JP2005520130A

JP2005520130A - 試料の生物物質の複合検出方法

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Publication number: JP2005520130A
Application number: JP2003575077A
Authority: JP
Inventors: デイビッドアール．チェーフィン; デニスエム．コナリー
Original assignee: インテグレイティッドナノ−テクノロジーズエルエルシー
Priority date: 2002-03-08
Filing date: 2003-03-07
Publication date: 2005-07-07
Also published as: WO2003076902A2; CA2478096A1; EP1487996A2; EP1487996A4; WO2003076902A3; US20030203384A1; AU2003218047A1

Abstract

本発明は、試料中の標的核酸分子を検出する方法に関する。この方法は、電気的に分離された導体上の捕捉プローブ間に間隙が存在するように導体に付着された捕捉プローブを有する、2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体の複数の異なる群を提供することを含む。潜在的に標的核酸分子を含む試料と捕捉プローブを、試料に存在する任意の標的核酸分子を捕捉プローブにハイブリダイズさせるために有効な条件下で接触させて、これにより捕捉プローブを結合する。標的核酸分子の存在は、電気が電気的に分離された導体の間で行われるかどうか決定することによって検出される。本方法を実施するための装置も、開示される。

Description

発明の分野
本出願は、2002年3月8日に出願の米国特許仮出願第60/363,348号の利益を主張する。

本発明は、流体試料から、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）などの標的分子の複合検出に関する。

発明の背景
DNAまたはRNAなどの核酸は、臨床面または法医学での用途のための分析物として、関心が高まってきている。強力な新たな分子生物学技術により、先天性のまたは伝染性の疾患を発見することができる。これらと同様の技術により、父の決定の手続きおよび犯罪訴追などの法的訴訟における事実問題の解決に使用するためにDNAを特徴づけることができる。

核酸分子の解析および試験のためには、少量の核酸分子の増幅、増幅された核酸断片の単離、およびその他の手順が必要である。少量のDNAの増幅の科学分野は、急速に進歩し、現在いくつかの方法が存在する。これらには、連結型リニア増幅法（linked linear amplification）、ライゲーションに基づいた増幅法、転写に基づいた増幅法、およびリニア一定温度増幅法を含む。連結型リニア増幅法は、Wallaceらに対する米国特許第6,027,923号に詳述されている。ライゲーションに基づいた増幅法は、Wuら、Genomics、4: 560 (1989)に詳述されたライゲーション増幅反応（LAR）、および欧州特許第0320308B1号に記載されたリガーゼ連鎖反応を含む。転写に基づいた増幅法は、米国特許第5,766,849号、および米国特許第5,654,142号、Kwohら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、86: 1173 (1989)、およびGinergerasらに対する国際公開公報第88/10315号に詳述されている。より最近のリニア一定温度増幅法は、Kurnに対する米国特許第6,251,639号に記載されている。

最も一般的なDNA増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応法（「PCR」）によるものであり、Mullisら、Cold Spring Harbor Quant. Biol.、51: 263-273 (1986)、Mullisらに対する欧州特許第201,184号、Mullisらに対する米国特許第4,582,788号、Erlichらに対する欧州特許第50,424号、欧州特許第84,796号、欧州特許第258,017号、および欧州特許第237,362号、並びにSaikiらに対する米国特許第4,683,194号に詳述されている。PCR反応は、多サイクルのハイブリダイゼーションおよび核酸合成および変性に基づいており、極小数の核酸分子または断片を数オーダー程度倍増して、検出可能な量の物質を提供することができる。PCR増幅の有効性および再現性は、一部はDNA鋳型の純度および量に依存的であることが、当業者に知られている。核酸の生物源に存在する特定の分子は、PCR増幅を停止または阻害することが知られている（Belecら、Muscle and Nerve、21 (8): 1064 (1998); Wiedbraukら、Journal of Clinical Microbiology 33 (10): 2643-6 (1995); DeneerおよびKnight、Clinical Chemistry. 40 (1): 171-2 (1994)）。たとえば、全血においては、ヘモグロビン、ラクトフェリン、および免疫グロブリンGが、PCR反応を行うために使用されるいくつかのDNAポリメラーゼを妨害することが既知である（Al-SoudおよびRadstrom、Journal of Clinical Microbiology 39 (2): 485-493 (2001); Al-Soudら、Journal of Clinical Microbiology、38 (1): 345-50 (2000)）。これらの阻害作用は、特定のタンパク質薬剤を添加することによって多少克服することができるが、PCRを行うためにすでに使用される多くの成分に加えて、これらの薬剤を添加しなければならない。したがって、このような阻害剤の除去または不活化は、選択された試料からDNAを増幅する際の重要な因子である。

一方、混合物中の特定の核酸分子の単離および検出には、ゲル電気泳動および蛍光検出を組み合わせた核酸シーケンサー並びに断片アナライザーが必要である。残念なことに、電気泳動法は、試料または試験項目の数が増大すると、非常に大きな労働力を要してしまう。

このため、DNAオリゴヌクレオチドプローブを使用する、より簡便な解析方法が普及してきている。VLSIPS（商標）と呼ばれている新たな技術により、それぞれのチップが何十万またはそれ以上の異なる分子プローブを含み、親指の爪よりも小さいチップの作製が可能となった。これらの技術は、Pirrungらに対する米国特許第5,143,854号、国際公開公報第92/10092号、および国際公開公報第90/15070号に記載されている。これらの生物学的チップは、それぞれのプローブ集団が特定の位置に割り当てられているアレイに配置された分子プローブを有する。これらの分子アレイチップは、それぞれのプローブ位置が、マイクロメートルスケールで測定される中心から中心の距離を有するものとして製造されていた。これらのアレイタイプのチップの使用は、少量の試料のみが必要とされること、および多数のプローブ配列を同時に使用することができることといった利点を有する。アレイチップは、Pirrungらに対する米国特許第5,143,854号に記載されたような、遺伝子発現レベルの測定、一塩基多型の同定、並びに分子診断および配列決定を含む多くの異なるタイプの科学的な適用において有効であった。

プローブが核酸分子であるアレイチップは、特異的なDNA配列の存在を検出するためにいっそう有用であった。アレイチップに関するほとんどの技術は、本質的に、構造的な、または伝導性のいずれかであり得る基板に対しての配列が既知のプローブの結合を含んでいる。構造的タイプのアレイチップは、通常プローブ分子が塩基毎に構築されているか、または共有結合で結合する完全な分子であることができるプラットフォームを提供することを含む。典型的なアレイチップは、標的核酸の増幅に続いて蛍光標識で検出し、標的核酸分子がチップ上のオリゴヌクレオチドプローブのいずれかとハイブリダイズするかどうか決定することを含む。選択された試験条件下で、標的核酸分子を含む試料にアレイを曝露した後、走査デバイスによってアレイのそれぞれの位置を検査して、その位置においてハイブリダイズした物質の量を定量することができる。または、アレイチップの電導性のタイプは、金属などの導電材料に結合されたプローブ配列を含む。標的核酸のハイブリダイゼーションは、一般的には電導性の電極へ運ばれる電気信号を誘発し、次いで解析される。

多くの固体支持体またはアレイ技術については、小さなオリゴヌクレオチド捕捉プローブが支持体上に固定され、または合成される。捕捉プローブの配列は、ハイブリダイゼーション反応における特異性を与える。異なるいくつかの化学組成物が、現在捕捉プローブ研究のために存在する。長年の標準では、直鎖デオキシリボ核酸であった。これらの短い一本鎖DNA分子の利点は、この技術が長年存在していること、および合成反応が比較的安価なことである。さらに、技術研究の大部分は、ハイブリダイゼーションを含む種々の科学技術のための、簡単な参照に利用できる。しかし、多くの異なるタイプのDNA類似体が今では商業的に合成され、ハイブリダイゼーションのためのDNAオリゴヌクレオチドに勝る利点を有する。これらの一部には、PNA（タンパク質核酸）、LNA（ロック核酸）、およびメチルホスホネート化学を含む。一般に、DNA類似体の全てが、標準的なDNAオリゴヌクレオチドよりも高い融解温度を有し、完全に相補的なものと一塩基ミスマッチの標的との間をより容易に区別することができる。DNA類似体は、標準的なDNAの場合のように負に荷電した主鎖を有しないので、これが可能である。これにより、1本の鎖だけが負に荷電するので、入って来る標的DNAの鎖をDNA類似体によりしっかりと結合させることができる。ハイブリダイゼーション技術のためのこれらの類似体で最も研究されたものはPNA類似体であり、これはアミノ酸側鎖に対して置換された核酸塩基を有するタンパク質主鎖から構成される（www.appliedbiosystems.comまたはwww.eurogentec.comを参照されたい）。実際に、PNAは、DNA配列決定（Arlinghausら、Anal Chem. 69： 3747-53 （1997））、DNAフィンガープリント（Guerasimovaら、Biotechniques, 31： 490-495 （2001））、診断バイオチップ（Prixら、Clin. Chem. 48： 428-35 （2002）； Feriottoら、 Lab Invest, 81： 1415-1427 （2001））、およびハイブリダイゼーションに基づいたマイクロアレイ解析（Weilerら、Nucleic Acids Res, 25： 2792-2799 （1997）; Igloi, Genomics 74： 402-407 （2001））を含むほとんどすべての分子生物学技術のための標準的なDNAの代わりに使用されている。

基板上に配列を形成するための技術は、周知である。たとえば、Pirrungらに対する米国特許第5,143,854号、国際公開公報第92/10092号、またはHubbelらに対する米国特許第5,571,639号に開示された技術に従って配列を形成してもよい。ガラス（http://www.piercenet.com/Technical/default.cfm?tmpl=../Lib/ViewDoc.cfm&doc=3483； McGovernら、Langmuir、 10： 3607-3614 （1994））または酸化ケイ素（McGovernらに対する米国特許第6,159,695号の実施例4〜6）などの電気絶縁表面に対する生物学的に有用な分子の付着について、いくつかの参照文献があるが、電気電導性表面に対する有効な分子付着の例は、金（Bainら、Langmuir, 5： 723-727 （1989））および銀（Xiaら、Langmuir, 22： 269（1998））を除いて、ほとんどない。一般に、生物学的に活性な分子を基板表面に付着することの問題点は、これが金属導体またはガラスなどの電気絶縁体であるかにかかわらず、基板上の相補反応基と生体分子上の反応基の単純な化学反応よりも困難である。たとえば、原則として、金属の表面上で偶然に、または故意に配置され得るものを除いて、金属導体は、反応部位を有しない。

このような表面結合した捕捉プローブに対する標的DNAのハイブリダイゼーションは、両方の種が可溶性の場合には見られないという問題点を生じる。固体支持体自体により、およびプローブ密度が高すぎることにより、立体効果が生じる。研究では、ハイブリダイゼーション効率は、プローブの相補領域を表面から離れさせるリンカー部分の挿入（Schepinovら、 Nucleic Acid Res., 25： 1155-1161 （1997）； Dayら、Biochem J. 278： 735-740 （1991））、プローブが沈着される密度（Petersonら、Nucleic Acids Res., 29： 5163-5168 （2001）； Wilkinsら、Nucleic Acids Res., 27： 1719-1729））、およびプローブ高次構造（Riccelliら、Nucleic Acids Res., 29： 996-1004 （2001））によって変えることができることを示した。プローブの相補的領域とその付着部分の間にリンカー部分を挿入することにより、ハイブリダイゼーション効率を増大することができ、30〜60原子の間の長さのリンカーについて、最適なハイブリダイゼーション効率が報告されている。同様に、プローブ密度の研究でも、最適なプローブ密度が存在すること、およびこの密度が、表面全体の飽和よりも低いことが示唆されている（Schepinovら、Nucleic Acid Res., 25： 1155-1161 （1997）； Petersonら、Nucleic Acid Res., 29： 5163-5168 （2001）； Steelら、Anal. Chem., 70： 4670-4677 （1998））。たとえば、Petersonらは、2.0×10¹²分子/cm²および12.0×10¹²分子/cm²のプローブ密度では、ハイブリダイゼーション効率は、それぞれ95%から15%に減少することを報告した。

ハイブリダイゼーション事象の定量は、ハイブリダイゼーション反応によって生じるシグナルのタイプに依存することが多い。最も一般的な解析技術は、いくつかの異なるタイプの色素およびフルオロフォアからの蛍光発光である。しかし、この方法で試料を定量するには、通常、正確に定量するために十分な発光を生じさせるために、大量のシグナル分子を存在させる必要がある。さらに重要なことに、一般に蛍光の定量は、線形応答のための高価な解析装置を必要とする。さらに、ハイブリダイゼーション反応には、2時間を必要とし、生物戦病原体を検出することなどの多くの用途のためには、全くあまりに長すぎる。したがって、迅速に試料中の生物学的物質を検出することができるシステムに対する要求が存在する。

本発明は、これらの目的を達成することに関する。

発明の概要
本発明は、試料中の標的核酸分子を検出する方法に関する。本方法は、電気的に分離された導体上の捕捉プローブ間に間隙が存在するように導体に付着された捕捉プローブを有する、2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体の複数の異なる群を提供することを含む。捕捉プローブを、潜在的に標的核酸分子を含む試料と、試料に存在する任意の標的核酸分子を捕捉プローブにハイブリダイズさせるために有効な条件下で接触させて、これにより捕捉プローブを結合する。標的核酸分子の存在は、電気が電気的に分離された導体間で電導されるどうかを決定することによって検出される。

本発明は、また、試料中の標的核酸分子を検出するための装置に関する。本装置は、電気的に分離された導体上の捕捉プローブ間に間隙が存在するように、2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体の複数の異なる群と導体に付着された捕捉プローブを含み、導体の異なる群上の捕捉プローブは同じである。

本発明のもう1つの局面は、試料中の標的核酸分子を検出するための装置に関する。本装置は、2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体の複数の群および電気的に分離された導体上の捕捉プローブ間に間隙が存在するように導体に付着された捕捉プローブを含み、少なくともいくつかの導体の異なる群の上の捕捉プローブは、異なっている。

蛍光標識または放射性標識の使用および長い反応時間を必要とするその他の検出システムと比較して、本発明は、試料中の標的分子を検出するために迅速かつ経済的なシステムを開示する。

発明の詳細な記載
本発明は、試料中の標的核酸分子を検出する方法に関する。本方法は、電気的に分離された導体上の捕捉プローブ間に間隙が存在するように導体に付着された捕捉プローブを有する、2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体の複数の異なる群を提供することを含む。捕捉プローブを潜在的に標的核酸分子を含む試料と、試料に存在する任意の標的核酸分子を捕捉プローブにハイブリダイズさせるために有効な条件下で接触させて、これにより捕捉プローブを結合する。標的核酸分子の存在は、電気が電気的に分離された導体間で電導されるどうかを決定することによって検出される。

本発明の1つの局面は、ハイブリダイゼーション技術に基づいて複数のDNA配列から複数のDNA配列を検出することを含む。この方法は、細菌、ウイルス、またはその他のDNA含有種を収集し、濃縮することによる試料収集方法を含む。また、この方法は、遺伝的成分の遊離を含む試料調製方法を組み込む。DNAを遊離した後に、関心対象の標的のための相補DNAプローブを含む検出チップに、試料を注入する。このように、本装置は、それぞれが、単一の、しかし異なるDNA配列を認識するプローブ分子の複数のセットを含んでいてもよい。このプロセスは、最終的にハイブリダイゼーション産物の検出を含む。

収集段階では、細菌、ウイルス、またはその他のDNAを含む試料を収集し、濃縮する。解析する試料のタイプに応じて、多くの収集方法が使用される。液体試料は、溶解緩衝液に一定体積の液体を配置することによって収集する。風媒性の試料は、一定の時間空気をフィルターに通すことによって収集することができる。フィルターは、溶解緩衝液で洗浄する。または、フィルターを直接溶解緩衝液に入れることもできる。水性試料は、一定の水量をフィルターに通すことによって収集することができる。次いで、フィルターを溶解緩衝液によって洗浄するか、または溶解緩衝液に直接浸すことができる。乾燥試料は、関心対象の生物体の除去のために溶解緩衝液に直接沈着させることができる。

試料の収集および溶解後、細胞片を沈澱または濾過によって除去することができる。理想的には、試料は、より迅速で、かつ特殊試薬を必要としない濾過によって濃縮される。試料は、細胞物質のみを通すことができるフィルターを通過させて、全生物体、および壊れた細胞片をトラップする。

本発明に記載されている検出装置は、単一のDNA配列を、それゆえに単一の生物を認識する程度に単純であっても、または多くのDNA配列を認識する程度に複雑であることもできる。したがって、適用の複雑度に応じて、異なるタイプの装置を構築することができる。図1は、注入ポート112および出口ポート114を含む試験カートリッジ102を表す。カートリッジ内部には、一連の試験構造108A、110A、および初めに電気的に分離される110Bがある。本発明の1つの局面において、カートリッジは、単一のDNA配列を認識するように設計されており、したがって、2つのタイプのプローブ分子のみが、別々の電極に対して、電極108に対して電極プローブAを、並びに電極110Aおよび110BにプローブBを付着する。本発明のこの局面において、それぞれの試験構造群I、II、およびIIIは、同一である。複数のDNA配列が、ポート112を介してカートリッジに注入される。電極に結合されるプローブに相補的な配列だけが、カートリッジに保持される。未結合のDNA配列は、出口ポート114を介してカートリッジを出る。プローブAおよびBのいずれに結合するDNAも、ブリッジを形成し、電極104と106の間の接続を完了する。

ここで、核酸分子の電気伝導率は、電気信号の電送に依存する。Hans-Werner FinkおよびChristian Schoenenbergerは、Nature （1999）（これは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）において、DNAが半導体様の電気を伝導することを報告した。この電流の流れは、簡単なスイッチを構築するためには十分であり得るし、これは標的核酸分子が試料内に存在するか否かを指し示すと考えられる。任意で、捕捉プローブのセットに対する標的核酸分子のハイブリダイゼーション後、核酸分子を米国特許出願第60/095,096号または第60/099,506号（これらは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）に記載されたような、金属などの導体で被覆することができる。次いで、被覆された核酸分子は、プローブ対の間の間隙を超えて電気を伝導することができ、したがって標的核酸分子の存在を表す検出可能なシグナルを生じる。DNA配列の希薄および複雑な混合物からの関心対象の標的DNAの捕捉の変化を増大するために、多くの試験構造は、試験カートリッジ内に配置することができる。図1は、3つの同様の試験構造を表すが、より多くの試験構造を単一のカートリッジ内に配置することができる。このアプローチの利点は、統計学を用いて任意の生物体の存在を積極的に同定することによって、低い偽陽性率を克服することが可能であることである。本発明の1つの局面において、全てのプローブ電気パッド104I、104II、および104IIIは、それぞれワイヤー116、120、および124によって、単一であるが、共通のワイヤー128に接続される。同様に、全ての電気パッド106I、106II、および106IIIは、それぞれワイヤー118、122、および126によって、異なるが共通のワイヤー130に接続される。したがって、あらゆる試験構造上の陽性事象は、装置からシグナルを与える。本発明のもう1つの局面において、電気パッド104Iおよび106I、104IIおよび106II、並びに104IIIおよび106IIIの群は、別々に電力源に接続されており、各々の試験構造群I、II、およびIII中で伝導が別々に測定される。

図2は、試験構造群I、II、およびIIIを含む試験カートリッジを表し、これによって各々が異なるDNA配列を認識するように設計されている。試験構造群Iは、2つの電気的パッド204および206、並びに初めは分離されているそれぞれの電気パッドに付着された電極208A、210A、および210Bを含む。それぞれの試験構造群からの電気的パッド204および206は、それぞれ別々のワイヤーに接続され、カートリッジを解析装置に接続する（図示せず）。たとえば、試験構造群Iでは、電気的パッド204および206が、それぞれワイヤー222および224に接続する。同様に、試験構造群IIでは、電気的パッド204および206が、それぞれワイヤー226および228に接続し、一方、試験構造群IIIでは、電気的パッド204および206が、それぞれワイヤー230および232に接続する。試験構造群IIおよびIIIは、異なるプローブ配列が電極に付着されていることを除き、試験構造群Iと同一である。複数のDNA配列は、ポート220を介してカートリッジ202に注入される。電極に結合したプローブに相補的な配列のみが、カートリッジに保持される。未結合のDNA配列は、出口ポート234を介してカートリッジを出る。結合したDNAのどれもがブリッジを形成し、電極204と206の間の接続を完了する。本発明のこの局面において、異なるDNA配列は、カートリッジ内に作製される電気接続のパターンを決定することによって区別することができる。

本発明の1つの局面において、試験構造群は、1つの生物体から多くのDNA標的を認識するように設計されている。したがって、試験構造群I、II、およびIIIは、電極に付着された異なるプローブ配列を有し、多くの標的配列を認識することができる。本発明のもう1つの局面において、試験構造は、多くの生物体から標的DNAを認識するように設計されている。第1の局面において、図2からの試験構造群I、II、およびIIIは、単一の生物体由来の単一遺伝子内の異なるDNA配列、または単一の生物体由来の複数の遺伝子からの配列を含む。多くの遺伝子は、ファミリーメンバー間で保存された配列を有するので、この方法で本発明を設計することにより、密接に関連した生物体をより積極的に同定できる。第2の局面において、本発明は、多くの生物体の存在をスクリーニングするように設計することができる。この例では、プローブ・セットは、異なる生物体由来の遺伝子を認識するように設計し、別々の試験構造に付着される。ちょうど記載されているものなどの試験構造は、診断目的のために使用することができる。

本発明の第2の適用は、標的分子の存在量についての定量的情報を得ることである。一部の疾病状態は、液体の固定量に存在する生物の数または分子によって評価される。たとえば、HIVの重篤さの診断は、ウイルス負荷、または血流に循環するHIV粒子の量に依存することが多い。HIVを有する任意の特定の患者の診断は、比較的容易に実施されるが、さらに量的情報を得ることが有利である。同様に、疾患の進行および治療の有効性が、個々のウイルス負荷によって再び判断される。その他の例において、関心対象の試料に存在する生物体の数の定量的測定を得ることは有効である。本発明は、炭疽または痘瘡などの細菌戦の病原体の存在を検出することができるだけでなく、攻撃の重篤さの正確な定量化もできる。これは、人員に対する曝露レベルを決定するときに、抗生物質を最初に受けるか、並びに曝露後にどのくらい有効に除去および除染されるか、重要である。

本発明は、2つの局面において混入物の量についての情報を提供する。図3は、プローブ分子の量を増大することを含む、試験構造群に基づいた定量化の方法を表す。本発明の本局面のための基本は、ハイブリダイゼーションが濃度依存的な方法で起こることである。電極に結合されるプローブ分子数が増えると、標的がその電極に結合すると思われる可能性も増える。試料中の標的の量を限定することによって、ハイブリダイゼーションは、電極に結合されるプローブ分子数に依存的になる。したがって、ハイブリダイゼーションは、定量化カートリッジに含まれる電極のサブセット上で効率的に起こり、極めて少ないプローブが配置された電極上では全く起こらない。次いで、任意の試料に存在する標的の量は、試験構造が電導性のブリッジを形成したかによって、直接決定することができる。図3の定量カートリッジ302は、試験構造群I、II、およびIIIからなり、それぞれ2つの電極304および306を含む。より小さな電極、308A、310A、および310Bは、初めは電気的に分離されたこれらの電極に接続される。それぞれの試験構造群は、特定の試験群の電極304および306の1つからカートリッジ302の外側まで走る別々のワイヤー316〜326によって、解析装置に接続される（図示せず）。複数のDNA配列が、ポート312を介してカートリッジ302に注入される。電極に結合したプローブに相補的な配列のみが、カートリッジに保持される。未結合のDNA配列は、出口ポート314を介してカートリッジを出る。結合したDNAのどれもが、ブリッジを形成し、電極304と306の間の接続を完了する。

本発明のもう1つの局面において、定量は、フィンガー投射の数を増大して試験構造群を構築することによって得てもよい。図4は、定量カートリッジ402を表し、それによって試験構造群I、II、およびIIIが、それぞれ5、11、および19個互いに嵌合されたフィンガー電極を含む。本発明のその他の局面において、試験構造は、何十、何百、または何千ものフィンガー電極を含む。それぞれの試験構造は、初めは電気的に分離されている2つの電極404および406を含む。それぞれの電極は、一組の互いに嵌合されたフィンガーを含む。電極404および406は、個々のワイヤー412〜422によって解析装置に接続される（図示せず）。複数のDNA配列が、ポート408によるカートリッジ402に注入される。電極に結合したプローブに相補的な配列のみが、カートリッジに保持される。未結合のDNA配列は、出口ポート410を出る。結合したDNAのどれもが、ブリッジを形成し、電極404および406の間で結合を完了する。この代表例では、プローブ分子は、それぞれの試験構造の電極上に同じ濃度で結合される。電極の数を増大することによって、ハイブリダイゼーションのために曝露されるプローブ分子の数は、効率的に増大する。次いで、上記したように、ハイブリダイゼーションは、存在する標的量に依存的になる。試料に存在する標的分子の量は、電導性のブリッジを含む試験構造のパターンによって決定することができる。

本発明の1つの局面において、陽性の同定は、2つの電極セット間の距離に及び、2つの電極セット間の閉回路を形成するDNAブリッジの検出として定義される。本発明に記載されているように、陽性のシグナルは、2つの手段によって生じ得る。捕捉プローブに相補的な標的DNAは、ブリッジを形成し、回路を閉じることができる「真の」シグナルである。任意のハイブリダイゼーションアッセイ法に固有であるが、一部の回路は、関心対象の標的核酸に関連しない非特異的な核酸分子の結合によって形成されるかもしれず、「偽陽性」と呼ばれている。任意の特定の試験については、試験構造および電極に結合された特定の捕捉プローブ上を通過する核酸の複雑な混合物によって定義される偽陽性シグナルに対する真の比が存在する。特定の標的核酸が試料に存在するかどうかをより明確に決定することができるように、偽陽性シグナルをできるだけ低く保つことが望ましい。任意の特定の核酸検出試験について、「偽陽性」シグナルの割合を定義することが必要である。一旦定義されると、偽陽性シグナル以上の真のシグナルの統計学的に関連性のある数を、特定の核酸が試料に存在するかどうかを決定するために使用することができる。

本発明の1つの局面は、1つの試験カートリッジ内で核酸配列に対する多重試験の能力を詳述する。多重試験が、単一のまたは多くの核酸配列に特異的な捕捉プローブを含む場合は、標的核酸の存在を決定するために異なる統計基準が必要とされる可能性がある。単一の核酸配列に対する多重試験の場合には、1つの化学反応のみについての偽陽性率を考慮しなければならない。しかし、多重試験が、多くの異なる捕捉プローブのセットを含む場合、それぞれの試験は、それ自身の偽陽性率を有し、それぞれの割合は、別々に考慮されなければならない。後者の場合は、より厳密な統計解析が必要である。

図5A〜Bは、試料から標的核酸分子を検出するためのシステムの斜視図を示す。本システムは、デスクトップ検出ユニットおよびデスクトップユニットに挿入される検出カートリッジを含む。本態様において、デスクトップ検出ユニット502は、試薬を充填するためのドア504、制御ボタン506、および可視ディスプレイ510と共に提供される。デスクトップ検出ユニット502のスロット508は、検出カートリッジ512を受けるように構成される。検出カートリッジ512は、試料溶液をカートリッジ512の第1のチャンバに導入することができる第1の注入ポート514、および試薬を第1のチャンバに導入することができる第2の注入ポート516をさらに含む。

図5Cは、デスクトップ検出ユニット502およびカートリッジ512を利用するシステムの概略図を示す。このシステムにおいて、デスクトップ検出ユニット502は、試薬を保持するために適しており、かつ第2の注入ポート516および導管521を介して検出カートリッジ512の第1のチャンバ520に試薬を放出するように配置された容器532A〜Cを含む。容器532A〜Cは、たとえば、中和剤、緩衝液、電導性イオン溶液、および相乗剤を有することができる。これらの容器の内容物は、ドア504によって補充することができる。これは、封着し、かつ使い捨てに容器532A〜Cを作製することによって、またはこれらを補充可能に作製することによって達成される。

ポンプ528は、それぞれチューブ530A〜Cを介して、容器532A〜Cから試薬を除去し、チューブ526、および検出カートリッジ512内の第2の注入ポート516を介してこれらを放出する。容器532A〜Cから試薬を引き出すために単一のポンプ528を使用する代わりに、これらの内容物を個々に除去することができるように、各々の容器532A〜Cについて別々のポンプを提供することができる。

または、必要な試薬は、検出カートリッジ内部の容器に保持されていてもよい。検出ユニットのポンプは、空気、水、または油などの物質を検出カートリッジ内へ押し込み、試薬をそれぞれの容器から、第1のチャンバに押し込むことができる。次いで、試薬をそれぞれの検出カートリッジと交換して、これにより検出ユニットに集積した塩沈降物を除去する。

また、デスクトップ検出ユニット512は、試料中の標的分子の存在を検出するために、電気コネクタ536の手段によって検出カートリッジ512の導体と電気的連絡する制御装置538と共に提供される。また、制御装置538は、電気コネクタ534を経由してポンプ528を操作する。または、別々の制御装置により、ポンプおよび標的分子の検出を操作するように使用することもできる。デジタル連結器540により、制御装置538は、デスクトップ検出ユニット512の外部にあるコンピュータ542にデータを伝達することができる。

検出カートリッジ512は、第1のチャンバ520を含み、上記のとおり、第2の注入ポート516および導管521を経由して、デスクトップ検出ユニット502内から試薬を受ける。解析する試料は、第1の注入ポート514および導管518を通って第1のチャンバ520に放出される。上記図1〜4に関してより完全に記載されているように、標的分子の存在は、第1のチャンバ520において検出される。検出カートリッジ512には、コネクタ522を経由して、第1のチャンバ520から放出される物質を収集するための第2のチャンバ524がさらに提供される。また、検出カートリッジは、試料中の標的分子の存在を検出することができるように、筐体を通って延長され、かつ第1のチャンバ520内の電気的に分離された導体に結合された電気コネクタ525を含む。

デスクトップ検出システムを使用する標的分子の検出は、図5A〜Cに示したとおり、次のように行うことができる。試料の溶解および清澄の後、第1の注入ポート514および導管518を介して、検出カートリッジ512および第1のチャンバ520に試料を導入する。一旦試料が導入されると、検出カートリッジ512をデスクトップ検出ユニット502のスロット508に挿入し、その結果、第2の注入ポート516が導管521に接続され、および電気コネクタ536が電気コネクタ525に結合される。試料中の標的核酸分子の検出のために十分な期間、試料を捕捉プローブおよび導体を含む第1のチャンバ520内で処理する（図1〜4に示したものの様に）。第1のチャンバ520内における試料の処理は、試料を中和すること、緩衝液と中和された試料を接触させること、次いで、導電性のイオンで試料を処理すること、相乗剤で試料を処理することを含むことができる。捕捉されない分子は、第2の導管522を介して第1のチャンバ520から第2のチャンバ524に放出される。デスクトップ検出システムは、本装置の前面の一連の操作ボタン506によってプログラムすることができ、結果は可視ディスプレイ510で見ることができる。

電導性パッドおよび電導性フィンガーが固定された検出チップは、支持体上に構築される。有用な支持体物質の例には、たとえば、ガラス、石英、およびケイ素、並びにポリマー基板（たとえばプラスチック）を含む。電導性または準電導性の支持体の場合、一般に支持体に絶縁層を含むことが望ましい。しかし、本装置を構築するためには、非導電性表面を有する任意の固体支持体を使用してもよい。支持体表面は、平らである必要はない。実際、支持体は、チップのチャンバ壁にあってもよい。

図6A〜Bは、携帯型検出システムを示す。このシステムは、携帯ユニット600と共に提供され、これは、携帯型パーソナル・デジタル・アシスタントの形態であることができる（たとえばa Palm（登録商標）unit, 3Com Corporation, Santa Clara, CA）。携帯ユニット600は、可視ディスプレイ602および制御ボタン604と共に提供される。スロット606は、電気コネクタ610を有する検出カートリッジ608を受けるように提供される。

図6Cは、本発明の携帯型検出システムに使用される検出カートリッジ608の模式図を示す。検出カートリッジ608は、筐体内に第1の注入ポート612を含み、これを介して試料溶液を導入することができる。

検出カートリッジ608は、試薬を保持するために適しており、かつ導管628を通して試薬を第1のチャンバ638に放出するように配置された複数の容器630、632、634、および636を含む。容器630、632、634、および636は、たとえば、中和剤、緩衝液、導電性のイオン溶液、および相乗剤を保有することができる。

試料前処理チャンバ614は、第1のチャンバ638の上流に配置され、フィルター618は、前処理チャンバ614および第1のチャンバ638の間に位置する。容器616は、前処理チャンバ614に隣接し、試料を前処理するための試薬を保持する。また、検出カートリッジ608は、フィルター620および導管624を経由して前処理チャンバ614に結合された前処理廃棄物チャンバ626を含む。第2のチャンバ642は、コネクタ640を経て第1のチャンバ638から放出される物質を受ける。検出カートリッジ608は、図1〜4の態様の試験カートリッジ102、202、302、および402に示したものの様に、電気的に分離された第1のチャンバ638の導体を電気コネクタ610に結合する電気コネクタ644を含む。

操作において、携帯型検出システムを使用する標的分子の検出は、図6A〜Cに示すように、次のように行うことができる。試料の溶解および清澄の後、試料溶液を第1の注入ポート612を介して検出カートリッジ608に導入する。試料前処理チャンバ614内において、試料を第1の容器616の試薬によって前処理することができる。変性および除タンパクの後、前処理された試料の一部がチャンバ622に保持されるように位置する試料をフィルター618に通すことによって、濃縮することができる。過剰な液体および不必要な細胞物質は、フィルター620および廃棄物チューブ624に通して、前処理廃棄物チャンバ626に収集される。第1のチャンバ638を通過する試料溶液部分は、第2の容器630から中和剤の付加によって中和される。第1のチャンバ638内では、中和された標的核酸分子が試料中に存在する場合には、図1〜4に関して上記したものと実質的に同じ方法で、第1のチャンバ638の検出チップ上の捕捉プローブとハイブリダイズさせることができる。この期間中に、第1のチャンバ638の内容物が、第3の容器632からの緩衝液と接触する。結合および洗浄の後、第4の容器634からの導電性イオン溶液で試料を処理し、その結果、導電性イオンが検出チップ上の捕捉プローブにハイブリダイズした標的分子に堆積される。その上、導電性イオン溶液で処理した後に、試料を第5の容器636からの相乗剤溶液で処理して、堆積した導電性イオンからの導電性金属の連続層を生成させることができる。過剰な緩衝液および廃棄緩衝液は、廃棄チューブ640を介して第1のチャンバ638を出て、第2のチャンバ624において回収される。電気コネクタ644は、検出チップ上の電気的に分離された導体を携帯ユニット600に接続する電気コネクタ610に結合する。携帯型検出システムは、携帯ユニット600の前面の一連のボタン604を操作することによってプログラムすることができ、結果はスクリーン602に視覚化される。

本発明の方法を行う際に、試料収集段階を初めに行い、ここでは、細菌、ウイルス、またはその他の種が収集されて、濃縮される。配列を決定される標的核酸分子は、通常組織試料から単離される。標的核酸分子がゲノムの場合、試料は、任意の組織由来のものであってもよい（もっぱら赤血球を除く）。たとえば、全血、末梢血リンパ球もしくはPBMC、皮膚、毛、または精液は、臨床的な試料の便利な供与源である。標的がRNAである場合もまた、これらの供与源が適している。血液およびその他の体液も、ウイルス核酸を単離するための便利な供与源である。標的核酸分子がmRNAである場合、試料は、mRNAが発現されている組織から得られる。試料中の標的核酸分子がRNAである場合、これをDNAに逆転写してもよいが、本発明においてDNAに変換する必要はない。

本発明の方法を実行する方法のさらなる詳細は、Connollyに対する米国特許第6,399,303号B1において記載され、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる。

解析する試料のタイプに依存して、複数の収集方法を使用することができる。液体試料は、一定体積の液体を溶解緩衝液に配置することによって回収することができる。風媒性の試料は、空気を一定時間フィルタを通すことによって回収することができる。フィルタを溶解緩衝液で洗浄することができる。または、フィルタを直接溶解緩衝液に入れることができる。水を担体とする試料は、一定量の水をフィルタを通すことによって回収することができる。次いで、フィルタを溶解緩衝液で洗浄すること、または溶解緩衝液に直接浸すことができる。乾燥試料は、関心対象の生物体を除去するために、溶解緩衝液に直接析出させることができる。

細胞、ウイルス、またはその他の組織試料の全体を解析する場合、典型的には、種々の試料調製操作を続ける前に、細胞またはウイルスから核酸を抽出することが必要である。したがって、試料収集に続いて、回収した細胞、ウイルスの外殻などから、核酸を粗抽出物中へ遊離させ、続いて、混入している（DNA結合）タンパク質の変性、精製、濾過、および脱塩の次の操作のために試料を調製するためにさらなる処理を行ってもよい。

試料細胞またはウイルスからの核酸の遊離、およびDNA結合タンパク質の変性は、一般に物理的または化学的な方法によって行ってもよい。たとえば、化学的方法は、一般に細胞を崩壊させるための溶解剤を使用して細胞から核酸を抽出し、続いて任意に混入しており、および潜在的に干渉するタンパク質を変性させるために、グアニジウムイソチオシアネートまたは尿素などのカオトロピック塩で抽出物を処理する。一般に、化学的な抽出および／または変性方法を使用する場合、適切な試薬を抽出チャンバ（分離したアクセスできるチャンバ）内に取り込むか、または外部から導入してもよい。

または、核酸を抽出し、およびDNA結合タンパク質を変性させるために、物理的な方法を使用してもよい。米国特許第5,304,487号（これは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）は、マイクロチャネル内の物理的な突出またはチャンバもしくはチャネル内の鋭い先端の粒子を使用して、細胞膜を突き通してこれらの内容物を抽出することについて考察する。また、細胞抽出のためのより伝統的な方法を使用してもよく、たとえば、横断面寸法が制限されたチャネルを使用し、試料を十分な流量圧力でチャネルを通過すると、細胞溶解が生じる。または、細胞抽出および混在タンパク質の変性は、交流電流を試料に印加することによって行ってもよい。より詳細には、細胞試料を微小管アレイを通して流し、一方で、交流電流を液体の流れ全体に印加する。細胞の溶解／抽出を行うために、本発明の装置内でその他の種々の方法を使用してもよく、たとえば、細胞を超音波撹拌に供する段階、または幾何学的形態（microgeometry）装置を通して細胞を押し込むことにより、細胞を高剪断応力に供して、破裂を生じさせる段階を含む。

抽出に続いて、粗抽出物におけるその他のエレメント、たとえば変性タンパク質、細胞膜粒子などから核酸を分離することが多くの場合望ましい。微粒子物質の除去は、一般に濾過、凝結などによって達成される。理想的には、試料は濾過によって濃縮され、これはより迅速であり、特殊な試薬を必要としない。種々のフィルタタイプが、容易に装置に組み込まれる場合がある。細胞材料だけを通過することができるフィルタに試料を通して、生物体全体および破壊された細胞片を捕捉することができる。さらに、化学的変性法を使用する場合、次の工程へ進む前に試料を脱塩することが望ましい場合がある。試料の脱塩、および核酸の単離は、一般に1工程で、たとえば、核酸を固相に結合して混入している塩を洗い流す段階、または試料に対してゲル濾過クロマトグラフィを行う段階によって行われてもよい。核酸の結合に適した固体の支持体は、たとえば、珪藻土、シリカ等を含む。また、適切なゲル排除媒体が当技術分野において周知であり、商業的に入手可能である（たとえば、PharmaciaおよびSigma Chemical）。この単離および／またはゲル濾過／脱塩は、さらなるチャンバにおいて行ってもよく、または、代わりに、特定のクロマトグラフィ媒体をチャネルもしくは流路に組み込んで、後続の反応チャンバに導いてもよい。

プローブは、好ましくは標的と結合するように選択され、その結果ほぼ同じ融解温度を有する。これは、ハイブリダイゼーション領域の長さを変化させることによって行うことができる。A-Tリッチな領域は、より長い標的配列を有してもよいが、G-Cリッチな領域は、より短い標的配列を有する場合がある。

基板に結合したオリゴヌクレオチドアレイ上のハイブリダイゼーションアッセイ法は、ハイブリダイゼーション工程および検出工程を含む。ハイブリダイゼーション工程は、潜在的に標的、およびイソ安定化剤（isostabilizing agent）、変性剤、または再生促進剤を含む試料をアレイのプローブと接触させて、標的と任意の相補的なプローブの間のハイブリダイゼーションを可能にする温度で、かつ適切な時間インキュベートした。

ハイブリダイゼーション混合物にハイブリダイゼーション最適化剤を含むことにより、完全にマッチした標的および一塩基ミスマッチ間のシグナルの識別を有意に改善する。本明細書において使用される場合の、「ハイブリダイゼーション最適化剤」という用語は、ミスマッチ核酸分子、すなわちその配列が正確に相補的ではない核酸分子の間のハイブリダイゼーションを減少させる組成物をいう。

イソ安定化剤は、DNAの熱融解遷移の塩基対組成依存性を減少させる組成物である。より詳しくは、本用語は、適切な濃度において、それぞれATまたはGCで構成される二本鎖DNAオリゴヌクレオチドについて、たった約1℃の差の融解温度を生じる化合物をいう。イソ安定化剤は、好ましくは1Mと10Mの間、より好ましくは2Mと6Mの間、最も好ましくは4Mと6Mの間、4Mと10Mの間に、並びに至適には約5Mの濃度で使用される。たとえば、5Mの薬剤の2×SSPE（塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／EDTA溶液）溶液が適当である。ベタインおよび低級テトラアルキルアンモニウム塩は、適切なイソ安定化剤の例である。

ベタイン（N,N,N,-トリメチルグリシン；（Reesら、 Biochem., 32： 137-144 （1993）、これは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる））により、DNAの熱安定性の塩基対組成依存性を除去することができる。塩化テトラメチルアンモニウム（「TMACl」）とは異なり、ベタインは、中性のpHにおいて双性イオンであり、核酸の高分子電解質の挙動を変化させないが、核酸の組成依存的な安定度を変化させる。約5Mのベタインの含有量では、平均ハイブリダイゼーションシグナルを低下させることができるが、マッチしたおよびミスマッチのプローブ間の識別性を増大する。

変性剤は、二本鎖核酸分子の塩基間の水素結合または核酸分子の水和を妨げることによって、二本鎖核酸分子の融解温度を低下させる組成物である。変性剤は、約1M〜約6M、および好ましくは、約3M〜約5.5Mの濃度でハイブリダイゼーション緩衝液に含めることができる。

変性剤は、ホルムアミド、ホルムアルデヒド、ジメチルスルホキシド（「DMSO」）、酢酸テトラエチル、尿素、チオシアン酸グアニジン（「GuSCN」）、グリセリン、およびカオトロピック塩を含む。本明細書において使用されるものとして、「カオトロピック塩」という用語は、核酸分子の原子間のファンデルワールス引力を崩壊させるように機能する塩をいう。たとえば、カオトロピック塩は、トリフルオロ酢酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、およびチオシアン酸カリウムを含む。

再生促進剤は、核酸の再生速度を少なくとも100倍増大する化合物である。これらは、通常、核酸分子と弱く結合する比較的構造化されていない重合体ドメインを有する。促進剤は、異質核内リボ核タンパク質（heterogenous nuclear ribonucleoprotein:「hnRP」）A1、並びに好ましくは、臭化セチルトリメチルアンモニウム（「CTAB」）およびドデシル臭化トリメチルアンモニウム（「DTAB」）などの陽イオン界面活性剤、並びに、また、ポリリジン、スペルミン、スペルミジン、一本鎖結合タンパク質（「SSB」）、T4ファージ遺伝子32タンパク質、並びに酢酸アンモニウムおよびエタノールの混合物を含む。再生促進剤は、約1μM〜約10mM、および好ましくは1μM〜約1mMの濃度でハイブリダイゼーション混合物に含まれうる。CTAB緩衝液は、0.1mM程度の低濃度でよく機能する。

ハイブリダイゼーション緩衝液への少量のイオン性界面活性剤（N-ラウロイル-サルコシンなど）の添加もまた有用である。LiClは、NaClよりも好ましい。ハイブリダイゼーションは、約14ヌクレオチドのプローブについては、20℃〜65℃、通常37℃〜45℃であってもよい。ハイブリダイゼーション条件のさらなる例は、いくつかの供与源において提供されており、Sambrookら、Molecular Cloning： A Laboratory Manual、 2nd Ed.、Cold Spring Harbor、N.Y. （1989）；並びにBergerおよびKimmel、「Guide to Molecular Cloning Techniques」Methods in Enzymology、 Volume 152, Academic Press, Inc.、San Diego、Calif. （1987）；YoungおよびDavis、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、80： 1194 （1983）を含み、これらは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。

水性緩衝液に加えて、非水性緩衝液も使用してもよい。特に、ハイブリダイゼーションを容易にするが、低導電率を有する非水溶緩衝液が好ましい。

試料およびハイブリダイゼーション試薬をアレイと接触して配置し、インキュベートする。接触は、任意の適切な容器において、たとえば、プローブアレイを保持するように、並びに流体を導入および除去することができるように、特別に設計されたディッシュまたはセルにおいて行うことができる。一般に、インキュベーションは、核酸のハイブリダイゼーションに通常使用される温度で、たとえば、約20℃〜約75℃の間、たとえば、約25℃、約30℃、約35℃、約40℃、約45℃、約50℃、約55℃、約60℃、または約65℃の間であると考えられる。約14ヌクレオチドよりも長いプローブについては、37〜45℃が好ましい。より短いプローブについては、55〜65℃が好ましい。より特異的なハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイズした領域の融点を決定するための式を使用して算出することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、融解温度の5度以下および融解温度の温度において、またはその間において行う。より好ましくは、ハイブリダイゼーションは、融解温度および融解温度の5度以下の温度において、またはその間において行う。標的と任意の相補的な捕捉プローブの間で所望のハイブリダイゼーションレベルにさせるために十分な時間、標的を捕捉プローブとインキュベートする。ハイブリダイゼーション混合物とのインキュベーション後、電気的に分離された導体をハイブリダイゼーション緩衝液（これは、ハイブリダイゼーション最適化剤を含んでいてもよい）で洗浄する。これらの薬剤は、ハイブリダイゼーション工程のための量と同じ範囲で含まれることができ、またはこれらは全く除去することができる。

捕捉プローブを導体に付着させる方法についての詳細は、米国特許出願第10/288,657号に記載されており、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる。

導体に捕捉プローブを付着するために、種々のその他の方法が存在する。たとえば、米国特許第5,861,242号、同第5,861,242号、同第5,856,174号、同第5,856,101号、および同第5,837,832号は（これらは、これらの全体が参照として本明細書に組み入れられる）、固体支持体の表面上の除去できる保護基で保護されている機能基（オリゴヌクレオチド、典型的には-OH）を活性化するために、マスクを通って光が照射される方法を開示する。光活性化の後、光除去できる保護基で保護された（5’-OHで）ヌクレオシドブロック自体は、支持体の活性化領域に結合される。基板上にプローブを配置するために、異なるマスクまたはマスク指向およびブロックを使用して、プロセスを繰り返すことができる。

または、ペプチド、ポリカルバメート、オリゴヌクレオチドのアレイのコンビナトリアル・ケミストリー合成のための新たな方法が最近報告された（Fodorら、Science 251： 767-773 （1991）； Choら、Science 261： 1303-1305 （1993）；およびSouthernら、 Genomics 13： 1008-10017 （1992）を参照されたい、これらはその全体が参照として本明細書に組み入れられる）。これらのアレイ（Fodorら、Nature 364： 555-556 （1993）を参照し、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる）は、高密度で情報豊富な形式で、正確な位置に特異的に化学物質を収容し、生物学的な認識プロセスの研究のための強力なツールである。

好ましくは、プローブは、空間的に定方向のオリゴヌクレオチド合成によって装填材料に付着される。空間的に定方向のオリゴヌクレオチド合成は、基板上の特異的な位置にオリゴヌクレオチドを合成させる任意の方法によって行われてもよい。空間的に定方向のオリゴヌクレオチド合成のための方法は、光定方向（light-derected）オリゴヌクレオチド合成、マイクロリソグラフィ、インクジェットによる適用、特異的な位置に対するマイクロチャネル沈着、および物理的な障害での隔離を含むが、これらに限定されない。一般に、これらの方法は、保護基を除去することによって、活性部位を作製すること、およびさらなるヌクレオチドのカップリングが望まれる場合、それ自体が任意で保護された活性部位を有するヌクレオチドを、活性部位にカップリングすることを含む。

1つの態様において、リードに結合したオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,143,854号、国際公開公報第92/10092号、および国際公開公報第90/15070号（これらは、これらの全体が参照として本明細書に組み入れられる）に開示されている光定方向オリゴヌクレオチド合成によって、特異的な位置に合成される。このプロセスの基本的ストラテジーにおいて、リンカーおよび感光性保護基によって修飾された固体支持体の表面は、フォトリソグラフィのマスクを通って照射され、照射領域に反応性のヒドロキシル基を生じる。次いで、3’-O-ホスホラミダイトで活性化されたデオキシヌクレオシド（感光性基を有する5’-ヒドロキシルで保護されている）が表面に提示されて、光に照射された部位でカップリングが生じる。任意の反応していない活性部位のキャップ形成および酸化に続いて、基板をリンスして、リンカーにカップリングするためのさらなるヒドロキシル基を曝露するために、表面を第2のマスクを通して照射する。第2の5’保護された、3’-O-ホスホラミダイトで活性化されたデオキシヌクレオシド（C-X）が表面に提示される。選択的な光脱保護およびカップリングのサイクルを、所望のセットのプローブが得られるまで繰り返す。次いで、感光性基を任意で除去して、配列をその後に、任意でキャップ形成する。側鎖保護基が存在する場合、これも除去する。フォトリソグラフィが使用されるので、プロセスは、支持体上に高密度でリードを特異的に標的化するために小型化することができる。

保護基は、それ自体が感光性であることができる。または、保護基は、特定の化学的条件、たとえば酸条件下で不安定であることができる。この実施例では、固体支持体の表面は、光に対する照射によって酸を発生する組成物を含むことができる。したがって、光に対して基板領域を照射すると、その領域に酸を発生し、露出領域の保護基を除去する。また、合成方法は、3’保護された5'-O-ホスホラミダイトで活性化されたデオキシヌクレオシドを使用することができる。この場合、オリゴヌクレオチドは、5’から3’への方向に合成され、遊離の5’末端を生じる。

光に曝露することによって保護基を除去すること、曝露された活性部位にヌクレオチドをカップリングすること（任意で、さらなるカップリングに適格なもの）、および任意の応していない部位のキャップ形成の一般的なプロセスは、本明細書において「光定方向ヌクレオチドカップリング」という。

プローブは、好ましくはプローブまたはヌクレオチドを支持体物質よりも導体に結合する、プローブまたはヌクレオチドを導体に付着するための化学反応を使用することにより、電気的に分離された導体に標的化してもよい。または、プローブまたはヌクレオチドは、導体上に、静電気的にプローブまたはヌクレオチドを引きつける電荷を構築することによって導体に標的化してもよい。

誤って導体に付着したプローブを除去するために、ヌクレアーゼを使用することができる。より詳しくは、標的核酸分子をプローブに添加してもよい。両方の末端で、プローブに一端をそれぞれの導体に結合する標的は、遊離末端を有さないと考えられ、エキソヌクレアーゼ消化に耐性であると考えられる。しかし、標的が両方の導体と接触できないように配置されたプローブは、一端だけで結合し、分子が消化を受けやすいままであると考えられる。したがって、不適切に位置するプローブを除去することができ、一方で適切に位置するプローブを保護する。プロテアーゼを除去または不活性化させた後、標的核酸分子を除去することができ、本装置の使用のための準備がされる。

捕捉プローブは、結合化学に適合性の活性化されたヒドロキシル基を有する限り、天然のヌクレオチド、化学的に修飾されたヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体から形成することができる。このようなRNA類似体またはDNA類似体は、2'-O-アルキル糖修飾、メチルホスホネート、ホスホロチオネート、ホスホロジチオネート、ホルムアセタール、3’-チオホルムアセタール、スルホン、スルファメート、および窒素酸化物主鎖の修飾、アミド、並びに基礎部分が修飾された類似体を含むが、限定されない。加えて、オリゴマーの類似体は、糖部分が別の適切な部分によって修飾され、または置換された重合体であり、以下のものを含むが、これらに限定されない重合体を生じてもよい：ポリビニル主鎖（Pithaら、「Preparation and Properties of Poly （I-vinylcytosine）」、Biochim. Biophys. Acta、204： 381-8 （1970）； Pithaら、「Poly （1-vinyluracil）：The Preparation and Interactions with Adenosine Derivatives」、 Biochim. Biophys. Acta、204： 39-48 （1970）、これらは、これらの全体が参照として本明細書に組み入れられる）、モルホリノ主鎖（Summertonら、「Morpholino Antisense Oligomers： Design, Preparation, and Properties」、Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 7： 187-9 （1997）、これは、その全体が参照として本明細書に組み入れられる）、およびペプチド核酸（PNA）類似体（Steinら、「A Specificity Comparison of Four Antisense Types： Morpholino, 2'-O-methyl RNA, DNA, and Phosphorothioate DNA」、J. Antisense Nucleic Acid Drug Dev.、 7： 151-7 （1997）； Egholmら、「Peptide Nucleic Acids （PNA）-Oligonucleotide Analogues with an Achiral Peptide Backbone」、（1992）； Faruqiら、「Peptide Nucleic Acid-Targeted Mutagenesis of a Chromosomal Gene in Mouse Cells」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 95： 1398-403 （1998）； Christensenら、「Solid-Phase Synthesis of Peptide Nucleic Acids」、J. Pept. Sci.、1： 175-83（1995）； Nielsenら、「Peptide Nucleic Acid（PNA）. A DNA Mimic with a Peptide Backbone」、Bioconjug. Chem.、5：3-7（1994）、これらは、その全体が参照として本明細書に組み入れられる）。

捕捉プローブは、例示的には以下の修飾を含むことができる：タンパク質（たとえば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、およびポリ‐L‐リジンを含む）などの突出部分；干渉物質（たとえばアクリジン、およびソラレン）、キレート剤（たとえば、金属、放射性金属、ホウ素、および酸化的金属）、アルキル化剤（alkylators）、並びにその他の修飾された結合（たとえば、αアノマー核酸）。このような類似体は、標的RNAのRNAseHを媒介したた破壊、結合親和性、ヌクレアーゼ耐性、および／または標的特異性を改善する目的の、結合基および／または糖もしくは塩基の構造の修飾を含む上述の修飾の種々の組み合わせを含む。

本発明は、病原菌の検出などの多くの適用のために使用することができる。たとえば、飲料水または食品から試料を単離して、感染生物を迅速にスクリーニングしてもよい。本発明は、食品または水を試験するために使用してもよい。最近では、汚染された肉製品のいくつかの大規模なリコールがあった。本発明の検出システムは、食品の病原体の製造中の検出、およびその後の汚染された物質の処分のために使用することができる。これにより、有意に食品安全性を改善し、食品に含まれる疾病および死亡を防止し、並びに費用のかかるリコールを避けることができる。食品産業において使用するために、サルモネラ（Salmonella）および大腸菌（E. coli）などの、一般の食品に含まれる病原体を同定することができる捕捉プローブを設計することができる。

さらにもう1つの態様において、本発明は、生物戦病原体のリアルタイム検出に使用することができる。交戦圏において、およびテロ攻撃において、生物兵器の使用の最近の懸念と共に、本装置は、戦闘兵のための個人センサーに、または生物学的な脅威の高度な警告のためのリモートセンサーに構成することができる。特に病原体の同定に使用することができる装置は、別の位置に情報を送るためのモデムと結合することができる。また、モバイル機器は、位置情報および病原菌情報を提供する全地球測位システムを含んでいてもよい。

さらにもう1つの態様において、本発明は、個体を同定するために使用してもよい。個体を区別するために十分な数の、高度な信頼性を有する一連のプローブを本装置内に配置する。種々の多型部位が使用される。好ましくは、本装置は、1,000,000人に1人よりも高い特異性で同定することができ、より好ましくは1,000,000,000人に1人よりも高い特異性であり、さらにより好ましくは10,000,000,000人に1人よりも高い特異性である。

本発明は、説明のために詳述したが、このような詳細は、単にその目的のためだけであり、当業者により、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、変更を行うことができることが理解される。

標的核酸分子を検出するための、電気的に分離された導体の複数の異なる群を有する、本発明の1つの態様を示す概略図である。標的核酸分子を検出するための、電気的に分離された導体の複数の異なる群を有する、本発明の第2の態様を示す概略図である。標的核酸分子を検出するための、電気的に分離された導体の複数の異なる群を有する、本発明の第3の態様を示す概略図である。標的核酸分子を検出するための、電気的に分離された導体の複数の異なる群を有する、本発明の第4の態様を示す概略図である。図5A〜Bは、試料から標的核酸分子を検出するためのシステムの斜視図を示し、デスクトップ検出ユニットおよびデスクトップユニットに挿入されるカートリッジを含む。図5Cは、このシステムの概略図を示す。図6A〜Bは、標的核酸分子を検出するためのシステムの斜視図を示し、携帯型検出ユニットおよび携帯型ユニットに挿入されるカートリッジを含む。図6Cは、このシステムの概略図を示す。

Claims

試料中の標的核酸分子を検出する方法であって：
電気的に分離された導体上の捕捉プローブ間に間隙が存在するように導体に付着された捕捉プローブを有する、2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体の複数の異なる群を提供すること;
潜在的に標的核酸分子を含む試料と捕捉プローブを、試料に存在する任意の標的核酸分子を捕捉プローブにハイブリダイズさせるために有効な条件下で接触させて、これにより捕捉プローブを結合すること;および
電気が電気的に分離された導体の間を電導されるかどうか決定することによって標的核酸分子の存在を検出すること、
を含む方法。
捕捉プローブがオリゴヌクレオチドである、請求項1記載の方法。
捕捉プローブがペプチド核酸類似体である、請求項1記載の方法。
標的核酸分子がDNAである、請求項1記載の方法。
標的核酸分子がRNAである、請求項1記載の方法。
捕捉プローブが病原菌の遺伝物質由来の標的核酸分子に相補的である、請求項1記載の方法。
病原菌が生物戦病原体である、請求項6記載の方法。
病原菌が食品伝染病原体である、請求項6記載の方法。
捕捉プローブがウイルスの遺伝物質由来の標的核酸に相補的である、請求項1記載の方法。
捕捉プローブがヒトの遺伝物質由来の標的核酸に相補的である、請求項1記載の方法。
多型に相補的な塩基または塩基群が捕捉プローブの末端に位置する場合に、捕捉プローブが多型に相補的である、請求項1記載の方法。
2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体の複数の異なる群のための捕捉プローブが、同じ標的核酸分子が捕捉プローブにハイブリダイズさせるように同じである、請求項1記載の方法。
電気が電気的に分離された導体の間を電導されるかどうか決定することによって標的核酸分子の存在を検出する結果として、試料中の標的核酸分子の量を定量することをさらに含む、請求項12記載の方法。
定量することが、2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体の異なる群上の標的核酸分子との接触のために利用できる異なる量の捕捉プローブを有することによって行われる、請求項13記載の方法。
標的核酸との接触のために利用できる捕捉プローブの量が、異なる被露出領域を有する2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体の異なる群を有することによって変化される、請求項14記載の方法。
2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体の異なる群が、異なる数の電気的に分離された導体を有する、請求項15記載の方法。
標的核酸との接触のために利用できる捕捉プローブの量が、所与の被露出領域に異なる濃度の捕捉プローブを有する2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体を有することによって変化される、請求項14記載の方法。
2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体の少なくともいくつかの異なる群のための捕捉プローブが、異なる標的核酸分子を捕捉プローブにハイブリダイズさせるように異なっている、請求項1記載の方法。
異なる標的核酸分子が同じ供与源に由来する、請求項18記載の方法。
供与源が病原菌である、請求項19記載の方法。
供与源がウイルスである、請求項19記載の方法。
供与源がヒトである、請求項19記載の方法。
異なる標的核酸分子が異なる供与源に由来する、請求項18記載の方法。
少なくとも1つの供与源が病原菌である、請求項23記載の方法。
少なくとも1つの供与源がウイルスである、請求項23記載の方法。
少なくとも1つの供与源がヒトである、請求項23記載の方法。
2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体の複数の異なる群の少なくともいくつかのための捕捉プローブが、これらの同じ捕捉プローブに同じ標的核酸分子をハイブリダイズさせるように同じである、請求項18記載の方法。
電気が同じ捕捉プローブを有する電気的に分離された導体の間を電導されるかどうか決定することによって標的核酸分子の存在を検出する結果として、試料中の標的核酸分子の量を定量することをさらに含む、請求項27記載の方法。
定量することが、2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体の異なる群上の標的核酸分子との接触のために利用できる異なる量の捕捉プローブを有することによって行われる、請求項28記載の方法。
標的核酸との接触のために利用できる捕捉プローブの量が、異なる被露出領域を有する2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体を有することによって変化される、請求項29記載の方法。
2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体の異なる群が、異なる数の電気的に分離された導体を有する、請求項30記載の方法。
標的核酸との接触のために利用できる捕捉プローブの量が、所与の被露出領域に異なる濃度の捕捉プローブを有する2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体の異なる群を有することによって変化される、請求項28記載の方法。
捕捉プローブ並びに捕捉プローブにハイブリダイズした任意の標的核酸分子を、導電性材料で被覆することさらに含む、請求項1記載の方法。
導電材料が銀である、請求項33記載の方法。
導電材料が金である、請求項33記載の方法。
検出結果を統計学的に解析することをさらに含む、請求項1記載の方法。
試料中の標的核酸分子を検出するための装置であって：
2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体の複数の群、および
電気的に分離された導体上の捕捉プローブ間に間隙が存在するように導体に付着された捕捉プローブを含み、導体の異なる群の捕捉プローブが同じである装置。
2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体の異なる群上の標的核酸分子との接触のために利用できる異なる量の捕捉プローブを有する、請求項37記載の装置。
標的核酸との接触のために利用できる捕捉プローブの量が、異なる被露出領域を有する2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体を有する装置を有することによって変化される、請求項38記載の装置。
2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体の異なる群が電気的に分離された異なる数の導体を有する、請求項39記載の装置。
標的核酸との接触のために利用できる捕捉プローブの量が、所与の被露出領域に異なる濃度の捕捉プローブを有する2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体の異なる群を有することによって変化される、請求項38記載の装置。
捕捉プローブがオリゴヌクレオチドである、請求項37記載の装置。
捕捉プローブがペプチド核酸類似体である、請求項37記載の装置。
試料中の標的核酸分子を検出するための装置であって：
2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体の複数の群、および
電気的に分離された導体上の捕捉プローブ間に間隙が存在するように導体に付着された捕捉プローブを含み、導体の異なる群の少なくともいくつかの捕捉プローブが同じである装置。
同じ標的核酸分子が同じ捕捉プローブのものにハイブリダイズするように、導体の異なる複数の群の少なくともいくつかの捕捉プローブが同じである、請求項44記載の装置。
2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体の異なる群上の同じ標的核酸分子との接触のために利用できる異なる量の捕捉プローブを有する、請求項45記載の装置。
標的核酸との接触のために利用できる捕捉プローブの量が、異なる被露出領域を有する2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体を有する装置を有することによって変化される、請求項46記載の装置。
2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体の異なる群が、電気的に分離された異なる数の導体を有する、請求項47記載の装置。
標的核酸との接触のために利用できる捕捉プローブの量が、所与の被露出領域に異なる濃度の捕捉プローブを有する2つまたはそれ以上の電気的に分離された導体を有することによって変化される、請求項46記載の装置。
捕捉プローブがオリゴヌクレオチドである、請求項44記載の装置。
捕捉プローブがペプチド核酸類似体である、請求項44記載の装置。