JP2005522195A - 細菌胞子 - Google Patents

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Abstract

本発明は、抗原および胞子コートタンパク質をキメラ遺伝子としてコードする一つ以上の遺伝構築物を含む遺伝暗号により遺伝子改変された胞子(芽胞)を提供し、前記遺伝子改変胞子は前記胞子コートタンパク質とともに前記抗原を融合タンパク質として発現させる。

Description

本発明は、免疫応答を誘発する胞子(芽胞)の使用法と、前記免疫応答の誘発方法と、前記胞子の製造方法とに関する。
感染はヒト集団において死亡の主要原因である。過去100年間、公衆衛生に最も寄与したものは衛生設備およびワクチン接種の二つであり、この二つにより感染症による死亡が激減した。
更に改良したワクチン接種法の開発が常に最重要な課題となっている理由はいくつかある。
第一に、主に粘膜面を介して身体に侵入する病原菌に対して、より高度な免疫を提供するためである。通常、ワクチンは非経口投与される。しかし、疾患の多くは主な侵入口として胃腸(GI)管を利用する。従って、コレラや腸チフスは、病原菌であるチフス菌(Salmonella typhi)やコレラ菌(Vibrio cholera)が摂取され、次に粘膜上皮(GI管内側を覆う部分)にてコロニー形成(V.cholera)し、または粘膜上皮に渡って転移(S.typhi)することにより発症する。同様に、TB(結核)は初めに結核菌(Mycobacterium tuberculosis)による肺感染により発症する。注射による免疫では顕著なIgG反応を含む血清反応(体液性免疫)が生じ、これは感染予防に対し有効性が最も低い。これが、ワクチンの多くが一部にしか有効でなかったり、その予防期間が短かったりする理由の一つである。
第二に、注射針を用いない投与経路を提供するためである。現在のワクチン接種プログラムの最大の問題は、少なくとも1回、注射が必要なことである（破傷風ワクチンを例に挙げる）。予防効果は10年間継続するが、小児は当初3回注射を受け、引続き5年毎に追加免疫を受けることになっている。先進国では「注射の恐怖」のために追加免疫を受けないようにする人が多い。対照的に、破傷風による死亡率が高い発展途上国では、再利用されたり、殺菌処理を施したりしない注射針を使用することに問題がある。
第三に、安全性を向上させ、有害な副作用を最小限にするためである。ワクチンの多くは非病原性(弱毒化)にした、生きている生物、または何らかの方法で不活化された生物からなる。原則的にこれは安全であると考えられているが、より安全な方法を開発しなければならないことを示す根拠がある。例えば、1949年に(京都事件)68人の小児が汚染されたジフテリアワクチンを受けて死亡した(Health、1996)。同様に、1995年のCutter事件では105人の小児がポリオを発症した。ポリオワクチンがホルマリンにより適正に不活化されてなかったことが判明した。他の多くのワクチン、例えばMMR(麻疹・風疹・流行性耳下腺炎)ワクチンや百日咳ワクチン(Health、1996)は、副作用の風評に曝されている。
第四に、保存施設および輸送施設の不足により有効な免疫プログラム妨げられている発展途上国に対し、経済的なワクチンを提供するためである。ワクチンを輸入しなければならない発展途上国では、ワクチンは適正に保存・配給されることが想定されている。ワクチンを冷蔵し、適正な衛生条件に維持するための関連費用は、発展途上国には多大である。経口ポリオワクチンやBCGワクチンのような一部のワクチンは、2〜8℃にて一年間しか存続しない(Health、1996)。周囲温度にて無期限に保存可能な強固なワクチンの必要性は、発展途上国にとって今や最優先課題である。この種のワクチンは耐熱性であり、温度および乾燥の大きな変動に耐え得ることが理想である。最後に、生産が容易なワクチンであれば発展途上国に多大な利点が得られ、発展途上国において生産可能性がある。
これらの問題を改善する方法が求められている。
従って、本発明は、抗原および胞子コートタンパク質をキメラ遺伝子としてコードする、少なくとも一つの遺伝構築物を含む遺伝暗号により遺伝子改変された胞子を提供し、前記遺伝子改変された胞子は前記胞子コートタンパク質との融合タンパク質として発現される前記抗原を有している。
本発明の利点は、ワクチン投与に胞子を用いて注射の必要性、および発展途上国における注射針に関連する問題が解消されることである。加えて、胞子は安定しており、熱および乾燥に対して耐性を有するため、発展途上国におけるワクチン保存の問題を克服できる。胞子は生産が容易であり、低コストで生産可能であるため、本発明に基づくワクチン生産は経済的になり、最終的には非病原菌として、また経口プロバイオティックとして現在使用されていることから、枯草菌(Bacillus subtilis)を用いることにより、現在利用できるワクチンより安全なワクチン系となる。
本発明の更なる利点は、胞子が粘膜において免疫応答を誘発することである。これによりワクチン接種は、例えばS.typhi,V.choleraおよびM.tuberculosisのような粘膜病原菌に対してより効果的となる。
粘膜面に送達されたワクチンは、粘膜経路を介して感染する疾患に対抗するのにより効果的であろう。ワクチン投与の粘膜経路には経口、鼻腔内及び／又は直腸経路があろう。
好ましくは、胞子はバシラス菌種の胞子である。
好ましくは、栄養細胞はバシラス菌種の栄養細胞である。
遺伝暗号はDNAまたはcDNAを含む。遺伝暗号という用語は、コドン使用の縮重を包含するように意図されていると理解されたい。
好ましくは、遺伝構築物はキメラ遺伝子の形態にて、少なくとも胞子コートタンパク遺伝子の一部、および少なくとも抗原遺伝子の一部を含む。
好ましくは、抗原遺伝子は胞子コートタンパク遺伝子の3’末端に位置する。また、抗原遺伝子は胞子コートタンパク遺伝子の5’末端、または胞子コートタンパク遺伝子の内部に位置し得る。
好ましくは、遺伝構築物はキメラ遺伝子の5’末端に胞子コートプロモーターを含む。
遺伝構築物はプラスミドまたは他のベクターを含み、キメラ遺伝子は少なくとも一部のamyE遺伝子に挟まれた多重クローニング部位に位置する。また、遺伝構築物はプラスミドまたは他のベクターを含み、キメラ遺伝子は少なくとも一部のthrC遺伝子に挟まれた多重クローニング部位に位置する。本発明はamyEおよびthrC遺伝子における挿入に限定されるものではないことを理解されたい。生物の発育および胞子形成が阻害される、即ち挿入が機能的に重複することがない限り任意の遺伝子に挿入することが許容される。
好ましくは、遺伝構築物は二重交叉型組換えにより栄養型母細胞を形質転換するのに用いられる。また、遺伝構築物は、例えばp JH101のような組込みベクターであり、これは単一交叉型組換えにより栄養型母細胞を形質転換するのに用いられる。
好ましくは、抗原は破傷風毒素断片Cまたは易分性毒素Bサブユニットの少なくとも一つである。また、抗原は免疫応答を誘発するのに使用が適した任意の抗原でよい。
好ましくは、胞子コートタンパク質はcotBである。また、胞子コートタンパク質はcotA,cotC,cotD,cotEおよびcotFからなる群から選択される。また、胞子コートタンパク質はcotG,cotH,cotJA,cotJC,cotM,cotSA,cotS,cotT,cotV,cotW,cotX,cotYおよびcotZからなる群から選択される。
胞子は経口、鼻腔内または直腸経路で投与され得る。胞子は一つ以上の前記経口または鼻腔内または直腸経路を用いて投与され得る。
胞子の経口投与は錠剤、カプセルまたは液体懸濁液または乳剤によるのが妥当であろう。また、胞子はDischalerRまたはTurbohalerRを介して微紛またはエアロゾルの形態で投与してもよい。
鼻腔内投与は微紛またはエアロゾル鼻スプレーまたは改変Dischaler（登録商標）もしくはTurbohaler（登録商標）の形態が妥当であろう。
直腸投与は座剤によるのが妥当であろう。
本発明に基づく胞子は、栄養細胞に発芽しないように投与前に熱不活化される。
更なる態様に基づき、本発明は活性製薬物質として使用される、本発明に基づく遺伝子改変胞子を提供する。
更なる態様に基づき、本発明は少なくとも二つの異なる遺伝子改変胞子を提供し、各改変胞子は、活性製薬組成物として用いられる本発明に基づき、少なくとも一つの異なる抗原を発現する。
更なる態様に基づき、本発明は遺伝子改変胞子の製造方法を提供し、この方法は、
抗原および胞子コートタンパク質をキメラ遺伝子としてコードする、少なくとも一つの遺伝構築物を含む遺伝暗号を作り、
前記少なくとも一つの遺伝構築物を用いて栄養型母細胞を形質転換し、
前記形質転換された母細胞を誘発して胞子形成させ、
生じた遺伝子改変胞子を分離するステップを含む。
胞子は栄養細胞に発芽しないように投与前に熱不活化される。
更なる態様に基づき、本発明は製薬的に許容される賦形剤または担体とともに、本発明に基づく遺伝子改変胞子を含む組成物を提供する。
製薬的に許容される妥当な担体は当業者には周知であり、製薬組成物が経口、直腸または鼻腔内投与を意図するものであるか否かに関わる。
更なる態様に基づき、本発明は医学的処置方法に用いるための、本発明に基づく遺伝子改変胞子を提供する。
更なる態様に基づき、本発明は医薬の製造のための、医学的処置方法で使用するための、本発明に基づく遺伝子改変胞子を提供する。
好ましくは、医学的処置方法はワクチン投与により疾患に対してヒトまたは動物を免疫する。
更なる態様に基づき、本発明は医学的処置方法を提供し、この方法は、
医学的処置を必要とするヒトまたは動物に対し、本発明に基づく遺伝子改変胞子を経口または鼻腔内または直腸投与し、
前記遺伝子改変胞子が疾患防止に用いられる免疫応答を誘発するステップを含む。
本発明は添付図を参照して単なる例示として記載される。
本発明は以下の非限定的実施例を参照して示される。
（実施例１）
TTFCまたはLTB遺伝子配列がインフレームで特異性cot遺伝子に融合されたキメラ遺伝子を構築した。次に、B.subtilisの染色体に構築物を導入した。次に、キメラ遺伝子の発現が確認され、純系マウス(純系ブラックC57)を用いて免疫を行った。次に、免疫応答を定量した。他で記載しなければcot遺伝子はcotA,cotB,cotC,cotD,cotEおよびcotFを指すものとする。
組換えキメラ遺伝子
Figure 2005522195
 1amyE座に配置
2thrC座に配置
a)キメラ遺伝子の構築
特異性cot遺伝子を増幅し、増幅されたcot遺伝子配列の3’末端が、TTFCまたはLTBの5’末端を保有する類似PCR産物の5’末端に融合できるように、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法を用いた。PCR連結産物はPCR産物の制限消化により得られた。これは、埋包制限部位を保有するプライマーを用い、PCR増幅法により可能であった。cot遺伝子の5’末端および抗原遺伝子の3’末端を認識する制限酵素により、適当なクローニングベクター(以下参照)を制限(切断)した。PCR開裂産物を開裂ベクターにより連結し、当業者に周知の標準的技法により組換体を評価した。
(この方法では、cot遺伝子が遺伝子の5’末端にそれ自体のプロモーター配列を保有することが不可欠である。)
b)染色体に挿入するベクター
ベクターpDG364最も重要な特徴は、amyE遺伝子の左右の側方腕である(amyE前部およびamyE後部と呼ぶ)。クローニングされたDNA(即ち、cot-抗原キメラ)は、一般的なPCR法により多重クローニング部位に導入され、次にクローンを検証し、関連バックボーン配列を認識する酵素(例えば、PstI)を用いた消化により選択プラスミドクローンを線形化する。次に、線形化DNAを用いてB.subtilisの形質転換受容性細胞を形質転換する。プラスミドが保有する抗生物質耐性(クロラムフェニコール耐性)を用いて形質転換体を選択する。線形化プラスミドは、組換えのためのamyEの前部および後部側方腕を用いた二重交叉型組換えイベントを介してのみ完全体になる。この過程で、クローニングされたDNAがamyE遺伝子に導入され、amyE遺伝子は不活化される。この方法により、染色体に対する損傷が最小限にされ、細胞の発育、代謝や胞子形成が阻害されない。挿入した遺伝子キメラは染色体のamyE座に位置するため、遺伝子は標準的cot遺伝子座に対しトランスである。例えば、cotA遺伝子がTTFCに融合しamyE座に導入されると、染色体のどこかに普通のcotA遺伝子も存在する。従って、細胞は部分的に二倍体であり、一つの普通のcotA遺伝子と一つのキメラ遺伝子とを保有する。
pDG364に加え、もう一つの妥当なベクターはpDG1664である。このベクターはpDG364とほぼ同一であるが、次の点で異なる。
i)エリスロマイシン耐性遺伝子ermを保有する。これによりクロラムフェニコールの代わりにエリスロマイシンを用い、形質転換されたB.subtilis細胞の選択が可能になる。
ii)amyE遺伝子の前部および後部の代わりにthrC遺伝子の前部および後部を保有する。thrCが重複する。
クローニングの最後の経路は組込みベクターを用いることである。このようなベクターは多数存在するが、pSGMU2またはpJH101が好ましい。この方法では、クローン中のcot遺伝子および染色体の常在cot遺伝子は、共通の相同性によりcot-抗原キメラを染色体に導入する。単一交叉組換え後、cot遺伝子の染色体位置でcot-抗原キメラを有するプラスミド全体が染色体に導入される。従って、これにより常在cot遺伝子は改変される。これは別部位に配置され、常在cot遺伝子を改変しないpDG364/pDG1664ベクターと対照的である。
c)複数の抗原の提示
胞子コートに複数の抗原提示をなすには、例えばpDG364およびpDG1664のような二つの異なるプラスミドベクターを用いることが必要である。pDG364にて一つのキメラ遺伝子が作製されてamyE座に導入され、pDG1664にてもう一つのキメラが作製されthrC座に導入される。この場合、各形質転換イベントには別の抗生物質耐性の選択が必要なためである。胞子コートに複数の抗原提示をなすには、当業者に周知の任意の関連する技術を適用することが可能であることを理解されたい。
d)菌株の検証
表１に示すキメラを保有する同系菌株を検証し、異種抗原の発現を確認した。特に、樹立した方法により菌株を発育させ、胞子形成するように誘発した。胞子形成の誘発後約20〜24時間の胞子を採取し、SDS-DTT抽出法またはNaOH抽出法により全ての胞子コートタンパク質を回収した。異種抗原の存在を示すため、抗TTFCまたは抗LTB抗体を用いたウエスタンブロッティング法を用いた。概してタンパク質レベルはcotEおよびcotFキメラにおいて比較的低かった。検証によりこれらの抗原は偶発的なタンパク質の分解を受けないことが確認された。
TTFCはthrC座で発現され、LTBはamyE座から発現され、遺伝子発現は同一レベルである。
菌株の最終的検証には胞子の耐性特性が何らかのかたちで影響を受けたか否かを評価することがあった。各菌株の胞子懸濁液を調製した(表１に示す)。これらの胞子懸濁液は80℃にて30分間加熱され、熱処理前後においてほぼ同数の生存可能な胞子ユニットを保有することが示された。異種抗原の発現は胞子の耐性特性に何ら影響を与えなかった。
e)腹腔内免疫
胞子は表１に示す組換え菌株の各々から調製し、汚染性栄養細胞を除去するため洗浄を繰り返して懸濁液を精製した。次に、懸濁液は残留栄養細胞(胞子形成のない細胞)を不活化するために65℃にて熱処理され、続いて0,14および28日に1X109胞子/ml用量にて腹腔内経路によりマウスに投与するのに用いられた。その後、血清検体を採取し、ELISA法により抗体力価を測定した。未処置マウスまたは非組換え胞子で免疫したマウスに比し、全ての構築物が高濃度の血清IgGを示した。これらの結果より、TTFCおよびLTBキメラが免疫原性であり、免疫応答を誘発することが可能であることが示された。
f)粘膜免疫
粘膜免疫のために経口投与と鼻腔内投与の二つの方法を用いた。TTFC融合タンパク質を発現する胞子を経口投与するため、35日間にわたる複数回投与を用いて胃内洗浄液によりブラックC57純系マウスに1X1010胞子/用量を投与した。適当な時間に尾部血液および糞便検体を採取し、尾部血中の血清IgGおよび糞便検体中のIgAを解析した。高濃度の抗TTFC IgGおよびIgAが認められた。LTB（示さず）を発現する胞子によるマウスの経口免疫後にも同様の高濃度の免疫(IgGおよびIgAの双方)が認められている。
同様に、0、14および28日に胞子(20μl)を投与するためマイクロピペットを用い、1X109胞子/用量によりLTBを発現する胞子によるマウスの鼻腔内投与を行った。高濃度の粘膜免疫が発生し、鼻腔内経路による送達により粘膜ワクチン媒体としての胞子の可能性が示された。TTFCを発現する胞子によるマウスの鼻腔内免疫後にも同様の高濃度の免疫(IgGおよびIgAの双方)を認めた。
TTFCおよびLTBの双方を発現する胞子を用い、経口および鼻腔内免疫後に同様に高濃度の抗TTFCおよび抗LTB IgGおよびIgAを得ることができた。
g)用量(dosage)
予備的研究で経口免疫に必要な最低用量は約1X109胞子/用量であり、鼻腔内免疫では1X108胞子/用量であることが知られている。別の投与計画(多数存在する)により、より低用量にすることも可能である。
本発明に基づく胞子は任意の生物学的に活性化した分子を示すことが可能であろう。例えば、産業上利用するための酵素である。
異種抗原の提示には任意の胞子形成種を用いることも可能であろう。しかし、他の胞子形成微生物は胞子コートタンパク質の同じ補体を保有する可能性が少ない。実際、セレウス菌(Bacillus cereus)のような一部の胞子形成菌は、catタンパク質を一つしか含有しないかもしれない。しかし、収集したcotA,cotB,cotC,cotD,cotEおよびcotFに対する抗血清を用いることにより、胞子形成菌の外被から相同または交差反応コートタンパク質を同定し、次に逆遺伝学により遺伝子をクローニングすることも可能である。
本発明に基づく胞子はアジュバントと併用することも可能である。これらにはコレラ毒素、キトサンまたはアプロトニンが含まれよう。
（実施例２）
材料および方法：
胞子の調製
全ての免疫には同質遺伝的祖先であるPY79とともにB.subtilis RH103菌株(amyE::cotB-tetC)を用いた2)。RH103は他で記載されており3)、胞子の外被タンパク質CotB(59kDa)のC末端に対する破傷風毒素断片C(TTFC;47kDa)の融合物を保有する。キメラcotB-tetC遺伝子はB.subtilisのamyE座にて保有され、従って内在性cotB遺伝子に対してトランスであった。RH103またはPY79の胞子形成は、他1)で記載されている取り尽くし法(exhaustion method)により、DSM(ディフコ胞子形成培地)培地にて行った。胞子形成開始後22時間にて胞子形成培養物を採取した。残留胞子細胞を分解するためにリゾチーム処理を用い、NicholsonおよびSetlow1)が記載するように胞子の精製懸濁液を作製し、続いて1M NaCl,1M KClにて、次に水(2回)にて洗浄した。タンパク質分解を阻害するためPMSFを含めた。水における最後の懸濁後、残留細胞を死滅させるために68℃にて1時間、胞子を処理した。次に、-20℃にて凍結する前にCFU/ml値を得るために胞子懸濁液を即座に滴定した。この方法によりDSM培地1Lあたり6x1010個の胞子を確実に作製することができた。TTFCポリクローナル抗血清を用いたウエスタンブロッティング法により、このようにして調製された胞子の各バッチを検査し、胞子コートタンパク質抽出物中の106kDa CotB-TTFCハイブリッドタンパク質の存在を求めた。
免疫蛍光顕微鏡検査
B.subtilis菌株(PY79,RH103)を再懸濁法1)により胞子形成するように誘発した。検体は胞子形成開始後に規定の時間にて回収され、Harryら4)により記載された方法により、再懸濁培地に直接固定され、以下の改変がなされた。GTE−リゾチーム(50mMグルコース、20mM Tris-HCl1 pH7.5、10mM EDTA、リゾチーム2mg/ml)にて懸濁後、0.01%(w/v)ポリ−L−リジン(Sigma社)で処理された顕微鏡カバーガラス(BDH)に検体(10μl)を即座に付着した。4分後、カバーガラスから液体を吸引し、次に常温にて2時間、完全に乾燥させた。カバーガラスをPBS pH7.4にて3回洗浄し、常温で2% BSA含有PBSにて15分間ブロックし、次に更に9回洗浄した。検体を常温にて45分間、ウサギ抗CotBおよびマウス抗TTFC血清によりインキュベートし、3回洗浄し、次に常温にて45分間、抗ウサギIgG-FITCおよびマウス抗IgG-TRITC接合体(Sigma社)により更にインキュベートした。3回洗浄した後、カバーガラスを顕微鏡のスライドに装着し、Nikon Eclipse E600蛍光顕微鏡下で観察した。Nikon DMX1200デジタルカメラを用いて撮像し、Lucia GFソフトウェアで画像処理を行い、TIFFフォーマットに保存した。
TTFCタンパク質
C末端ポリヒスチジンタグに融合したtetC遺伝子を保有するpET28b発現ベクター(Novagen社)から、組換えTTFCがE.coli BL21(DE3 pLys)に生成された。細菌の誘発により高レベルの発現が得られ、TTFCの精製はニッケルアフィニティーカラムに細胞溶解物を通過させて行った。
TTFC-His溶出タンパク質はSDS-PAGEにより完全性を検討し、BioRad DCタンパク質測定キットを用いて濃度を測定した。
抗原特異性血清および粘膜抗体を検出する間接ELISA法
50μl/ウェルの特異抗原(炭酸／重炭酸緩衝剤中2μg/ml)でプレートを被覆し、常温にて一晩放置した。抗原は抽出胞子コートタンパク質またはTTFC精製タンパク質であった。37℃にて1時間、0.5% BSA含有PBSにてブロックした後、ELISA希釈緩衝剤(0.1M Tris-HCl,pH7.4;3%(w/v)NaCl;0.5%(w/v)BSA;10%(v/v)羊血清(Sigma社);0.1%(v/v)Triton-X-100;0.05%(v/v)Tween-20)にて、1/40希釈から開始する連続2倍希釈により血清検体を加えた。各プレートは、陰性対照群(1/40に希釈された免疫前血清)、陽性対照群(TTFCタンパク質または胞子により非経口で免疫したマウス由来の血清)の同型ウェルを保有した。抗マウスHRP接合体(サブクラス用のSerotec社を除き、全てSigma社から得た)の添加前に、37℃にて2時間、プレートをインキュベートした。37℃にて更に1時間、プレートをインキュベートし、次に基質TMB(3,3',5,5'-テトラメチル−ベンジジン;Sigma社)を用いて展開した。2M H2SO4を用いて反応を停止した。各検体に対して希釈曲線を描き、エンドポイント力価は免疫前プール血清の1/40希釈と同じ吸光度を生じる希釈として算出した。群間の統計上の比較はMann-Whitney U検査により実施した。P>0.05は有意でないと考えられた。糞便IgAをELISA解析すべく、Robinsonら5)の方法に従い、BSA(1%)およびPMSF(1mM)含有PBSにて懸濁され、一晩4℃にてインキュベートされ、かつELISA前に−20℃にて保存された約0.1gの糞便ペレットを用いた。各検体に対し、不希釈免疫前糞便抽出物と同じ吸光度を生じる希釈としてエンドポイント力価を算出した。6.0以上のエンドポイント力価は「陽性」であると考えられた。
免疫
7匹または8匹のマウス群(雌、C57 BL/6、8週齢)に、経口、鼻腔内または腹腔内経路によりCotB-TTFC(RH103)を発現する胞子または対照群の非発現胞子(PY79菌株)の懸濁液を投与した。経口および鼻腔内投与のマウスをハロタンで軽度に麻酔した。経口および鼻腔内経路では、これまで最適化粘膜免疫6,5)に用いられた複数回投与計画を用いた。未処置非免疫対照群を含めた。経口投与では4μg/用量の精製TTFCを服用する7匹のマウス群も含めた。
a)経口免疫は0.15ml容積に1.67x1010胞子を含み、0,2,4,18,20,22,34,35および36日に胃内洗浄により免疫した。−1,17,33および54日に血清検体を採取し、−2,17,33および52日に糞便を採取した。
b)鼻腔内免疫は20μl容積の1.11x109胞子投与量を用い、0,2,16,17,30および31日にマイクロピペットを用いて投与した。−1,15,29および48日に血清検体を採取した。−1,15,29および47日に糞便を採取した。
c)腹腔内経路による免疫は0.15ml容積に1.5x109胞子を含み、0，14および28日に投与した。−1,7,22,36および43日に血清検体を採取した。
破傷風毒素の惹起
初回の経口免疫後60日にて、RH免疫マウスに10または20LD50に相当する惹起用量の破傷風毒素を皮下注射した。精製した毒素(20μgタンパク質/Lf;Lf＝凝結単位)を滅菌0.9% NaClに懸濁した。破傷風毒素のLD50は最初に実験的に0.0003Lf(即ち、1LD50＝6ngのタンパク質)であると測定され、注射量は200μl/マウスであった。破傷風の徴候を見るために綿密に動物をモニタリングし、麻痺症状を発症したマウスは人間的に安楽死させた。14日後に徴候を示さない個体は免疫性であると考えられた。TTFC精製タンパク質の経口免疫を受けたマウスは10LD50で厳密に調べた。未処置マウスまたはPY79胞子で免疫したマウスは2LD50で厳密に調べた。
胞子コートタンパク質の抽出
他1)で詳細に記載されているSDS-DTT抽出緩衝剤を用い、胞子の懸濁液から高濃度(>1x1010胞子/ml)で胞子コートタンパク質が抽出された。
抽出したタンパク質はSDS-PAGEにより統合性を評価し、BioRad DCタンパク質測定キットを用いて濃度を評価した。
潘種実験
SC2362菌株(rrnO-lacZ cat)の1x109胞子/用量を連続5日間、Balb/cマウス(雌、5週齢)に経口投与した。SC2362は栄養寒天(Xgal含有)に青色コロニーとして認識可能なLac表現型、およびクロラムフェニコール耐性(5μg/ml;cat遺伝子がコードする)を提供した。その後の時点で4匹のマウス群を犠牲にし、検体臓器および検体組織を次の手順で解剖した。
初めに、新鮮糞便ペレットを採取し、その後、CO2の吸入により動物を殺し、70%アルコールで除染した。滅菌PBS 3mlを腹腔に注射して腹膜マクロファージを採取し、次にソフトにマッサージを行った。次に、21ゲージの針および注射器を用いて腹膜滲出物を採取し即刻処理した。次に腹腔を開き肝臓を切除した。腸を切り離し、腸間膜を除去した。次に、脾臓および腎臓を回収し、その後、バイヤー斑の位置を同定し、腸管腔内容物からの汚染を避けるため、これを切除した(陰性対照群として周囲組織も切除した)。最後に、頚管腺および顎下腺を回収した。滅菌解剖器具は臓器毎に交換した。3mlのガラスビーズ(直径2mmおよび4mmの混合)を有する1ml PBSにてボルテックスにより検体を均質化し、次に生存可能総数を明らかにすべくCFU値を得るために即座にプレートし(Xgalおよびクロラムフェニコール含有寒天培地に)、またはプレートして胞子数を測定する前に熱処理した(65℃にて1時間)。
結果
異種抗原の胞子表面における表面発現
キメラとして胞子コートタンパク質CotBに融合したTTFCを発現する組換え胞子(RH103)は他3)で記載されている。TTFCを発現する胞子に対する免疫応答を評価する前に、図1に示すようにTTFCが免疫蛍光により表面に露出することを実証した。TTFCおよびCotBに対してポリクローナル血清を用いることにより、胞子形成の開始後5時間に採取した胞子形成培養物にTTFCを検出することができた。4時間および6時間にCotBおよびTTFCを検出することもできた(データは示さない)。高レベルの背景標識化は放出された内生胞子の使用を妨げるということが他の研究で示されているため4)、胞子嚢細胞を標識化に用いた。本結果により抗TTFC血清で標識化した無傷卵形前胞子が示された。CotB抗血清での標識化により組換え胞子および非組換え胞子の双方でCotBが検出された(パネルAおよびC)。
TTFCを発現する組換え胞子の腹腔内注射後の抗TTFC血清反応
経口および鼻腔内免疫を開始する前に、組換え胞子の免疫原性を評価するために予備的研究を行った。8匹のC57マウス群に組換え胞子または非組換え胞子を注射した(腹腔内)。本免疫計画では、組換えRH103胞子(ハイブリッドCotB-TTFCを発現)または非組換えPY79胞子を3回注射する(1.5x109胞子/用量含有)標準的処方計画を用いた。これまでの研究で3)RH103胞子は約9.75x10-5pgのTTFCポリペプチド/胞子を保有することが示されたため、本免疫用量は0.15μgのTTFCを含有するであろう。RH103胞子による免疫は、間接ELISA法により測定された1.5x103の抗TTFC IgG最高力価となり(データは示さない)、対照群(PY79で1.1x102、未処置で0.8x101)と有意に異なり(p<0.05)、TTFCが安定的に表現され、胞子表面に示されるときに適切に免疫原性であることを示した。
経口および鼻腔内免疫後の抗TTFC血清反応
粘膜反応および全身反応の誘発を試験すべく、7匹のマウス群を経口(1.67x1010胞子/用量;1.65μg TTFC/用量)または鼻腔内(1.11x109,胞子/用量;0.11μg TTFC/用量)のいずれかにより免疫した。技術的に鼻経路ではより高用量を投与できなかったことに留意されたい。図2Aに示すように、RH103(CotB-TTFC)胞子によるマウスの経口免疫は33日までに1x103を超える力価を示し、非組換え胞子(PY79)を投与したマウス、TTFC精製タンパク質(4μg/用量)を与えたマウス、または未処置対照群の力価より有意に高かった(p<0.05)。これまでの研究で鼻経路にて送達されるTTFC(低用量、即ち10μg/用量未満)は免疫原性でないことが示されているため8)、鼻腔内経路の対照群としてTTFCタンパク質を用いなかった。
鼻腔内免疫後48日に多少低めのレベルのTTFC特異性IgGエンドポイント力価が認められた(図2B)。本データにより、いずれの経路であっても未処置および非組換え群の免疫の力価は有意に異なることはないことが示された(p>0.05)。CotBに融合したTTFCを発現する胞子を投与したマウス群は、経口群では33日以降から、鼻腔内群では29日から、対応する対照群より有意に高いTTFC特異性IgG力価で反応した。ここでは示さない研究で、コレラ毒素(Inaba 569B型、0.33μg/用量)を併用または併用せずに経口投与されたRH103胞子が、抗TTFC IgG力価に有意な相違を全く示さないことも見出した。
抗TTFC血清抗体アイソタイプ
TTFC特異性IgG,IgAおよびIgM抗体アイソタイプならびにIgG1,IgG2a,IgG2bおよびIgG3サブクラスの存在を知るためにも、粘膜免疫されたマウス由来の血清を検討した(図3)。CotB-TTFCを発現するRH103胞子で経口免疫されたマウスは、54日に高濃度のIgG1およびIgG2bアイソタイプを示した。IgG1,IgG2aおよびIgG2bサブクラスでは、平均力価は2対照群、即ちi)未処置マウス、ii)非組換え胞子で免疫したマウス、の基線力価と有意に異なった(p<0.05)。IgG3,IgMおよびIgAサブクラスには殆ど変化は認められなかった。鼻腔内免疫されたマウスでは、48日における血清がIgG1,IgG2bおよびIgMサブクラスの優勢を示した。これらのサブクラスでは力価は対照群より有意に高かった(p<0.05)。対照的に、非組換え胞子投与群と未処置群との間にはどのアイソタイプにおいても有意な差異は認められなかった(p>0.05)。
粘膜抗-TTFC IgA反応
TTFC特異的分泌性IgA(sIgA)の存在を知るため、経口または鼻腔内免疫したマウス由来の新鮮糞便ペレットをELISA法により検査した(図4)。CotB-TTFCを発現する胞子による免疫はいずれの経路でも明らかなTTFC特異性sIgA反応を誘発した。経口または鼻腔内免疫したマウス群では、TTFC特異性sIgA力価は33日に最高値になった(図4Aおよび図4B)。糞便TTFC特異性sIgAのエンドポイント力価は対照群より有意に高いことが示されたが(p<0.05)、対照群(非組換え胞子群および未処置群；p>0.05)の間には有意な相違は全くなかった。
経口免疫後の破傷風毒素の惹起に対する防御
経口免疫後に認められた血清IgGの高力価(>103)は潜在的に防御レベルであった。誘発された抗毒素反応の生物活性および関連する防御レベルを検査すべく、B.subtilis胞子(RH103)を発現するCotB-TTFCで経口免疫したマウスを、皮下投与による致死量の破傷風毒素(10または20 LD50)で綿密に調べた(表2)。
経口免疫後の破傷風毒素による致死性全身惹起に対するマウスの防御
Figure 2005522195
表２は６０日に惹起用量の破傷風毒素を皮下注射される前に、0,2,4,18,20,22,34,35および36日にB.subtilisの1.67x1010胞子または4μgのTTFC精製タンパク質で経口免疫された8匹のマウス群の処理結果を示す。14日後に徴候を発症しない個体は免疫性であると考えられた。
マウスは10LD50の惹起に対して十分に防御された。20LD50で惹起された8匹のマウス中1匹が72時間後に明らかな症状を示した。未処置マウスおよび野性型B.subtilis胞子(PY79)で免疫したマウスの全てが、2LD50の惹起後72時間以内に明らかな破傷風の徴候を示した。TTFC精製タンパク質(4μg/用量)による経口免疫は10LD50に対して何ら防御せず、全てのマウスが24時間以内に明らかな破傷風の徴候を示した。従って、CotB-TTFCを発現するB.subtilis胞子による経口免疫を介して誘発された全身抗体反応は防御的であった。
抗-胞子反応
抗TTFC反応に加え、経口および鼻腔内免疫後の抗胞子IgGおよびsIgA反応を定量した(図5)。
CotB-TTFCを発現する胞子(RH103)および非組換え胞子(PY79)双方による経口免疫は、未処置群より有意に高い胞子コート特異性IgG全身濃度を生じた(p<0.05)(図5A)。組換えまたは非組換え胞子のいずれが用いられたかに関わらず、鼻腔内免疫後に比較的低いものの有意なレベル(p<0.05)の胞子コート特異性IgG力価が認められた(図5C)。
経口免疫されたマウスの糞便中に認められた胞子コート特異性sIgA濃度は(図5B)、この胞子に対して十分な反応を示した。これらの濃度は非組換え胞子を免疫に用いたときより有意に高かった(p<0.05)。免疫に鼻腔内経路(図5D)を用いたとき、同様のプロファイルの胞子コート特異性sIgA濃度が認められ、非組換え胞子を投与されたマウスでは時間の経過とともにIgA濃度は低下した。ここでも胞子コート特異性sIgA濃度は未処置マウスより有意に高かった(p<0.05)。
胞子の播種
5日間連続して毎日、純系Balb/cマウスに1x104胞子/用量を投与した。予備的研究でこの連続投与計画が回復可能かつ統計的に関連する数を達成するのに十分であることが示されていた。最終的な投与後の時点で4匹のマウス群を犠牲にし、主要リンパ器官を解剖した。加えて、糞便を採取して均質化し、計数した。均質化した組織および糞便中にて総生存可能数および熱耐性数を測定した。回復した生存可能数は表1に示され、腸のバイヤー斑および腸間膜リンパ節からの細菌の回復を示し、GALTとの相互作用を示唆している。
Figure 2005522195
表３は5日間連続してB.subtilis SC2362菌株(rrnO-lacZ)の1x109胞子を経口投与された4匹のBalb/cマウス群の処理結果を示す(総投与量5x109)。この結果は、投与最終日後の指示時間にて採取したマウスの臓器毎のコロニー形成単位平均数として示される。総数(熱処理なし)および胞子数(検体は65℃にて1時間処理)として表される。NDは測定されず、NSは有意でない(検体あたりの生存可能ユニット<10)ことを表す。データは算術手段±標準偏差として提示される。
表３において、PP/MLNはバイヤー斑および腸間膜リンパ節の略語であり、SMG/CLNは顎下腺および頚管腺の略語であり、PMは腹膜マクロファージの略語である。
非常に興味深かったのは、顎下腺および頚管腺において生存可能数が回復し、肝臓および脾臓からは有意な数の回復が見られなかったことである。細菌が頭頚部組織から回復し、広範な全身部位からの回復が殆どまたは全く見られないことは、胞子が上咽頭粘膜を乗り越えた可能性を示唆する。糞便中の数は細菌がGITから除去されるに従い、徐々に減少したが、総数と胞子数との間に差異は殆ど認められなかった。
文献
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蛍光免疫法によるCotBおよびTTFCの存在検出を示す概略図である。B.subtilis 菌株の胞子形成は再懸濁法1)により誘発され、胞子形成の開始後5時間に検体を採取した。ウサギ抗CotBおよびマウス抗TTFC抗血清で検体を標識化し、続いて抗ウサギIgG-FITC(緑色フルオレセイン、パネルAおよびC)および抗ウサギIgG-TRITC(赤色フルオレセイン、パネルBおよびD)の接合体で標識化した。パネルAおよびBはPY79(野性型)であり、パネルCおよびDはRH103(CotB-TTFC発現菌株)である。 粘膜免疫後の全身反応を示すグラフである。CotB-TTFCを発現する組換えB.subtilis胞子を用いた経口免疫後の抗TTFC特異性IgG反応。CotB-TTFCを発現する胞子(RH103；●)または非組換え胞子(PY79；○)により、7匹のマウス群が経口免疫された(↑)。1.67x1010胞子用量を使用し、TTFC特異性IgGを検討するためにマウス群由来の個体血清検体をELISA法により検査した。未処置対照群(△)および4mg/用量のTTFC精製タンパク質で経口免疫されたマウス群(◇)由来の血清も測定した。データは算術手段として提示され、エラーバーは標準偏差である。 粘膜免疫後の全身反応を示すグラフである。CotB-TTFCを発現する組換えB.subtilis胞子を用いた鼻腔内免疫後の抗TTFC特異性IgG反応。CotB-TTFCを発現する胞子(RH103；●)または非組換え胞子(PY79；○)により、7匹のマウス群が鼻腔内免疫された(↑)。1.1x109を使用し、TTFC特異性IgGを検討するためにマウス群由来の個体血清検体をELISA法により検査した。未処置対照群(△)および4mg/用量のTTFC精製タンパク質で経口免疫されたマウス群(◇)由来の血清も測定した。データは算術手段として提示され、エラーバーは標準偏差である。 抗体アイソタイプのプロファイルを示すグラフである。図2Aおよび図2Bの説明文に記載するように、CotB-TTFCを発現する組換え胞子(RH103)または非組換え(PY79)B.subtilis胞子を用いた経口免疫後54日または鼻腔内免疫後48日における抗TTFC抗体アイソタイププロファイル。間接ELISA法によりTTFC特異性IgG1,IG2a,IgG2b,IgG3,IgMおよびIgAアイソタイプを判定した。未処置対照群由来の血清も測定した。エンドポイント力価は免疫前プール血清の1/40希釈と同じ吸光度を生じる希釈として算出した。データは算術手段として提示され、エラーバーは標準偏差である。 TTFC特異性IgA反応を示すグラフである。図２Ａの説明文に記載するように、CotBTTFCを発現する組換え胞子(RH103)または非組換え胞子(PY79)を用いて、7匹のマウス群が経口免疫された。例2の材料および方法の節に記載するように、これらの免疫化マウスおよび未処置群から新鮮糞便ペレットを採取し、TTFC特異性IgAの存在を検討するために検査した。エンドポイント力価は不希釈免疫前糞便抽出物と同じ吸光度を生じる糞便抽出物の希釈として算出した。データは算術手段として提示され、エラーバーは標準偏差である。 TTFC特異性IgA反応を示すグラフである。図２Ｂの説明文に記載するように、CotBTTFCを発現する組換え胞子(RH103)または非組換え胞子(PY79)を用いて、7匹のマウス群が鼻腔内免疫された。例2の材料および方法の節に記載するように、これらの免疫化マウスおよび未処置群から新鮮糞便ペレットを採取し、TTFC特異性IgAの存在を検討するために検査した。エンドポイント力価は不希釈免疫前糞便抽出物と同じ吸光度を生じる糞便抽出物の希釈として算出した。データは算術手段として提示され、エラーバーは標準偏差である。 抗胞子IgG血清反応およびIgA粘膜反応を示すグラフである。CotB-TTFCを発現する組換え胞子(●)または非組換え胞子(○)を用いて、図2の説明文に記載するように7匹のマウス群が経口で免疫された(↑)。B.subtilis胞子コート特異性血清Igを検討するために、間接ELISA法により個々の検体を検査した。未処置対照群(△)由来の血清も測定した。エンドポイントIgG力価は免疫前プール血清の1/40希釈と同じ吸光度を生じる血清希釈として算出した。エンドポイントIgA力価は不希釈免疫前糞便抽出物と同じ吸光度を生じる糞便抽出物の希釈として算出した。データは算術手段として提示され、エラーバーは標準偏差である。 抗胞子IgG血清反応およびIgA粘膜反応を示すグラフである。CotB-TTFCを発現する組換え胞子(●)または非組換え胞子(○)を用いて、図2の説明文に記載するように7匹のマウス群が経口で免疫された(↑)。胞子コート特異性糞便IgAを検討するために、間接ELISA法により個々の検体を検査した。未処置対照群(△)由来の血清も測定した。エンドポイントIgG力価は免疫前プール血清の1/40希釈と同じ吸光度を生じる血清希釈として算出した。エンドポイントIgA力価は不希釈免疫前糞便抽出物と同じ吸光度を生じる糞便抽出物の希釈として算出した。データは算術手段として提示され、エラーバーは標準偏差である。 抗-胞子IgG血清反応およびIgA粘膜反応を示すグラフである。CotB-TTFCを発現する組換え胞子(●)または非組換え胞子(○)を用いて、図2の説明文に記載するように7匹のマウス群が鼻腔内経路(パネルCおよびD)で免疫された(↑)。B.subtilis胞子コート特異性血清IgGを検討するために、間接ELISA法により個々の検体を検査した。未処置対照群(△)由来の血清も測定した。エンドポイントIgG力価は免疫前プール血清の1/40希釈と同じ吸光度を生じる血清希釈として算出した。エンドポイントIgA力価は不希釈免疫前糞便抽出物と同じ吸光度を生じる糞便抽出物の希釈として算出した。データは算術手段として提示され、エラーバーは標準偏差である。 抗胞子IgG血清反応およびIgA粘膜反応を示すグラフである。CotB-TTFCを発現する組換え胞子(●)または非組換え胞子(○)を用いて、図2の説明文に記載するように7匹のマウス群が鼻腔内経路(パネルCおよびD)で免疫された(↑)。胞子コート特異性糞便IgAを検討するために、間接ELISA法により個々の検体を検査した。未処置対照群(△)由来の血清も測定した。エンドポイントIgG力価は免疫前プール血清の1/40希釈と同じ吸光度を生じる血清希釈として算出した。エンドポイントIgA力価は不希釈免疫前糞便抽出物と同じ吸光度を生じる糞便抽出物の希釈として算出した。データは算術手段として提示され、エラーバーは標準偏差である。

Claims (17)

  1. 抗原および胞子コートタンパク質をキメラ遺伝子としてコードする一つ以上の遺伝構築物を含む遺伝暗号により遺伝子改変された胞子であって、前記胞子コートタンパク質との融合タンパク質として発現される前記抗原を有する前記遺伝子改変胞子。
  2. 胞子がバシラス菌種の胞子であることを特徴とする請求項１に記載の胞子。
  3. 遺伝構築物がキメラ遺伝子の形態にて胞子コートタンパク遺伝子の少なくとも一部、および抗原遺伝子の少なくとも一部を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の胞子。
  4. 抗原遺伝子が胞子コートタンパク遺伝子の３’末端に位置することを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の胞子。
  5. 遺伝構築物がキメラ遺伝子の５’末端に胞子コートプロモーターを含むことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の胞子。
  6. 抗原が破傷風毒素断片Ｃまたは易分性毒素Ｂサブユニットの少なくとも一つであることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の胞子。
  7. 胞子コートタンパク質がcotA, cotB, cotC, cotD, cotE, cotF, cotG, cotH, cotJA, cotJC, cotM, cotSA, cotS, cotT, cotV, cotW, cotX, cotYおよびcotZからなる群から選択されることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の胞子。
  8. 胞子が使用時に栄養細胞に発芽しないように熱不活化することを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の胞子。
  9. 医学的症状の治療に使用するための請求項１から８のいずれか一項に記載の胞子。
  10. 請求項１から９のいずれか一項に記載の少なくとも二つの異なる胞子を含んだ組成物であって、前記少なくとも二つの異なる胞子が少なくとも二つの異なる抗原を発現することを特徴とする組成物。
  11. 組成物が更に製薬的に許容される賦形剤または担体を含むことを特徴とする請求項１０に記載の組成物。
  12. 製薬的に許容される賦形剤または担体とともに請求項１から９のいずれか一項に記載の胞子を含む組成物。
  13. 医学的症状、好ましくは炎症、疼痛、ホルモンのアンバランス及び／又は腸の障害である医学的症状の治療に用いるための請求項１０から１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 医学的症状、好ましくは炎症、疼痛、ホルモンのアンバランス及び／又は腸の障害である医学的症状の治療に用いられ医薬の製造における請求項１から９のいずれか一項に記載の胞子の使用。
  15. ａ）医学的処置を必要とするヒトまたは動物に請求項１から９のいずれか一項に記載の胞子を投与し、
    ｂ）前記遺伝子改変胞子が疾患防止に用いる免疫応答を誘発するステップを含む医学的処置方法。
  16. 胞子を経口投与、鼻腔内投与または直腸投与することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
  17. 抗原および胞子コートタンパク質をキメラ遺伝子としてコードする一つ以上の遺伝構築物を含む遺伝暗号を作成し、
    前記一つ以上の遺伝構築物を用いて栄養型母細胞を形質転換し、
    前記形質転換された母細胞を誘発して胞子形成させ、
    生じた遺伝子改変胞子を分離するステップを含む遺伝子改変胞子の製造方法。
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