JP2005523706A - 改良型キメラ糖タンパク質と、類型化されたレンチウイルス - Google Patents

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Abstract

本発明により、改良型キメラ糖タンパク質（GP）と、その糖タンパク質で類型化された改良型レンチウイルス・ベクターが提供される。そのような糖タンパク質とベクターを作るための方法と組成物、ならびにそのベクターを用いて細胞への形質導入を試験管内と生体内で行なう改良された方法も提供される。改良型キメラGPは、MLV-A GPの細胞質尾部と融合したGALV GPまたはRD114 GPの細胞外ドメインと膜貫通ドメインをコードしている。GALV/TPキメラGPまたはRD114/TPキメラGPで類型化されたベクターは、親GPでコーティングされたベクターよりも力価が有意に大きい。しかも、RD114 GPで類型化されたベクターは、効率的に濃縮され、ヒトとマカク両方の血清の補体によって誘導される不活化に対する抵抗力がある。RD114 GPで類型化されたレンチウイルス・ベクターは、生体内への遺伝子導入に特に役立つ。

Description

本発明は、キメラ糖タンパク質と、その糖タンパク質で類型化された改良型レンチウイルス・ベクターと、そのような糖タンパク質とベクターを作るための方法および組成物と、そのベクターを用いて試験管内と生体内で細胞に形質導入する方法に関する。この改良型組成物と改良型ベクターは、生体内への遺伝子導入に特に役立つ。
レトロウイルス由来のベクターでは、（細胞の親和性を決定している）さまざまなウイルスの表面糖タンパク質を（ゲノムの複製と組み込みを決定している）さまざまなタイプのウイルス・コアと組み合わせることができるため、このベクターは、遺伝子導入に応用する際の柔軟性が特に大きい1。例えばVSV-G糖タンパク質をレンチウイルス由来のウイルス・コアと組み合わせると、幅広い親和性を持っていて、非増殖性の標的細胞に組み込むことのできるベクター類型が得られる2。このベクター類型は、生体外と生体内でいくつかのタイプの細胞への形質導入に有効であることがわかっている3-7。現在でも、別のウイルス糖タンパク質で類型化したレンチウイルス・ベクターの性質を探究することは、非常に興味深いテーマである8-15。この類型化により、ウイルスの物理化学的特性、そのウイルスと宿主の免疫系の相互作用、そのウイルスにとっての宿主の範囲が変化するようである。実際、標的細胞への形質導入の効率は、レトロウイルス・ベクターのコーティングに用いる糖タンパク質のタイプによって異なることが、いくつかの研究によって示されている16-21。さらに、生体内への遺伝子導入では、場合によっては、全身投与後に特定の細胞への輸送および／または遺伝子の発現を目的としたベクターが必要とされるようである22。そのベクターの受容部である形質膜の脂質成分23は広く分布しているため、VSV-G類型は、接種後、標的細胞に到達する前に遭遇するあらゆる細胞の表面に結合する可能性がある。しかもVSV-Gで類型化されたベクターはヒト血清によって急速に不活化されるため24、全身に遺伝子を供給するためのベクターをVSV-Gを糖タンパク質として用いて類型化するには制約があろう。
サル免疫不全ウイルス（SIV）に由来するレンチウイルス・ベクターは、われわれの研究室25を含むいくつかの研究室1で作り出されている。このベクターの特徴を明らかにすることにより、非増殖性細胞への導入遺伝子の挿入に関しては、ヒト免疫不全ウイルス（HIV-1）に由来するベクターと類似していることがわかった。ただしサルの細胞では、SIVベクターのほうがHIV-1ベクターよりも性能が優れている25。
本発明は、類型化されたウイルス・ベクター粒子を作るのに用いるキメラ糖タンパク質と突然変異糖タンパク質に関する。特別な実施態様では、キメラ糖タンパク質は、MLV-Aに由来する細胞質尾部ドメインと、ネコ内在性ウイルスRD114に由来する膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを備えている。
別の実施態様では、糖タンパク質は、レンチウイルスをベースとしたベクターを用いて効率的に類型を形成することを可能にする最小限の修飾を含んでいる。特別な実施態様には、レトロウイルス・ベクターのレトロウイルス・コアのプロテアーゼと適合性のある開裂部位を細胞質尾部ドメイン内に含む糖タンパク質が含まれ、そのレトロウイルス・ベクターは、変化した糖タンパク質で類型化されることになる。特別な実施態様では、連続した8個のアミノ酸を修飾する。この8個のアミノ酸はウイルス・コアのプロテアーゼにとっての基質であり、それが開裂することは、ウイルスの糖タンパク質の融合生成性にとって本質的である。こうした修飾により、がんレトロウイルス・コアまたはさまざまなレンチウイルス・コアを用いた類型化が可能になる。
これら実施態様に関連した本発明のさらに別の実施態様は、キメラ糖タンパク質または突然変異糖タンパク質の細胞質尾部のアミノ酸配列にウイルス・コアのプロテアーゼを接触させ、その結果としてそのコア上に劇的に改良された糖タンパク質アセンブリーを得る方法である。
本発明には、このような糖タンパク質をコードしている核酸構造体も含まれる。好ましい一実施態様では、核酸は、配列ID番号1の配列を含んでいる。別の特徴によると、この構造体は糖タンパク質の発現に適した発現構造体であるため、組み換えウイルス・ベクター粒子に組み込むことができる。さらに別の特徴によると、本発明には、このような核酸構造体をトランスフェクトされた細胞も含まれる。
本発明の一実施態様には、MLV-Aに由来する細胞質尾部ドメインと、ネコ内在性RD114ウイルスに由来する膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインとを備えるキメラ糖タンパク質を含むベクター粒子が含まれる。さらに別の特徴によると、ベクター粒子は、類型化されたベクター粒子である。さらに別の特徴によると、ベクター粒子は、組み換えウイルス・ベクター構造体をさらに含んでいる。
別の一実施態様では、ベクター粒子は、レトロウイルスまたはレンチウイルスに由来するベクター構造体を含んでいる。1つの特徴によれば、このベクター構造体はSIVまたはHIVに由来する。
別の一実施態様では、ベクター粒子がベクター構造体を含んでおり、そのベクター構造体がさらに導入遺伝子を含んでいる。1つの特徴によれば、導入遺伝子は、マーカー遺伝子またはレポータ遺伝子である。特別な一実施態様では、導入遺伝子はグリーン蛍光タンパク質（GFP）である。別の1つの特徴によれば、導入遺伝子は治療用遺伝子である。特別な実施態様では、導入遺伝子は、がん遺伝子またはがん原遺伝子である。別の特別な一実施態様では、導入遺伝子は薬剤感受性遺伝子である。
本発明の別の一実施態様は、細胞に形質導入する方法であって、
a）形質導入する細胞を取得するステップと；
b）請求項8の類型化されたベクター粒子を取得するステップと；
c）形質導入が十分に起こる条件下で上記細胞を（b）のベクター粒子と接触させるステップとを含む方法である。別の一実施態様では、この方法は、形質導入を増大させるのに十分な量のレトロネクチンを提供するステップをさらに含んでいる。この方法の1つの特徴によれば、試験管内で細胞への形質導入がなされる。別の特徴によれば、生体内で細胞への形質導入がなされる。さらに別の実施態様によれば、細胞は、脊椎生物の細胞、霊長類の細胞、ヒトの細胞のいずれかである。細胞は、CD34+細胞またはPBL細胞にすることもできる。上記方法の別の実施態様として、その方法によって形質導入された細胞が含まれる。
さらに別の一実施態様は、類型化された組み換えベクター粒子を製造する方法であって、
（a）（i）少なくとも1つのベクター構造体と；
（ii）少なくとも1つのパッケージング構造体と；
（iii）請求項1のキメラ糖タンパク質をコードしている発現構造体とを細胞にトランスフェクトして産生細胞を作り出すステップと；
（c）その産生細胞を培地内で培養するステップと；
（d）その産生細胞を培地から分離することにより、その培地から組み換えウイルス・ベクター粒子を回収するステップを含む方法である。
別の実施態様には、細胞への形質導入が組み換えベクターによってなされる条件下で、本発明の方法に従って製造したベクター粒子とその細胞を接触させるステップが含まれる。細胞としては、特にヒトの細胞が考えられる。その中には、造血幹細胞またはヒトCD34+細胞が含まれる。別の一実施態様では、細胞に対し、幹細胞の多能性が実質的に失われることなく細胞増殖が促進されるような処理を行なう。別の特徴によれば、生体内または試験管内で細胞への形質導入を行なう。さらに別の実施態様では、形質導入された細胞を、対象とする動物に導入する。好ましい一実施態様では、その対象はヒトである。
本発明に含まれる生体外遺伝子治療の代表的な一例は、慢性肉芽腫症（CDG）を患っている患者である。この患者の場合、CD34+細胞を骨髄または末梢血から単離し、gp91phox遺伝子を発現するレンチウイルスを用いて生体外で形質導入した後に患者に再移植する。重症複合型免疫不全（SCID）を患っている患者の場合には、本発明により同様の方法が考えられ、患者に欠けている遺伝子（例えばインターロイキン受容体の共通γ鎖をコードしている遺伝子）を発現する本発明のベクター構造体を使用する。HIV感染の遺伝子治療を行なうため、本発明の発明者は細胞内で免疫感作することを考え、細胞に抗ウイルス遺伝子を導入してHIVウイルスに対する抵抗力をその細胞に持たせることにした。HIVの細胞内免疫感作を行なう実施態様では、本発明によるベクターの標的として、造血前躯体、末梢血のCD4+T細胞、単球などが挙げられる。当業者であればわかるように、他のウイルス感染でも同様の細胞内免疫感作法を利用できる。がんの免疫療法では、腫瘍細胞または抗原提示細胞（例えば樹状細胞）を本発明のレンチベクターで遺伝子操作することになろう。がんの治療では、本発明によるレンチベクター構造体で使用できるいくつかの導入遺伝子は、増殖を抑制および／または阻止および／または予防する、および／またはがん／腫瘍細胞、および／またはがん／腫瘍遺伝子（例えばTNF）のアポトーシスを媒介する遺伝子である。
この明細書に記載したベクター粒子は、生体内で使用することもできる。そのためには、例えば血中または特定の器官に直接注入する。例えばグリア細胞由来増殖因子（GDNF）を発現するレンチウイルスを脳内に注入することによってパーキンソン病を治療することができる。別の一実施態様では、血友病Aを治すための凝固第VIII因子を発現するレンチベクターを門脈内に注入することが考えられる。さらに別の一実施態様では、デュシェンヌ筋ジストロフィを治療するためにジストロフィン遺伝子を発現する本発明のレンチベクターを静脈内または筋肉内に注入することが考えられる。したがって当業者であれば、遺伝子治療に関して本発明のベクター構造体とベクター粒子を広く使用することが考えられよう。
この明細書で“含む”という用語とともに用いられる“1つの”は、1つ以上を意味することができる。この明細書で用いる“別の”は、少なくとも第2の、またはそれ以上を意味することができる。
本発明の他の目的、特徴、利点は、以下の詳細な説明から明らかになろう。しかしその詳細な説明と具体的な実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しているとはいえ、単なる説明のために提示されていることを理解する必要がある。というのも、当業者にとって、本発明の本質と範囲から逸脱することなくさまざまな変更や修正を行なうことが詳細な説明から明らかだろうからである。
図面は本発明の一部であり、本発明のいくつかの側面をさらに提示するために添付してある。本発明は、この明細書に記載した具体的な実施態様に関する詳細な説明にその図面のうちの1枚以上を組み合わせて参照することにより、さらによく理解できよう。
われわれは、MLV-A GPの細胞質尾部（TRと表記する）と融合したGALV GPまたはRD114 GPの細胞外ドメインと膜貫通ドメインをコードしているキメラGPを作った。驚くべきことに、このGALV/TR GPキメラまたはRD114/TR GPキメラで類型化したSIV由来のベクターは、親GPでコーティングしたベクターよりも力価が有意に大きい。しかも、RD114/TRで類型化したベクターは効率的に濃縮され、ヒト血清とマカク血清の両方の補体によって誘導される不活化に対する抵抗力がある。したがって修飾したRD114 GP類型化レンチウイルス・ベクターは、生体内への遺伝子導入という用途において特に有用である。さらに、他のレトロウイルスのGPまたはVSV-Gで類型化したベクターと比較すると、RD114/TRで類型化したベクターでは、ヒトとマカクの一次血液リンパ球とCD34+細胞への形質導入が増大している。
さらに、膜貫通ドメインおよび／または細胞質尾部に変化部を有するRD114 GP突然変異体は、MLV、SIV、HIV-1のいずれかのウイルス・コア粒子を用いた類型形成を変化させることができる。われわれは、効率的な類型化を可能にするためにはウイルス・コアのプロテアーゼに適合した開裂部位がRD114 GPの細胞質尾部に存在している必要があることを示す。開裂部位がMLVプロテアーゼに適合していないと、類型化されたビリオンの感染力は変化するがMLVコアへのGPの組み込みは変化しないのに対し、開裂部位がレンチウイルスのプロテアーゼに適合していると、GPの組み込みと類型化されたレンチウイルス・コアの感染力の両方が制御される。したがってウイルスをアセンブリーする新規な方法が存在する。この方法によれば、GPの細胞質尾部にあってレンチウイルス・コアへのGPの組み込みを制限する決定基をウイルスのプロテアーゼで除去することで、GPの組み込みと類型化されたビリオンの感染が可能になるはずである。
1．RD114 GPの細胞質尾部が細胞-細胞融合生成性とウイルス-細胞融合生成性を制御する
タイプCとタイプDに属する哺乳動物レトロウイルスのGPでは、細胞質尾部がウイルスのアセンブリーと融合生成性の両方を調節するプロセスにおいて非常に重要である。糖タンパク質の局在、細胞表面の密度、細胞-細胞融合、異種または同種のウイルス・コアとの相互作用、異種または同種のウイルス・コアの組み込み、ビリオンの感染力に対して細胞質尾部が影響を有することを示すいくつかの証拠がある。GPの細胞質尾部は、Rと呼ばれるカルボキシ末端ペプチドを含む構造モチーフである。このRはチロシン・エンドサイトーシス・シグナル（YXXL）（5）を備えており、そのRがウイルスのプロテアーゼによって開裂するとGPの性質が大きく変化する。GPの元々の形態でRペプチドが開裂前に相互作用すると考えられている相手は、i）細胞エンドサイトーシス機構のアダプチン複合体、ii）ビリオン内に見いだされる成熟GPのカルボキシ末端（図1Aに示した細胞質尾部のTドメイン）、iii）ビリオンの内部タンパク質である（1、8、13、14、17、19、43）。RD114 GP突然変異体の特性を調べた結果（この明細書）は、細胞質尾部によって運ばれる関連シグナルが存在していることを示している。したがって、YXXLモチーフが点突然変異誘発によって破壊されたRDΔYXXL突然変異体GPにより、おそらくは細胞表面での発現が増えることを通じて細胞-細胞融合が増加する。これは、がんレトロウイルスとレンチウイルスの糖タンパク質を用いた別の人による研究が示唆していることである（1、8、13）。しかし細胞-細胞融合生成性および／または細胞表面の発現を増大させた突然変異は、必ずしもウイルスの組み込みおよび／またはウイルスの感染力を増大させない可能性がある。そのことは、RDRなし、RDPrMLV、RDPrSIVRQAG、RDPrHIV、RDΔYXXLという突然変異体GPの性質から推測される。さらに、われわれのデータは、類型化されたベクターの感染力が、RD114 GPの修飾された細胞質尾部とウイルス・コアのタイプの間の適合性に依存することを示している。
タイプCとタイプDに属する他の哺乳動物レトロウイルスのGPを用いて得られるいくつかの遺伝子上の証拠は、細胞質尾部が、開裂していない細胞形態で、GPの融合生成性に関して本質的に負の調節役としてとして機能する（2、14、17、30、33、43）と同時に、ビリオンの組み立て中にマトリックス・タンパク質のパートナーとして機能する（2、3）ことを示している。RD114 GPのCT突然変異体を用いて得られた結果は、そのGPの融合制御が、タイプCとタイプDに属する糖タンパク質の融合制御と同様、そのGPの細胞質尾部によって変化することを示している。実際、細胞質尾部の開裂が、タイプCとタイプDに属するいくつかの糖タンパク質にとって、まだわかっていないメカニズムを通じて融合能力を活性化する上で本質的であることが見いだされた（2、14、30、33）。CTが開裂しないと、融合生成性糖タンパク質がわずかになる。また、停止コドンを開裂位置に挿入することによって実現される未熟な開裂により、シンシチウムの形成が非常に促進される（2、30、33）。さらに、われわれのデータから、ビリオンが構成されている間または構成された後にRD114 GPのカルボキシ末端が開裂して感染可能になるはずであることが、直接確認される（図5）。それに加え、成熟細胞質尾部を形成する領域（ドメインT、図1B）またはRペプチドにおける突然変異により、細胞-細胞融合の制御状態が変化する（14、17、43）。これは、この細胞質尾部の構造および／または完全性が壊れた結果であることが確実であるように思われる。同様に、細胞質尾部に突然変異をいくつか有するRD114 GP突然変異体（例えば突然変異体RDPrMLV、RDPrSIVRQAG、RDPrHIV）は細胞毒性が増大している可能性がある。というのも、突然変異した細胞質尾部によって融合の抑制を制御できなくなっているからである。
2．レンチウイルス・コアを用いた類型形成の新規な方法
RD114 GPの細胞質尾部を修飾しても、レンチウイルス・コアとは異なり、MLVコアへのRD114 GPキメラの組み込みにはほとんど影響がなかった（図4）。これは、GPの組み込みに関してがんレトロウイルス・コアがレンチウイルス・コアよりも許容度が大きいこと、あるいはRD114 GPの持つ不適合性決定基がレンチウイルス・コアに限定されていることを示している。しかし類型化されたMLVベクター粒子の感染力は、RD114 GPキメラの細胞質尾部に導入された開裂部位のタイプによって大きく影響された（図3）。RD114 GPの開裂部位をMLVの開裂部位で置換しても感染力に影響はなかったが、レンチウイルスの開裂部位を挿入すると感染が劇的に低下した。これは、MLV突然変異体がMLVコア粒子に組み込まれたときにそのTMタンパク質の細胞質尾部が十分に処理されていないことと整合性がある（図5A）。これらの結果は、ベクター類型の感染力が低いのは、組み込まれたGPキメラの融合能力が十分に活性化されていないためであることを示唆している。MLV GPでは、開裂部位そのものまたはウイルスのプロテアーゼが突然変異しているために細胞質尾部が開裂しない結果、正常レベルのGPが組み込まれているが感染力のない突然変異体が生成した（33）。
興味深いことに、野生型RD114 GPで類型化したSIVベクターの低い感染力は、その細胞質尾部の開裂部位とレンチウイルス・コアのプロテアーゼが適合しないだけでは説明できなかった。実際、われわれのデータは、MLV-A GPとは異なり、修飾されていないRD114 GPの細胞質尾部だとレンチウイルス・コアと最適の相互作用ができず、このGPの効率的な組み込みが阻止される可能性があることを示唆している（図4）。RD114 GPキメラの特性を調べると、この負の相互作用に関する分子的基礎が得られる。実際、RD114 GPの細胞質尾部を組み込み能力があるMLV-A GPの細胞質尾部で置換すると、ウイルスの組み込みが10倍まで増大した（図4）。これは、RD114 GPの細胞質尾部が、レンチウイルス・コアと適合しない決定基を含んでいることを示している。興味深いことに、適合性は、その細胞質尾部の開裂部位の特異性を変化させることによって回復させることができた。1つの可能性は、そのような変化によって細胞質尾部構造の修飾が誘導された結果、例えばSIVマトリックス・タンパク質との立体的不適合性が低下し、SIVコアとの相互作用が最適化されたのであろうというものである。しかしわれわれのデータは、細胞質尾部の開裂にGPの組み込みが伴っていたという別の可能性も示唆している。RD114 GPの開裂部位を類型化能力のあるMLV-A GP（突然変異体RDPrMLV）またはSIV Gagタンパク質（突然変異体RDPrSIVRQAG）に由来する開裂部位で置換すると、RDPrSIVARLMGP突然変異体を除き、SIVコア粒子への組み込みと、ウイルスの力価の両方が増大した。Cannonらは、最近の関連した研究において、修飾されていないGALV GPがHIV-1コアに組み込まれないことを見いだした（4）。Rペプチドを切断するとともに、GALV CTまたはその開裂部位をMLV-Aに由来する対応する配列で置換すると、GPの組み込みとウイルスの力価の両方が増大した（4）。これは、別のタイプのレトロウイルス糖タンパク質で得られたわれわれのデータと一致する。したがってこれらのデータを合わせると、類型化されたレンチウイルス・ベクターが感染力を持つのは、類型化糖タンパク質のCTがウイルス・コアと適合している結果であり、感染力は、ウイルス・コアのプロテアーゼによるCTの開裂を通じて変化させうることが示唆される。この仮説は細胞質尾部の開裂を直接に評価することによって確認する必要があるとはいえ、われわれは、細胞質尾部の開裂と非許容コアへのGPの組み込みは互いに関係している可能性があると考えている。血漿中を浮遊する膜脂質はレンチウイルスが出芽を開始する場所であることがわかっており（25）、血漿中を浮遊するその膜脂質中にがんレトロウイルス糖タンパク質が局在しているにもかかわらず（29）、開裂していないこれらGPの細胞質尾部はマトリックス・タンパク質のネットワークと適合していない可能性がある。ウイルス・アセンブリー部位の近くにレンチウイルスの活性なプロテアーゼがいくつか存在していることで、これらGPの細胞質尾部の開裂が、その細胞質尾部に含まれる開裂部位との適合性に応じて起こる可能性がある。その結果、Rペプチドが除去され、レンチウイルス・コアへの組み込みを阻止する不適合性決定基が除かれる。次に、切断されたGPは、おそらく受動的な組み込みメカニズムによってレンチウイルス粒子に組み込まれる。
3．ウイルス・ベクター
多種類のウイルスがベクターのベースとなっている。ウイルスを感染させるには、ウイルスのゲノムを宿主細胞に導入する。このゲノムを、ウイルスをベースとしたベクター内の遺伝子デリバリー・ビヒクルとして利用する。使用するウイルスは、細胞にトランスフェクトするのに必要な特徴と能力の多くをすでに有する病原性ウイルス種に由来するものであることがしばしばある。しかしすべてのウイルスがあらゆるタイプの細胞の細胞周期のすべての段階でうまくトランスフェクションを起こさせうるわけではない。したがってウイルス・ベクターを開発する際にウイルスのゲノムを修飾することにより、外来性遺伝子構造体（導入遺伝子）または他の核酸を導入する効果と効率を増大させる。そのとき、そのベクターが疾患を引き起こす能力を小さくする修飾、あるいはなくす修飾を行なう。
レンチウイルスはレトロウイルスの一種であり、分裂していない細胞に感染させることができる。それは、レンチウイルスの統合前複合体が核親和特性を持っているため、導入核孔を通じて活性状態で核の内部に侵入できるからである。それに対応して、ヒト免疫不全ウイルス・タイプ1（HIV-1）に由来するレンチウイルス・ベクターは、非有糸分裂細胞（試験管内の細胞と生体内の細胞の両方）に導入遺伝子を効率的に到達させてその細胞と一体化し、その中で長期発現させることができる（Naldini他、1996年a；Naldini他、1996年b；Blomer他、1997年）。例えばHIVをベースとしたベクターは、サイトカインの刺激なしでヒトCD34+造血細胞を効率的に形質転換することができ（Akkina他、1996年；Sutton他、1998年；Uchida他、1998年；Miyoshi他、1999年；Case他、1999年）、この細胞はNOD/SCIDマウスの体内で長期にわたって生存することができる（Miyoshi他、1999年）。さらに、この一次レシピエントからの骨髄は、二次マウスに形質転換された細胞を再び生着させることができる。これは、非常に原始的な造血前躯体（おそらく間違いなく幹細胞）の遺伝子改変がレンチベクターを介して起こったことの証拠である。現在利用可能な他のどの遺伝子デリバリー系もそのような能力は持っていないため、レンチウイルス・ベクターは、造血現象やそれと類似の現象を研究するための、また、遺伝性または後天性の異常をヒト幹細胞（HCL）の遺伝子改変を通じて遺伝子治療するための、以前には探究されていない基礎を提供する。
この重要な能力は、生体に対する安全性に関する重要な争点となっている（Akkina他、1996年；Sutton他、1998年；Uchida他、1998年）。レンチウイルス・ベクターのストックを製造している間に複製能力を有する組み換え体（RCR）が事故によって生成することのないようにするというのが、ヒトの遺伝子治療でレンチウイルス・ベクターを用いることが選択肢として可能になる前に解決すべき主要な問題の1つである。
レトロウイルスのゲノムでは、必要なすべてのシス作用性エレメントも含む単一のRNA分子が、すべてのコード配列を含んでいる。したがって生体に対するベクター製造系の安全性は、さまざまな要素をコードしている配列をできるだけ多くの独立したユニットに分散させることでRCRを再び作るのに必要なクロスオーバーの数を最大にすることにより、最もよく実現される。レンチベクター粒子は、ビリオン・パッケージング・エレメントとベクターのゲノムを宿主産生細胞（例えば293ヒト胚性腎臓細胞）の中で同時発現させることによって作られる。HIV-1をベースとしたベクターの場合、ビリオンのコアと酵素成分がHIV-1由来であるのに対し、エンベロープ・タンパク質は異種ウイルス（VSVに由来することが最も多い）に由来する。HIVでは、全遺伝子が病原性にとって不可欠な毒性因子をコードしているが、その毒性因子はウイルスの遺伝情報を伝達する上で不可欠ではない。このようにHIVのゲノムが複雑であることが、臨床的に許容可能なベクター系を開発するのに実質的に役立つ。
多数の箇所が欠損したパッケージング系は、一般に、HIV-1の9つの遺伝子のうちの3つだけを含んでいる。すなわち、gag（ビリオンの主要構造タンパク質をコードしている）、pol（レトロウイルス特異的な酵素にとって重要である）、rev（gagとpolの効果的な発現にとって必要な転写後調節因子をコードしている）である（Dull他、1998年）。このように多くの欠損があるパッケージング系から親ウイルスを再構成することはできない。というのも、そのゲノムの約60％が完全に除去されているからである。HIV-1をベースとしたパッケージング系の一例では、Gag/Pol、Rev、VSV G、ベクターが、別々の4つのDNAユニットから産生される。また、ベクターとヘルパー配列の重なりを少なくして数十ヌクレオチドにしてあるため、相同的組み換えが起こる機会が非常に少なくなっている。
HIVタイプ1（HIV-1）をベースとしたベクター粒子は、ビリオン・パッケージング・エレメントとベクターのゲノムとをいわゆる産生細胞（例えば293ヒト胚性腎細胞）の中で同時発現させることによって作ることができる。この細胞には、多数のプラスミドを一時的にトランスフェクトすることができる。一般に3〜4個のプラスミドを使用するが、その数は、レンチウイルスの構成要素をどの程度まで別々のユニットに分解するかに応じ、さらに大きくすることもできる。一般に、1つのプラスミドは、HIV-1に由来するビリオンのコアと酵素成分をコードしている。このプラスミドをパッケージング・プラスミドと名づける。別のプラスミドは、エンベロープ・タンパク質をコードしている。最も一般的なエンベロープ・タンパク質は、安定性が大きくて幅広い親和性を有する水疱性口内炎ウイルスのGタンパク質（VSV G）である。このプラスミドは、エンベロープ発現プラスミドと名づけることができる。さらに別のプラスミドは、標的細胞に移植されるゲノム（すなわちベクターそのもの）をコードしており、トランスファー・ベクターと呼ばれる。力価が1mlにつき数百万形質転換単位（TU/ml）である組み換えウイルスは、この方法、またはその変形法で作ることができる。超遠心分離した後、約109TU/mlに濃縮されたストックが得られる。
ベクターそのものは、標的細胞に移植された遺伝子材料に過ぎない。一般にベクターは、導入遺伝子カセットを含んでおり、それに隣接して、そのカセットのカプセル化、逆転写、核への輸送、核への組み込みに必要なシス作用エレメントがある。標的細胞に移植されるとウイルスの長い末端反復配列（LTR）の転写能力を失わせるという点で“自己不活性化”作用を有するレンチウイルス・ベクターを、がんレトロウイルス・ベクターで以前になされているようにして作った（Zufferey他、1998年）。この修飾により、さらに、複製可能組み換え体（RCR）が出現するリスクを低下させ、プロモータの干渉と関連した問題を回避することができる。
4．類型化ウイルス・ベクター
レトロウイルスに組み込まれるタンパク質は、同種のウイルス糖タンパク質に限られない。宿主細胞に由来する40種類を超えるタンパク質が、HIV-1ウイルス粒子の外側で同定されている。例えば、腫瘍組織適合遺伝子複合体のクラスI（MHC-I）とMHC-IIの分子、接着分子、共刺激分子、相補性制御タンパク質などが挙げられる48。さらに、多数の異種ウイルス糖タンパク質をレトロウイルス粒子に組み込んで感染力を持たせることができる49。類型化として知られるこのプロセスにより、レトロウイルス・ベクターを用いて広い範囲の細胞と組織を形質転換することが可能になる。VSV-G糖タンパク質を用いたレンチウイルス・ベクターの改変は、異種糖タンパク質がベクターの親和性を拡張する能力を有することの具体例である2。しかし所定の糖タンパク質（GP）を異種ウイルス・コアと同時発現させても、必ずしも感染力の大きなウイルス粒子は得られないであろう8、14、15、50。
env遺伝子は、レトロウイルスを含むあらゆるウイルスに由来するものが可能である。レトロウイルス由来のenv遺伝子としては、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMuLVまたはMMLV）、ハーヴェイマウス肉腫ウイルス（HaMuSVまたはHSV）、マウス乳腺癌ウイルス（MuMTVまたはMMTV）、テナガザル白血病ウイルス（GaLVまたはGALV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）などが挙げられる。他のenv遺伝子、例えば水疱性口内炎ウイルス（VSV）のGタンパク質（VSV G）、肝炎ウイルスやインフルエンザ・ウイルスのenv遺伝子も用いることができる。
VSV Gタンパク質は組み換えウイルスに対して広い範囲の宿主を提供するため望ましいenv遺伝子である一方で、宿主細胞（例えばパッケージング細胞）にとって有害になる可能性がある。したがってVSV Gの遺伝子などを使用する場合には、誘導プロモータ系を使用してVSV Gの発現を制御し、VSV Gの発現が必要でないときには宿主への毒性が最少になるようにするとよい。例えばテトラサイクリンで制御するGossenとBujard（1992年）の遺伝子発現系を使用し、テトラサイクリンを移植された細胞から取り除いたときにVSV Gの発現が誘導されるようにすることができる。そこでtet/VP16トランスアクチベータを第1のベクター上に存在させ、VSV Gをコードしている配列を、別のベクター上のtetオペレータ配列によって制御されるプロモータの下流からクローニングする。
ウイルスのenv核酸配列を提供するベクターは、調節配列（例えばプロモータまたはエンハンサー）と機能上関連している。調節配列としては、あらゆる真核生物のプロモータまたはエンハンサーが可能である。例えば、EF1α、PGK、モロニーマウス白血病ウイルスのプロモータ-エンハンサー・エレメント、ヒト・サイトメガロウイルスのエンハンサー、ワクシニアのP7.5プロモータなどが挙げられる（後出の表1と表2に示した具体例も参照のこと）。場合によっては、モロニーマウス白血病ウイルスのプロモータ-エンハンサー・エレメントなどのプロモータ-エンハンサー・エレメントが、LTR配列の中に、あるいはLTR配列に隣接して存在している。調節配列は、ベクターのベースとなるレンチウイルスに内在性のものではないことが好ましい。したがってベクターをSIVから作る場合には、SIVのLTRに見いだされるSIVの調節配列を、SIV由来でない調節エレメントで置換することになろう。
エンベロープ・タンパク質を、特定のタイプの細胞の受容体を標的とするための抗体または特定のリガンドと連結させることにより、組み換えウイルスを標的にすることもできる。（調節配列を含む）興味ある配列と、例えば特定の標的細胞上の受容体に対するリガンドをコードしている別の遺伝子とをウイルス・ベクターに挿入することにより、ベクターは標的特異的になる。レトロウイルス・ベクターは、例えば糖脂質またはタンパク質を挿入することによって標的特異的にすることができる。ターゲティングは、レトロウイルス・ベクターを標的とした抗体の抗原結合部分または組み換え抗体タイプの分子（例えば一本鎖抗体）を用いることによって実現することがしばしばある。
2種類のメカニズムにより、ウイルス粒子上に同種と異種のウイルスまたは細胞の糖タンパク質がアセンブリーされると考えられる。GP組み込みの受動モデルとは、類型化用糖タンパク質とウイルス・コアの強制的ではない相互作用を意味する。ただし、類型化用糖タンパク質がウイルス出芽部位に十分に存在していて51、その細胞質尾部が、ウイルス・アセンブリーまたはビリオンの形態と立体的に適合しない決定基を持っていないこと49が条件である。この点に関し、短い細胞質尾部を有する異種GP（例えばFPV、LCMV、VSVのGP（図2））は、受動的メカニズムを通じてレンチウイルス粒子に組み込まれるようである。他方、GP組み込みの能動モデルでは、類型化用糖タンパク質の細胞質尾部とビリオン・コアの要素の相互作用が、ウイルス粒子をアセンブリーさせる。ウイルスのアセンブリーにおいてこのような相互作用が持つ重要な役割を支持する幅広い証拠（概説が39、49にある）が、少なくともレンチウイルスに関して文献に記載されている52-55。
われわれは、最近の論文において、タイプCとタイプDの哺乳動物レトロウイルスの糖タンパク質を用いたレンチウイルス・コア粒子の類型化にアセンブリーの別の経路が関与することを提案した14。そのレトロウイルスのうちのいくつか（例えばGALVウイルス、RD114ウイルス）のGPは、細胞質尾部にレンチウイルス・コアへの組み込みを制限する決定基を有することがわかった8、14。タイプC/Dの哺乳動物レトロウイルスのGPの比較的短い細胞質尾部（アミノ酸約30〜40個）は、アミノ酸約15〜20個のカルボキシ末端ペプチド（MLVではRと呼ばれる）を含んでおり、糖タンパク質の融合能力を活性化するには同種ウイルス・コアのプロテアーゼによってそのカルボキシ末端ペプチドを開裂させる必要がある56-58。タイプC/Dの同種ウイルス・コアを用いて類型を形成する場合には、ウイルスのプロテアーゼでRペプチドを開裂させないと、類型化されたビリオンの感染力は変化するが、GPの組み込みは影響を受けない14、56、58。逆に、開裂部位がレンチウイルスのプロテアーゼと適合していると、GPの組み込みと、類型化されたレンチウイルス・コア粒子の感染力が影響を受ける14。したがってGPをレンチウイルス・コアに組み込むための可能な方法には、ビリオンのアセンブリー部位においてコアの活性なプロテアーゼによりRペプチドを開裂させることが関係する可能性がある。その結果、類型化を妨げる細胞質尾部決定基が除去される。われわれは、このような観察結果に基づき、GALV8とRD114に由来するキメラGPで類型化した効果的なSIV由来のベクターを作った（図2）。これら突然変異糖タンパク質（それぞれGALV/TR、RD114/TRと呼ぶ（図2））は、MLV-A GPの細胞質尾部を備えており、その開裂部位は、HIV-1およびSIVのプロテアーゼと適合している。GPがレンチウイルス粒子に効率的に組み込まれるのは、この性質があるためらしい。
5．霊長類の血清中におけるレンチウイルス・ベクターの安定性
VSV Gで類型化したレンチウイルス・ベクターは、いくつかのタイプの細胞を生体内と試験管内で形質転換させるのに有効であることが証明されている3-7。しかしヒト24とヒト以外の霊長類の補体に対する感受性が大きい（図4）ため、生体内への全身投与は不可能であろう。VSV-G類型とは異なり、レトロウイルスの糖タンパク質を用いて作ったベクターはヒトとマカクの血清中で安定であり、RD114/TRで類型化したSIVベクターは、ヒト血清に対して常に抵抗性を示した。これは、後者のベクターが全身への遺伝子デリバリーに特に適していることを示唆している（図4）。いくつかの因子が補体に対する感度決定に寄与しており、その因子が依存するのは、i）いろいろな人からの血清；ii）産生細胞のタイプ34、36；iii）糖タンパク質中のα(1-3)ガラクトース糖エピトープの存在；iv）類型化用GPのタイプ34、36、62のいずれかである。ヒト細胞が産生するレトロウイルスは、通常はヒト血清中で抵抗性だが34、36、VSV-Gで類型化したベクターは例外である24。しかし最近のある研究によると、ヒト細胞が産生する、MLV GPでコーティングされたがんレトロウイルス・ベクターは、血清中での補体不活性化に対する感度が、ヒトからの進化距離の増大と相関した形で非ヒト旧世界霊長類とは異なっていることが見いだされた63。マカク血清に対する感受性があるため、99％を超えるベクターが分解した63。ところがわれわれは、レトロウイルスのGPで類型化したレンチウイルス・ベクターはマカク血清中で比較的安定であることを見いだした（図4）のであるから、がんレトロウイルス・ベクターで得られた上記の結果とは明らかに一致しない。血清に対する応答を変化させ、しかもがんレトロウイルス粒子とレンチウイルス粒子の違いを説明できる可能性のある因子は、レンチウイルス粒子へのCD46、CD55、CD59補体抑制分子の組み込みである。これについては、HIVとSIVに関して報告されている48、64。
6．類型化されたSIVベクターを用いた一次細胞の形質転換
VSV-Gで類型化されたレンチウイルス・ベクターの幅広い親和性は、特定の用途での遺伝子導入には適していない可能性がある。それは、細胞のタイプに特異的な遺伝子デリバリーが必要とされるような場合である。より選択的な親和性は、膜で覆われたいくつかのウイルスに由来する糖タンパク質が持つ自然の親和性を利用することによって、あるいは組み込み能力のあるGP（例えばMLV、GALV/TR、FPV-HA）の宿主の範囲を変化させることによって実現できよう65、66。例えば肺感染を引き起こし、気道上皮を通じて感染するウイルス（エボラ・ウイルス、インフルエンザ・ウイルス）に由来する表面糖タンパク質を用いると、ヒト気道の遺伝子治療に有効であることがわかる可能性がある10。しかしレンチウイルス・ベクター類型は、親ウイルスの宿主の範囲と必ずしも同じでない可能性があることに注意せねばならない。例えば向神経性狂犬病ウイルスであるモコラ・ウイルスの糖タンパク質は効率的にHIV-1ベクターを類型化する12とはいえ、類型化されたベクターは親ウイルスの特異的向神経性を再現しない。
最近の報告によれば、RD114 GPで類型化したがんレトロウイルス・ベクターがヒトとイヌのCD34+細胞を効率的に形質転換することが明らかにされた16-18、21。形質転換された細胞は、形質転換されていない細胞と同じように効率的にNOD/SCIDマウスとイヌの体内で生存し、多系列で発現した16-18。これらの研究から、ヒトCD34+細胞では、“遺伝子導入の主要な障害が受容体レベルにあり、標的細胞が不活性であるためではない”18ことが示唆される。われわれは、MLV、GALV/TR、RD114/TRで類型化したレンチウイルス・ベクターを用いてこの仮説を検証することを試みた。以前の研究とは異なり、われわれは、ウイルス／受容体相互作用および／または形質導入に作用する可能性のある因子の影響を最少にすると思われる条件、すなわち繰り返される感染がなく、レトロネクチンまたはストロマ細胞がなく、最小限のサイトカイン処理だけという条件を用いた。そこでヒトCD34+細胞への形質導入を、MLVベクターによるCD34+細胞への形質導入が可能でないようなサイトカイン処理条件下で、ウイルス／細胞への曝露を1回だけ短時間行なうことによって実現した26。このように最適ではない条件であったため、遺伝子導入の最大レベルは比較的低かった。それでもそのレベルから、CD34+細胞への形質導入における類型化用GPの特異的影響を信頼性よく比較することができた。このような条件下における最適な糖タンパク質は、明らかにVSV-G GPとGALV/TR GPであった（図5A）。VSV-Gと比較すると、MLV-A GPおよびRD114/TR GPで類型化したベクターで実現された形質導入のレベルははるかに低かった。この結果は、GPが異なるとCD34+細胞上での受容体の発現パターンが異なることを反映している可能性があり、がんレトロウイルス・ベクターで以前に報告されている結果と矛盾しているように見える18。しかしRD114/TR GPとレトロネクチンを組み合わせて用いるとヒト細胞への形質導入が非常に増大し、RD114/TRで類型化したレンチウイルス・ベクターのほうがVSV-Gで類型化したレンチウイルス・ベクターよりも優れたものになる（図5）ことは、以前の研究と一致している16-18。CH-296レトロネクチン断片が感染を増大させるメカニズムには、CH-296が、α4/5β1インテグリンに付着することを通じて細胞の表面に結合し、高親和性ヘパリンIIドメインを通じてウイルスの糖タンパク質にも結合するという性質を有する42ため、レトロウイルス粒子と標的細胞が同時に局在化すること43が関係している可能性がある。アポトーシスの抑制や細胞分裂の促進といった別の説明が提案されているが67、われわれの結果は、前者のメカニズムを支持している。というのも、レンチウイルス・コア粒子を類型化するのに用いた糖タンパク質のタイプに応じてCH-296の異なるさまざまな効果が検出されたからである。細胞外マトリックス・タンパク質（例えばヘパラン硫酸プロテオグリカン）は、感染の初期ステップにおいて主要な役割を演じており、おそらくウイルス／細胞付着の際にはウイルスの受容体そのものよりも重要である68ため、主として膜の融合を開始させるのに役立つ69、70。細胞外マトリックス・タンパク質への結合にいろいろな影響を与えるモチーフが、エンベロープを有するいくつかのウイルスの糖タンパク質で同定されている71、72。これらモチーフはRD114糖タンパク質において特に効果があり、CH-296を通じた細胞への付着を促進する。
RD114/TRで類型化したSIVベクターは、レトロネクチンの不在下でヒトとマカクのPBLに非常に効率的に形質導入された（図6）。実際、これらの細胞中では、VSV-GまたはMLV-A GPで類型化したベクターとRD114/TR GPでコーティングしたベクターでは、観察された形質導入の効率が大きく異なっていた。この差が生じる理由は、これらGPに対する受容体の発現の違いに存在している可能性がある。あるいはこの結果には、受容体の密度、および／またはウイルス／受容体初期相互作用パラメータの違いが必ずしも関係していない可能性がある。形質導入の効率は、受容体の発現レベルとは相関していない17、73が、結合後のイベント（例えば受容体のクラスター化、膜融合メカニズム、融合部位、非コーティング部位と核からのウイルス粒子の離脱と移動）の重要さを明らかにしている74、75ことが、いくつかの報告に示されている。したがってSIVベクターを用いたPBLへの形質導入に関しては、RD114受容体が、結合後のイベントをVSV-G受容体やMLV-A受容体よりも効果的に調節することが推定できる。
細胞は、最終的な用途が何であるかに応じ、生体内でも試験管内でも形質導入することができる。ヒトの遺伝子治療（例えばヒト幹細胞の遺伝子治療）においてさえ、生体内で幹細胞に形質導入すること、あるいは試験管内で形質導入した後、その形質導入した幹細胞をヒト患者に輸液することができる。この実施態様の1つの特徴によれば、ヒト幹細胞を当業者によく知られている方法を用いてヒト（例えばヒト患者）から取り出し、上記のようにして形質導入することができる。次に、形質導入した幹細胞を同じヒトまたは別のヒトに再び導入する。
ヒト患者にベクターを導入してその患者を直接治療する場合、治療は、一般に、ベクターを静脈内投与することによって行なわれる。細胞（例えばCD34+細胞、樹状細胞、末梢血細胞、腫瘍細胞）に生体外で形質導入するとき、一般に1〜50感染多重度（MOI）のオーダーの用量（105個の細胞につきウイルス・ベクターが1×105〜50×105形質導入単位であることにも対応）を用いてベクター粒子を細胞とともにインキュベートする。もちろんこの中には、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50MOIに対応する量のベクターが含まれる。一般に、ベクターの量は、Hela形質転換単位（TU）で表わすことができる。ベクターを投与する別の経路としては、動脈内、内視鏡経由、病変内、経皮、皮下、筋肉内、硬膜下腔内、眼窩内、皮膚内、腹腔内、気管経由、表皮下、幹細胞内注射、吸入または鼻腔内スプレー、気管内経路などが挙げられる。本発明のベクターを用いた腫瘍／がんの治療に関する実施態様では、発現ベクターを腫瘍または腫瘍の血管に直接注入することによって標的に到達させることができる。
7．宿主細胞
この明細書では、“細胞”、“細胞系”、“細胞培養物”という用語は、同じ意味で用いることができる。これらのどの用語にも、その子孫が含まれる。子孫とは、その後の世代すべてを意味する。意図的または非意図的な突然変異があるため、すべての子孫が同じとは限らないことがわかる。異種核酸配列の発現という文脈では、“宿主細胞”は、原核細胞または真核細胞を意味し、その中には、形質転換が可能で、ベクターの複製、および／または本発明のベクターによってコードされている異種核酸の発現が可能なあらゆる生物が含まれる。宿主細胞は、ベクターのレシピエントとして用いることができ、実際にレシピエントとして用いられてきた。宿主細胞は、“トランスフェクト”または“形質転換”することができる。これは、外来性核酸を宿主細胞に移植または導入するプロセスを意味する。形質転換された細胞としては、一次対象細胞やその子孫が挙げられる。この明細書では、“操作した”細胞または宿主細胞、“組み換えた”細胞または宿主細胞という用語は、外来性核酸配列（例えば治療用遺伝子構造体を有する本発明のレンチベクター）を導入された細胞を意味する。したがって組み換え細胞は、組み換えによって導入された核酸を含まない自然に発生する細胞から区別することができる。
いくつかの実施態様では、RNA配列またはタンパク質配列を、選択した他のRNA配列またはタンパク質配列と同時に同じ宿主細胞の中で発現させることを考える。同時発現は、宿主細胞に2つ以上の異なる組み換えベクターを同時にトランスフェクトすることによって実現できる。別の方法として、RNAの多数の異なるコード領域が含まれるようにした単一の組み換えベクターを構成した後、その単一のベクターをトランスフェクトした宿主細胞の中で、そのRNAを発現させることもできる。
宿主細胞は、望む結果がベクターの複製であるか、ベクターによってコードされている核酸配列の一部または全部の発現であるかに応じ、原核生物または真核生物に由来するものが可能である。多数の細胞系と細胞培養物を宿主細胞として利用できる。それは、生きた培養物と遺伝子材料のアーカイブとして機能する組織であるアメリカ基準培養物コレクション（ATCC）から入手できる。本発明で使用する宿主細胞の具体例として、ウイルス・パッケージング細胞、ウイルス産生細胞、293T細胞、ヒト造血前駆細胞、ヒト造血幹細胞、CD34+細胞、CD4+細胞などが挙げられる。
A．組織と細胞
当業者であれば、本発明が特定の1つのタイプの細胞に限定されることはなく、導入遺伝子を発現させるために本発明のレンチウイルス・ベクターと本発明の方法を多くのタイプの細胞で使用できることが理解できよう。考えられる細胞のタイプの具体例として、ニューロン、肺細胞、筋細胞、肝細胞、膵臓細胞、内皮細胞、心筋細胞、皮膚細胞、骨髄ストロマ細胞、耳細胞、目細胞など、最終分化した細胞が挙げられる。さらに、幹細胞や前駆細胞（例えば膵臓管細胞、神経前躯体、中胚葉幹細胞）も考えられる。しかし注目すべきことに、本発明のより好ましいレンチベクターは、ヒト前駆細胞の中で導入遺伝子の発現レベルが高い一方、ヒトの身体に対する安全性の条件に合致しているという非常に望ましい特徴を持っている。
ウイルス粒子を作る際には、レンチウイルスのGag遺伝子およびPol遺伝子の発現と適合性のある任意の細胞、またはそのような発現を支援するように操作された任意の細胞を用いることができる。例えば293T細胞、TE671細胞、HT1080細胞などの産生細胞を使用することができる。
すでに述べたように、本発明のレンチベクターが特に役に立つのは、骨髄、末梢血、臍帯血のいずれかから得られたヒト造血前駆細胞または造血幹細胞の形質導入と、CD4+T細胞、末梢血のBリンパ細胞またはTリンパ細胞、末梢血の単核細胞、樹状細胞、単球細胞の形質導入においてであろう。特に好ましい標的はCD34+細胞である。
組織は、核酸デリバリー組成物および／または追加薬剤を用いて形質転換する1つまたは複数の宿主細胞を含むことができる。組織は、1個の生物の一部、すなわち1個の生物からのものが可能である。いくつかの実施態様では、組織ならびにその組織を構成している細胞として、血液（例えば造血細胞（ヒト造血前躯細胞、ヒト造血幹細胞、CD34+細胞、CD4+細胞など））、リンパ球やそれ以外の血液系細胞）、骨髄、脳、幹細胞、血管、肝臓、肺、骨、乳房、軟骨、首、大腸、角膜、胚、子宮内膜、内皮、上皮、食道、顔面、線維芽細胞、小胞、神経節細胞、グリア細胞、杯細胞、腎臓、リンパ節、筋肉、ニューロン、卵巣、膵臓、末梢血、前立腺、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣などが挙げられる。
B．生物
いくつかの実施態様では、宿主の細胞または組織が少なくとも1つの生物に含まれていてよい。いくつかの実施態様では、その生物として、ヒト、霊長類、ネズミ類のいずれかが可能である。別の実施態様では、当業者であればわかるように、その生物として任意の真核生物が可能であり、原核生物（例えば、真正細菌、古細菌）さえ可能である。本発明によるいくつかのレンチベクターは制御配列を含むことができるため、そのレンチベクターを原核細胞と真核細胞の両方において複製すること、および／または発現させることができる。当業者であればさらに、上記のあらゆる宿主細胞をインキュベートして維持し、ベクターを複製できるようにする条件がどのようなものであるかが理解できよう。本発明のレンチベクターを大規模に製造する方法と条件は公知であり、そのレンチベクターによってコードされている核酸、そのコグネイト・ポリペプチド、タンパク質、ペプチドを製造する方法と条件も公知である。こうやって製造されたもののうちのいくつかは、遺伝子治療に用いられることになる治療用の遺伝子またはタンパク質である。
C．注入可能な組成物と医薬製剤
本発明のレンチウイルス・ベクター組成物を用いて遺伝子治療を実現するためには、一般に、その治療を必要としている細胞を、治療用遺伝子を含むレンチウイルス・ベクターと接触させることになろう。その細胞は、その後、遺伝子治療を必要としているヒトなどの生物に入れられることになる。投与経路は、当然のことながら、疾患の場所と性質に応じてさまざまになろう。例えば、静脈内、動脈内、皮膚内、経皮、筋肉内、鼻腔内、皮下、気管内、腹腔内、腫瘍内、灌流、洗浄などの経路がある。細胞を生物から単離して生体外でレンチベクターに曝露し、あとで再び移植することも時に行なわれる。
本発明によるレンチウイルス核酸構造体の注入は、発現構造体が注射に必要な特定のゲージの針を通過できさえすれば、注射器で、あるいは溶液を注入するのに使用される他の任意の方法で行なうことができる。溶液を入れたアンプルのチェンバーを区画するノズルと、その溶液をノズルから到達部位へと押し出すエネルギー装置を備えた新規な針なし注射システムが最近報告されている（アメリカ合衆国特許第5,846,233号）。所定量の溶液をどの深さであれ厳密にその深さまで多数回注入することのできる注射システムを利用して遺伝子治療することも報告されている（アメリカ合衆国特許第5,846,225号）。
遊離塩基または生理学的に許容可能な塩としての核酸溶液は、界面活性剤（例えばヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水の中で調製することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、これらの混合物、油の中で調製することもできる。保管および使用する際の通常の条件下では、このような調製物は、微生物の増殖を阻止する保存剤を含んでいる。注射に適した医薬形態としては、減菌水溶液または減菌分散液や、注射可能な減菌水溶液または減菌分散液をその場で調製するための減菌粉末などが挙げられる（アメリカ合衆国特許第5,466,468号）。調製物は、いずれの場合にも、減菌形態になっている必要があり、容易に注射できるようにするために液体になっている必要がある。調製物は、製造条件と保管条件のもとで安定でなければならず、微生物（例えば細菌や真菌）の汚染作用に打ち勝って保存できなくてはならない。基剤としては、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、および／または植物油を含む溶媒または分散媒体が可能である。適切な流動性を維持するため、例えばコーティング（例えばレシチン）を利用すること、必要とされる粒子サイズを維持すること（分散液の場合）、界面活性剤を利用することができる。微生物の作用を阻止するには、さまざまな抗菌剤や抗真菌剤（例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）を使用するとよい。多くの場合に等張剤（例えば糖、塩化ナトリウム）を含めることが好ましかろう。注射可能な組成物の吸収時間を延ばすには、吸収遅延剤（例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン）の組成物を用いるとよい。
例えば水性溶液として非経口投与するためには、その溶液を必要に応じて適度に緩衝させ、その希釈された液体をまず最初に十分な生理食塩水またはグルコースを用いて等張にする必要がある。この特別な水溶液は、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、腹腔内に投与するのに特に適している。その関連で、使用可能な減菌水性媒体が何であるかは、当業者であればこの明細書の記述からわかるであろう。例えば1回の用量を等張NaCl溶液1mlに溶かし、皮下注入液体1000mlに添加するか、あるいは予定されている輸液部位に注入するとよい（例えば『レミントンの医薬科学』、第15版、1035−1038ページと1570−1580ページを参照のこと）。治療する患者の状態に応じて用量を変更せねばならないことがある。いかなる場合にも、投与に責任を持つ人が、個々の患者にとって適切な用量を決定する。さらに、ヒトに投与する場合には、調製物は、FDAの生物製剤基準局が要請する減菌、発熱性、一般的な安全性、純度の基準に合致している必要がある。
減菌注射溶液は、必要量の活性化合物と、必要に応じて上記の他のさまざまな成分とを適切な溶媒に組み込んだ後、濾過殺菌することによって調製する。一般に、分散液は、さまざまな減菌活性成分を、基本的な分散媒体とそれ以外に必要な上記のさまざまな成分を含む減菌ビヒクルに組み込むことによって調製する。減菌注射溶液を調製するための減菌粉末の場合には、好ましい調製方法は真空乾燥法と凍結乾燥法であり、これらの方法により、あらかじめ濾過殺菌した溶液から、活性成分と望む任意の追加成分で構成された粉末が得られる。
この明細書に開示した組成物は、中性形態または塩形態の製剤にすることができる。薬理学的に許容可能な塩として、酸添加塩が挙げられる。酸添加塩は、無機酸（例えば塩酸、リン酸）や有機酸（例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸）などを用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩は、無機塩基（例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄）、有機塩基（例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン）などから得ることができる。製剤化された溶液は、その製剤に適したやり方で、治療に有効な量だけ投与する。製剤は、さまざまな形態（例えば注射溶液、薬剤放出カプセルなど）で簡単に投与することができる。
この明細書では、“基剤”という用語に、溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、緩衝液、基剤溶液、懸濁液、コロイドなどがすべて含まれる。薬理学的に活性な物質のためのこのような媒体および試薬の使用法は、従来技術において公知である。このような媒体および試薬は、活性成分と適合しない場合を除き、治療用組成物での使用が考えられる。追加の活性成分も組成物の中に組み込むことができる。
“医薬として許容可能”または“薬理学的に許容可能”という表現は、ヒトに投与したときにアレルギー反応やそれと同様の好ましくない反応を引き起こさない分子や組成物を意味する。活性成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製物は、従来技術においてよく知られている。一般に、このような組成物は、注射が可能なように溶液または懸濁液として調製する。注射前に溶液または懸濁液にするのに適した固体形態も調製することができる。
この明細書では、“接触した”、“曝露した”という用語は、細胞について用いる場合には、治療用レンチウイルス・ベクターを標的細胞に到達させる方法を記述するのに用いる。
離散していてアクセスが可能な固形腫瘍の場合には、腫瘍内注入、または腫瘍の血管系への注入が特に考えられる。局所的投与、領域内投与、全身投与も適切である可能性がある。4cmよりも大きい腫瘍の場合には、投与量は約4〜10mlである（10mlが好ましい）のに対し、4cmよりも小さい腫瘍の場合には、投与量は約1〜3ml（3mlが好ましい）にする。単位用量を多数回の注射で供給する場合には、1回の量は約0.1〜約0.5mlである。ウイルス粒子は、約1cmの間隔で多数回の注射を行なって腫瘍に接触させることが望ましい。全身投与は、悪性血液疾患などの疾患の場合に好ましい。
場合によっては連続投与することもできる。注射器またはカテーテルを通じたデリバリーが好ましい。このような連続的灌流は、治療の開始後、約1〜2時間、約2〜6時間、約6〜12時間、約12〜24時間、約1〜2日、約1〜2週間、あるいはそれ以上の期間にわたって実施することが可能である。一般に、連続的灌流による治療用組成物の用量は、1回の注射または複数回の注射で投与される量に等しく、その量を、灌流を行なう期間全体で調節する。
治療法もいろいろな方法が可能であるが、疾患のタイプや疾患組織の場所のほか、患者の健康状態や年齢などの因子によって決まることがしばしばある。本発明のレンチウイルス・ベクターをベースとした治療製剤の効果と毒性（もし存在するのであれば）に基づいてそのような決断を下すのは、医師が最適であろう。
治療には、さまざまな“単位用量”が用いられる。単位用量は、本発明のレンチウイルス・ベクターを含む治療用組成物が所定量含まれていること、と定義される。投与量と、具体的な経路および製剤形態は、臨床の当業者には公知である。単位用量は、1回の注射で投与する必要はなく、所定の期間にわたって連続的に輸液してもよい。本発明の単位用量は、便宜上、HaLa細胞系または293細胞系に対してベクターが及ぼす効果によって決まるレンチベクターの形質導入単位（TU）で表現する。単位用量は、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013TU、あるいはそれ以上の範囲になる。
8．核酸
A．導入遺伝子と疾患の治療
本発明の一実施態様は、治療用遺伝子をコードしている核酸、中でも造血異常またはリンパ造血異常（例えばすでに記載した先天性または後天性の疾患）を治療するための遺伝子をコードしている核酸を導入するというものである。一実施態様では、核酸が、そのような遺伝子の全長、あるいは実質的に全長、あるいは機能的な等価物をコードしている。このような遺伝子は、導入遺伝子として知られている。
用途に応じ、本発明のレンチベクターを利用して望むあらゆる導入遺伝子を標的に到達させることができると考えられる。造血前駆細胞に到達させる場合には、一般に、その細胞に望む機能を付与することになる導入遺伝子を選択することになろう。具体的には、グロビン遺伝子、造血増殖因子（例えばエリスロポエチン（EPO）、インターロイキン類（特にインターロイキン-1（IL-1）、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-3（IL-3）、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン-12（IL-12）など）、コロニー刺激因子（顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージ・コロニー刺激因子、幹細胞コロニー刺激因子））、血小板特異的インテグリンαIIbβ、多剤抵抗遺伝子、慢性肉芽腫症（CGD）の患者に欠損しているgp91またはgp47、ヒト後天性免疫不全ウイルスなどの病原体の感染に対して細胞に抵抗力を持たせる抗ウイルス遺伝子、血友病患者で突然変異している血液凝固VIII因子やIX因子をコードしている遺伝子、T細胞を通じた免疫応答に関与するリガンド（例えばT細胞抗原受容体やB細胞抗原受容体（免疫グロブリン）、インターロイキン受容体の共通γ鎖のほか、T細胞抗原受容体とB細胞抗原受容体を単独で、または組み合わせて、ScFvなどの一本鎖抗体、腫瘍壊死因子（TNF）、IL-2、IL-12、インターフェロンγ、CTLA4、B7などと組み合わせたもの）、腫瘍細胞で発現している遺伝子（例えばMelana、MAGE遺伝子（例えばMAGE-1、MAGE-3）、P198、P1A、gp100など）が挙げられる。
本発明の主な用途は、多数あるいろいろな理由で望む導入遺伝子を造血細胞に到達させるベクターを供給することであろう。理由としては、化学療法または免疫抑制療法や、エイズ感染、遺伝子の異常、がんなどの結果として起こる可能性のある骨髄抑制や好中球減少症の治療などが挙げられるが、もちろんそれだけに限られるわけではない。
考えられる造血細胞の遺伝子異常の具体例としては、鎌状赤血球貧血、サラセミア、ヘマグロビノパシー、グランツマン血小板無力症、リソソーム貯蔵疾患（例えばファブリー病、ゴーシェ病、ニーマン-ピック病、ヴィスコット-オールドリッチ症候群）、重症複合型免疫不全症候群（SCID）のほか、分泌タンパク質（例えば血液凝固VIII因子／IX因子）の産生が全身で欠乏している結果として起こる疾患が挙げられる。そのような場合、導入遺伝子を導入することが望ましかろう。導入遺伝子としては、例えば、グロビン遺伝子、造血増殖因子（例えばエリスロポエチン（EPO）、インターロイキン類（中でもインターロイキン-1、インターロイキン-2、インターロイキン-3、インターロイキン-6、インターロイキン-12など）、コロニー刺激因子（顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージ・コロニー刺激因子、幹細胞コロニー刺激因子））、血小板特異的インテグリンαIIbβ、多剤抵抗遺伝子、慢性肉芽腫症（CGD）の患者に欠損しているgp91またはgp47、ヒト後天性免疫不全ウイルスなどの病原体の感染に対して細胞に抵抗力を持たせる抗ウイルス遺伝子、血友病患者で突然変異している血液凝固VIII因子やIX因子をコードしている遺伝子、T細胞を通じた免疫応答に関与するリガンド（例えばT細胞抗原受容体やB細胞抗原受容体（免疫グロブリン）、インターロイキン受容体の共通γ鎖のほか、T細胞抗原受容体とB細胞抗原受容体を単独で、または組み合わせて、一本鎖抗体（ScFv）、IL-2、IL-12、TNF、インターフェロンγ、CTLA4、B7などと組み合わせたもの）、腫瘍細胞で発現している遺伝子（例えばMelana、MAGE遺伝子（例えばMAGE-1、MAGE-3）、P198、P1A、gp100など）が挙げられる。
がんの具体例としては、造血が原因であるもの、例えば骨髄様細胞系、リンパ様細胞系、赤血球細胞系、またはその前駆細胞が原因であるものが挙げられる。骨髄様細胞性疾患の具体例としては、急性前骨髄球性白血病（APML）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病（CML）などが挙げられる。本発明のレンチベクターを用いて治療できる可能性のあるリンパ様細胞性悪性疾患としては、急性リンパ芽球性白血病（ALL）（その中には、B細胞系ALLとT細胞系ALLが含まれる）、慢性リンパ性白血病（CLL）、前リンパ性白血病（PLL）、ヘアリー・セル白血病（HLL）、ヴァルデンストレーム・マクログロブリン血症（WM）などが挙げられる。本発明のレンチベクターを用いて治療できる候補として考えられる別の悪性リンパ腫として、非ホジキンリンパ腫とその変種、末梢T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病／リンパ腫（ATL）、皮膚T細胞リンパ腫（CTCL）、大型顆粒リンパ性白血病（LGF）、ホジキン病などが挙げられる。
したがって本発明のいくつかの実施態様では、造血異常またはリンパ造血異常を治療するため、治療用核酸発現構造体を含む本発明のレンチウイルス・ベクターを、造血が原因で異常になっている細胞に投与する。治療用核酸発現構造体を含む本発明のレンチウイルス・ベクターを用いて造血異常またはリンパ造血異常を治療するための薬を製造する方法も本発明に含まれる。造血細胞がこの構造体を取り込み、核酸によってコードされている治療用ポリペプチドを発現することにより、細胞の正常な表現型が回復すると考えられる。
核酸は、当業者に知られている任意の方法で作ることができる。合成核酸（中でも合成オリゴヌクレオチド）の具体例として、ホスホトリエステル、ホスホン酸エステル、ホスホロアミダイトのいずれかと、ヨーロッパ特許第266,032号に記載されている固相法を利用して試験管内で化学合成された核酸、あるいはFroehler他、1986年とアメリカ合衆国特許第5,705,629号に記載されているデオキシヌクレオシドHホスホン酸中間体を通じて試験管内で化学合成された核酸などが挙げられる。酵素によって作られた核酸の具体例としては、PCR（登録商標）（例えばアメリカ合衆国特許第4,683,202号、第4,682,195号を参照のこと）などの増幅反応において、あるいはアメリカ合衆国特許第5,645,897号に記載されているオリゴヌクレオチドの合成において、酵素によって作られた核酸などが挙げられる。生物によって作られた核酸の具体例としては、生きた細胞の内部における組み換え核酸の産生などが挙げられる（例えばSambrook他、2000年を参照のこと）。
核酸は、ポリアクリルアミド・ゲル上で、あるいは塩化セシウム遠心分離勾配により、あるいは当業者に知られている他の任意の手段を用いて精製することができる（例えばSambrook他、2000年を参照のこと）。
“核酸”という用語は、一般に、DNA、あるいはRNA、あるいはその誘導体またはミミックの少なくとも1つの分子または鎖で、少なくとも1つの核酸塩基（例えばDNAの中に見いだされる自然発生のプリン塩基またはピリミジン塩基（例えばアデニン“A”、グアニン“G”、チミン“T”、シトシン“C”）またはRNAの中に見いだされる自然発生のプリン塩基またはピリミジン塩基（例えばA、G、ウラシル“U”、C））を含むものを意味する。“核酸”という用語には、“オリゴヌクレオチド”と“ポリヌクレオチド”が含まれる。“オリゴヌクレオチド”という用語は、核酸塩基約3〜約100個の長さを持つ少なくとも1つの分子を意味する。“ポリヌクレオチド”という用語は、核酸塩基が約100個を超える長さの少なくとも1つの分子を意味する。これらの定義は、一般に、少なくとも1つの一本鎖分子を意味するが、特別な実施態様には、少なくとも1つの一本鎖分子と部分的に、あるいは実質的に、あるいは完全に相補的な追加の少なくとも1つの鎖も含まれる。したがって核酸には、少なくとも1つの二本鎖分子または少なくとも1つの三本鎖分子であって、その分子の1本の鎖を含む特定の配列と相補的な鎖、すなわち“相補体”を少なくとも1つ含むものが含まれていてよい。
いくつかの実施態様では、“遺伝子”は、転写される核酸を意味する。この明細書では、“遺伝子セグメント”は、1つの遺伝子の核酸セグメントである。いくつかの特徴によれば、遺伝子には、転写や、メッセージの生成または組成に関わる調節配列が含まれる。特別な実施態様では、遺伝子は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドのいずれかをコードしていて転写されることになる配列を含んでいる。別の特徴によれば、遺伝子は、核酸を含んでいる、および／または、造血異常とリンパ造血異常において欠陥または突然変異がある遺伝子のペプチドまたはポリペプチドをコードしているコード配列をコードしている。この明細書に記載されている用語を続けると、“単離された遺伝子”には、転写された核酸、調節配列、コード配列などが、他の同様の配列（例えば自然に発生する遺伝子、調節配列、ポリペプチド・コード配列、ペプチド・コード配列など）から実質的に単離されたものが含まれる。この点に関し、“遺伝子”という用語は、単純に、転写されたヌクレオチド配列を含む核酸とその相補体を指すのに用いる。特別な側面として、転写されたヌクレオチド配列は、少なくとも1つの機能的タンパク質、および／またはポリペプチド、および／またはペプチドをコードしているユニットを含んでいる。当業者であればわかるように、この便利な“遺伝子”という用語には、ゲノム配列、RNAまたはcDNAの配列、操作されてより小さくなった核酸セグメント（例えば遺伝子の転写されない部分の核酸セグメント（例えば遺伝子のうちで転写されないプロモータ領域またはエンハンサー領域））が含まれる。操作されてより小さくなった核酸セグメントは、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質、突然変異体などを発現すること、あるいはそれらが発現するように核酸操作技術を利用して改変することができる。例えば“切断された遺伝子”は、連続した核酸残基が欠けている核酸配列を意味する。
個々の核酸配列に基づいてさまざまな核酸セグメントを設計することができる。核酸セグメントの長さは任意である。1つの配列に数値（例えば第1の残基に1、第2の残基に2など）を割り当てることにより、すべての核酸セグメントを規定するアルゴリズムを作り出すことができる：
n〜n+y
ここにnは1から配列の最後の数までの範囲の整数であり、yは核酸セグメントの長さから1を引いた値であり、n+yは配列の最後の数を超えない。したがって10量体では、核酸セグメントが塩基1〜10、2〜11、3〜12などに対応する。15量体では、核酸セグメントが塩基1〜15、2〜16、3〜17などに対応する。20量体では、核酸セグメントが塩基1〜20、2〜21、3〜22などに対応する。
本発明の核酸は、配列そのものの長さに関係なく他の核酸配列（例えばプロモータ、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、制限酵素部位、多重クローニング部位、コード・セグメントなど）と組み合わせ、1つ以上の核酸構造体を作り出すことができる。全長は、核酸構造体ごとに大きく異なる可能性がある。したがってほぼ任意の長さの核酸セグメントを使用することができる。ただし全長は、調製の容易さ、あるいは予定している組み換え核酸プロトコルでの使いやすさによって制限されることが好ましい。
“ベクター”という用語は、担体となる核酸分子を意味する。その核酸分子の中には細胞に導入するための核酸配列を挿入し、その細胞内でその核酸配列を複製させることができる。本発明のベクターは、この明細書の前後に述べてあるように、レンチウイルスをベースとしている。本発明のベクターによって運ばれる核酸分子は、治療用遺伝子をコードしており、遺伝子治療を行なうのに使用されることになる。当業者であれば、そのような治療用ベクターを標準的な組み換え技術を利用して構成する能力を備えているであろう（例えばManiatis他、1988年とAusbel他、1994年を参照のこと）。
“発現ベクター”という用語は、転写可能なRNAをコードしている核酸を含むあらゆるタイプの遺伝子構造体を意味する。ある場合は、RNA分子がその後翻訳されてタンパク質、ポリペプチド、ペプチドになる。別の場合には、例えばアンチセンス分子やリボザイムが産生されるときにその配列が翻訳されない。発現ベクターは、さまざまな“制御配列”を含むことができる。制御配列とは、特定の宿主細胞内で機能上関連したコード配列を転写するのに必要で、おそらくは翻訳するのにも必要な核酸配列のことを意味する。ベクターと発現ベクターは、転写と翻訳を支配している制御配列に加え、他の機能に関わる核酸配列も含むことができる。それについては後で説明する。
B．多重クローニング部位
本発明のベクターには、多重クローニング部位（MCS）が含まれる。MCSは多重制限酵素部位を含む核酸領域であり、そのうちの任意の制限酵素部位を標準的な組み換え技術と組み合わせることによってベクターを消化する（例えばCarbonelli他、1999年、Levenson他、1998年、Cocea他、1997年を参照のこと）。“制限酵素消化”は、核酸分子の特定の位置だけで機能する酵素を用いて核酸分子を触媒的に開裂させることを意味する。このような制限酵素の多くは市販されている。このような制限酵素を使用することは、当業者に広く知られている。MCS内で切断を行なう制限酵素を用いてベクターを直線化または断片化し、外来性配列がそのベクターに連結できるようにすることがしばしば行なわれる。“連結”は、2つの核酸断片間にホスホジエステル結合を形成するプロセスを意味する。その核酸断片は、互いに連続していてもいなくてもよい。制限酵素と連結反応を含む方法は、組み換え技術の当業者には周知である。
C．スプライシング部位
転写されたほとんどの真核生物RNA分子は、RNAのスプライシングを受けて一次転写産物からイントロンが除去される。真核生物のゲノム配列を含むベクターは、タンパク質を発現させる転写産物の適切なプロセシングを保証するドナーおよび／またはアクセプター・スプライシング部位を必要とする可能性がある（例えばChandler他、1997年を参照のこと）。
D．終結シグナル
本発明のベクターまたは構造体は、一般に、少なくとも1つの終結シグナルを含んでいる。“終結シグナル”または“ターミネータ”は、RNAポリメラーゼによるRNA転写産物を具体的に終結させることに関与するDNA配列からなる。したがっていくつかの実施態様では、RNA転写産物の産生を終わらせる終結シグナルが考えられる。望むメッセージ・レベルを実現するのに生体内にターミネータが必要とされる可能性がある。
真核生物系では、ターミネータ領域は、新しい転写産物の部位特異的な開裂を起こさせてポリアデニル化部位を露出させることのできる特別なDNA配列も含んでいてよい。この配列によってシグナルが特別な内在性ポリメラーゼに伝えられ、約200個のA残基（ポリA）が転写産物の3'末端に付加される。このポリA尾部による修飾を受けたRNA分子は、より安定で、より効率的に翻訳されるように見える。したがって真核生物に関する別の実施態様では、ターミネータがRNAを開裂させるためのシグナルを含んでいることが好ましく、ターミネータ・シグナルがメッセージのポリアデニル化を促進することがより好ましい。ターミネータおよび／またはポリアデニル化部位のエレメントは、メッセージのレベルを増大させ、カセットが読み過ごされて他の配列になるのを最少にするのに役立つ。
本発明で利用することが考えられるターミネータとしては、この明細書に記載した公知のあらゆる転写ターミネータ、あるいは当業者に知られているあらゆる転写ターミネータが挙げられる。それは例えば、遺伝子の終結配列（例えばウシ成長ホルモン・ターミネータ）や、ウイルス終結配列（例えばSV40ターミネータ）などである。いくつかの実施態様では、配列が切断されるなどが原因で、転写可能な配列または翻訳可能な配列が終結シグナルに欠けている可能性がある。
E．ポリアデニル化シグナル
真核生物の遺伝子発現では、転写産物を適切にポリアデニル化するためのポリアデニル化シグナルが一般に用いられる。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明を成功させるのに不可欠であるとは考えられず、同様の任意の配列を用いることができる。いくつかの実施態様には、便利でさまざまな標的細胞の中でうまく機能することが知られているSV40ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモン・ポリアデニル化シグナルが含まれる。ポリアデニル化により、転写産物の安定性が増大する可能性、あるいは細胞質における輸送が容易になる可能性がある。
F．複製起点
本発明のベクターを宿主細胞内で伝播させるため、そのベクターは、複製が開始される特別な核酸配列である複製起点部位（“オリ”と呼ばれることがしばしばある）を1つ以上含んでいるとよい。あるいは宿主細胞が酵母の場合には、自律複製配列（ARS）を用いることもできる。
G．選択マーカー、スクリーニング・マーカー
本発明のいくつかの実施態様では、本発明のレンチベクターを用いて形質導入された細胞は、発現ベクター内にマーカーを含めることによって試験管内または生体内で同定することができる。このようなマーカーは、形質導入された細胞に同定可能な変化を与えるため、その発現ベクターを含む細胞を容易に同定できるようになろう。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする性質を与えるマーカーである。正の選択マーカーは、そのマーカーが存在することによってそのマーカーを選択できるようにするマーカーであるのに対し、負の選択マーカーは、そのマーカーが存在することによってそのマーカーの選択が阻止されるマーカーである。正の選択マーカーの一例は、薬剤耐性マーカーである。
通常は、薬剤選択マーカーを含めることで形質転換体のクローニングと同定が容易になる。例えばネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシン、ヒスチジノールに対する抵抗性を与える遺伝子構造体が、選択マーカーとして役に立つ。形質転換体を実際の諸条件に基づいて識別できるようにする表現型を与えるマーカーに加え、スクリーニングを可能にする他のタイプのマーカー（例えば比色分析に基づくGFP）も考慮することができる。別の方法として、スクリーニング用酵素（例えば単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（tk）やクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT））を用いることもできる。当業者であれば、免疫マーカーの使用法も知っており、おそらくFACS分析と組み合わせるやり方も知っているであろう。使用するマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現することができるのであれば、どのマーカーを使用するかは重要でないと考えられる。選択とスクリーニングを可能にするマーカーのさらに別の具体例は、当業者には周知である。
9．プロモータとエンハンサー
“プロモータ”は、核酸配列のうちで転写開始と転写速度を制御する領域となっている制御配列である。プロモータは、調節タンパク質と調節分子が結合して核酸配列の特異的な転写を開始させる遺伝子エレメント（例えばRNAポリメラーゼや他の転写因子）を含むことができる。“機能する位置にある”、“機能上関連した”、“制御下”、“転写制御下”といった表現は、核酸配列に対してプロモータが正しく機能する位置および／または向きにあって、その配列の転写開始および／または発現を制御していることを意味する。
プロモータは、一般に、RNA合成開始部位の位置を決める配列を含んでいる。最もよく知られたプロモータは、TATAボックスであるが、TATAボックスのないいくつかのプロモータ（例えば哺乳動物のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモータや、SV40後期遺伝子のプロモータ）では、開始部位そのものと重なっている離散エレメントが開始位置を固定するのに役立つ。別のプロモータ・エレメントは、転写開始の頻度を調節する。一般に、プロモータ・エレメントは、開始部位の上流30〜110bpの領域に位置するが、多数のプロモータが開始部位の下流に機能エレメントを含んでいることがわかっている。コード配列をプロモータの“制御下”に置くため、転写リーディング・フレームの転写開始部位の5'末端を、選択したプロモータの（3'末端の）“下流”に位置させる。“上流”のプロモータは、DNAの転写を刺激し、コードされたRNAの発現を促進する。
プロモータのエレメント相互間の距離は自由であることがしばしばあるため、エレメントが逆転したり、互いの位置が動いたりしてもプロモータの機能は保存される。tkプロモータでは、プロモータのエレメント相互間の距離を50bpまで離したとき、活性が低下し始める。プロモータごとに、転写を活性化するのに個々のエレメントが共同で機能するか独立に機能するかが決まっているようである。プロモータは、“エンハンサー”と組み合わせて使用してもしなくてもよい。なお“エンハンサー”とは、核酸配列中で転写の活性化に関するシス作用調節配列を意味する。
プロモータは、核酸配列に自然に付随するものが可能であり、コード・セグメントおよび／またはエキソンの上流に位置する5'非翻訳配列を単離することによって得ることができる。このようなプロモータは、“内在性”と呼ぶことができる。同様に、エンハンサーは、核酸配列に自然に付随するものが可能であり、その配列の下流または上流に位置する。別の方法として、コード核酸セグメントの制御を、自然環境では核酸配列に通常は付随しないプロモータである組み換えプロモータによって、あるいは異種プロモータによって行なうことにより、いくつかの利点が生まれるであろう。組み換えエンハンサーも異種エンハンサーも、自然環境では核酸配列に通常は付随しないエンハンサーである。このようなプロモータまたはエンハンサーとしては、他の遺伝子のプロモータまたはエンハンサー、他のウイルス、原核細胞、真核細胞から単離されたプロモータまたはエンハンサー、“自然には発生しない”（すなわち、さまざまな転写調節領域のいろいろなエレメントおよび／または発現を変化させる突然変異を含む）プロモータまたはエンハンサーなどが挙げられる。例えば組み換えDNA構造体で最も一般的に使用されているプロモータとしては、β-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース、トリプトファン（trp）といったプロモータ系が挙げられる。プロモータとエンハンサーの核酸配列は、合成で作ること以外に、この明細書に記載されている組成物と組み合わせ、組み換えクローニング技術および／または核酸増幅技術（例えばPCR（登録商標））を利用して作ることができる（アメリカ合衆国特許第4,683,202号、第5,928,906号を参照のこと）。さらに、核のない細胞小器官（例えばミトコンドリア、葉緑体など）の中で配列の転写および／または発現を指示する制御配列を使用することも考えられる。プロモータ、エンハンサー、ならびにそれ以外の遺伝子座または転写制御／調節エレメントを含む制御配列も、“転写カセット”と呼ばれる。
当然のことだが、発現させるために選択した細胞小器官、細胞、組織、器官、生物の中でDNAセグメントの発現を効果的に指示するプロモータ／エンハンサーを用いることが重要であろう。分子生物学の当業者であれば、プロモータ、エンハンサー、細胞を組み合わせてタンパク質を発現させる方法を知っているはずである（例えばSambrook他、2000年を参照のこと）。使用するプロモータとしては、導入されたDNAセグメントを高レベルで発現させるのに適切な条件下で構成的、組織特異的、誘導的、有用なものが可能である。そのようになっていると、遺伝子治療、または組み換えタンパク質および／またはペプチドの大規模な製造といった用途において望ましい。プロモータは、異種のものでも内在性でもよい。
T3、T7、SP6細胞質発現系を使用するというのは可能な別の実施態様である。真核細胞は、適切な細菌のポリメラーゼがデリバリー複合体の一部として、あるいは追加の遺伝子発現構造体として与えられるのであれば、細胞質である種の細菌のプロモータから転写を行なわせるのを促進することができる。
表1には、RNAの発現を調節するために本発明で使用できるエレメント／プロモータの具体例をリストにしてあるが、これがすべてではない。表2には、誘導エレメントの具体例を提示してあるが、これがすべてではない。なお誘導エレメントとは、特定の刺激に応答して活性化することのできる核酸配列内の領域である。
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組織特異的なプロモータまたはエレメントの同定法と、その活性を調べるアッセイは、当業者には周知である。このような領域として、例えばヒトLIMK2（Nomoto他、1999年）、ソマトスタチン受容体2遺伝子（Kraus他、1998年）、マウス精巣上体レチノイン酸結合遺伝子（Lareyre他、1999年）、ヒトCD4（Zhao-Emonet他、1998年）、マウスα2(XI)コラーゲン（Tsumaki他、1998年）、D1Aドーパミン受容体遺伝子（Lee他、1997年）、インスリン様増殖因子II（Wu他、1997年）、ヒト血小板内皮細胞接着分子1（Almendro他、1996年）などが挙げられる。
本発明のレンチウイルス・ベクターは、主として、調節された真核生物のプロモータの制御下で治療用遺伝子を用いて細胞を形質転換できるように設計されている。gp91-phoxプロモータが好ましいとはいえ、上の表1と表2に示した他のプロモータと調節シグナル・エレメントも使用することができる。さらに、プロモータ／エンハンサーの任意の組み合わせ（真核生物プロモータのデータベースEPDB）を利用し、本発明のレンチウイルス・ベクターに関連して用いられる治療用遺伝子をコードしている構造遺伝子の発現を促進することもできよう。別の方法として、がんの遺伝子治療のための組織特異的プロモータ、または腫瘍を標的とする組織特異的プロモータを本発明のレンチウイルス・ベクターとともに使用すると、がん（特に造血に関するがん）を治療できる可能性がある。
真核細胞の中でタンパク質をコードしている遺伝子の転写を制御する代表的なプロモータとエンハンサーは、多数の遺伝子エレメントで構成されている。細胞機構は、各エレメントから運ばれてきた調節情報を集めて統合することができるため、さまざまな遺伝子から、互いに異なっていてしばしば複雑な転写制御パターンを生成させることが可能になる。プロモータ・エレメントとエンハンサー・エレメントの活性化または抑制は、これらエレメントを適切な転写アクチベータまたは転写リプレッサと接触させることによって実現できる。転写アクチベータまたは転写リプレッサとしては、図1Bに記載されているもの（gp91-phoxプロモータに関して）や、LuoとSkalnik（1996年）、J. Biol. Chem.、第271巻、18203−18210ページと、LuoとSkalnik（1996年）、J. Biol. Chem.、第271巻、23445−23451ページに記載されているものがある。gp91-phoxプロモータに関しては、インターフェロンγが発現カセットの転写と発現を変化させる活性を有するということが、本発明を実施する際にそのようなプロモータ・エレメントまたはエンハンサー・エレメントと、そのエレメントと相互作用する因子とがどのように使用されるかの一例になっている。
エンハンサーは、最初は、同じDNA分子上の離れた位置に存在するプロモータからの転写を増大させる遺伝子エレメントとして検出された。大きな距離を隔てて作用するこの能力は、真核生物の転写制御に関する従来の研究にはほとんど見られない。続く研究により、エンハンサー活性があるDNA上の領域は、プロモータと同じように組織化されていることがわかった。すなわち、その領域は、多数の個々のエレメントで構成されており、そのそれぞれが1個以上の転写タンパク質と結合している。例えば図1Bに示したgp91-phoxプロモータを調節するためのモデルを参照のこと。本発明で考慮する具体的なエンハンサーは、DNアーゼ超感受性エレメントとそのホモログであり、Lien L.L.、Lee Y、Orkin S.H.、1997年、「酵母人工染色体クローンを胚性幹細胞に導入することによって研究した、骨髄細胞を発現したヒトgp91-phox遺伝子の調節：多様な細胞発現パターンを抑制するには互いに離れたシス・エレメント群の完全相補体が必要である」、Mol. Cell. Biol.、第17巻(4)、2279−2290ページに記載されている。これらエンハンサー・エレメントの影響を受けると、遺伝子の発現が（HSのエンハンサー活性によって）より多くなり、（HSのサイレンサー活性によって）より多様でなくなる可能性がある。
gp91-phoxのHSエレメントのアナログは、他のプロモータ-エンハンサー系において活性である。例えばMay C.、Rivella S.、Callegari J.、Heller G.、Gaensler K.M.、Luzzatto L.、Sadelain M.、2000年、「レンチウイルスがコードしているヒトβ-グロビンを発現するβ-サラセミア・マウスにおける治療用ヘモグロビンの合成」、Nature、第406巻（6791号）、82−86ページを参照のこと。この論文では、β-グロビンのHSエレメントのアナログがレンチベクターのβ-グロビン・プロモータの上流に組み込まれてβ-グロビンのcDNAの発現を促進した。
プロモータとエンハンサーは、細胞内で転写を活性化するという同じ一般的な機能を有する。両者はしばしば重なっていて連続であり、非常に似たモジュール組織を持っているように見えることがしばしばある。こうした考察を総合すると、プロモータとエンハンサーは相同であり、これら配列に結合した転写アクチベータ・タンパク質は、細胞の転写機構と基本的に同じように相互作用する可能性のあることが示唆される。プロモータとエンハンサーの基本的な違いは動作である。エンハンサー領域は、全体として、離れた距離から転写を刺激できる必要がある。このことは、プロモータ領域またはその構成エレメントには当てはまる必要がない。他方でプロモータは、特定の部位において特定の方向にRNAの合成開始を指示する1つ以上のエレメントを含んでいる必要がある。ところがエンハンサーはこの特徴を欠いている。この動作上の違いは別にすると、エンハンサーとプロモータは互いに非常によく似ている。したがって転写と発現を制御するエレメント構造体では、さまざまなエレメントが有用性と動作性を向上させる手段となるように配置されている可能性がある。
役に立つ可能性のあるシグナルは、ポリアデニル化シグナル（hGH、BGH、SV40）である。多重遺伝子メッセージまたはポリシストロン性メッセージを作るのに内部リボソーム結合部位（IRES）エレメントが用いられる。IRESエレメントは、5'がメチル化されたキャップに翻訳が依存するというリボソーム走査モデルをバイパスし、内部部位で翻訳を開始することができる（PelletierとSonenberg、1988年）。ピコルナウイルス・ファミリーの2つのメンバー（ポリオウイルスと脳心筋炎ウイルス）からのIRESエレメントが報告されており（PelletierとSonenberg、1988年）、哺乳動物のメッセージからのIRESも報告されている（MacejakとSarnow、1991年）。IRESエレメントは、異種のオープン・リーディング・フレームに連結させることができる。多数のオープン・リーディング・フレームを同時に転写することができる。そのときそれぞれのオープン・リーディング・フレームはIRESによって隔てられていて、ポリシストロン性メッセージを作り出す。IRESエレメントのおかげでそれぞれのオープン・リーディング・フレームがリボソームに接近できるため、翻訳が効率的になされる。多重遺伝子は、単一のメッセージを転写する単一のプロモータ／エンハンサーを用いて効率的に発現させることができる。
いずれにせよ、プロモータは、機能上、遺伝子の上流に位置しているときにその遺伝子を発現させるDNAエレメントである。本発明のレンチウイルス・ベクターを用いて形質転換されることになるたいていの導入遺伝子は、機能上、プロモータ・エレメントの下流に位置する。
コード配列を効率的に翻訳するには特別な開始シグナルも必要である可能性がある。そのようなシグナルとしては、ATG開始コドンまたは隣接配列が挙げられる。外来性翻訳制御シグナル（例えばATG開始コドン）も必要である可能性がある。当業者であれば、それを容易に決定し、必要なシグナルを提供できるであろう。挿入体全体が確実に翻訳されるようにするためには、開始コドンが望むコード配列のリーディング・フレームと“イン-フレーム”の状態になっている必要のあることがよく知られている。外来性翻訳制御シグナルと開始コドンは、天然のものでも、合成したものでもよい。発現効率は、適切な転写エンハンサー・エレメントを含めることによって増大させることができる。
10．配列リストの簡単な説明
配列ID番号1は、[ ]のヌクレオチド配列を提供する。
配列ID番号2は、[ ]のアミノ酸配列を提供する。
配列ID番号3は、[ ]のヌクレオチド配列を提供する。
配列ID番号4は、[ ]のアミノ酸配列を提供する。
11．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を示すためにこの明細書に含めてある。以下の実施例に開示した技術は、発明者が本発明を実施する際にうまくいくことを発見した技術であるため、本発明を実施するための好ましい態様を構成すると考えられることに当業者は注意されたい。しかし当業者であれば、この明細書の開示内容に照らし、開示してある具体的な実施態様において本発明の精神と範囲を逸脱することなく多くの変更をなしても同様の結果が得られることがわかるはずである。
A．実施例1〜10で用いる材料と方法
1．細胞
293Tヒト胚性腎細胞系（ACTT CRL-1573）とTE671ヒト横紋筋肉腫細胞系（ACTT CRL-8805）を、10％ウシ胎仔血清（FCS）を追加したDMEM（ライフ・テクノロジーズ社、フランス）の中で増殖させた。
ヒトとカニクイザル（マカカ・ファスキクラリス）のCD34+細胞を、それぞれ動員血と骨髄のサンプルから、以前に報告されている26-28ようにして取得した。フィコール-パック（ファルマシア社、スウェーデン）勾配遠心分離を行なった後にCD34+細胞を回収し、抗CD34 M450ダイナビーズ（ダイナル社、ノルウェー）を用いて精製した。CD34+細胞の純度は95％を超えていた。
ヒトとカニクイザルの末梢血単核細胞（PBMC）を、以前に報告されている29ようにフィコール-ハイパック／パーコール勾配（ファルマシア社、スウェーデン）を利用して健康なドナーの新鮮な血液から分離した。接着する単球をPBMC分画から除去するために37℃にて一晩接着させることによって末梢血リンパ球（PBL）が豊富な状態にし、CD3マーカーの発現をモニターした（75〜85％がCD3+であった）。
2．抗体
抗RD114 GP（ヴァイロメド・バイオセイフティ・ラブズ社、アメリカ合衆国）は、RD114 gp70エンベロープ糖タンパク質（SU）に対するヤギの抗血清であり、それを1/5,000に希釈してウエスタン・ブロットに使用した。抗SIV CA（NIHエイズ研究・基準試薬プログラム、アメリカ合衆国）は、SIVmac251 p27キャプシド・タンパク質（CA）に対するマウスのモノクローナル抗体（2F12）であり、それを1/500に希釈してウエスタン・ブロットに使用した。抗MLV CA（ヴァイロメド・バイオセイフティ・ラブズ社、アメリカ合衆国）は、ラッシャー白血病ウイルス（RLV）p30キャプシド・タンパク質（CA）に対するヤギの抗血清であり、それを1/10,000に希釈してウエスタン・ブロットに使用した。
3．パッケージングと輸送用のベクター構造体
pSIV-12パッケージング・プラスミド（図1）はpSIV825の誘導体であり、hCMVプロモータとHIV-1 rev遺伝子発現ユニットの制御下でSIVmac251 gag-pol遺伝子を発現する。HIV-1 rev遺伝子発現ユニットにはrevの2つのエキソンが融合しており、その2つのエキソンは、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素Aレダクターゼ（HMG）プロモータと、HMGイントロンIと、SV40ポリアデニル化配列の制御下にある。pSIV-T1+プラスミド30は、パッケージング能力を有するSIVmac251をベースとしたベクターをコードしており、CMVプロモータの制御下で増大したグリーン蛍光タンパク質（GFP）マーカー遺伝子を発現する（図1）。
pSIV-T1+プラスミドは、パッケージング能力を有するSIVmac251をベースとしたベクターをコードしており、CMVプロモータの制御下で増大したグリーン蛍光タンパク質（GFP）を発現する。pTG5349マウス白血病ウイルス（MLV）パッケージング・プラスミドとpTG13077プラスミドは、CMV-GFP内部転写ユニットを含むMLVをベースとしたベクターをコードしており、親切にもトランスジーン社（ストラスブール、フランス）から提供された。
4．ウイルス糖タンパク質発現構造体
phCMV-G31、EboV-GP（V. Volchkovからの好意ある提供）、phCMV-HA32、phCMV-10A133、phCMV-GALV33というプラスミドは、水疱性口内炎ウイルス（VSV）のGP、エボラ・ウイルス（EboV）のザイール株のGP、トリ・インフルエンザ・ウイルス（FPV）のH7-HAヘマグルチニン、MLV-10A1、テナガザル白血病ウイルス（GALV）のエンベロープ糖タンパク質をそれぞれコードしている。糖タンパク質はすべて、同じシス作用性シグナルの制御下で発現した：CMVプロモータ、ウサギのβ-グロビンのイントロンII、ポリアデニル化配列（図1）。
ネコ内在性ウイルスRD114（Genbank X8782934）に由来する糖タンパク質と、両種指向性MLV（MLV-A35）の4070A株に由来する糖タンパク質を発現させるための骨格としてphCMV-Gを使用した。RD114ウイルス・エンベロープ糖タンパク質（RD114 GP）を発現するphCMV-RD114発現ベクターとphCMV-GALV構造体をさらに修飾し、MLV-A GP細胞質尾部を有する、RD114/TR（図2B）とGALV/TR8、13、15のキメラ糖タンパク質を発現させた。
RD114ウイルス・エンベロープ糖タンパク質（RD114 GP）を発現するphCMV-RD発現ベクターをさらに修飾し、RD114 GP膜貫通ドメイン（TMD）および／または細胞質尾部（CT）が修飾されている一連の突然変異体を生成させた。続く構造体はすべて、PCRを通じたオリゴヌクレオチド部位指定突然変異誘発によって生成させ（詳細と配列は、問い合わせがあれば提供する）、phCMV-RDプラスミドの中でクローニングした。RD114 GP突然変異体のカルボキシ末端部分のアミノ酸配列を図7に示してある。
5．シンシチウム・アッセイ
融合アッセイで使用するHeLa細胞は、以前に報告されているように（9）、HIV-1の長い末端反復配列（LTR）の制御下にあるβ-ガラクトシダーゼ遺伝子（LacZ）（この遺伝子の発現はTatに依存する）の安定なトランスフェクタントになっている（HeLaCD4LTRLacZ細胞）か、あるいはHIV-1のTatタンパク質を構成的に発現していた（HeLa-Tat細胞）。エンベロープを通じた融合は、ほぼ以前に報告されているようにして定量化した（9、16）。このアッセイでは、エンベロープを発現する細胞が受容体を有する指示細胞と融合したとき、HIV-1 LTRによって引き起こされるβ-ガラクトシダーゼの発現がTatタンパク質によってトランス活性化される。トランスフェクションを行なう24時間前に、5×104個のHeLaCD4LTRLacZ細胞を24ウエルのプレートに植えた。ウイルス糖タンパク質発現構造体を、リン酸カルシウム・トランスフェクション・プロトコル（クロンテック社、フランス）を利用して上記のHeLa細胞にトランスフェクトした。そのとき、製造者の勧めに従ってプラスミドを1μgを用いた。トランスフェクションを行なってから24時間後、105個のHeLa-Tat指示細胞を、ウイルス糖タンパク質を提示する細胞とともに36〜48時間にわたって培養した。以前に報告されているように（9、16）、PBS（リン酸緩衝溶液）の中で0.5％（重量／容積）のグルタルアルデヒドを用いて固定し、PBSで洗浄し、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド（X-Gal）溶液の中でインキュベートすることによって染色した後に細胞-細胞融合を測定した。エンベロープを提示する細胞とTatを含有する指示細胞が互いに融合していることを示す青いシンシチウムを、シンシチウム1つ当たりの核の数に関係なくカウントした。
6．レトロウイルス・ベクターの製造
類型化されたSIV由来のベクターを、以前に報告されている25ようにして、293T細胞の一過性トランスフェクションによって作った。pSIV-T1+ベクター構造体（8.1μg）と、pSIV-12パッケージング構造体（8.1μg）と、ウイルス糖タンパク質発現構造体（2.7μg）を同時に、前日に10cmのプレートに植えた293T細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションを行なった16時間後に培地（プレート1つにつき12ml）を交換し、上清を24時間後に回収した。26mlの超遠心分離管の中でベクター粒子を濃縮し、ビリオンをペレット化した。なおこの超遠心分離管は、70Tiベックマン・ローターの中で4℃にて1時間にわたって32,000rpmで回転させた。ウイルスのペレットは、ウイルスの上清を最初の1/100の体積採取してその中に1％ウシ血清アルブミン（BSA）を追加した無血清DMEMを入れたものの中に再び分散させ、等分し、-80℃で保管した。
類型化されたMLV由来のベクターを、同様にしてpTG5349 MLVパッケージング構造体（8.1μg）と、pTG13077 MLVベクター構造体（8.1μg）と、糖タンパク質発現構造体（2.7μg）を一過性にトランスフェクトすることによって作った。プラスミドDNAを、製造者の勧めに従ってリン酸カルシウム・トランスフェクション・プロトコル（クロンテック社、フランス）を利用し、前日に10cmのプレートに植えた2.5×106個の293T細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションを行なった16時間後に培地（プレート1つにつき8ml）を交換し、上清を24時間後に回収し、孔のサイズが0.45μmの膜で濾過した。
7．免疫ブロットとウイルスへの糖タンパク質の組み込み
ウイルス産生細胞を、1％のトリトン-X100と、0.05％のSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）と、5mg/mlのデオキシコール酸ナトリウムと、150mMのNaClと、1mMのPMSFとを含む20mMのトリス-HCl（pH6.5）の中で溶解させた。ライセートを4℃にて10分間にわたってインキュベートし、13,000×gで5分間にわたって遠心分離し、核をペレットにした。次に上清を-80℃で凍結させ、さらに分析を行なうときまで保存した。精製したウイルス・サンプルは、SW41ベックマン・ロータ（25,000rpm、2.5時間、4℃）の中に入れた1.5mlの20％ショ糖クッションの上でウイルスの上清（8ml）を超遠心分離することによって得られた。ウイルスのペレットを100μlのPBSに分散させ、-80℃で凍結させた。
サンプル（細胞ライセートに関しては30μg、精製したウイルスに関しては20μl）を、6％のSDSと、30％のβメルカプト-エタノールと、10％のグリセロールと、0.06％のブロモフェノール・ブルーとを含む375mMのトリス-HCl（pH6.8）緩衝液の中で5：1（容積：容積）の割合で混合し、5分間にわたって沸騰させた後、9％SDS-PAGEを行なった。タンパク質がニトロセルロース・フィルタの上に移動した後、免疫染色を、10％の粉ミルクと0.1％のTWEENを含むTBS（トリスをベースとした生理食塩水、pH7.4）の中で実施した。ブロットを適切な抗体を用いて調べ、それぞれの一次抗体（DAKO社、イギリス）に対するHRPOと共役したIg（免疫グロブリン）と、化学発光増大キット（アマーシャム・ライフ・サイエンス社）とを用いて現像した。
8．代謝性標識と免疫沈降
さまざまながんレトロウイルスまたはレンチウイルスのベクター成分をトランスフェクトそた12時間後、ウイルス産生細胞をシステインとメチオニンを含まない培地の中に1時間入れて飢餓状態にし、システインとメチオニンは含まないが、1mlにつき100μCiの35S-システインおよび35S-メチオニン（ICN）と、透析した2％ウシ胎仔血清とを含む3mlのDMEMの中で、37℃にて16時間にわたって標識した。細胞を溶解させ、以前に報告されている（9）ようにしてヤギの抗RD114 SU血清を用いて免疫沈降させた。TM GPサブユニットの細胞質尾部のプロセシングを分析するため、ウイルス産生細胞の上清を回収し、孔のサイズが0.45μmの膜で濾過した。SW41ロータ（ベックマン社）の中に入れた2mlの20％ショ糖クッション上で2時間にわたって30,000rpmで上清を超遠心分離した。溶解用緩衝液（50mMのトリスHCl（pH7.5）、15mMのNaCl、5mMのMgCl2、5mMのKCl、1％のトリトンX-100、0.5％のデオキシコール酸ナトリウム）を添加してペレットを溶解させた。ライセートの1/5を取ってそのまま電気泳動にかけ、ウエスタン・ブロット法でウイルスのタンパク質をおおまかに分析し、残りのライセートに対しては抗RD114 SU抗体を用いて免疫沈降を実施した。還元条件下にてドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-12％ポリアクリルアミド・ゲルの中で免疫沈降物を電気泳動にかけ、SUから同時に免疫沈降したTM GPサブユニットを分離した。
9．感染アッセイ
以前に報告されている25ようにして、TE671を標的細胞として用いて形質導入の効率と感染力価を調べた。以前に報告されている36ようにして、ウイルス調製物と新鮮な血清が1：1（容積：容積）の混合物の中で37℃にて1時間にわたってインキュベートした後に生き残ったウイルス粒子を滴定することにより、ヒトとマカクの血清におけるベクター類型の安定性を調べた。点1つにつき、類型化されたベクター粒子を約5×104GFP感染単位使用した。文献36に記載されているようにして血清を健康な血液ドナーから採取し、調整した。ビリオンの安定性を、ウシ胎仔血清で処理したウイルスの感染力に対する霊長類の血清で処理したウイルスの感染力の割合として調べた。熱で不活化した血清（56℃、1時間）を対照として用いた。
形質導入を行なう1日前にTE671標的細胞をウエル1つにつき細胞3×105個の密度で植えた。ベクター調製物を順番に希釈したものを、6μg/mlのポリブレンの存在下で細胞に添加し、その培養物を37℃にて4時間にわたってインキュベートした。次に、ベクターを含む培地を通常の培地で置換し、細胞を37℃にて72時間にわたってインキュベートした。形質導入された細胞をトリプシンの中で1個ずつにし、それをPBSに再び分散させた後、GFPがプラスである細胞の割合として決まる形質導入の効率を、FACS分析によって測定した。感染力価（感染単位(i.u.)/mlとして与えられる）を、公式：力価 = ％inf×（3×105/100）×dを用いて計算した。ただしこの公式において、“d”はウイルスの上清の希釈因子であり、“％inf”は、GFPがプラスである細胞の割合である。この割合は、GFPがプラスである標的細胞の1％〜5％に形質導入するウイルス上清希釈液を用いてFACS分析することによって明らかになる。
10．一次細胞の形質導入
抗体（ステムセル・テクノロジーズ社、メラン、フランス）と10ng/mlのトロンボポエチン（TPO；ペプロテック社、ロンドン、イギリス）を追加した2mlのステムスパンSFEM培地の中に細胞をウエル1つにつき2×106個植えた12ウエルのプレートの中で、精製したCD34+細胞を一晩にわたってインキュベートした。次に、あらかじめ活性化させたCD34+細胞を96ウエルのプレートに植え（104細胞／ウエル）、TPOと6μg/mlのポリブレンを含む合計体積が200μlのステムスパン培地の中で、類型化されたベクターを用いて形質導入した。TE671標的細胞を用いて決定したさまざまな感染多重度（MOI）を標的細胞に適用したところ、標的細胞1個当たりの感染粒子は0.5〜60個の範囲であった。レトロネクチンでコーティングしたウエル（CH-296；宝酒造、日本）での形質導入を、ウエル1つにつき8μgのレトロネクチンを2時間にわたってあらかじめコーティングした96ウエルのプレートの中で、同じプロトコルを利用して行なった。16時間後、CD34+細胞を洗浄し、10％ウシ胎仔血清（ライフ・テクノロジーズ社、フランス）と、抗生物質と、10ng/mlのFlt3-L、TPO、幹細胞因子（SCF）とを追加した400μlのステムセル培地の中に3日間分散させておいた。感染の5日後、GFPの発現をFACSによって分析した。
ヒトとマカクのPBLを24時間にわたってあらかじめ活性化させた後、以前に報告されているように、1μgの抗CD3抗体（HIT3a、ファーミンジェン社）と抗CD28抗体（CD28.2、ファーミンジェン社）を、2×106個のヒトPBLを含む1mlの培地に添加することによって29、あるいは5ng/mlのコンカナバリンAと10ng/mlのIL2を2×106個のマカクPBLに添加することによって37感染させた。形質導入するため、6μg/mlのポリブレンを追加した合計体積が1mlのPBL培地の中で、105個の活性化したPBLを、類型化されたベクターと37℃にて4時間にわたって混合した。感染後、細胞をPBSの中で洗浄し、IL2を追加したRPMI-1640（ライフ・テクノロジーズ社、フランス）の中で37℃にて5日間にわたってインキュベートし、FACS分析によって形質導入の効率を測定した。
B．実施例1〜10
実施例１：さまざまなウイルス糖タンパク質がSIVベクターを類型化する能力
われわれは、一群のウイルス糖タンパク質（GP）がサル免疫不全ウイルス（SIVmac251）に由来するレンチウイルス・ベクターを類型化する能力を調べた。糖タンパク質は、タイプCの哺乳動物レトロウイルスに由来するもの（例えばネコ内在性レトロウイルスRD114、両種指向性ネズミ白血病ウイルス（MLV-A）、MLV-10A1、テナガザル白血病ウイルス（GALV）のEnv GP）、あるいは膜で覆われたウイルスに由来するもの（例えばトリ・インフルエンザ・ウイルス（FPVヘマグルチニン、FPV-HA）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）、エボラウイルス（EboV）、水疱性口内炎ウイルス（VSV）のGP）であった。類型化されたSIVベクターは、SIVウイルスのコア・タンパク質をコードしている3種類のプラスミド（図1）と、SIVをベースとしていてGFPマーカー遺伝子を含む輸送ベクターと、さまざまなGPとをトランスフェクトした293T細胞の中で一過性に発現させることによって作った。TEI671ヒト横紋筋肉腫細胞に関する感染アッセイにより、VSV、LCMV、MLV-A、MLV-10A1のGPを用いて作ったベクターで105i.u./mlを超える力価が得られることがわかった（図2A）。それとは対照的に、EboV、FPVのGPを用いて作ったベクターは力価が小さく、5×103i.u./ml未満であった。GALV、RD114のGPを用いて作ったSIVベクターでは力価が中間的な値であり、104〜5×104i.u./mlであった。類型化されたベクターの感染力のこうした相対的な違いは、他の標的細胞（例えば293T細胞）でも再現された（データは示さない）。これは、TEI6細胞に関する感染力価が、さまざまなGPがSIVコアを類型化する能力を反映していることを示唆している。
FPV、GALV、RD114のGPを用いて作ったSIVベクターを用いて得られた感染力価は、同じ糖タンパク質で類型化したMLVベクターで得られる感染力価21、34、38よりも驚くほど小さかった。レンチウイルス・コア粒子の出芽はウイルス糖タンパク質の発現に依存しない39ため、これは、ビリオンがこれらGPを効率的に組み込めなかったこと、あるいはビリオンがGPを組み込んだ後に産生細胞から出られなかったことを示唆している。実際、FPV-HAを発現するベクター産生細胞をノイラミニダーゼで処理すると、HAで類型化したベクターの感染力は100倍にもなった（図2A）。この増大は、産生細胞の上清の中でウイルス粒子の産生が50倍になったことと関係していた（データは示さない）。この現象は、シアル酸含有細胞表面分子と結合しているために細胞表面に保持されていたビリオンが、ノイラミニダーゼを媒介として放出されることによって誘導された可能性が大きい40、41。しかしビリオン脱出に関するこのような欠点は、GALV GP、RD114 GPを用いて作ったSIVベクターに感染力が欠けていることを説明できないであろう。というのも、これらの糖タンパク質で類型化したMLVベクターの力価は一般に大きいからである21、34。これは、むしろ、レンチウイルス・コアにGPが組み込まれるレベルでの欠陥を示唆している。以前の研究により、タイプCの哺乳動物レトロウイルスの細胞質尾部は、霊長類のレンチウイルスを用いた類型の形成および／または感染力を制御するエレメントを含んでいることがわかっている8、13-15。MLV-A GPはレンチウイルス・ベクターを効率的に類型化するため（図2A）、われわれは、その細胞質尾部が、レンチウイルス粒子にGPを最適に組み込むのに必要なあらゆるエレメントを含んでいるはずであると仮定した。実際、RD114（図2B）とGALVのGPの細胞質尾部をMLV-A GPの細胞質尾部で置換すると、レンチウイルス・コアへの糖タンパク質の組み込みが大きく増大した。そのことが、RD114 GPについては図2Cに示してあり、GALV GPについては別のところに示されている8、13、15。キメラGALV GPとキメラRD114 GP（それぞれGALV/TR、RD114/TRと名づける）は、受容体干渉アッセイで明らかにされたように最初の糖タンパク質に関する宿主の範囲を維持しており（データは示さない）、SIVベクターと比べて力価が25倍になった（図2A）。
実施例２：SIVをベースとした類型化されたベクターのストックのキャラクテリゼーション
われわれは、修飾されたウイルス糖タンパク質または修飾されていないウイルス糖タンパク質でコーティングされたベクターのうちで、SIVベクター粒子を効率的に類型化したものの性質を明らかにすることを試みた。SIVベクター類型を超遠心分離によって濃縮し、1％のBSAを含む貯蔵用緩衝液の中に再び分散させ、等分し、-80℃で保管した後、感染アッセイを行なった。MLV-10A1 GPでコーティングされたベクターは濃縮前に正常な力価であったが、効率的に濃縮できなかったため（データは示さない）、その後の分析では使用しなかった。それとは対照的に、FPV-HA、VSV-Gの糖タンパク質で類型化したベクター、あるいはGALV/TR、RD114/TR、MLV-A、LCMVの糖タンパク質で類型化したベクターは、非常に効率的に濃縮されたため、物理的粒子を100倍に濃縮した後の感染性粒子の回収率は平均して80％を超えた（データは示さない）。FPV-HA、LCMVの糖タンパク質で類型化したベクターは、ここでテストした一次造血細胞（すなわちPBLとCD34+細胞；データは示さない）に形質導入することができなかったため、それ以上は分析しなかった。残った糖タンパク質（すなわちMLV-A、GALV/TR、RD114/TR、VSV-G）で類型化したベクターの濃縮ストックの感染力価は、TE671標的細胞を用いて測定した。その値は、感染力が小さい類型の5×106i.u./ml（GALV/TR GPで得られた）から、最も感染力の大きい類型の1×108i.u./ml（VSV-Gで得られた）までの範囲であった（図3A）。ベクター類型間での力価に関する同様の違いが、他のヒト接着細胞系で検出された（データは示さない）。これは、許容性の非常に大きなTE671細胞を用いた力価測定が、類型化されたベクターの特異的感染力を反映していることを示している。重要なことだが、感染性粒子の数は、物理的粒子の存在と相関していた。図3Bからわかるように、類型化されたベクターの調製物を相互に比較すると、似た量のビリオン関連キャプシド・タンパク質が、力価が最大であったベクター類型（VSV-G、MLV-A、RD114/TRのGP）において検出された。GALV/TR GPで類型化したビリオンでは、より少ない量の物理的粒子が繰り返して検出された。これは、その力価がより小さいことと整合性がある（図3A）。しかしビリオン関連キャプシド・タンパク質の絶対量における重要な違いは、感染力価がほぼ同じである2つの独立な調製物を比較するときに明らかになった（データは示さない）。そこでベクターのストックの品質差による誤りを最少にするため、同時に作った類型化されたベクターを用いて後で評価実験を行なった。さらに、ビリオン関連キャプシド・タンパク質の検出結果は感染性粒子の有効な指標であるようには見えず、結果の比較から除外したため、TE671細胞に関して測定した力価を用いて類型化されたベクターのストックを規格化した。
実施例３：霊長類の血清中におけるベクター類型の安定性
生体内の遺伝子デリバリーに適したベクターは、37℃で安定でなくてはならず、霊長類の血清中で大きな感染力を維持していなくてはならない。そこで37℃にて1時間にわたってインキュベートしたウイルス粒子の力価を4℃にてインキュベートした場合と比較することにより、ベクター類型の安定性を調べた。RD114/TR GPまたはVSV-Gで類型化したレンチウイルス・ベクターは37℃で安定であり、85％を超えるベクター粒子が37℃でのインキュベーション後に感染力を保持していた（データは示さない）。それに対してMLV-A GPとGALV/TR GPで類型化したベクターは、37℃でインキュベートした後は75％以上が感染力を失った（データは示さない）。これは、レンチウイルス・コア粒子に組み込まれた後者のGPが温度感受性を持っていたことを示唆している。
ヒトとカニクイザルの血清中における類型化されたベクターの安定性を評価した。類型化された感染性粒子をそれぞれ同じ量用意して霊長類の新鮮な血清と50/50（v/v）の割合で混合し、37℃にて1時間にわたってインキュベートした。熱で不活化した霊長類の血清とウシ胎仔血清（FCS）を対照として用いた。結果は、新鮮な血清または熱で不活化した霊長類の血清の中でインキュベートした後の残留感染力を、FCSの中でインキュベートしたビリオンの感染力（100％）と比較して％で表わした。その結果を図4に示してある。VSV-Gで類型化したベクターは、ヒトとマカクの両方の血清によって不活化され、ウイルス粒子の90％以上が分解された。レトロウイルス糖タンパク質で類型化したベクターは、ヒト血清中でのほうが抵抗力が有意に大きかったが、その抵抗レベルは、テストした血清サンプルとレトロウイルスGPのタイプによって異なっていた。MLV-A GPで類型化したベクターは、ヒト血清中で安定であったが、マカク血清による不活化には比較的感受性を持っていた。GALV/TR GPでコーティングされたベクターは、ヒトとマカクの血清における安定性レベルが変動した。それとは対照的に、RD114/TR GPで類型化したレンチウイルス・ベクターは、テストしたヒト血清中で完全に安定であり（図4A）、マカク血清中ではよい安定性を示した（図4B）。
実施例４：ヒトとマカクの一次造血細胞への形質導入
われわれは、次に、一次造血細胞（例えばCD34+細胞やPBL）に対するさまざまなベクター類型の形質導入能力を比較した。動員血に由来するヒトCD34+細胞を、TPOを追加した無血清培地の中で一晩にわたってあらかじめ活性化させ、MLV-A、GALV/TR、RD114/TR 、VSV-Gのいずれかの糖タンパク質で類型化したSIVベクターを用いて単一ヒットで16時間にわたって形質導入した。TE671細胞に関して評価した感染力価を用いて決まるさまざまな感染多重度（MOI）を利用し、CD34+細胞に形質導入した。CH-296レトロネクチン断片の存在下または不在下で、密接な関連のある複数の形質導入実験を行なった42-44。感染後、低濃度のTPO、SCF、Flt3-Lの存在下で細胞を5日間にわたって増殖させた。GFPの発現は、フローサイトメトリーにより、形質導入された細胞において容易に検出された。そのためMOIと類型化用GPが形質導入の効率に及ぼす影響を評価することができた（図5A）。レトロネクチンの不在下での形質導入に関しては、GFP+細胞の割合は最初のうちはMOIに比例して増加し、MOIが2と20の間では曲線が平坦になり、GFP+細胞の最大値25％に達した。形質導入効率がこのように中程度であったのは、感染プロトコルが最適ではなく、特に標的細胞をビリオンとともに1回だけ短時間しかインキュベートしなかったためであろう。このような実験条件では、最も効果的なベクターは、VSV-G GPで類型化したベクターであった（平均GFP+細胞：24.75％±3.23％；n=5）が、MOIが2未満では、GALV/TR GP、MLV-A GPで類型化したSIVベクターのほうが、VSV-Gで類型化したベクターよりも形質導入効率が大きかった（図5Aの挿入図を参照のこと）。しかしテストした最も効果的なMOIでは、MLV-A、GALV/TR、RD114/TRの糖タンパク質を用いたベクターの形質導入効率は、VSV-G類型と比べて1/5〜1/12であった（図5A）。GALV/TR GPを用いて作ったベクターの力価は比較的小さいため（図3A）、大きなMOIで形質導入効率を評価することはできなかった。レトロネクチンでコーティングしたプレート上でCD34+細胞に感染させたときには、異なる結果が得られた（図5A）。この条件下において、VSV-Gで類型化したベクターは、レトロネクチンの不在下と同じ最大形質導入効率（GFP+細胞が24.56％±3.27％；n=5）を保持していた。これは、別の結果とも一致している45。それとは対照的に、RD114/TRで類型化したベクターは、形質導入効率が10倍になり、GFP+細胞が65％に達した（平均：51.30％±8.74％；n=5）。これは、RD114/TR GPとレトロネクチンを組み合わせて使用すると感染が相乗的に増大することを示している。レトロネクチンは、GALV/TR GP、MLV-A GPで類型化したベクターの形質導入効率も増大させたが、RD114/TR GPで類型化したベクターと比べてその大きさははるかに小さかった（図5A）。
われわれは、次に、類型化されたベクターを用い、骨髄由来のマカクCD34+細胞に形質導入した（図5B）。レトロネクチンがない場合には、最高の類型化用GPはVSV-Gであり、GFP+細胞の割合が26％になるまで形質導入された（21.7％±3.51％；n=5）。GALV/TR GPまたはMLV-A GPで類型化したSIVベクターは、マカクCD34+細胞への形質導入効率がそれよりも低かった（最大形質導入効率が、GFP+細胞3％）。VSV-Gで類型化したベクターと比較すると、RD114/TR GPで類型化したベクターは、形質導入効率が約1/2であった（10.12％±1.26％；n=4）。形質導入の間にレトロネクチンが存在していても、VSV-Gで類型化したベクターによる形質導入効率は改善しなかった（図5B）。しかしヒトCD34+細胞への形質導入と同様、レトロネクチンは、MLV-A GPまたはRD114/TR GPで類型化したレンチウイルス・ベクターによるマカクCD34+細胞への形質導入を増大させた。この条件下では、RD114/TR GPで類型化したベクターの場合に形質導入の最大値がGFP+細胞30％（24.23％±4.15％；n=5）に達した（図5B）。
われわれは、次に、ヒトとマカクのPBLにおける類型化されたSIVベクターの形質導入効率を測定した。新鮮な血液から単離したPBLを、レトロネクチンの不在下でベクターとともに4時間にわたってインキュベートした。以前に報告されている16、29、46ように、可溶性の抗CD3抗体と抗CD28抗体を用いてPBLを24時間にわたってあらかじめ活性化させることが、レンチウイルス・ベクターを形質導入するのに必要であった。CD3+細胞の刺激と生存に好ましいこのような実験条件にした結果、PBLへの形質導入がT細胞に向かった。感染後5日目に測定したGFPの発現（図6）から、PBLの形質導入がMOIに依存することがわかった。MOIの値が小さいときには、さまざまなベクター類型についてGFP+細胞の割合が着実に増加してプラトーに達した。プラトーに達するのに必要とされるMOIは、ベクター類型ごとに異なっていた。VSV-G、MLV-A GP、GALV/TR GPのいずれかで類型化したレンチウイルス・ベクターに関して細胞1個につき感染粒子5個未満というMOIのときに、形質導入のプラトーに素早く到達した（図6A）。それとは対照的に、RD114/TR GPで類型化したビリオンでは、プラトーに到達するのに必要なMOIの閾値は、細胞1個につき感染粒子が約5〜10個であった（図6A）。興味深いことに、形質導入レベルの最大値もテストしたベクター類型によって異なっていた。VSV-Gで類型化したベクターは、T細胞の形質導入が最大で10〜23％（平均：16.87％±6.53％；n=4）であった。この比較的低い形質導入レベルは、この明細書で使用しているSIV-T1+ベクターと同じ世代、同じ設計のVSV-Gで類型化したHIV由来のベクターで得られた以前の結果26と一致している。それとは対照的に、RD114/TRキメラGPで類型化したベクターでははるかに大きな形質導入レベルが実現され、50〜75％に達した（55.04％±11.74％；n=4）。しかし類型化した他のベクターで得られた形質導入効率の最大値はすでに述べたように低かった。GALV/TRキメラGPでコーティングしたベクターの力価は低かったため、2よりも大きなMOIで調べることができなかった。さらに、いくつかのベクター調製物では、MLV-A GPまたはGALV/TR GPで類型化したSIVベクターの大きなMOIを利用してヒトPBLへの形質導入を行なったとき、形質導入の効率が低下することが見いだされた（図6A）。この効果は、最近の研究44、47が示唆しているように、おそらく、欠陥のある過剰な粒子によって、あるいはウイルス粒子から“隠されている”可溶性GPによって、受容体との結合の競合が誘導されるためであろう。
同様の結果が、マカクPBLへの形質導入でも得られた。しかし感染がプラトーに達するのに必要なMOIの閾値は、ヒトPBLの場合に必要な値よりも大きいように見え、形質導入の最大レベルは、ヒトPBLで得られたレベルよりも低かった（図6B）。GALV/TR GPまたはMLV-A GPで類型化したベクター粒子で得られた形質導入効率は低いままであり（GFP+細胞が4〜12％未満）、MOIが1よりも大きいときに低下することが見いだされた。これらのGPまたはVSV-Gで類型化したベクター（15.32％±10.06％；n=4）と比べ、RD114/TR GPで類型化したベクターでPBLに形質導入することは容易であった。GFP+細胞が40％という値まで形質導入することができた（26.86％±8.07％；n=4）が、明らかに、この実験で用いたよりも大きなMOIのときにより高いレベルの形質導入レベルが可能になることが予想される。
これらの結果から、霊長類のCD34+細胞とPBLに類型化されたSIVベクターを形質導入するにはRD114/TR GPが特に有力であることがわかる。しかしRD114/TR GPで類型化したSIVベクターは、短期間刺激されたCD34+細胞に最適な形質導入を行なう上でレトロコネクチンCH-296断片を必要とした。
実施例５：RD114/TR GPの細胞質尾部突然変異体の設計
ネコ内在性ウイルスRD114は、その細胞内コア粒子の形状からわかるように、タイプCの哺乳動物レトロウイルスである（32）。しかしそのRD114のGPは、タイプDのサル・レトロウイルスに典型的なGPであり（28）、そのレトロウイルスと同じ細胞表面受容体RDR（31、38）を備えており、MPMV（メーソン-ファイザーサル・ウイルス）のGPと特にTMサブユニットにかなりの相同部を有する（図7）。われわれは、以前の報告においてRD114ネコ内在性ウイルスの糖タンパク質がレンチウイルス・コアと効率的に類型を形成できないことを見いだした。そこでわれわれは、この明細書で、SIV（サル免疫不全ウイルス）に由来するレンチウイルス・ベクターとの類型化を制限するRD114 GPの決定基を調べることにした。
最近の研究により、タイプCの哺乳動物レトロウイルスの膜貫通ドメインおよび／または細胞質尾部が、HIV-1ベクターとの類型の形成および／または感染力を制御するエレメントを有することがわかった（4、34、36）。このようなエレメントは、ウイルス粒子の感染力に異なるレベルで影響を与える可能性がある。例えば、i）ウイルスのアセンブリーに必要なGPとウイルス・コアの細胞内同時局在、ii）GPの組み込みを調節する、GPとウイルス・コアのタンパク質の相互作用、iii）ビリオンの出芽中に、あるいは出芽後しばらくしてからレトロウイルスのプロテアーゼによってGPの細胞質尾部が開裂することによるGP融合生成性の活性化などに影響する可能性がある。両種指向性ネズミ白血病ウイルス（MLV-A）とRD114の両方のGPが、MLVのコア粒子を効率的に類型化する（6、39）。したがって、MLV-AのGPもSIVウイルス・コアを効率的に類型化する（24、35）ため、われわれは、MLV-A GPが、RD114 GPのエレメントとは異なり、SIVベクター類型のアセンブリーおよび／または感染力を最適に制御するエレメントを含んでいるはずであると仮定した。そこでわれわれは、RD114 GPがレンチウイルス・コア粒子を類型化する能力を制限する決定基を明らかにするため、一群のRD114 GP突然変異体を作った。この突然変異体では、RD114 GPの膜貫通ドメイン（TMD）および／または細胞質尾部（CT）に由来するサブ領域が、MLV-A GPに由来するその対応物で置換されている（図7B）。MLV CTそのものの重要さを調べるため、突然変異体RD/TRを作った。突然変異体RD/MTRとRD/eMTRは、MLV CTに加えてMLV TMDを含んでいた。RDRのないGPはRD114 GPが切断されたものであり、そのCTの想定開裂部位に対応する位置に停止コドンを挿入することによって作った（下の記述を参照のこと）。突然変異体RDPrMLVでは、想定RD114 CT開裂部位がMLV GPの開裂部位で置換されていた。RDPrSIVARLM、RDPrSIVRQAG、RDPrHIVといった他の突然変異体の細胞質尾部は、SIVmacまたはHIV-1のコア・プロテアーゼのための基質を含んでいた。なおSIVmacは、SIVmac251で見いだされた開裂部位に由来し、HIV-1のコア・プロテアーゼは、HIV-1のGagタンパク質で見いだされた開裂部位に由来する。最後に、RD114 CTに含まれていて、GPの局在化、および／または細胞表面での発現、および／または融合生成性に影響を与える可能性のある想定チロシン・エンドサイトーシス・モチーフの重要性を評価するため、突然変異体RDΔYXXLを設計した。このモチーフの影響は、他のレトロウイルスのGPに関してはよくわかっている（1、13、19）。
CMVプロモータに制御される同じ発現ベクターを用い、あらゆるGP突然変異体を作った。ベクター粒子の成分（すなわち、ウイルス・コアのタンパク質、輸送ベクター、さまざまなGPのどれか）をコードしている複数のプラスミドを、293生成細胞に同時にトランスフェクトした。抗RD114 SU抗体を用いて細胞ライセートの免疫ブロットをモニターしたとき、コア・タンパク質にもGPにも量の変化は検出されなかった（データは示さない）。
実施例６：RD114 GPの細胞質尾部を修飾することによって細胞-細胞融合生成性が変化する
GP発現細胞の培養物は、シンシチウムを形成した。この現象は、細胞質尾部に導入した突然変異のタイプに依存することがわかった（図8）。野生型MLV-A GPと比べると、修飾されていないRD114 GPそのものの発現によってかなりのシンシチウムの形成が誘導された。この効果は、RD114 CTによるGPの融合生成性が十分に制御されていないことによって引き起こされるようであった。というのも、RD114 CTをMLV-A CT（突然変異体RD/TR、RD/MTR、RD/eMTR）で置換するとトランスフェクトされた細胞内のシンシチウムの数が顕著に低下し、野生型MLV-A GPで検出されたレベルになったからである（図8）。他のRD114キメラGPは、さまざまなレベルのシンシチウムを誘導した。最大の細胞変性効果は、RDPrHIVとRDRのない突然変異体で見いだされた。修飾されていないRD114 GPと同じ程度の融合生成性を示す突然変異体RDPrSIVARLMは例外だが、他のキメラ（RDΔYXXL、RDPrMLV、RDPrSIVRQAG）は、野生型RD114 GPで得られたよりも高レベルのシンシチウム形成を誘導した（図8）。変化した細胞-細胞融合生成性は、元々RD114 GPの修飾と結び付いており、トランスフェクトされた細胞に存在する他のウイルス成分との相互作用の影響は受けなかった。実際、細胞が発現しているかいないかや、がんレトロウイルスまたはレンチウイルスのコア・タンパク質に関係なく、同じレベルのシンシチウムが検出された（データは示さない）。さまざまなRD114 GPキメラでGPの発現に変化が見られなかったため、その結果から、細胞-細胞融合生成性の制御に関してRD114 GPの細胞質尾部が果たす役割が明らかになった。CTを通じたこの融合制御は、タイプCとタイプDの他の哺乳動物レトロウイルス（例えばMLVやMPMV）のGPに関する融合制御を思い起こさせた（2、30、33）。RD114 GPの細胞質尾部の配列を修飾すると、MLV-A GPと同様に（14、17、43）、その融合抑制特性が変化するようであった。そこでウイルス粒子を形成する上で望ましくない可能性のあるRD114 GPの修飾によって誘導される細胞変性効果を最少にするため、産生細胞の上清に含まれるビリオンをトランスフェクション後しばらくしてから（すなわち36時間後に）回収した。
実施例７：RD114 GPの細胞質尾部を修飾することによってレンチウイルス・ベクターまたはがんレトロウイルス・ベクターの類型化が変化する
RD114 GP突然変異体がSIVmac251またはMLVをベースとしたベクターを類型化する能力を、野生型RD114 GP、MLV-A GP、VSV-Gと比較した。TE671標的細胞を用い、さまざまなGPの存在下で作ったベクターの感染力を評価した（図9）。修飾されていないMLVをベースとしたベクターはうまく類型化することができた（6）が、レンチウイルスをベースとしたベクターは効率的に類型化できなかった（35）。これは、われわれの以前の結果と一致していた。RDΔYXXL GP突然変異体を用いて作ったSIVベクターとMLVベクターの両方とも、修飾されていないRD114 GPで類型化したベクターと比べて力価が1/3〜1/4になっていた（図9）。RDRのない超融合生成性突然変異体を用いて作ったベクターの力価も、野生型RD114 GPを用いて作ったベクターの力価より低かった。しかしわれわれは、この突然変異体によって及ぼされる特に強い細胞変性効果（図8）がベクター粒子の最適な形成を妨げないことを否定はできなかった。重要なことだが、RD/TRキメラGPとRD/MTRキメラGPは、SIVをベースとしたベクターを効率的に類型化した。その結果、RD/TR突然変異体の場合には、感染力価が106i.u./mlよりも大きくなった。すなわち、野生型RD114 GPで得られた値の25倍に達し、MLV-A GPまたはVSV-Gで類型化したSIVベクターで得られた感染力価よりも大きくはないにしても同程度の値になった（図9B）。それとは対照的に、同じキメラGPを用いて作ったMLV由来のベクターは、すでに力価が大きい野生型RD114 GPで類型化したベクターと比べて感染力がほんの2倍にしかならなかった（図9A）。細胞質尾部は、これらRD114 GPキメラ中で類型化されたレンチウイルス・ベクターの感染力を大きくする修飾された最少ドメインであるため、これらのデータから、MLV-AのTMDではなくCTが、SIVベクターを用いた類型形成を容易にする要素を備えていることが示唆された。RD114 GPキメラをさらに調べることにより（図7B）、この要素が、そのキメラの細胞質尾部内の想定開裂部位を含む領域に位置していることが明確になった。
ウイルスのプロテアーゼを用いてタイプCとタイプDの哺乳動物レトロウイルスのTMタンパク質（MLVではRペプチドと呼ばれる）からC末端を除去することが、その融合機能を活性化するのに不可欠であることが示されている（2、30、33）。TMタンパク質のこのカルボキシ末端のプロセシングは、ビリオンの出芽中または出芽後に起こる。細胞質尾部の開裂と、その後に続く融合生成性の活性化は、RD114 GPについてはこれまでのところ報告されていない。われわれの結果は、受容体が結合したときに糖タンパク質の融合活性を十分に発揮させるためには、RD114 TMのプロセシングも必要であるらしいことを示している。実際、未熟な停止コドン（RDRのない突然変異体）が挿入されることによってRD114 GPが切断されると、細胞-細胞融合生成性が大きくなった（図8）。これは、タイプCまたはタイプDの哺乳動物レトロウイルスのR切断型GP突然変異体の表現型と似ている（2、10、30、33）。さらに、RD114 GPの細胞質尾部と、タイプCおよびタイプDのいくつかの哺乳動物レトロウイルスのGPのCTとの間で配列をアラインメントさせてみると、RD114 GPの細胞質尾部内に、レトロウイルスのプロテアーゼによる開裂部位を形成している可能性が最も大きい長さ8個のアミノ酸配列（VHAMVLAQ）が位置することが予測された（図7A）。興味深いことに、この配列をMLV CT（突然変異体RDPrMLV）またはSIV Gagタンパク質（突然変異体RDPrSIVARLM、RDPrSIVRQAG）に由来する開裂部位で置換すると、SIVベクター類型の感染力が7倍に増大した（図9B）。同様に、HIV-1 Gagタンパク質（突然変異体RDPrHIV）に由来する開裂部位を挿入するとHIV-1をベースとしたベクターを用いた類型の形成が選択的に増大した（データは示さない）が、SIV由来のベクターを用いた類型の形成は増大しなかった（図9B）。したがってこれらの結果は、この8個のアミノ酸配列が、レンチウイルス・ベクター粒子を用いた類型形成を変化させる非常に重要な要素を含んでいることを示している。
極めて多彩な結果が、RD114 GPキメラを用いてMLVベクター粒子を類型化するときに得られた（図9A）。PDPrMLV突然変異体で類型化したMLVベクターは、野生型RD114 GPを用いて形成したウイルス類型と比べて感染力が同様であるかわずかに大きくなっていたが、レンチウイルスの開裂部位（RDPrSIVARLM、RDPrSIVRQAG、RDPrHIV）を含むRD114キメラGPは、MLVで類型化したベクターの感染力を劇的に低下させて1/20にした（図9A）。したがってRD114キメラは、レンチウイルスまたはがんレトロウイルスのコアに接続されたときには異なる振る舞いをした。それゆえこれらの結果は、特定のコア／CT相互作用がウイルスのタイプに特異的なやり方で起こり、GPの組み込みおよび／または細胞質尾部のプロセシングを制御できることを強く示唆している。
実施例８：RD114 GPの細胞質尾部を修飾することによってウイルスの組み込みが変化する
われわれは、次に、RD114 GPの修飾が、ウイルス粒子へのそのRD114 GPの組み込みに影響を与えるかどうかを調べることを試みた。この実験は、修飾されていないRD114 GPを、シンシチウムの形成を極端に多くは誘導しなかったGP突然変異体であるRDPrMLV、RDPrSIVARLM、RDPrSIVRQAG、RD/TR（図8）のサブセットと比較するために実施した。実際、他の突然変異体（RDPrHIV、RDRなし）では細胞-細胞融合生成活性が大きいために産生細胞の上清に細胞のごみが放出されることにより、精製されたビリオン調製物の品質が損なわれていた（データは示さない）。RD114 GPキメラを用いてSIVコアまたはMLVコアを有するウイルス粒子を作り、20％ショ糖クッションを通じて超遠心分離することによってそのウイルス粒子を精製した。ウイルスのコア・タンパク質と糖タンパク質の両方を検出し定量する操作を、抗CA抗体または抗RD114 GP抗体を用い、精製したビリオンの免疫ブロッティングを行なうことによって実施し、ウイルス粒子上のRD114 GPキメラの密度を測定した（図4）。ウイルス・コアの不在下で糖タンパク質だけを発現した産生細胞からの上清を超遠心分離して得たペレットの中では、GPを検出することができなかった（図4）。したがって、精製したビリオンで得られたシグナルに特異性があることが証明された。野生型RD114 GPと比較すると、RDPrSIVARLMGP突然変異体も、このGPによって感染力が大きくなるにもかかわらず、SIVコア粒子にうまく組み込まれた（図9B）。それとは対照的に、SIVベクター粒子へのRDPrMLVキメラGP、RDPrSIVRQAGキメラGP、RD/TRキメラGPの組み込みは3〜10倍になった（図4）。これは、これら突然変異体GPで非常に大きな力価が得られたことと整合性がある（図9B）。したがって、これらの結果は、SIVコア粒子へのRD114 GPキメラの組み込みと、類型化されたベクターの感染力価とが相関していることを示している。ただしRDPrSIVARLMGP突然変異体の場合は、絶対的相関からはずれていた。
同じGPキメラをMLVコア粒子に組み込む際に対照的な結果が得られた。RD/TR GPキメラの組み込みはわずかに増大して2倍になった（図4）。これは、この特別な突然変異体で得られたウイルスの力価がわずかに増大したことと整合性がある（図9A）。しかし修飾されていないRD114 GPと比較すると、RDPrMLV GP突然変異体、RDPrSIVARLMGP突然変異体、RDPrSIVRQAGGP突然変異体は、類型化されたMLVベクターに関する後者2つのGPキメラの力価が非常に小さくなっている（図9A）にもかかわらず、MLV粒子上の密度は同じくらいであった（図4）。したがって類型化されたMLVコアに関しては、GPの組み込みと感染力の相関を示すことはできなかった。
実施例９：RD114 GPの細胞質尾部を修飾することによってウイルス・コアに依存した形でその尾部の開裂が変化する
われわれは、次に、RD114 GPキメラの細胞質尾部が類型化されたMLVウイルス・コア粒子またはSIVウイルス・コア粒子において開裂されるかどうかを調べた。類型化されたこれら2つのビリオンのうちのどちらかを産生するトランスフェクトされた細胞に、35S-メチオニンと35S-システインで放射性標識した。ビリオン産生細胞のライセート、または20％ショ糖クッション上で精製したビリオンのライセートを、抗RD114 SU抗体とともにインキュベートした。糖タンパク質を免疫沈降させた後、サンプルを還元し、変性させ、免疫沈降したGP複合体のTMタンパク質を分解させた後、SDS-PAGEで分析した（図5）。ビリオン産生細胞のライセートには、予想されるように、SU糖タンパク質とTM糖タンパク質の両方がほぼ同じ量含まれていることがわかった。すべての突然変異体のTM糖タンパク質は、ゲル上で電気泳動の移動度が同じであった（図5A、図5B）。これは、異なる種類のTMのCTの大部分が、産生細胞の内部で開裂しなかったことを示している。これらの結果から、RD114 GP突然変異体の細胞-細胞融合生成性の変化はそのTMタンパク質のプロセシングに依存しておらず（図8）、本質的にその細胞質尾部の構造または配置の変化と結び付いていることも確認された。
SUサブユニットとTMブユニットの両方に関し、さまざまなRD114 GPキメラが、精製したMLVウイルス・コア上で似た強度を示した（図5A）。この結果は、そのGPの細胞質尾部を修飾してもがんレトロウイルス・コアへのGPの組み込みに影響がなかったことを示している（図4）。しかし組み込まれたTM糖タンパク質のプロセシングは、RD114 GPキメラのタイプに依存した形で検出された。実際、細胞ライセートにおけるRD114 GPキメラのTMタンパク質のサイズと比較すると、修飾されていないRD114 GP、キメラRDPrMLV、RD/TRキメラのTMサブユニットは、約2kDa短かった（図5）。この観察結果は、ウイルス・コアのプロテアーゼによってRD114 GPのTMが処理されることの遺伝子上の直接的な証拠であった。それとは対照的に、レンチウイルスのプロテアーゼに特異的な開裂部位を有するRDPrSIVARLMGP突然変異体とRDPrSIVRQAGGP突然変異体（図5A）では、処理されなかったTMだけが、MLVコア上で検出された（図7B）。これらの結果は、後者のRD114キメラGPで類型化されたMLVベクターの感染力が大きく低下していることと整合しており（図9A）、ビリオンが感染するにはRD114 GPの細胞質尾部が開裂する必要があることの確認となっていた。
MLVコアとは異なってSIVコア粒子上では、SU糖タンパク質とTM糖タンパク質の両方について、さまざまな量が検出された（図5B）。これは、さまざまなGPがビリオンに組み込まれるという結果と一致している（図4）。SUがSIV粒子に容易に組み込まれるRDPrSIVRQAGGP突然変異体とRD/TR GP突然変異体の場合には、TMタンパク質を観察することができた（図5B）。これらのRD114 GPキメラの細胞質尾部が効率的に処理されることが検出された。これは、SIVベクター類型が感染力を持つという結果（図9B）と整合性がある。修飾されていないRD114 GPのTMタンパク質と、RDPrMLV GP突然変異体、RDPrSIVARLMGP突然変異体のTMタンパク質は、ゲルの曝露という通常の条件下では容易に検出されなかった。これは、組み込みの結果と整合性がある（図9B）。ゲルの過剰曝露により、RDPrMLV GPとRDPrSIVARLMGPのTMタンパク質が処理されたことが明らかになった（データは示さない）。この結果により、RDPrMLV GPまたはRDPrSIVARLMで作ったSIVベクター粒子を用いると感染レベルが低くなることが説明された（図9B）。
実施例１０：RD114 GP細胞質尾部を修飾しても浮遊脂質内へのGPの局在化は影響を受けない
最近の報告によれば、レンチウイルスは、浮遊脂質から選択的に集合して出芽することが明らかになった（18、25、26）。したがって、RD114 GPの細胞質尾部が修飾された結果、ウイルス・アセンブリー部位において、ウイルスのさまざまなコア成分と糖タンパク質の同時局在状態が変化したというのが、類型化されたSIV粒子にいろいろなRD114 GP突然変異体が異なった組み込まれ方をすることを説明するための1つの可能性である。そこでわれわれは、RD114 GPが浮遊脂質に局在する可能性があるかどうかと、そのGPの細胞質尾部が修飾されることによって細胞の局在が変化する可能性があるかどうかを調べた。浮遊脂質は、低温で非イオン洗剤に対して抵抗力があり、ショ糖勾配遠心分離によって可溶性である膜の塊から物理的に分離することができる。さまざまなGP突然変異体をトランスフェクトした細胞の膜をこのような条件下で分画し、膜分画のGP含量をウエスタン・ブロットにより分析した（図6）。野生型RD114 GPと細胞質尾部突然変異体が、トランスフェクトした細胞のライセートの洗剤抵抗性分画の中に現われた。これは、すべてのGPが浮遊脂質に向かったことを示している。
この明細書と請求項に開示した組成物および／または方法はすべて、この明細書の開示内容に照らして困難な実験を行なうことなく製造したり実行したりすることができる。本発明の組成物と方法を好ましい実施態様に関して記述してきたが、当業者であれば、本発明の考え方、精神、範囲から逸脱することなく、組成物および／または方法を変更できることや、この明細書に記載した方法のステップまたはステップ列を変更できることは明らかであろう。さらに詳しく説明すると、化学的にも生理学的にも互いに関連しているいくつかの薬剤をこの明細書に記載した薬剤で置換しても、同じ結果または似た結果が得られることは明らかであろう。当業者にとって明らかな同様の置換物と修飾は、添付の請求項に定義された本発明の精神、範囲、考え方に含まれると考えれられる。
参考文献
以下の参考文献は、この明細書に記載した具体的な手続き、またはそれ以外の補足的な詳細を提供する限り、参考として特にこの明細書に組み込まれているものとする。
アメリカ合衆国特許第4,682,195号、
アメリカ合衆国特許第4,683,202号、
アメリカ合衆国特許第5,466,468号、
アメリカ合衆国特許第5,645,897号、
アメリカ合衆国特許第5,686,279号、
アメリカ合衆国特許第5,705,629号、
アメリカ合衆国特許第5,846,225号、
アメリカ合衆国特許第5,846,233号、
アメリカ合衆国特許第5,925,565号、
アメリカ合衆国特許第5,928,906号、
アメリカ合衆国特許第5,935,819号、
アメリカ合衆国特許第5,994,136号、
アメリカ合衆国特許第6,013,516号、
アメリカ合衆国特許第6,136,597号、
ヨーロッパ特許第266,032号。
上付き番号を付した参考文献
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括弧内に番号を示した参考文献
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その他の参考文献
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図１Ａは、SIVmac251に由来するベクターの製造。SIVmac（SIVmac251）という感染性分子クローンのゲノムである。 図１Ｂは、SIVmac251を使用し、パッケージング機能をコードする構造体と輸送ベクターを有する構造体を作った。さまざまなウイルス糖タンパク質（GP）を発現する発現構造体も設計した。黒い箱は、ウイルスの遺伝子を表わす。白い箱は、シス作用配列を示している。LTR、長い末端反復配列；CMV、ヒト・サイトメガロウイルス極初期プロモータ；PBS、プライマー結合部位；MSD、主要スプライス・ドナー部位；ψ、パッケージング配列；RRE、Rev応答エレメント；PHMG、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素Aレダクターゼ（HMG）プロモータ；ポリA、ポリアデニル化部位；SD、スプライス・ドナー部位；SA、スプライス・アクセプター部位；SV40、サル・ウイルス40初期プロモータ。パッケージング機能を有するプラスミド、ウイルス糖タンパク質、輸送ベクターを293T細胞に同時にトランスフェクトすることにより、ベクター粒子を製造した。トランスフェクトされた細胞の上清を一過性の発現をしている間に回収し、超遠心分離によって濃縮し、標的細胞への形質導入に使用した。 さまざまなウイルス糖タンパク質で類型化したSIVmac由来のベクターの感染力価。レトロウイルスまたは非レトロウイルス（×印）に由来する図に示したGPを用い、GFPマーカー遺伝子を含むベクターを製造した。EboV、エボラウイルス；FPV-HA、トリ・インフルエンザ・ウイルスのヘマグルチニン；GALV、テナガザル白血病ウイルス；MLV-A、両種指向性ネズミ白血病ウイルス；LCMV、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス；VSV、水疱性口内炎ウイルス。TE671標的細胞に濃縮していないベクター調製物の希釈液を感染させ、感染後3日目にGFP+細胞の割合を測定した。感染力価を、GFP i.u./mlを単位として計算した。2回の実験で、FPV-HAを発現するベクター産生細胞を2Uのウェルシュ菌のノイラミニダーゼ（シグマ-オールドリッチ社、フランス）で24時間にわたって処理し、産生細胞の表面からHAで類型化した粒子の放出を誘導した（FPV-HA+NA）。 RD114糖タンパク質の細胞質ドメインをMLV-A GPの細胞質ドメインで置換したRD114/TRキメラGPの概略図である。3つのトポロジカル・ドメイン、すなわち細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質尾部の配列を示してある。GALV/TRキメラGPも同様にして修飾した。 ビリオンへのRD114 GPとGALV/TR GPの組み込みを、20％ショ糖クッションを通じてペレット化したSIVベクター粒子に対して抗RD114SUと抗CA抗体を利用して行なった免疫ブロットから評価した。分子量マーカーの位置を示してある（kDa）。 図３Ａは、類型化されたSIVベクターのストックのキャラクテリゼーションである。SIVmacをベースとしたベクターのストックを図に示したGPで類型化し、超遠心分離によって濃縮したものの感染力価。TE671標的細胞に対して行なった9回の実験から得られた平均力価±標準偏差を示してある。 図３Ｂにおいては、精製した代表的なベクターのストックに対して抗SIV-CA（キャプシド）抗体を利用して免疫ブロッティングを実施することにより、物理的粒子の検出を行なった。 図４Ａは、類型化されたSIVベクター・ビリオンのヒト血清における安定性を示す。類型化された感染性SIVベクター粒子（懸濁緩衝液50μlに50,000GFP i.u.）を、50μlの新鮮なヒト血清（網棒）または熱で不活化したヒト血清（黒棒）と混合した。比較用として、ビリオンを、熱で不活化したウシ胎仔血清（FCS）50μlと混合した。ビリオン／血清混合物を37℃にて1時間にわたってインキュベートした後、TE671細胞に形質導入した。数値は、霊長類の血清の中でインキュベートしたビリオンの力価を、同じビリオンをFCSの中でインキュベートした場合の力価で割った値を示している（％）。異なる3人のドナーからの血清を用いて行なった実験の結果を示してある。ヒト血清#659を用いた実験は3回行ない、平均値±標準偏差として示してある。 図４Ｂは、類型化されたSIVベクター・ビリオンのマカク血清における安定性を示す。類型化された感染性SIVベクター粒子（懸濁緩衝液50μlに50,000GFP i.u.）を、50μlの新鮮なマカク血清（網棒）または熱で不活化したマカク血清（黒棒）と混合した。比較用として、ビリオンを、熱で不活化したウシ胎仔血清（FCS）50μlと混合した。ビリオン／血清混合物を37℃にて1時間にわたってインキュベートした後、TE671細胞に形質導入した。数値は、霊長類の血清の中でインキュベートしたビリオンの力価を、同じビリオンをFCSの中でインキュベートした場合の力価で割った値を示している（％）。異なる3匹のドナーからの血清を用いて行なった実験の結果を示してある。
ヒトとマカクのCD34+細胞への形質導入。ヒトの動員血に由来するCD34+細胞をTPOとともに一晩にわたってインキュベートすることによってあらかじめ刺激し、VSV-G（三角形）、MLV-A GP（黒丸）、GALV/TR GP（白丸）、RD114/TR GP（黒四角）のいずれかで類型化したSIVベクターを16時間にわたってそのCD34+細胞に異なる感染多重度（MOI）で形質導入した。それぞれのCD34+細胞について、形質導入を2回行なった。すなわち、プレートにコーティングしたCH-296のレトロネクチン・ポリペプチドの不在下と存在下で形質導入した。感染後、細胞をPBSの中で洗浄し、Flt3-L、TPO、SCFの存在下でさらに3日間にわたって培養した後、形質導入の効率を評価した。代表的な実験の投与量-応答曲線を同じバッチのCD34+細胞について示してある。また、いろいろなドナーからと類型化されたベクターのストックからのCD34+細胞で少なくとも4回の実験を実施したときの最大形質導入効率の統計的分析結果も示してある。 ヒトとマカクのCD34+細胞への形質導入。カニクイザルの骨髄に由来するCD34+細胞をTPOとともに一晩にわたってインキュベートすることによってあらかじめ刺激し、VSV-G（三角形）、MLV-A GP（黒丸）、GALV/TR GP（白丸）、RD114/TR GP（黒四角）のいずれかで類型化したSIVベクターを16時間にわたってそのCD34+細胞に異なる感染多重度（MOI）で形質導入した。それぞれのCD34+細胞について、形質導入を2回行なった。すなわち、プレートにコーティングしたCH-296のレトロネクチン・ポリペプチドの不在下と存在下で形質導入した。感染後、細胞をPBSの中で洗浄し、Flt3-L、TPO、SCFの存在下でさらに3日間にわたって培養した後、形質導入の効率を評価した。代表的な実験の投与量-応答曲線を同じバッチのCD34+細胞について示してある。また、いろいろなドナーからと類型化されたベクターのストックからのCD34+細胞で少なくとも4回の実験を実施したときの最大形質導入効率の統計的分析結果も示してある。 ヒト末梢血リンパ球への形質導入。ヒト末梢血リンパ球（PBL）に、図に示したSIVベクター類型を異なる感染多重度（MOI）で形質導入した。ヒトPBLを可溶性の抗CD3抗体と抗CD28抗体で24時間にわたって活性化させた。マカクPBLをコンカナバリンAとrhIL2で2日間にわたって活性化させた後、感染させた。活性化したPBLに、VSV-G（三角形）、MLV-A GP（黒丸）、GALV/TR GP（白丸）、RD114/TR GP（黒四角）のいずれかで類型化したSIVベクターを4時間にわたって感染させた。感染した細胞をPBSの中で洗浄し、PBL培地の中で増殖させ、感染後5日目に形質導入の効率を評価した。異なるドナーに由来するPBLを用いて行なった実験の結果を示してある。また、いろいろなドナーからと類型化されたベクターのストックからのCD34+細胞で少なくとも4回の実験を実施したときの最大形質導入効率の統計的分析結果も示してある。 マカク末梢血リンパ球への形質導入。カニクイザル末梢血リンパ球（PBL）に、図に示したSIVベクター類型を異なる感染多重度（MOI）で形質導入した。ヒトPBLを可溶性の抗CD3抗体と抗CD28抗体で24時間にわたって活性化させた。マカクPBLをコンカナバリンAとrhIL2で2日間にわたって活性化させた後、感染させた。活性化したPBLに、VSV-G（三角形）、MLV-A GP（黒丸）、GALV/TR GP（白丸）、RD114/TR GP（黒四角）のいずれかで類型化したSIVベクターを4時間にわたって感染させた。感染した細胞をPBSの中で洗浄し、PBL培地の中で増殖させ、感染後5日目に形質導入の効率を評価した。異なるドナーに由来するPBLを用いて行なった実験の結果を示してある。また、いろいろなドナーからと類型化されたベクターのストックからのCD34+細胞で少なくとも4回の実験を実施したときの最大形質導入効率の統計的分析結果も示してある。
図７Ａは、RD114 GP細胞質尾部突然変異体の図である。RD114 GPのTMサブユニットと、哺乳動物レトロウイルスのタイプC（MLV-A）またはタイプD（メーソン-ファイザーサル・ウイルス（MPMV））に含まれるエンベロープ糖タンパク質のTMのアラインメント。（：）は、RD114と比べた場合にMLV-AとMPMVのTMにも同じアミノ酸があることを示す。保存されているアミノ酸、例えば脂肪族残基ではI、L、V；正に帯電している残基ではKまたはR；負に帯電している残基ではDまたはEを強調してある。各GPの膜貫通ドメイン（M）を四角で囲ってある。細胞質尾部は、2つのセグメントからなる。すなわち、GPのカルボキシ末端（R）と、ウイルス・コアのプロテアーゼによってそのカルボキシ末端（R）を除去した後のビリオン上に見いだされる成熟GPの尾部（T）である。プロテアーゼによる開裂部位（四角で囲んだ部分）とYXXLエンドサイトーシス・モチーフ（下線部）を、それぞれのGPについて示してある。 図７Ｂにおいては、それぞれの突然変異体について、RD114 GPから変化したカルボキシ末端の配列に下線が引いてある。異なるいろいろなキメラGPの膜貫通ドメインだけを四角で囲んである。（*）は、RDRのないキメラGPに挿入された未熟停止コドンの位置を示す。（'）は、ウイルス・コアのプロテアーゼによる開裂位置を示す。 アッセイの結果。トランスフェクトされた細胞を2cm2のウエルに植えてその細胞内のシンシチウムの数を数えることによって測定した、GPキメラの細胞-細胞融合生成性。モックをトランスフェクトした細胞（GPなし）を用い、シンシチウムのバックグラウンドの数を測定した（ここではその数を差し引く）。データは、3回の独立した実験の結果を示している。 図９Ａは、ベクター類型の感染力を示す。図に示したGP突然変異体で類型化したMLVベクターの感染力を、GFP i.u./mlを単位として示してある。このグラフは、4回の独立した実験についての平均値±標準偏差を示している。比較のため、MLV-A GPまたはVSV-Gで類型化したベクターを用いて得られた結果も示してある。 図９Ｂは、ベクター類型の感染力を示す。図に示したGP突然変異体で類型化したSIVベクターの感染力をGFP i.u./mlを単位として示してある。このグラフは、4回の独立した実験についての平均値±標準偏差を示している。比較のため、MLV-A GPまたはVSV-Gで類型化したベクターを用いて得られた結果も示してある。
【配列表】
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Claims (37)

  1. MLV-Aに由来する細胞尾部ドメインと、ネコ内在性ウイルスRD114に由来する膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインとを含むキメラ糖タンパク質。
  2. 請求項1のキメラ糖タンパク質をコードしている核酸。
  3. 配列ID番号1の配列を含む、請求項2に記載の核酸。
  4. 請求項2の核酸を含む発現構造体。
  5. 請求項4の構造体をトランスフェクトされた細胞。
  6. 請求項1のキメラ糖タンパク質を含むベクター粒子。
  7. 類型化されている、請求項6のベクター粒子。
  8. 組み換えウイルス・ベクター構造体をさらに含む、請求項6のベクター粒子。
  9. 上記ベクター構造体がレトロウイルスまたはレンチウイルスに由来する、請求項8のベクター粒子。
  10. 上記ベクター構造体がSIVに由来する、請求項9のベクター粒子。
  11. 上記ベクター構造体がHIVに由来する、請求項9のベクター粒子。
  12. 上記ベクター構造体が導入遺伝子をさらに含む、請求項8のベクター粒子。
  13. 上記導入遺伝子がマーカー遺伝子またはレポータ遺伝子である、請求項12のベクター粒子。
  14. 上記導入遺伝子がグリーン蛍光タンパク質（GFP）である、請求項13のベクター粒子。
  15. 上記導入遺伝子が治療用遺伝子である、請求項12のベクター粒子。
  16. 上記導入遺伝子ががん遺伝子またはがん原遺伝子である、請求項15のベクター粒子。
  17. 上記導入遺伝子が薬剤感受性遺伝子である、請求項15のベクター粒子。
  18. 細胞に形質導入する方法であって、
    a）形質導入する細胞を取得するステップと；
    b）請求項8の類型化されたベクター粒子を取得するステップと；
    c）形質導入が十分に起こる条件下で上記細胞を（b）のベクター粒子と接触させるステップとを含む方法。
  19. 形質導入を増大させるのに十分な量のレトロネクチンを提供するステップをさらに含む、請求項18に記載の方法。
  20. 上記細胞に試験管内で形質導入を行なう、請求項18に記載の方法。
  21. 上記細胞に生体内で形質導入を行なう、請求項18に記載の方法。
  22. 上記細胞が脊椎生物の細胞である、請求項18に記載の方法。
  23. 上記細胞が霊長類の細胞である、請求項18に記載の方法。
  24. 上記細胞がヒトの細胞である、請求項18に記載の方法。
  25. 上記細胞がCD34+細胞またはPBL細胞である、請求項18に記載の方法。
  26. 請求項18に記載の方法によって形質導入された細胞。
  27. 類型化された組み換えベクター粒子を製造する方法であって、
    （a）（i）少なくとも1つのベクター構造体と；
    （ii）少なくとも1つのパッケージング構造体と；
    （iii）請求項1のキメラ糖タンパク質をコードしている発現構造体とを細胞にトランスフェクトして産生細胞を作り出すステップと；
    （c）その産生細胞を培地内で培養するステップと；
    （d）その産生細胞を培地から分離することにより、その培地から組み換えウイルス・ベクター粒子を回収するステップを含む方法。
  28. 細胞に形質導入する方法であって、その細胞の形質導入が組み換えベクターによってなされる条件下で、請求項27に従って製造したベクター粒子とその細胞を接触させるステップを含む方法。
  29. 上記細胞がヒトの細胞である、請求項28に記載の方法。
  30. 上記細胞が造血幹細胞である、請求項29に記載の方法。
  31. 上記細胞がヒトのCD34+細胞である、請求項30に記載の方法。
  32. 細胞に対し、幹細胞の多能性が実質的に失われることなく細胞増殖が促進されるような処理を行なう、請求項30に記載の方法。
  33. 上記細胞に生体内で形質導入を行なう、請求項28に記載の方法。
  34. 上記細胞に試験管内で形質導入を行なう、請求項28に記載の方法。
  35. 形質導入された上記細胞を、対象とする動物に導入する、請求項34に記載の方法。
  36. 上記対象がヒトである、請求項35に記載の方法。
  37. 造血疾患またはリンパ造血疾患の治療を目的とした医薬を製造における、請求項15〜17のいずれか1項によるレンチウイルス・ベクターの使用。
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