JP2005523016A - 熱安定性dnaポリメラーゼ及びその製造方法 - Google Patents
熱安定性dnaポリメラーゼ及びその製造方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
熱安定性酵素の精製
従来、生物から細胞内タンパク質の調製を容易にするために、種々の方法が用いられてきた。最初のステップとして、通常、対象とする生物又は細胞の内容物を、例えば、細胞の溶解、破裂及び/又は透過処理によって遊離させる。この内容物の放出に続いて、多くは、一連のクロマトグラフィー、沈殿及び/又は選択的結合ステップによって、1種以上の所望のタンパク質を細胞抽出物から精製することができる。
Taq DNA Polymerase (AmpliTaqO) (SEQ ID NO: 1)
1 mrgmlplfep kgrvllvdgh hlayrtfhal kglttsrgep vqavygfaks llkalkedgd
61 avivvfdaka psfrheaygg ykagraptpe dfprqlalik elvdllglar levpgyeadd
121 vlaslakkae kegyevrilt adkdlyqlls drihvlhpeg ylitpawlwe kyglrpdqwa
181 dyraltgdes dnlpgvkgig ektarkllee wgsleallkn ldrlkpaire kilahmddlk
241 lswdlakvrt dlplevdfak rrepdrerlr aflerlefgs llhefglles pkaleeapwp
301 ppegafvgfv lsrkepmwad llalaaargg rvhrapepyk alrdlkearg llakdlsvla
361 lreglglppg ddpmllayll dpsnttpegv arryggewte eageraalse rlfanlwgrl
421 egeerllwly reverplsav lahmeatgvr ldvaylrals levaeeiarl eaevfrlagh
481 pfnlnsrdql ervlfdelgl paigktektg krstsaavle alreahpive kilqyreltk
541 lkstyidplp dlihprtgrl htrfnqtata tgrlsssdpn lqnipvrtpl gqrirrafia
601 eegwllvald ysqielrvla hlsgdenlir vfqegrdiht etaswmfgvp reavdplmrr
661 aaktinfgvl ygmsahrlsq elaipyeeaq afieryfqsf pkvrawiekt leegrrrgyv
721 etlfgrrryv pdlearvksv reaaermafn mpvqgtaadl mklamvklfp rleemgarml
781 lqvhdelvle apkeraeava rlakevmegv yplavpleve vgigedwlsa ke
Tth DNA Polymerase (SEQ ID NO: 2)
1 meamlplfep kgrvllvdgh hlayrtffal kglttsrgep vqavygfaks llkalkedgy
61 kavfvvfdak apsfrheaye aykagraptp edfprqlali kelvdllgft rlevpgyead
121 dvlatlakka ekegyevril tadrdlyqlv sdrvavlhpe ghlitpewlw ekyglrpeqw
181 vdfralvgdp sdnlpgvkgi gektalkllk ewgslenllk nldrvkpenv rekikahled
241 lrlslelsrv rtdlplevdl aqgrepdreg lraflerlef gsllhefgll eapapleeap
301 wpppegafvg fvlsrpepmw aelkalaacr dgrvhraadp laglkdlkev rgllakdlav
361 lasregldlv pgddpmllay lldpsnttpe gvarryggew tedaahrall serlhrnllk
421 rlegeekllw lyhevekpls rvlahmeatg vrrdvaylqa lslelaeeir rleeevfrla
481 ghpfnlnsrd qlervlfdel rlpalgktqk tgkrstsaav lealreahpi vekilqhrel
541 tklkntyvdp lpslvhprtg rlhtrfnqta tatgrlsssd pnlqnipvrt plgqrirraf
601 vaeagwalva ldysqielrv lahlsgdenl irvfqegkdi htqtaswmfg vppeavdplm
661 rraaktvnfg vlygmsahrl sqelaipyee avafieryfq sfpkvrawie ktleegrkrg
721 yvetlfgrrr yvpdlnarvk svreaaerma fnmpvqgtaa dlmklamvkl fprlremgar
781 mllqvhdell leapqaraee vaalakeame kayplavple vevgmgedwl sakg
Thermus oshimai DNA Polymerase (Tsp sps17) (SEQ ID NO: 3)
1 mlplfepkgr vllvdghhla yrtffalkgl ttsrgepvqa vygfaksllk alkedgevai
61 vvfdakapsf rheayeayka graptpedfp rqlalikelv dllglvrlev pgfeaddvla
121 tlakkaereg yevrilsadr dlyqllsdri hllhpegevl tpgwlqeryg lsperwveyr
181 alvgdpsdnl pgvpgigekt alkllkewgs leailknldq vkpervreai rnnldklqms
241 lelsrlrtdl plevdfakrr epdweglkaf lerlefgsll hefglleapk eaeeapwppp
301 ggaflgflls rpepmwaell alagakegrv hraedpvgal kdlkeirgll akdlsvlalr
361 egreippgdd pmllaylldp gntnpegvar ryggewkeda aarallserl wqalyprvae
421 eerllwlyre verplaqvla hmeatgvrld vpylealsqe vafelerlea evhrlaghpf
481 nlnsrdqler vlfdelglpp igktektgkr stsaavlell reahpivgri leyrelmklk
541 styidplprl vhpktgrlht rfnqtatatg rlsssdpnlq nipvrtplgq rirkafiaee
601 ghllvaldys qielrvlahl sgdenlirvf regkdihtet aawmfgvppe gvdgamrraa
661 ktvnfgvlyg msahrlsqel sipyeeaaaf ieryfqsfpk vrawiaktle egrkkgyvet
721 lfgrrryvpd lnarvksvre aaermafnmp vqgtaadlmk lamvklfprl rplgvrillq
781 vhdelvleap karaeeaaql aketmegvyp lsvplevevg mgedwlsaka
Pfu DNA Polymerase (SEQ ID NO: 4)
1 mildvdyite egkpvirlfk kengkfkieh drtfrpyiya llrddskiee vkkitgerhg
61 kivrivdvek vekkflgkpi tvwklylehp qdvptirekv rehpavvdif eydipfakry
121 lidkglipme geeelkilaf dietlyhege efgkgpiimi syadeneakv itwknidlpy
181 vevvsserem ikrflriire kdpdiivtyn gdsfdfpyla kraeklgikl tigrdgsepk
241 mqrigdmtav evkgrihfdl yhvitrtinl ptytleavye aifgkpkekv yadeiakawe
301 sgenlervak ysmedakaty elgkeflpme iqlsrlvgqp lwdvsrsstg nlvewfllrk
361 ayernevapn kpseeeyqrr lresytggfv kepekglwen ivyldfraly psiiithnvs
421 pdtlnlegck nydiapqvgh kfckdipgfi psllghllee rqkiktkmke tqdpiekill
481 dyrqkaikll ansfygyygy akarwyckec aesvtawgrk yielvwkele ekfgfkvlyi
541 dtdglyatip ggeseeikkk alefvkyins klpglleley egfykrgffv tkkryavide
601 egkvitrgle ivrrdwseia ketqarvlet ilkhgdveea vrivkeviqk lanyeippek
661 laiyeqitrp lheykaigph vavakklaak gvkikpgmvi gyivlrgdgp isnrailaee
721 ydpkkhkyda eyyienqvlp avlrilegfg yrkedlryqk trqvgltswl nikks
Bst DNA Polymerase (SEQ ID NO: 5)
1 mknklvlidg nsvayraffa lpllhndkgi htnavygftm mlnkilaeeq pthilvafda
61 gkttfrhetf qdykggrqqt ppelseqfpl lrellkayri payeldhyea ddiigtmaar
121 aeregfavkv isgdrdltql aspqvtveit kkgitdiesy tpetvvekyg ltpeqivdlk
181 glmgdksdni pgvpgigekt avkllkqfgt venvlaside ikgeklkenl rqyrdlalls
241 kqlaaicrda pveltlddiv ykgedrekvv alfqelgfqs fldkmavqtd egekplagmd
301 faiadsvtde mladkaalvv evvgdnyhha pivgialane rgrfflrpet aladpkflaw
361 lgdetkkktm fdskraaval kwkgielrgv vfdlllaayl ldpaqaagdv aavakmhqye
421 avrsdeavyg kgakrtvpde ptlaehlvrk aaaiwaleep lmdelrrneq drllteleqp
481 lagilanmef tgvkvdtkrl eqmgaelteq lqaverriye lagqefnins pkqlgtvlfd
541 klqlpvlkkt ktgystsadv leklaphhei vehilhyrql gklqstyieg llkvvhpvtg
601 kvhtmfnqal tqtgrlssve pnlqnipirl eegrkirqaf vpsepdwlif aadysqielr
661 vlahiaeddn lieafrrgld ihtktamdif hvseedvtan mrrqakavnf givygisdyg
721 laqnlnitrk eaaefieryf asfpgvkqym dnivqeakqk gyvttllhrr rylpditsrn
781 fnvrsfaert amntpiqgsa adiikkamid lsvrlreerl qarlllqvhd elileapkee
841 ierlcrlvpe vmeqavtlrv plkvdyhygp twydak
Tli DNA Polymerase (SEQ ID NO: 6)
1 mildtdyitk dgkpiirifk kengefkiel dphfqpyiya llkddsaiee ikaikgerhg
61 ktvrvldavk vrkkflgrev evwklifehp qdvpamrgki rehpavvdiy eydipfakry
121 lidkglipme gdeelkllaf dietfyhegd efgkgeiimi syadeeearv itwknidlpy
181 vdvvsnerem ikrfvqvvke kdpdviityn gdnfdlpyli kraeklgvrl vlgrdkehpe
241 pkiqrmgdsf aveikgrihf dlfpvvrrti nlptytleav yeavlgktks klgaeeiaai
301 weteesmkkl aqysmedara tyelgkeffp meaelaklig qsvwdvsrss tgnlvewyll
361 rvayarnela pnkpdeeeyk rrlrttylgg yvkepekglw eniiyldfrs lypsiivthn
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541 yadtdgfyat ipgekpelik kkakeflnyi nsklpgllel eyegfylrgf fvtkkryavi
601 deegrittrg levvrrdwse iaketqakvl eailkegsve kavevvrdvv ekiakyrvpl
661 eklviheqit rdlkdykaig phvaiakrla argikvkpgt iisyivlkgs gkisdrvill
721 teydprkhky dpdyyienqv lpavlrilea fgyrkedlry qsskqtglda wlkr
KOD DNA Polymerase (SEQ ID NO: 7)
1 mildtdyite dgkpvirifk kengefkiey drtfepyfya llkddsaiee vkkitaerhg
61 tvvtvkrvek vqkkflgrpv evwklyfthp qdvpairdki rehpavidiy eydipfakry
121 lidkglvpme gdeelkmlaf dietlyhege efaegpilmi syadeegarv itwknvdlpy
181 vdvvsterem ikrflrvvke kdpdvlityn gdnfdfaylk krceklginf algrdgsepk
241 iqrmgdrfav evkgrihfdl ypvirrtinl ptytleavye avfgqpkekv yaeeittawe
301 tgenlervar ysmedakvty elgkeflpme aqlsrligqs lwdvsrsstg nlvewfllrk
361 ayernelapn kpdekelarr rqsyeggyvk eperglweni vyldfr
421
481
541
601
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841 yrqraikila n
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961
1021
1081
1141
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1261
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1561 eqitrdlkdy katgphvava krlaargvki rpgtvisyiv lkgsgrigdr aipfdefdpt
1621 khkydaeyyi enqvlpaver ilrafgyrke dlryqktrqv glsawlkpkg t
1 mildvdyite dgkpvirvfk kdkgefkiey drefepyiya llrddsaiee iekitaerhg
61 kvvkvkraek vkkkflgrsv evwvlyfthp qdvpairpdk irkhpavidi yeydipfakr
121 ylidkglipm egdeelklms fdietlyheg eefgtgpilm isyadesear vitwkkidlp
181 yvdvvsteke mikrflkvvk ekdpdvlity dgdnfdfayl kkrceklgvs ftlgrdgsep
241 kiqrmgdrfa vevkgrihfd lypairrtin lptytleavy eavfgkpkek vyaeeiataw
301 etgeglegva rysmedarvt yelgreffpm eaqlsrligq glwdvsrsst gnlvewfllr
361 kayernelap nkpderelar rrggyaggyv keperglwdn ivyldfrsly psiiithnvs
421 pdtlnregck sydvapqvgh kfckdfpgfi psllgnllee rqkikrkmka tldplerkll
481 dyrqraikil ansfygyygy ararwyckec aesvtawgre yiemvirele ekfgfkdlya
541 dtdglhatip gadretvkkk dleflnyinp klpglleley egfysrgffv tkkkyavide
601 egkittrgle ivrrdwseia ketlarvlea ilrhgdveea vrivkeetek lskyevppek
661 lviteqitre lkdykatgph vaiakrlaar gikirpgtvi syivlkgsgr igdraipfde
721 fdptkhryda dyyienqvlp averilrafg ykkederyqk trqvglgawl gmggerlkl
Tba DNA Polymerase (SEQ ID NO: 9)
1 mildvdyite dgkpvirvfk kdkgefkiey drefepyiya llrddsaiee iekitaerhg
61 kvvkvkraek vkkkflgrsv evwvlyfthp qdvpairpdk irkhpavidi yeydipfakr
121 ylidkglipm egdeelklms fdietlyheg eefgtgpilm isyadesear vitwkkidlp
181 yvdvvsteke mikrflkvvk ekdpdvlity dgdnfdfayl kkrceklgvs ftlgrdgsep
241 kiqrmgdrfa vevkgrihfd lypairrtin lptytleavy eavfgkpkek vyaeeiataw
301 etgeglegva rysmedarvt yelgreffpm eaqlsrligq glwdvsrsst gnlvewfllr
361 kayernelap nkpderelar rrggyaggyv keperglwdn ivyldfrsly psiiithnvs
421 pdtlnregck sydvapqvgh kfckdfpgfi psllgnllee rqkikrkmka tldplerkll
481 dyrqraikil ansfygyygy ararwyckec aesvtawgre yiemvirele ekfgfkdlya
541 dtdglhatip gadretvkkk dleflnyinp klpglleley egfysrgffv tkkkyavide
601 egkittrgle ivrrdwseia ketlarvlea ilrhgdveea vrivkeetek lskyevppek
661 lviteqitre lkdykatgph vaiakrlaar gikirpgtvi syivlkgsgr igdraipfde
721 fdptkhryda dyyienqvlp averilrafg ykkederyqk trqvglgawl gmggerlkl
Taq D271 F667Y DNA Polymerase (Thermo Sequenase O) (SEQ ID NO: 10)
1
61
121
181
241 mlerlefgs llhefglles pkaleeapwp
301 ppegafvgfv lsrkepmwad llalaaargg rvhrapepyk alrdlkearg llakdlsvla
361 lreglglppg ddpmllayll dpsnttpegv arryggewte eageraalse rlfanlwgrl
421 egeerllwly reverplsav lahmeatgvr ldvaylrals levaeeiarl eaevfrlagh
481 pfnlnsrdql ervlfdelgl paigktektg krstsaavle alreahpive kilqyreltk
541 lkstyidplp dlihprtgrl htrfnqtata tgrlsssdpn lqnipvrtpl gqrirrafia
601 eegwllvald ysqielrvla hlsgdenlir vfqegrdiht etaswmfgvp reavdplmrr
661 aaktinygvl ygmsahrlsq elaipyeeaq afieryfqsf pkvrawiekt leegrrrgyv
721 etlfgrrryv pdlearvksv reaaermafn mpvqgtaadl mklamvklfp rleemgarml
781 lqvhdelvle apkeraeava rlakevmegv yplavpleve vgigedwlsa ke
Tth D273 F668Y DNA Polymerase (SEQ ID NO: 11)
1
61
121
181
241 mlerlef gsllhefgll eapapleeap
301 wpppegafvg fvlsrpepmw aelkalaacr dgrvhraadp laglkdlkev rgllakdlav
361 lasregldlv pgddpmllay lldpsnttpe gvarryggew tedaahrall serlhrnllk
421 rlegeekllw lyhevekpls rvlahmeatg vrrdvaylqa lslelaeeir rleeevfrla
481 ghpfnlnsrd qlervlfdel rlpalgktqk tgkrstsaav lealreahpi vekilqhrel
541 tklkntyvdp lpslvhprtg rlhtrfnqta tatgrlsssd pnlqnipvrt plgqrirraf
601 vaeagwalva ldysqielrv lahlsgdenl irvfqegkdi htqtaswmfg vppeavdplm
661 rraaktvnyg vlygmsahrl sqelaipyee avafieryfq sfpkvrawie ktleegrkrg
721 yvetlfgrrr yvpdlnarvk svreaaerma fnmpvqgtaa dlmklamvkl fprlremgar
781 mllqvhdell leapqaraee vaalakeame kayplavple vevgmgedwl sakg
Taq D271 F667Y E681W DNA Polymerase (SEQ ID NO: 12)
1
61
121
181
241 mlerlefgs llhefglles pkaleeapwp
301 ppegafvgfv lsrkepmwad llalaaargg rvhrapepyk alrdlkearg llakdlsvla
361 lreglglppg ddpmllayll dpsnttpegv arryggewte eageraalse rlfanlwgrl
421 egeerllwly reverplsav lahmeatgvr ldvaylrals levaeeiarl eaevfrlagh
481 pfnlnsrdql ervlfdelgl paigktektg krstsaavle alreahpive kilqyreltk
541 lkstyidplp dlihprtgrl htrfnqtata tgrlsssdpn lqnipvrtpl gqrirrafia
601 eegwllvald ysqielrvla hlsgdenlir vfqegrdiht etaswmfgvp reavdplmrr
661 aaktinygvl ygmsahrlsq wlaipyeeaq afieryfqsf pkvrawiekt leegrrrgyv
721 etlfgrrryv pdlearvksv reaaermafn mpvqgtaadl mklamvklfp rleemgarml
781 lqvhdelvle apkeraeava rlakevmegv yplavpleve vgigedwlsa ke
熱安定性DNAポリメラーゼの使用
本発明の精製熱安定性酵素を得れば、それを当業者に周知の標準法に用いることができる。特にDNAポリメラーゼ(例えば、先の「精製」の項に記載のもの)に関して、このような方法としては、特に限定されないが、DNAポリメラーゼ活性反応、DNAシークエンシング反応、PCRなどの増幅反応、一本鎖エンドヌクレアーゼ反応、二本鎖エンドヌクレアーゼ反応、一本鎖エクソヌクレアーゼ反応及び二本鎖エクソヌクレアーゼ反応が挙げられる。例えば、ロイヤー(Lawyer)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry) 1989年4月15日;264(11):6427〜37頁;コング(Kong)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry)1993年1月25日;268(3):1965〜75頁;タボール(Tabor)及びリチャードソン(Richardson)、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry)1989年4月15;264(11):6447〜58頁;及びリアミシェブ(Lyamichev)ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスズ・オブ・ジ・ユーエスエー(Proceedings of the National Academy of Sciences of USA)1999年5月25日;96(11):6143〜8頁参照。DNAシークエンシング法が特に好ましく、ジデオキシ鎖終結シークエンシング法が最も好ましい。例えば、ロー、クラブトリー(Roe, Crabtree)及びカーン(Khan)、「DNA Isolation and Sequencing」(エッセンシャル・テクニークス・シリーズ(Essential Techniques Series))、John Wiley & Sons、1996;Graham及びHill編、DNA Sequencing Protocols、第2版、Humana Press, 2001参照。
R−O−(CH2)x−CH3 R=グルコース、マルトース、ラクトース、キシロース、ガラクトース、x=5〜16;
R−S−(CH2)x−CH3 R=グルコース、マルトース、ラクトース、 キシロース、ガラクトース、x=5〜16、
n−ドデシル−β−D−マルトシド(「ドデシルマルトシド」)、n−ノニル−β−D−グルコピラノシド、n−オクチル−β−D−グルコピラノシド(「オクチルグルコシド」)、n−ヘプチル−β−D−グルコピラノシド、 n−ヘキシル−β−D−グルコピラノシド及びオクチル−β−D−チオグルコピラノシドが挙げられる。
この実施例は、凍結細菌細胞ペーストから好熱性のDNAポリメラーゼを精製する方法を記載する。
溶解緩衝液は、Tris HCl(pH8.5)、EDTA及び硫酸アンモニウムを混合することにより調製した。緩衝液溶液中のTris HCl、EDTA及び硫酸アンモニウムの最終濃度は、それぞれ50mM、2mM及び1Mとした。この緩衝液溶液のpHを、室温で8.50±0.1に調整した。緩衝液を4℃で最大1週間保存し、使用前に濾過した。
組換え熱安定性DNAポリメラーゼを発現している大腸菌のペーストを、細菌細胞溶解の前日に−80℃のフリーザーから4℃へ移した。予め冷却した溶解緩衝液をこの細胞(5ml/g)へ加え、その後、直ちにPMSF(100mM)を加えて均質になるまで連続して混合した。サンプルのその他の部分を溶解され得るまで4℃で保存するならば、大容量のサンプルを、溶解ステップ用に分割することができる。
溶解した細胞の容器を、変性させるため、予め加熱した85±2℃の水浴中に入れた。溶解物の温度を、溶解物中に置いた温度計でモニタリングした。温度が75±2℃に達するとすぐに、サンプルを40分間インキュベートした。40分後、サンプルを回収し、<10℃まで冷却するために、穏やかに旋回させながら直ちに氷上に置いた。冷却した細胞を1L瓶へ分配した。細胞抽出物のうち少量のサンプルを(<200μl)、後にサンプルの収率を評価するために残した。
清澄化細胞抽出物をブチルセファロースFFカラムへ添加する前に、カラムに緩衝液Aを流した。ブチルセファロースカラムの流出液の伝導率及びpHを調べ、調整した。伝導率はブチルセファロース緩衝液Aの±10%で、pHは±0.3pHでなくてはならない。清澄化細胞抽出物の伝導率も測定した。それはブチルセファロース緩衝液Aの10%以内でなくてはならない。調整は不要であるはずである。
次にサンプルを透析用に調製した。プールしていたブチル画分に沈殿物質があるならば、透析前に濾過する。ダイアフィルトレーションも用いてDNAポリメラーゼを含む画分を濃縮した。サンプル容積が1L未満となると、サンプルを透析チューブに入れ、グリセロールを含む3Lの最終緩衝液に対して一晩透析した。緩衝液を、その日の終わりに交換し、翌日の朝に再び交換した。DNAポリメラーゼを透析から回収した。
25mM TAPS(トリス−ヒドロキシメチル−メチルアミノプロパンスルホン酸)緩衝液、pH9.3(25℃で測定)、50mM KCl、2mM MgCl2、1mM 2−メルカプトエタノール、dGTP、dCTP、dTTP各0.2mM、0.2mM[α−33P]−dATP(0.05〜0.1 Ci/mmol)及び0.4mg/mL活性化サケ精子DNAを含む50μLの反応を実施して、DNAポリメラーゼ活性を測定した。反応混合物(45μL)を74℃まで予め加熱し、希釈したポリメラーゼ(5μL)を十分に混合しながら添加した。74℃で、さらに10分間インキュベーションした後、10μLの60mM EDTAを添加して反応を停止させ、全混合物を0℃に置いた。アリコート(50mL)の酸沈殿性放射活性を、0.05 mg/mlサケ精子DNAを含む1mlの2mM EDTAで希釈し、1mLの20%(w/v)トリクロロ酢酸、2%(w/v)ピロリン酸ナトリウム(Na4P2O7・10H2O)を添加し、氷上で15分以上インキュベートすることによって測定した。沈殿したDNAを、2.4cm GFCフィルター・ディスク(Schleichter and Schuell)を通して濾過することによって回収し、1N HCl、0.1M ピロリン酸ナトリウム5mlで7回洗浄した。フィルターを、3mlのシンチレーション計数液に入れ、33P−特異的放射活性をシンチレーション計数によって求めた。
Claims (21)
- 実質的精製熱安定性DNAポリメラーゼを含む組成物であって、外来添加界面活性剤を含まない組成物。
- 熱安定性DNAポリメラーゼが、サーマス、ピロコッカス、サーモコッカス、アキフェックス、スルフォロバス及びサーモトガからなる群から選択される属の生物から得たものであるか、又はそれに由来する、請求項1記載の組成物。
- 前記DNAポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼ、Tli DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ、nTba DNAポリメラーゼ、Tba DNAポリメラーゼ、TaqΔ271 F667Y、TthΔ273 F668Y及びTaqΔ271 F667Y E681Wからなる群から選択される、請求項1記載の組成物。
- 熱安定性DNAポリメラーゼを細胞から実質的に精製する方法であって、
(a)前記細胞を外来添加界面活性剤の非存在下で溶解して溶解物を得ること、及び
(b)外来添加界面活性剤の非存在下で、1以上の精製ステップを実施して、溶解物から実質的精製熱安定性DNAポリメラーゼを得ること
を含み、前記実質的精製熱安定性DNAポリメラーゼが外来添加界面活性剤を含まない、方法。 - 外来添加界面活性剤の非存在下で実施される前記精製ステップが、
前記溶解物を加熱して1種以上のタンパク質を変性させること、
前記溶解物を遠心分離し、上清の全て又は一部を除去して清澄化溶解物を得ること、及び
ブチル官能性を含むクロマトグラフィー媒体を用いて、清澄化溶解物を分画すること
を含む、請求項4記載の方法。 - 熱安定性DNAポリメラーゼが、サーマス、ピロコッカス、サーモコッカス、テリオコッカス、アキフェックス、スルフォロバス及びサーモトガからなる群から選択される種を有する生物から得たものであるか、又はそれに由来する、請求項4記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼ、Tli DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ、nTba DNAポリメラーゼ、Tba DNAポリメラーゼ、TaqΔ271 F667Y、TthΔ273 F668Y及びTaqΔ271 F667Y E681Wからなる群から選択される、請求項4記載の方法。
- 精製熱安定性DNAポリメラーゼを活性型でアッセイに提供する方法であって、
外来添加界面活性剤を含まない精製熱安定性DNAポリメラーゼ組成物に1種以上の界面活性剤を添加すること
を含む、方法。 - 前記1種以上の界面活性剤が、Tween 20、Iconol NP−40、 Mega−8、Mega−9、Mega−10、アルキルグリコシド類及びアルキル第三アミンN−オキシド類からなる群から選択される、請求項8記載の方法。
- 前記アルキルグリコシド類が、オクチル−β−D−グルコピラノシド及びドデシル−β−D−マルトシドからなる群から選択される、請求項9記載の方法。
- アルキル第三アミンN−オキシドが、ラウリルジメチルアミンオキシド(LDAO)である、請求項9記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼ、Tli DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ、nTba DNAポリメラーゼ、Tba DNAポリメラーゼ、TaqΔ271 F667Y、TthΔ273 F668Y及びTaqΔ271 F667Y E681Wからなる群から選択される、請求項8記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼが活性型でシークエンシング反応に提供される、請求項8記載の方法。
- 前記アッセイが、熱安定性DNAポリメラーゼ活性アッセイ、一本鎖又は二本鎖エクソヌクレアーゼ活性アッセイ、或いは一本鎖又は二本鎖エンドヌクレアーゼ活性アッセイからなる群から選択される、請求項8記載の方法。
- 前記界面活性剤がDNAポリメラーゼ活性を選択的に活性化させる、請求項8記載の方法。
- 実質的精製熱安定性DNAポリメラーゼ、並びにアルキル第三アミンN−オキシド類及びアルキルグリコシド類からなる群から独立に選択される1種以上の界面活性剤を含む組成物。
- 高分子非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項16記載の組成物。
- 加水分解コラーゲン誘導体をさらに含む、請求項16記載の組成物。
- 前記長鎖アルキルグリコシドが、グルコース、ガラクトース、キシロース、マルトース又はラクトースからなる群から選択される親水性部分と、C7〜C16アルキル疎水性部分とを含む、請求項16記載の組成物。
- 前記長鎖アルキルグリコシドがドデシルマルトシド又はオクチルグルコシドである、請求項19記載の組成物。
- 前記長鎖アルキル第三アミンN−オキシドがLDAOである、請求項16記載の組成物。
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Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009513113A (ja) * | 2005-10-28 | 2009-04-02 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | C型肝炎ウイルスns2/3活性のアッセイ法 |
JP2010528669A (ja) * | 2007-06-13 | 2010-08-26 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション | ポリメラーゼ安定化 |
JP2011217746A (ja) * | 2010-04-12 | 2011-11-04 | F Hoffmann La Roche Ag | 界面活性剤非含有ポリメラーゼ |
JP2012139167A (ja) * | 2010-12-28 | 2012-07-26 | Tosoh Corp | 安定化されたs−アデノシルホモシステイン加水分解酵素調製物 |
JP2015512651A (ja) * | 2012-04-12 | 2015-04-30 | ニユー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレイテツド | 重合反応のための合成核酸 |
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---|---|---|---|---|
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US6127155A (en) * | 1986-08-22 | 2000-10-03 | Roche Molecular Systems, Inc. | Stabilized thermostable nucleic acid polymerase compositions containing non-ionic polymeric detergents |
IL88923A (en) * | 1988-01-12 | 1995-07-31 | Hoffmann La Roche | Gene encoding a thermostable dna polymerase from thermus aquaticus said dna polymerase and its purification |
US5242818A (en) * | 1988-08-26 | 1993-09-07 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Method of producing a thermostable DNA polymerase from Thermus thermophilus |
JP2531246B2 (ja) * | 1988-08-26 | 1996-09-04 | 東洋紡績株式会社 | 耐熱性dnaポリメラ―ゼおよびその製法 |
US5322785A (en) * | 1990-04-26 | 1994-06-21 | New England Biolabs, Inc. | Purified thermostable DNA polymerase obtainable from thermococcus litoralis |
US5948663A (en) * | 1990-12-03 | 1999-09-07 | Stratagene | Purified thermostable pyrococcus furiosus DNA polymerase I |
TW517059B (en) * | 1994-07-25 | 2003-01-11 | Ciba Geigy Ag | New process for the production of biologically active protein |
CN1123328A (zh) * | 1994-11-17 | 1996-05-29 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 高温、高传真脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶(HiFi Bst) |
US5602011A (en) * | 1995-01-18 | 1997-02-11 | Pharmacia Biotech Inc. | Purified Thermococcus barossii DNA polymerase |
US6033859A (en) * | 1996-05-24 | 2000-03-07 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Thermostable DNA polymerase from a hyperthermophilic archaeon strain KOD1 |
AU4590297A (en) * | 1996-09-27 | 1998-04-17 | Merck & Co., Inc. | Detergent-free hepatitis c protease |
US5861295A (en) * | 1997-01-02 | 1999-01-19 | Life Technologies, Inc. | Nucleic acid-free thermostable enzymes and methods of production thereof |
US5882904A (en) * | 1997-08-04 | 1999-03-16 | Amersham Pharmacia Biotech Inc. | Thermococcus barossii DNA polymerase mutants |
US6242235B1 (en) * | 1998-06-24 | 2001-06-05 | Promega Corp. | Polymerase stabilization by polyethoxylated amine surfactants |
JP4470275B2 (ja) * | 2000-04-27 | 2010-06-02 | 株式会社島津製作所 | 核酸合成法 |
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-
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Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009513113A (ja) * | 2005-10-28 | 2009-04-02 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | C型肝炎ウイルスns2/3活性のアッセイ法 |
JP2010528669A (ja) * | 2007-06-13 | 2010-08-26 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション | ポリメラーゼ安定化 |
JP2011217746A (ja) * | 2010-04-12 | 2011-11-04 | F Hoffmann La Roche Ag | 界面活性剤非含有ポリメラーゼ |
JP2012139167A (ja) * | 2010-12-28 | 2012-07-26 | Tosoh Corp | 安定化されたs−アデノシルホモシステイン加水分解酵素調製物 |
JP2015512651A (ja) * | 2012-04-12 | 2015-04-30 | ニユー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレイテツド | 重合反応のための合成核酸 |
JP2018019699A (ja) * | 2012-04-12 | 2018-02-08 | ニユー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレイテツド | 重合反応のための合成核酸 |
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