ｏ)Ｃ_1-6ハロアルキルから選択される、請求項７記載の式（Ｉａ）の化合物。
9. 式（Ｉ）の化合物が、
   ５−［¹²⁵Ｉ］−ヨード−２−（４’−アミノ−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾール、
   ５−［¹²⁴Ｉ］−ヨード−２−（４’−アミノ−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾール、
   ５−［¹²³Ｉ］−ヨード−２−（４’−アミノ−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾール、
   ５−［¹²⁵Ｉ］−ヨード−２−（４’−トリフルオロメチルアミド−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾール、
   ５−［¹²⁴Ｉ］−ヨード−２−（４’−トリフルオロメチルアミド−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾール、及び
   ５−［¹²³Ｉ］−ヨード−２−（４’−トリフルオロメチルアミド−３’−メチルフェニル）ベンゾチアゾール
   から選択される、請求項７又は請求項８記載の式（Ｉａ）の化合物。

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