JP2005519905A - Ｄｎａの製剤 - Google Patents

Ｄｎａの製剤 Download PDF

Info

Publication number
JP2005519905A
JP2005519905A JP2003561574A JP2003561574A JP2005519905A JP 2005519905 A JP2005519905 A JP 2005519905A JP 2003561574 A JP2003561574 A JP 2003561574A JP 2003561574 A JP2003561574 A JP 2003561574A JP 2005519905 A JP2005519905 A JP 2005519905A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dna
preparation according
pharmaceutical preparation
dna pharmaceutical
storage medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2003561574A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2005519905A5 (ja
Inventor
キャッチポール，イアン，リチャード
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Glaxo Group Ltd
Original Assignee
Glaxo Group Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB0201736.6A external-priority patent/GB0201736D0/en
Priority claimed from GB0201735A external-priority patent/GB0201735D0/en
Application filed by Glaxo Group Ltd filed Critical Glaxo Group Ltd
Publication of JP2005519905A publication Critical patent/JP2005519905A/ja
Publication of JP2005519905A5 publication Critical patent/JP2005519905A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0021—Intradermal administration, e.g. through microneedle arrays, needleless injectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/167—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction with an outer layer or coating comprising drug; with chemically bound drugs or non-active substances on their surface
    • A61K9/1676—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction with an outer layer or coating comprising drug; with chemically bound drugs or non-active substances on their surface having a drug-free core with discrete complete coating layer containing drug
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/141—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers
    • A61K9/145—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers with organic compounds

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本発明は人体の皮膚への弾道的送達に適したDNA剤に関する。特に本発明は皮膚内へのDNAワクチンの弾道的投与に適したDNA処方を提供する。本発明は、DNA薬剤を含む非晶性の固形貯蔵媒体で被覆された高密度核成分を有する、新規のDNA医薬製剤を提供する。

Description

本発明はDNA薬剤、および好ましくは人体の皮膚への弾道的送達(ballistic delivery)に適したそれらの処方に関する。本発明は、その中の固溶液または懸濁液中にDNA薬剤を含む、非晶性の固形貯蔵媒体で被覆された高密度核成分を有する、新規のDNA医薬製剤を提供する。高密度核成分(dense core element)は好ましくは、細胞内への薬剤の弾道的送達に適した小さな金属ビーズであり、通常このようなビーズは平均粒径が直径0.5〜10μmの範囲のほぼ球形の金またはタングステンマイクロビーズである。好ましくは、ビーズを被覆している固形の薬剤貯蔵媒体はポリオールであり、非晶性状態のポリオールであることが好ましい。好ましくはポリオールはトレハロースまたはスクロースなどの炭水化物である。固形の薬剤貯蔵媒体は更に、フリーラジカルスカベンジャーまたは金属イオンキレート剤など、フリーラジカルの分解効果を阻害する安定化剤を含有しうる。本発明のDNA薬剤は貯蔵安定性があり、その中でDNAはスーパーコイル型で安定化され、皮膚内への投与後にだけ十分にDNA薬剤を放出する。更に、皮膚内にDNAワクチンを投与するためのワクチン送達装置、それらの製造方法および医学においてのそれらの使用方法を提供する。
皮膚は外部物質に対する有効な防壁に相当する。ヒトの皮膚の概説はDorland's Illustrated Medical Dictionary, 第28版に示されている。外層から始まり、内側で機能している皮膚は、角質層を含む上皮、生きている上皮から成り、上皮の下にあるのが真皮である。生きている上皮は５つの層で構成される。すなわち、角質層、透明層、顆粒層、有棘層、基底層である。上皮（５つの層すべてを含む）は、皮膚の非血管性の最外層であり、厚さ0.07〜0.12 mm（70〜120μm）の間で変化する。上皮は、ケラチンを産生し専門化した上皮細胞の95％を構成する細胞、ケラチノサイトで占められている。他の5％の細胞はメラノサイトである。基底を成す真皮は通常、角質層表面の直下に0.3から約3 mmの範囲で見られ、汗腺、毛嚢、神経終末および血管を含む。
角質層は皮膚の透過防壁の中心であり、いくらか半透明の角化上皮層から成る。この領域の死んだまたは死につつあるケラチノサイトの間の狭い隙間は、結晶性の脂質多重膜で満たされている。これらは、親水性分子の侵入に対して疎水性防壁を提供することによって、効果的に皮膚または体内と外界との間隙を密封する。角質層は30〜70μmの範囲の厚さである。
ランゲルハンス細胞は、生きている上皮の基底顆粒層（有棘層および顆粒層、（Small Animal Dermatology - 第３版, Muller - Kirk - Scott, Ed: Saunders (1983））中全体に見られ、侵入生物に対する免疫系の初期防御に重要な役割を担うと考えられる。従って、この皮膚層はある種のワクチンにとって適切な標的領域に相当する。
通常、皮下注射針および注射器による、皮膚内へのまたは皮膚を越えての従来の薬剤の投与の方法は、多数の欠点を有する。このような欠点は、痛み、薬剤を投与するための訓練を受けた専門家の必要性、およびまた、血液感染性疾患への感染の危険性を伴う投与者の針刺し傷害の危険性をも含む。このように、皮膚内へのまたは皮膚を介したあらゆる種類の薬剤の投与方法を改善する必要がある。
基底層を越えての薬剤投与の問題を克服するために、超音速気体流でのワクチンの弾道的送達のための様々な装置を含む、多数の代替的アプローチが記述されている。
DNAワクチンは通常、その中に強力なウイルスのプロモーター、抗原ペプチドをコードする関心の遺伝子、およびポリアデニル化/転写終止配列が挿入された細菌のプラスミドベクターで構成される。関心の遺伝子は、病原体、腫瘍もしくは防御されることを目的とする他の病因に関連する、タンパク質全体または単に抗原ペプチド配列をコードしうる。プラスミドは例えばE.coliなどの細菌内で増やすことができ、その後、単離され、宿主に投与される前に、目的の投与経路に応じて適切な媒体で調製される。投与後、宿主細胞はプラスミドがコードするタンパク質またはペプチドを産生する。哺乳動物宿主内でのプラスミドの複製および関連した動物の染色体DNAへの組込みを防ぐために、プラスミドベクターは通常、真核細胞で機能する複製起点を持たずに作製される。DNAワクチン接種に関する情報はDonnellyら、"DNA vaccines" Ann. Rev Immunol. 1997 15: 617-648で提供され、その開示は参照により本明細書に完全に組み入れられる。
特に免疫または遺伝子治療の目的のため、プラスミドに基づく遺伝子の送達が知られている。例えば、マウスの筋肉内への注射によるむき出しのDNAの投与は、WO90/11092に概説される。JohnstonらWO 91/07487は、関心の遺伝子をコードするポリヌクレオチドが沈着したマイクロビーズの使用によって、脊椎動物細胞に遺伝子を移送する方法、および、それらが標的細胞に侵入できるようにDNA/マイクロビーズを加速する方法を記載する。皮膚細胞へのDNAで被覆した金またはタングステンビーズの投与装置は、米国特許第5,630,796号; WO 96/04947; WO 96/12513; WO 96/20022; WO 97/34652; WO 97/48485; WO 99/01168; WO 99/01169に記載されている。結晶型の弾道的送達される薬剤を用いたワクチン接種方法はWO 99/27961に記載される。本発明は、上記の文献に記載されるような針のない弾道的送達装置のための改善されたDNAの製剤を提供する。当技術分野において記載されているような、DNAを金ビーズ上に沈着させる処方は、DNAを付加的な薬剤/賦形剤と共に処方することが困難であるという問題を有する。本発明は付加的な薬剤を共に処方する方法を提供する。
製剤が弾道的送達される粉末の形である、薬剤（DNAプラスミドを含む）および安定化ポリオール（糖など）を含有している固形の製剤は、WO 96/03978に記載されている。非晶性糖ガラス中の薬剤の安定化は、米国特許第5,098,893号に記載されている。
製剤に用いられる糖は結晶性または非晶性のいずれかであり得る。非晶性固体は、結晶性物質に見られる三次元の長距離秩序の欠如によって結晶と区別される。非晶性固体は分子レベルで液体と類似しており、その分子は不規則に配置されている。ガラス転移温度より低い温度で保存した場合、非晶性糖は薬剤に安定性をもたらす。非晶性糖は、ガラス転移温度と呼ばれる温度以下で糖基質中の分子の移動度に変化があるという特性を示す。この温度（Tg）以下では、非晶性糖はガラス状態で存在し、この温度以上では、ゴム状態で存在する。Tgより低い温度では、糖分子および糖基質に関連したまたは閉じ込められた任意の分子の移動度は非常に低く、このような処方の長期安定性を生じさせる。言い換えると、ガラス質の形成は分子の拡散速度を劇的に減少させる。これはまた、定圧熱容量（Cp）の40〜100％までの減少を伴う。この転移は示差走査熱量測定法のような高感度の熱測定技術によって容易に観察できる（Duddu, S.P., Zhang G,およびDal Monte, P. R., 1997., Pharm Res., 14: 596-600）。糖の安定化特性はまた、それらのタンパク質のような生体分子との水素結合特性にも起因している。
DNA薬剤は、スーパーコイル型で送達されることが望ましい。液体製剤中のスーパーコイルDNAは、時間とともに分解し、スーパーコイル構造の喪失および関連した開環状または直鎖状DNA構造の形成を引き起こすことが知られている（Evansら、2000, Journal of Pharmaceutical Sciences, 89 (1), 76 - 87; WO 97/40839）。この鎖の切断反応が起こる機構の１つは、DNA溶液中の溶存酸素から産生される遊離のヒドロキシルラジカルによるDNAの酸化、金属イオンによって触媒される過程である。フリーラジカル形成反応はいくつかの遷移金属イオンによって触媒されうるが、最も一般的なものは鉄および銅イオンである（Fe+3, Fe+2, Cu+2またはCu+1; Evansら、上述）。
スーパーコイルDNAの不安定性は、DNAが溶液である場合に明らかである。しかし、金属イオンキレート剤によるスーパーコイルDNAを含む溶液からの微量金属イオンの除去、および/または、非還元フリーラジカルスカベンジャーによる溶液中のフリーラジカルの除去は、DNAをスーパーコイル型で安定させ、DNAを酸化から保護する（WO 97/40839）。一旦、金またはタングステンビーズ上に被覆した乾燥型DNAの安定化の問題は、当技術分野において今まで対処されてこなかった。意外にも本発明は、金またはタングステンマイクロビーズ上に被覆した際、本発明の技術なしでは、乾燥型DNAは不安定であることをも観察した。
本発明はこれらの問題を克服し、付加的な賦形剤とともにまたは賦形剤なしで、皮膚内に効果的にDNA薬剤を投与、放出でき、またその中でDNAがスーパーコイル型で安定化されたDNA送達用量を提供する。
本発明は、DNA薬剤を含有している固形貯蔵媒体で被覆された高密度核成分を有する、新規のDNA医薬製剤を提供する。
DNAワクチン製剤は、本発明の好ましい態様である。このような用途においては、送達されるべき薬剤は微生物もしくはウイルスなどの病原体に由来する抗原をコードするポリヌクレオチドであり、または、癌ワクチンもしくは他の自己抗原の場合には自己抗原であってもよい。
本発明のDNA成分は直鎖状または開環状またはスーパーコイルプラスミドDNAでありうるが、本発明の関連形態で、DNAは生きた弱毒化細菌またはウイルスベクターの形でありうる。
本明細書に記載される装置の１実施例はまた、室温で保存され、従って物流コストを減らし、他の製品のために価値ある冷蔵スペースを開放するという有意な利点をも有する。
固形の非晶性貯蔵媒体は、好ましくは本発明に必要とされる機能を果たすポリオールである。その貯蔵部は、長期に及ぶ保存の間、貯蔵部が物理的に安定に付着し続け、また、被覆されたマイクロビーズが角質層を通して発射された際、投与処置の間、実質的に完全に保たれるよう十分な程度に、マイクロビーズに付着できなくてはならない。貯蔵部はまた、貯蔵媒体の生分解の間に皮膚内に放出される、乾燥もしくは部分的に乾燥した任意の形態で送達される薬剤の懸濁液もしくは溶液を保持または含有できなくてはならない。
本発明の意味では、媒体の生分解とは、非放出状態から放出状態に変化し、それによって薬剤が皮膚内に入るように、貯蔵媒体が状態を変化させることを意味する。活性を持つ薬剤の放出は、水和、拡散、相転移、結晶化、溶解、酵素反応および/または化学反応などの、１つ以上の物理的および/または化学的過程を含むかもしれない。貯蔵媒体の選択に応じて、生分解は以下の１つ以上によって誘導できる。すなわち、水、体液、湿度、体温、酵素、触媒および/または反応物質である。従って、貯蔵媒体の変化は、皮膚のより高い湿度および温度に関連した、水和および温度上昇によって誘導されうる。貯蔵媒体はその後、溶解および/または膨潤および/または相変化（結晶性または非晶性）によって分解され、その結果、崩壊または単に媒体の浸透が増加しうる。
好ましくは、媒体は溶解し、代謝または体から排出されるが、貯蔵部はあるいはマイクロビーズに付着したままであるかもしれず、それは正常な皮膚の置換の間に死んだ皮膚細胞の剥落を含む機構によって体外へ排出されうる。貯蔵媒体の溶解による薬剤の放出が好ましい。
好ましくは、固形貯蔵媒体は（WO96/03978に記載されたものなどの）ポリオールである。適切なポリオール貯蔵媒体は（糖質などの）炭水化物、多糖類、疎水性に誘導された炭水化物のような置換ポリオール、アミノ酸、生分解性高分子、または、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物（polyahhydride）、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、およびラクチド-カプロラクトン共重合体、もしくはラクチド-グリコリド共重合体などの共重合体を含む。
固形の貯蔵部は非晶性または結晶状態であってもよく、また部分的に非晶性で部分的に結晶状態であってもよい。しかし、貯蔵部のすべてまたはほぼすべてが非晶性状態であることが最も好ましい。更に、非晶性の貯蔵部はガラス形態であることがより好ましい（米国特許第5,098,893号）。最も好ましくは、貯蔵部は糖ガラスである。ガラス貯蔵部は任意のガラス転移温度を持ちうるが、保存の間は薬剤を安定させ、また皮膚内への貯蔵部の挿入後は薬剤の速やかな放出を促進するガラス転移温度を持つことが好ましい。従って、ガラス転移温度は30〜40℃以上であるが、体温付近であることが最も好ましい（例えば、限定はされないが40〜50℃）。
特に好ましい貯蔵媒体は、貯蔵期間に渡って送達されるべき薬剤を安定させるものである。例えば、ポリオールガラスに溶解もしくは分散した、または単にポリオール中で乾燥された抗原もしくは薬剤は、長期間安定に保存される（米国特許第5,098,893号、米国特許第6,071,428号、WO 98/16205、WO 96/05809、WO 96/03978、米国特許第 4,891,319号、米国特許第5,621,094号、WO 96/33744）。このようなポリオールは、好ましい一連の貯蔵媒体を形成する。
好ましいポリオールは単糖、二糖、三糖、またはオリゴ糖およびそれらに対応する糖アルコールを含む糖質を含有する。本発明における使用に適切な糖質は、当技術分野においてよく知られており、トレハロース、スクロース、ラクトース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、マンノース、マルチュロース、イソマルチュロースおよびラクチュロース、マルトース、またはデキストロース、ならびに、マンニトール、ラクチトールおよびマルチトールなどの前述の糖アルコールを含む。スクロース、グルコース、ラクトース、ラフィノースおよびトレハロースが好まれる。
本発明の貯蔵媒体は、好ましくは更にフリーラジカルの分解効果を阻害する安定化剤を含有しうる。好ましい安定化剤は安定化金属イオンキレート剤を含み、そのような好ましい金属イオンキレート剤は、イノシトール6リン酸、トリポリリン酸塩、コハク酸、リンゴ酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、トロメタミン（TRIS）、デスフェラール、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）およびエチレンジアミンジヒドロキシフェニル酢酸（EDDHA）を含有する。他の好ましい安定化剤は、非還元フリーラジカルスカベンジャーであり、好ましくは、このような薬剤はエタノール、メチオニンまたはグルタチオンである。他の適切なキレート剤およびスカベンジャー（ならびに適切でないもの）は、（WO 97/40839に記載されるような）通常の実験によって当業者により、容易に同定されうる。
本発明の装置における好ましい固形貯蔵媒体は金属イオンキレート剤または非還元フリーラジカルスカベンジャーを含有する。最も好ましくは、本発明の装置における固形貯蔵媒体は金属イオンキレート剤と非還元フリーラジカルスカベンジャーの両方を含有する。
安定化剤の量は当業者によって決定されうるが、一般的に金属イオンキレート剤は0.1〜10mMの範囲であり、エタノールは約5％（v/v）以下の量で存在し、メチオニンは約0.1〜100mMで存在し、グルタチオンは約0.1〜10％（v/v）で存在する。
安定化剤の好ましい組合せは（a）メチオニンまたはEDTAと組み合わせたリン酸緩衝エタノール溶液、（b）メチオニンもしくはエタノール（またはメチオニンおよびエタノールの併用）と組み合わせたTris緩衝EDTAである。
DNAと組み合わされ、脱金属水またはリン酸もしくはTrisバッファー中に溶解されたポリオール（好ましくはスクロースまたはトレハロース）を含む本発明の固形の製剤を形成するために高密度核成分上に被覆されうる特に好ましい処方は、更に以下のいずれかをも含有する：
A. 10mMメチオニンおよび2.9%エタノール
B. 3.7％エタノールおよび1mM EDTA
C. 100mM Tris、1mM EDTAならびに10mMメチオニンおよび2.9%エタノール
D. 100mM Tris、1mM EDTAおよび10mMメチオニン
E. 100mM Tris、1mM EDTAおよび2.9%エタノールである。
本発明の好ましい製造方法では、DNAは、糖を含む最終的な調剤の前に、これらの安定化剤中で保存され、操作される。
これらの安定化剤に加えて、固形ワクチン中のDNAの安定性を向上させるために、更なる方法を取りうる。例えば、製剤は使用前に（例えばBioradのChelex 100のような市販の脱金属樹脂を使用することによって）脱金属された溶液を用いて調製されてもよく、および/または、製剤は最終的に高いpH（例えばpH 8〜10）に調製されてもよい。
DNAはスーパーコイルプラスミドの形が好ましい。これらの製剤の本発明の１つの主要な利点は、放出の際、その多くがスーパーコイル型、好ましくは単量体のスーパーコイル型のままであるように、DNAが安定化されるという事実である。
プラスミドDNAの安定性は複数の方法で定義でき、pH、湿度および温度などの保存条件によって決定される相対的な事象であり得る。被覆された貯蔵部の鉄イオンの存在下での保存に関して、4℃で３ヶ月間の保存では、好ましくは50％以上のプラスミドがスーパーコイル（ccc, covalently closed circular）のまま維持される。より好ましくは、記載した保存条件下で、60％以上のプラスミドがcccのまま維持され、より好ましくは、これらの保存条件下で、90％以上のプラスミドが4℃で３ヶ月間cccのまま維持される。非金属イオン性の針または極微針を被覆するために、プラスミドDNAの安定性は、4℃で３ヶ月間の保存後、好ましくは60％以上、より好ましくは80％、最も好ましくは90％以上cccであるとよい。より好ましくは、これらの保存条件下で、90％以上のプラスミドが4℃で１年間cccのまま維持され、より好ましくは、90％以上のプラスミドが4℃で２年間cccのまま維持される。最も好ましくは、これらの条件下で、上記DNAの安定性は25℃で同じ期間に渡って達成される。
固形貯蔵媒体中のDNAは、（測定を簡単にするために、縫い針上に被覆した場合）促進安定性試験の間、スーパーコイル（ccc）型で安定化されていることが好ましく、DNAが単量体ccc型で安定化されていることが最も好ましい。促進安定性試験の実施例は、乾燥した被覆針を37℃で４週間維持し、それに続いて経時的にDNA構造の解析を行う場合である。この種の試験において、好ましくは50％以上のDNAがccc型のまま維持され、より好ましくは60％以上がccc型のまま維持され、より好ましくは70％以上がccc型のまま維持され、より好ましくは80％以上がccc型のまま維持され、最も好ましくは90％以上がccc型のまま維持される。これらの条件および好ましいcccの水準においては、単量体：二量体cccDNAの比率は（0.8〜1.2の範囲内、もしくはより好ましくは0.9〜1.1の範囲内、最も好ましくは0.95〜1.5の範囲内のように）約１または１以上であることも好ましい。
プラスミド安定性測定のための試験は当業者にとって既知であり、（Evansら、上述；WO 97/40839）に記載されている。これらは、アガロースゲル電気泳動、陰イオン交換HPLC（Ferreira, G.ら、1999, Pharm. Pharmacol. Commun., 5, pp57-59）またはキャピラリーゲル電気泳動（Schmidtら、1999, Anal. Biochem., 274, 235-240）のいずれかによって、スーパーコイル、ccc、プラスミドDNAの割合を測定および定量する技術を含む。単量体：二量体cccの比率は、（いずれのインターカレート剤も含まない）アガロースゲル電気泳動およびEtBr染色後、UVP Bioimaging systemで動作するLabworks 4.0などの市販のソフトウェアを用いた、画像強度解析によって測定できる。
本発明において、固形貯蔵媒体は、得られた処方が弾道的送達装置による投与に適した形で核成分を被覆する。それぞれの核成分は、適宜、完全にもしくは部分的に貯蔵部によって被覆されていてもよく、または複数の成分が固形貯蔵部の基質内に閉じ込められていてもよい。関連した本発明の製剤の製造方法では、多数の核成分を含有する多量の貯蔵部を弾道的送達装置による投与に適したより小さな粒子に破砕してもよい。
処方に含有されうる他の賦形剤は、バッファー、アミノ酸、加工もしくは保存の間塗膜の相変化を防ぐために添加されうる相変化阻害剤（結晶阻害剤）、または、アミノ酸のようなメーラード反応阻害剤などの、加工もしくは保存の間、有害な化学反応を防ぐための阻害剤を含む。
本発明の固形の製剤は、DNA被覆粒子を気体流で輸送する装置を用いて、皮膚細胞の弾道的トランスフェクションに用いられる。粒子は角質層を通過して細胞内に入り、そこでDNAが放出され、宿主細胞によって発現される。あるいは、粒子は細胞外空間に入り、そこでDNAを放出する。従って、本発明における使用に適した核成分は、この目的に適したものである。核成分は、最終的な製剤に、いかなる弾道的送達装置においても角質層を貫通する十分な強度および運動量を与える。核成分はDNA被覆粒子に十分な運動量を与えるために十分な密度を持つことが好ましく、適切な高密度核は金またはタングステンマイクロビーズであることが見いだされている。核成分のサイズは、DNA被覆粒子に必要とされる運動量を与えるように十分な質量を持つが、皮膚細胞が損傷を受けるほど大き過ぎないことが好ましい。適切な核成分の粒子サイズは、被覆された形の時、粒子の平均直径が0.5〜100μmの範囲内であり、好ましくは1〜50μm、より好ましくは1〜10μm、最も好ましくは約2μmの直径である。
通常、核成分はほぼ球形であるが、不規則な形態でも使用されうる。最も好ましくは、核成分は金またはタングステンマイクロビーズである。
本発明は、金属粒子およびDNAとともに存在する時、非晶性糖が処方に長期安定性を与えるであろうことを主張する。界面活性剤およびバッファーのような他の賦形剤は処方中に含有されうる。
このような処方を含有する非晶性糖の調製方法の実施例は以下を包括する。
1. 凍結乾燥法
糖、DNA、金粒子を含む溶液を混合し、ガラスバイアル中に満たす。これらのバイアルに半分栓をして、凍結乾燥機に取り付ける。その後、庫内温度を-45℃に低下させ、バイアル内の生成物を凍結させる。すべてのバイアルを凍結させた後、冷却器を-60℃以下の温度に冷やす。その後、約100 mTの真空をかけながら庫内温度を約-30℃に上昇させることによって、一次乾燥を行う。一次乾燥の間に、形成された氷の結晶からの水が昇華する。一次乾燥が完了した後、庫内温度を室温より高く上昇させ、最大の真空にかける。二次乾燥は強固に結合したすべての水を除去し、長期安定性を達成するために粉末を乾燥させる。
2. 噴霧乾燥
噴霧乾燥は、連続的な給液の噴霧によって作られた分散液滴を蒸発させるために、熱い気流（通常は空気）による熱を利用する脱水方法である。その結果生じる粉末生成物は数秒以内に乾燥し、細かい粒子となる。治療用タンパク質粉末の生成に対する噴霧乾燥の実現可能性は、十分に実証されている（（Broadhead, J., Rouan, S.K.E., Hau, I.,および Rhodes, C.T. 1994. J. Pharm. Pharmacol. 46: 458-467.; Mumenthaler, M., Hsu, C.C.,およびPearlman, R. 1994. Pharm. Res. 11: 12-20））。我々の製剤混合物へのこのような応用では、調剤されたDNA、金粒子および糖溶液は、50~150℃の範囲の一般的な注入温度で、通常0.1〜10 mL/minの間の流速で、噴霧乾燥機に供給されるであろう。その結果生じる粉末は乾燥され、コレクションチャンバーに回収される。
3. 噴霧凍結乾燥
噴霧凍結乾燥は、DNA、金粒子および糖を含む溶液をドライアイスまたは液体窒素を入れたトレイ上に噴霧する方法である。これは液滴の瞬間的な凍結を引き起こす。その後、トレイを凍結乾燥機に取り付け、そこで粒子を上述の方法に従って凍結乾燥させる。
これらの技術を用いて、各々の固形DNA送達用量は比較的多量のDNAを装填しうる。上記の技術による処方は、直接、または貯蔵媒体で被覆された高密度核ビーズに粉砕し篩にかけた後に使用されうる。
好ましくは、本発明のワクチン処方は、ヒトの病原体に対する免疫応答を誘導できる抗原または抗原組成をコードするDNAを含み、その抗原または抗原組成は、HIV-1、（tat, nef, gp120もしくはgp160など）、ヒトヘルペスウイルス、gDもしくはその誘導体などまたはHSV1もしくはHSV2由来のICP27のような前初期タンパク質、サイトメガロウイルス（（esp Human）（gBまたはその誘導体など）、ロタウイルス（弱毒生ウイルスを含む）、エプスタイン-バールウイルス（gp350もしくはその誘導体など）、水痘・帯状疱疹ヘルペスウイルス（gpI, IIおよびIE63など）に、または、B型肝炎ウイルス（例えばB型肝炎表面抗原もしくはその誘導体）、A型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルスおよびE型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルスに、または、パラミクソウイルス、すなわち、呼吸器合胞体ウイルス（FおよびGタンパク質またはその誘導体など）、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス（例えばHPV6, 11, 16, 18, ..）、フラビウイルス（例えば黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）もしくはインフルエンザウイルス（生きたウイルスまたは不活性化されたウイルス全体、卵またはMDCK細胞またはVero細胞で培養された分割インフルエンザウイルス、または（R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920によって記載された）インフルエンザウイルス粒子全体、またはHA、NP、NA、もしくはMタンパク質もしくはその組換え体など、その精製もしくは組換えタンパク質）などの他のウイルス性病原体に由来し、或いは、N. gonorrheaおよびN. meningitidisを含むNeisseria spp（例えば莢膜多糖類およびその共役物、トランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、PilC、付着因子）；S. pyogenes（例えばMタンパク質またはその断片、C5Aプロテアーゼ、リポタイコ酸）、S. agalactiae、S. mutans；H. ducreyi；Branhamella catarrhalisとしても知られるM catarrhalisを含むMoraxella spp（例えば高分子量および低分子量付着因子およびinvasin）；B. pertussis（例えばpertactin、百日咳毒素またはその誘導体、線維状血球凝集素、アデニル酸シクラーゼ、線毛）、B. parapertussisおよびB. bronchisepticaを含むBordetella spp；M. tuberculosis（例えばESAT6、Antigen 85A、-Bまたは-C）、M. bovis、M. leprae、M. avium、M. paratuberculosis、M. smegmatisを含むMycobacterium spp.；L. pneumophilaを含むLegionella spp,；腸管毒性大腸菌（例えば 定着因子、易熱性毒素またはその誘導体、耐熱性毒素またはその誘導体）、腸管出血性大腸菌、腸内病原性大腸菌（例えば 志賀毒素様毒素またはその誘導体）を含むEscherichia spp,；V. cholera（例えばコレラ毒素またはその誘導体）を含むVibrio spp；S. sonnei、S. dysenteriae、S. flexneriiを含むShigella spp；Y. enterocolitica（例えばYopタンパク質）、Y. pestis、Y. pseudotuberculosisを含むYersinia spp；C. jejuni（例えば毒素、付着因子およびinvasin）ならびにC. coliを含むCampylobacter spp；S. typhi、S. paratyphi、S. choleraesuis、S. enteritidisを含むSalmonella spp；L. monocytogenesを含むListeria spp.；H. pylori（例えばウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化毒素）を含むHelicobacter spp；P. aeruginosを含むPseudomonas spp；S. aureus、S. epidermidisを含むStaphylococcus spp.；E. faecalis、E. faeciumを含むEnterococcus spp.；C. tetani（例えば破傷風毒素およびその誘導体）、C. botulinum（例えばボツリヌス毒素およびその誘導体）、C. difficile（例えばクロストリジウム毒素AもしくはBおよびその誘導体）を含むClostridium spp.；B. anthracis（例えばボツリヌス毒素およびその誘導体）を含むBacillus spp.；C. diphtheriae（例えばジフテリア毒素およびその誘導体）を含むCorynebacterium spp.；B. burgdorferi（例えばOspA, OspC, DbpA, DbpB）、B. garinii（例えばOspA, OspC, DbpA, DbpB）、B. afzelii（例えばOspA, OspC, DbpA, DbpB）、B. andersonii（例えばOspA, OspC, DbpA, DbpB）、B. hermsiiを含むBorrelia spp.；E. equiを含むEhrlichia spp.およびヒト顆粒球性エールリヒア症の薬剤；R. rickettsiiを含むRickettsia spp；C. trachomatis（例えばMOMP、ヘパリン結合タンパク質）、C. pneumoniae（例えばMOMP、ヘパリン結合タンパク質）、C. psittaciを含むChlamydia spp.；L. interrogansを含むLeptospira spp.；T. pallidum（例えば希少な外膜タンパク質）、T. denticola、T. hyodysenteriaeを含むTreponema spp.などの細菌性病原体に由来し、または、P. falciparumを含むPlasmodium spp.；T. gondii（例えばSAG2, SAG3, Tg34）を含むToxoplasma spp.；E. histolyticaを含むEntamoeba spp.；B. microtiを含むBabesia spp.；T. cruziを含むTrypanosoma spp.；G. lambliaを含むGiardia spp.；L. majorを含むLeshmania spp.；P. cariniiを含むPneumocystis spp.；T. vaginalisを含むTrichomonas spp.；S. mansoniを含むSchisostoma spp.などの寄生生物に由来し、或いはC. albicansを含むCandida spp.；C. neoformansを含むCryptococcus spp.などの酵母に由来する。他の好ましい細菌性ワクチンは、B型H. influenzae（例えばPRPおよびその共役物）、亜型判定不能H. influenzae、例えばOMP26、高分子量付着因子、P5、P6、タンパク質Dおよびリポタンパク質D、ならびにフィンブリンおよびフィンブリン誘導ペプチド（米国特許第5,843,464号）を含むHaemophilus spp.に由来する抗原を含有する。
本発明の別の実施形態では、DNA製剤は、病原体に由来するタンパク質または多糖類抗原などの非DNA抗原とともにDNAワクチンを含有する。
本発明の利点の１つは、DNA薬剤を付加的な活性物質と共に調剤できること、他の固形のDNA薬剤では制限されていることである。例えば、DNAワクチンは更に、細胞内へのDNAの取り込みを促進する薬剤、免疫応答を向上および/または誘導するアジュバントまたは他の免疫賦活剤を含有してもよく、また更に薬学的に容認される賦形剤を含有してもよい。
例えば、固形の薬剤貯蔵媒体は、好ましくはDNA凝縮剤、例えばスペルミジンまたはPEI（ポリエチレンイミン）を含有しうる。製剤に含有されうる他の賦形剤は、バッファー、アミノ酸、加工もしくは保存の間塗膜の相変化を防ぐために添加されうる相変化阻害剤（結晶阻害剤）、または、アミノ酸のようなメーラード反応阻害剤などの、加工もしくは保存の間有害な化学反応を防ぐための阻害剤を含む。
DNAと共に貯蔵媒体中に包括される好ましい付加的な薬剤は、DNA分解酵素阻害剤である。好ましいDNA分解酵素阻害剤の１つの例は、アウリントリカルボン酸（ATA, Glasspool-Malone, J.ら、(2000), Molecular Therapy 2: 140-146）である。
本発明のワクチンはまた、DNAと共に固溶液中に免疫学的に有効なアジュバントを有利に含有しうる。代替として、アジュバントはDNA被覆マイクロビーズとは別のマイクロビーズに付加されうる。本発明のワクチンに適切なアジュバントは、免疫原に対する抗体反応を増強できるアジュバントを含有する。適切な免疫活性化剤は以下を含有するが、この羅列は決して完全に網羅されたものではなく、他の薬剤を除外しない。すなわち、イミキモド（imiquimod）[S-26308, R-837]（DockrellおよびKinghorn, 2001, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 48, 751-755; Harrisonら、'Reduction of recurrent HSV disease using imiquimod alone or combined with a glycoprotein vaccine', Vaccine 19: 1820-1826, (2001)）ならびにレジキモド（resiquimod）[S-28463, R-848] （Vasilakosら、'Adjuvant activites of immune response modifier R-848: Comparison with CpG ODN', Cellular immunology 204: 64-74 (2000).）のような合成イミダゾキノリン、ツカレソール（tucaresol）（Rhodes, J.ら'Therapeutic potentiation of the immune system by costimulatory Schiff-base-forming drugs', Nature 377: 71-75 (1995)）のような抗原提示細胞およびT細胞表面に常時発現するカルボニルおよびアミンのシッフ塩基、GM-CSF、IL-1α、IL-1β、TGF-αおよびTGF-βなどの前炎症性サイトカイン、インターフェロンγ、IL-2、IL-12、IL-15およびIL-18などのTh1誘導因子、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10およびIL-13などのTh2誘導因子ならびにMCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、TCA-3、CD80、CD86およびCD40Lなどの他のケモカインおよび共刺激遺伝子を含むであろう、タンパク質またはペプチドのいずれかのサイトカイン、ケモカインおよび共刺激分子、CTLA-4およびL-selectinなどの他の免疫活性化標的リガンド、Fas、（49）などのアポトーシス促進タンパク質およびペプチド、バクスフェクチン（vaxfectin）（Reyesら、'Vaxfectin enhances antigen specific antibody titres and maintains Th1 type immune responses to plasmid DNA immunization', Vaccine 19: 3778-3786）スクアレン、α-トコフェロール、ポリソルベート80、DOPCおよびコレステロールなどの合成脂質性アジュバント、内毒素[LPS]、（Beutler, B., 'Endotoxin, 'Toll-like receptor 4, and the afferent limb of innate immunity', Current Opinion in Microbiology 3: 23-30 (2000)）、CpGオリゴ-およびジヌクレオチド、Sato, Y.ら、'Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization', Science 273 (5273): 352-354 (1996). Hemmi, H.ら、'A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA', Nature 408: 740-745, (2000)、ならびに、合成マイコバクテリアリポタンパク質、マイコバクテリアタンパク質p19、ペプチドグリカン、タイコ酸およびリピドAなどのTh1-誘導性サイトカインを産生するためToll-like receptorの引き金となる他の潜在的リガンドである。
Th1型応答を優勢に誘導するためのある好ましいアジュバントは、例えば、モノホスホリルリピドAまたは好ましくは3-デ-O-アシル化モノホスホリルリピドAのようなリピドA誘導体を含む。MPL（登録商標）アジュバントはCorixa Corporation（Seattle, WA;例えば、米国特許第4,436,727号；4,877,611号；4,866,034号および4,912,094号参照）から入手可能である。CpGを含むオリゴヌクレオチド（その中でCpGジヌクレオチドはメチル化されていない）もまたTh1応答を優勢に誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは既知であり、例えば、WO 96/02555、WO 99/33488ならびに米国特許第6,008,200号および5,856,462号に記載されている。免疫活性化DNA配列はまた、例えば、Satoら、Science 273:352, 1996にも記載されている。別の好ましいアジュバントは、Quil AもしくはQS21およびQS7（Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA）を含むその誘導体；エスシン(Escin)；ディジトニン(Digitonin);またはGypsophilaもしくはChenopodium quinoaサポニンなどのサポニンを含有する。
本発明のこの態様において、好ましい免疫活性化剤またはアジュバントは、PCT特許出願公開番号WO 94/17043（その内容は参照により本明細書に組み入れられる）に記載されるような、イミキモドまたは他の関連分子（レジキモドなど）である。
本発明のある実施形態では、例えばUlmerら、Science 259:1745-1749, 1993に記載され、Cohen, Science 259:1691-1692, 1993によって概説されるように、ポリヌクレオチドは「むき出しの」DNAとして投与/送達される。むき出しのDNAの取り込みは、細胞内に効果的に輸送される、金もしくは生分解性のビーズなどの小さいマイクロビーズ上にDNAを被覆することによって、または、リン酸カルシウムもしくはDEAEデキストランなどの他の既知のトランスフェクション促進剤を使用することによって増加されうる。
各ワクチン投与において発現し得るDNA量は、一般的なワクチンにおいて著しい不都合な副作用なしに免疫防御反応を誘導する量として選択される。このような量は、用いられる特定のDNA構築物によって異なるであろうが、各用量は一般的に1〜1000μgのDNA、好ましくは1〜500μg、より好ましくは1〜100μgを含有し、最も好ましい範囲は1〜50μgであろうと予想される。特定のワクチンに対する最適な量は、被験体における適切な免疫応答の観察を含む標準的な検討によって確定され得る。最初のワクチン接種に続いて、被験体は十分な間隔を置いて１回または数回の追加免疫を受けてもよい。
本発明のDNA製剤に装填される弾道的送達装置もまた、本発明によって提供される。
本発明の製剤は予防および治療の両方の過程に使用されうる。従って、本発明は、感染症または癌、またはアレルギー、または自己免疫疾患に感受性のもしくは罹患している哺乳類の治療方法のために提供される。本発明の更なる態様では、医薬用に本明細書に記載されるようなワクチンが提供される。ワクチンの製造は、一般的にNew Trends and Developments in Vaccines, Vollerら編、University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978に記載される。
本発明は以下の実施例によって例示されるが、それに限定されない。
プラスミドDNAを含有する貯蔵媒体によるマイクロビーズの被覆の実証
1.1プラスミドの調製および製剤
この検討に使用したプラスミドは図１に示される。
pEGFP-C1はGFP発現ベクターである（Clontech, Palo Alto, California, USA）。pGL3CMVはpGL3 Basicを基にしたルシフェラーゼ発現ベクターであり（Promega Corporation., Madison, Wisconsin, USA）、そこではCMV前初期プロモーターがルシフェラーゼ発現を駆動する。
pVAC1.ovaは、pUGOVAからPCR増幅されたニワトリのオボアルブミンをコードするcDNAを発現ベクターpVAC1にライゲーションすることによって構築された、ニワトリのオボアルブミン発現プラスミドである。pVAC1は哺乳類発現ベクター、pCI（Promega）の改変物であり、そこでは多重クローニング部位、EcoRIからBst ZIまでが、pGL3Basic（Promega）から増幅された、特有のNhe I、Rsr IIおよびXho Iによって5'に、特有のPac I、Asc IおよびNot I制限酵素部位によって3'に隣接したEMCV IRES配列で置換されている。スーパーコイルプラスミドDNA（低内毒素）を、アルカリSDS溶解法、限外濾過および陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの組合せを用いて高純度に、大規模に約100mgの収量で精製した。
プラスミドをTE（10mM TrisHCl, 1mM EDTA）、pH 8.0に1μg/μlで再懸濁し、アガロースゲル電気泳動による解析で95％以上をスーパーコイルと判定した。
プラスミドを、通常の大規模エタノール沈殿法によって、針を被覆するために様々な溶液中に製剤した。沈殿させたDNAを直ちに0.5〜12μg/μlの濃度で水性製剤溶液に再懸濁した（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, J.ら、第2版, 1989, CSH laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USAの１章参照）。
1.2凍結乾燥
糖（1〜40％の間のスクロースまたはトレハロース）、DNAプラスミド、金粒子を含む溶液を混合し、ガラスバイアル中を満たす。これらのバイアルに半分栓をして、凍結乾燥機に取り付ける。その後、庫内温度を-45℃に低下させ、バイアル内の生成物を凍結させる。すべてのバイアルを凍結させた後、冷却器を-60℃以下の温度に冷やす。その後、約100 mTの真空をかけながら庫内温度を約-30℃に上昇させることによって、一次乾燥を行う。一次乾燥の間に、形成された氷の結晶からの水が昇華する。一次乾燥が完了した後、庫内温度を室温より高く上昇させ、最大の真空にかける。二次乾燥は強固に結合したすべての水を除去し、長期安定性を達成するために粉末を乾燥させる。
1.3噴霧乾燥
噴霧乾燥は、連続的な給液の噴霧によって作られた分散液滴を蒸発させるために、熱い気流（通常は空気）による熱を利用する脱水方法である。その結果生じる粉末生成物は数秒以内に乾燥し、細かい粒子となる。治療用タンパク質粉末の生成に対する噴霧乾燥の実現可能性は、十分に実証されている（（Broadhead, J., Rouan, S.K.E., Hau, I.,および Rhodes, C.T. 1994. J. Pharm. Pharmacol. 46: 458-467.; Mumenthaler, M., Hsu, C.C.,およびPearlman, R. 1994. Pharm. Res. 11: 12-20））。我々の製剤混合物へのこのような応用では、調製されたDNA、金粒子および糖溶液は、50〜150℃の範囲の一般的な注入温度で、通常0.1〜10 mL/minの間の流速で、噴霧乾燥機に供給されるであろう。その結果生じる粉末は乾燥され、コレクションチャンバーに回収される。
1.4噴霧凍結乾燥
噴霧凍結乾燥は、DNA、金粒子および糖を含む溶液をドライアイスまたは液体窒素を入れたトレイ上に噴霧する方法である。これは液滴の瞬間的な凍結を引き起こす。その後、トレイを凍結乾燥機に取り付け、そこで粒子を上述の方法に従って凍結乾燥させる。
上記の技術による製剤は、直接、または粉砕した後に従来の弾道的送達装置に使用され、標的細胞での発現は、それに続くルシフェラーゼ発現の観察によって行われうる。サンプルはまた、スーパーコイル構造の維持によって測定されるように安定である。
針上に被覆、凍結乾燥および37℃で保存後の、異なる糖製剤におけるプラスミドDNAの安定性
製剤に用いられるスクロースの量または糖の種類のいずれかを変化させた、一連の異なるDNA製剤のプラスミドDNA安定性の比較を行った。既にDNAの安定性および放出に最適であることが見いだされている他のすべての賦形剤は、すべての製剤中に存在させた（すなわち、100mM TrisHCl pH8.0、1mM EDTA、10mMメチオニンおよび2.9％エタノール）。針を被覆および凍結乾燥後、37℃で１ヶ月まで保存し、それらのスーパーコイルプラスミドDNAを安定化させる能力について、製剤を比較した（促進DNA安定性試験）。その後、標準的な手法でプラスミドDNA（pVAC1.OVA）を溶出、回収し、インターカレート剤の非存在下でアガロースゲル電気泳動（100V、100mAで２時間）を行った（Sambrook, J.ら、上述）。その後、エチジウムブロマイドによる染色およびUV光の下で可視化した後、溶出したプラスミドDNAの完全性を観察した。UVP Bioimaging system上のLabworks 4.0画像解析ソフトウェアを用いた画像強度として、これらのサンプルからのスーパーコイル単量体および二量体のプラスミド型ならびにまた直鎖型および開環型の比率を測定した。
縫い針上への被覆および凍結乾燥ならびに37℃での保存後の、スーパーコイルプラスミド（%ccc）、単量体（%cccmon）および二量体（%cccdim）両方のプラスミド形態の割合のグラフとして、データを図２に示す。用いられたプラスミド製剤は様々な量の糖を含有する。すなわち、図２A：5％スクロース、図２B：10％スクロース、図２C：17.5％スクロース、図２D：40％スクロース、図２E：40％トレハロース、図２F：40％グルコース。
データは、糖を含むすべての製剤が高度のプラスミド安定性を維持し、37℃で最大１ヶ月まで保存した後でも、80％以上、最大98％のプラスミドがスーパーコイル型のままであることを示す。40％（w/v）の糖レベルを含有する製剤に関して、トレハロースからスクロース、グルコースまで変化させた糖製剤では好ましい単量体型が優勢であり、単量体と二量体のプラスミド型間のバランスは相対的に一定のままである（図２D、２Eおよび２F）。より低濃度のスクロースを含む製剤に関して、特に37℃での長期の保存では、二量体型が単量体を越えて優位を占める傾向がある（図２A、２Bおよび２C）。概して、データは、製剤中により高レベルの糖が存在するとプラスミドDNAのより高い安定性をもたらすことと一致している。
賦形剤を含むスクロース製剤における、プラスミドDNAの凍結乾燥後の非晶性ガラス形成の実証
示差走査熱量測定（DSC）による凍結乾燥したプラスミドDNA製剤の解析
40％スクロース中にプラスミドDNA（pVAC1.OVA）（10mg/ml）を含む凍結乾燥DNA/スクロース製剤のサンプルを調製し、また、付加的に100mM TrisHCl pH8.0、1mM EDTA、10mMメチオニンおよび2.9％エタノールを含む凍結乾燥サンプルを調製した。サンプルを分割し、1時間または24時間のいずれかの凍結乾燥サイクルに供した。その後、固体の状態を決定するために、サンプルを示差走査熱量測定（DSC）による解析に供した。これは、20ml/minの流速で、パージガスとして窒素を用い、25℃〜300℃の温度範囲に渡って、TA Instruments DSC2920 machineで行われた。サンプルパンの種類はピンホールアルミニウムであり、サンプル重量は解析の当日にMettler M3 balanceで測定された。
データを図３に示した。すべてのサンプルは40％スクロース中にプラスミドDNA（10mg/ml）を含む。図３AおよびBでは、製剤はまた100mM TrisHCl pH8.0、1mM EDTA、10mMメチオニンおよび2.9％エタノールを含み、図３AおよびCは24時間の凍結乾燥サイクルを表し、図３BおよびDは1時間の凍結乾燥サイクルを表す。データは、すべてのサンプルが、約78℃（図３A）、85℃（図３B）、74℃（図３C）、63℃（図３D）で観測されるスクロースガラス転移温度を持つ非晶性スクロースを含むことを示唆し、それは文献に公表されている値とよく一致する。データは、短時間および長時間の凍結乾燥サイクルの両方が非晶性スクロースガラスを生成できることを示唆する。非晶性ガラスは高濃度のプラスミドDNA存在下およびまた記載したすべての賦形剤の存在下でも形成できる。しかし、結晶性物質がサンプル中に存在するか否か、またはDSC解析自体の間に形成されるか否かは不明だったので、その後更に、サンプルの非晶/結晶性質を決定するためにサンプルを偏光顕微鏡の技術によって解析した。
偏光顕微鏡による凍結乾燥したプラスミドDNA製剤の解析
上述のDSC解析のために調製した凍結乾燥プラスミドDNA/スクロース（±賦形剤）サンプルを、偏光顕微鏡によって解析した。対照サンプルは1時間および24時間サイクルで凍結乾燥した40％スクロースのみで調製され、また、スクロースならびに主要な固体賦形剤、すなわち、メチオニン、Tris HClおよびEDTAの結晶サンプルもまた解析された。これは、比較のため、および製剤中に存在するあらゆる結晶性物質の出現に留意するためであった。液浸油中に備え付け、被覆したサンプルを用いて、Zeiss STD16-444111偏光顕微鏡で解析を行った。
データは図４に示され、そこではすべての製剤が40％スクロース中にプラスミドDNA（10mg/ml）を含む。図４Aでは、製剤はまた100mM TrisHCl pH8.0、1mM EDTA、10mMメチオニンおよび2.9％エタノールを含み、図４Cでは、40％スクロースのみを含み、図４Dは主要な固体賦形剤の結晶を示す。1AM、2AMおよび3AMは24時間凍結乾燥サイクルを表し、一方、1ST、2STおよび3STは1時間凍結乾燥サイクルを表す。
図４Cから、40％スクロース単独で行われた1時間および24時間の両凍結乾燥サイクルが予想通り非晶性ガラスだけを生じることは明白である。図４Bから、40％スクロース製剤へのプラスミドDNA（10mg/ml）の添加は、概ね非晶性ガラスの形成を可能にするが、いくらかの結晶性スクロースの部分的な形成を可能にする（2AMおよび2STサンプルは、スクロースと思われる、いくらかの結晶性粒子の痕跡を含む非晶性物質で構成される）。しかし、図４Aから、DNA/スクロース製剤への賦形剤の添加は、24時間凍結乾燥したサンプルにおいて結晶性粒子形成の量を減少させ（1AM、サンプルの大部分は非晶性物質の層で構成される。結晶性粒子はほとんど存在しない）、1時間の短い凍結乾燥サイクルに関しては、結晶性粒子の形成の痕跡はなく、非晶性ガラスのみである。これは、スクロース中のプラスミドDNAへの記載した賦形剤の添加が、DNA放出および分解からの安定性の改善を助けるだけでなく、短い凍結乾燥サイクルでは非晶性ガラス状態の保護にも役立つことを示唆する。
賦形剤を含む異なる糖/ポリオール製剤における、プラスミドDNAの凍結乾燥後の非晶性ガラス形成の実証
上述のような賦形剤を含むプラスミドDNA製剤中に存在するポリオール/糖の性質が、凍結乾燥によって非晶性ガラスを生成するこのような製剤の能力に影響を与えるかを決定するために、ポリオールを変化させた。存在するポリオールのみが異なる多数の同様な製剤を作成し、凍結乾燥し、偏光顕微鏡によって解析した。この場合にはOlympus BX51偏光顕微鏡を使用したこと以外、これは実施例３に記載されたものと同様の方法で行われた。
データは図５に示され、そこではすべての製剤が、凍結乾燥したプラスミドDNA（pVAC1.OVA）（10mg/ml）および100mM TrisHCl pH8.0、1mM EDTA、10mMメチオニンおよび2.9％エタノールを含む。図５A、サンプル１：40％w/vフィコール、サンプル２：20％w/vデキストラン、サンプル３：40％w/vスクロース、サンプル４：20％w/vマルトトリオース。図５B、サンプル５：20％w/vラクトース、サンプル６：30％w/vマルトース、サンプル７：40％w/vグルコース、サンプル８：40％w/vトレハロース。記載されたすべてのサンプルおよび解析されたすべての製剤が、結晶性物質の存在の痕跡をほとんどまたは全く持たずに非晶性ガラスを形成したことに注目せよ。20％w/vデキストランを含むサンプル２に記載の製剤は、その後、アガロースゲル電気泳動解析によって、溶液からプラスミドDNAを沈殿させることを示し（データは示さない）、従って好ましい製剤ではないと思われることに注意せよ。このデータは、凍結乾燥させた際、記載された賦形剤を加えたプラスミドDNAが、文献（Hatley, R.およびBlair, J., (1999), Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 7: 11-19.）に記載された様々なポリオール/糖によって非晶性ガラス状態で維持され得ることを実証する。
糖/金/DNA製剤の凍結乾燥
本研究の目的は金粒子を含む３つの糖を基材とするDNA製剤を凍結乾燥することである。製剤は以下に示すように形成された。
・製剤１は40％スクロース、100mM TrisHCl pH8.0、10mM L-メチオニンおよび2.9％エタノールで構成された。
・製剤２は10％スクロース、100mM TrisHCl pH8.0、10mM L-メチオニンおよび2.9％エタノールを含有した。
・製剤３は40％トレハロース、100mM TrisHCl pH8.0、10mM L-メチオニンおよび2.9％エタノールで構成された。
スーパーコイルB型肝炎プラスミドを1mg/mLの濃度で３つの製剤の各々に調剤した。金粒子を製剤10mL当たり0.5gの濃度で各製剤に添加した。液体窒素に各製剤を滴状で添加することによって、製剤を急速に凍結させた。その結果生じる凍結ビーズを3mLの凍結乾燥バイアルに移した。そのバイアルをDW8 Heto Holten凍結乾燥機で以下に示すサイクルを用いて凍結乾燥した。
Figure 2005519905
凍結乾燥したサンプルに真空下で栓をした。真空を解放し、バイアルを凍結乾燥機から取り出した。凍結乾燥したDNA製剤を用いて、（25℃での）促進安定性試験を行った。安定性試験はエチジウムブロマイド染色したアガロースゲル電気泳動によって１週間間隔で観察された。
アガロースゲル電気泳動
試験の間のDNA構造の変化を決定するために、安定性サンプルについて0.6％アガロースゲル電気泳動を行った。各凍結乾燥サンプルを蒸留水中で再構成させ、以下のサンプル、ローディングバッファーおよび蒸留水の組合せを用いて、アガロースゲルの各ウェルに添加した：2μlのサンプル＋16μlの蒸留水＋2μlのローディングバッファー。
20μlの各サンプルをゲルの各ウェルに添加した。サンプルは20ボルトで一晩電気泳動された。電気泳動したゲルをエチジウムブロマイドで染色し、UV下で観察した。１週間および３週間の25℃での保存後に、安定性サンプルを分析した。
結果
１週間および３週間のサンプルを含有しているゲルの写真を図６および７に示す。図６は25℃で１週間保存したサンプルのDNAプロフィールを示す（左側がレーン１）。：レーン１ - 1キロベースラダー；レーン２-25℃で１週間保存した後の凍結乾燥サンプル（製剤１）；レーン３ - 5℃で１週間保存後の凍結乾燥サンプル（製剤１） - 対照；レーン４ - 25℃で１週間保存した後の凍結乾燥サンプル（製剤２）；レーン５ - 5℃で１週間保存した後の凍結乾燥サンプル（製剤２）；レーン６ - 25℃で１週間保存した後の凍結乾燥サンプル（製剤３）；レーン７ - 5℃で１週間保存した後の凍結乾燥サンプル（製剤３）；レーン８ - 凍結乾燥前の5℃での液体製剤１；レーン９ - 凍結乾燥前の5℃での液体製剤２；レーン１０ - 凍結乾燥前の5℃での液体製剤３；レーン１１ - 調剤されていないプラスミド、GW700561X (batch A01B30)；レーン１２ - DNAプラスミドを含まない製剤１の希釈剤＋金ビーズで構成される、凍結乾燥された製剤１の陰性対照。
結果は以下のことを示した。
・5℃での対照と比較して、３つの凍結乾燥した製剤のいずれにおいても（25℃で）有意な構造変化は検出されなかった。比較的少量の開環状および直鎖状のトポアイソフォームも検出されたが、DNAの大部分はスーパーコイルであることが見いだされた。
・凍結乾燥前の液体製剤は凍結乾燥後のサンプルと同様のバンドプロフィールを生じる。凍結乾燥前のサンプルにおいて検出されるより高い量の蛍光はおそらく、それらの中のより高い濃度のDNAが原因である。
・調剤されたおよび調剤されていないプラスミド（レーン１１）の間に、有意なDNAプロフィールの違いは検出されなかった。
・予想通り、レーン１２ - 陰性対照ではバンドが見られなかった。
図７は左側をレーン１として25℃で３週間保存したサンプルのDNAプロフィールを示す。：レーン１ - 1キロベースラダー；レーン２-25℃で３週間保存した後の凍結乾燥サンプル（製剤１）；レーン３ - 5℃で３週間保存後の凍結乾燥サンプル（製剤１） - 対照；レーン４ - 25℃で３週間保存した後の凍結乾燥サンプル（製剤２）；レーン５ - 5℃で３週間保存した後の凍結乾燥サンプル（製剤２）；レーン６ - 25℃で３週間保存した後の凍結乾燥サンプル（製剤３）；レーン７ - 5℃で３週間保存した後の凍結乾燥サンプル（製剤３）；レーン８ - 凍結乾燥前の5℃での液体製剤１；レーン９ - 凍結乾燥前の5℃での液体製剤２；レーン１０ - 凍結乾燥前の5℃での液体製剤３；レーン１１ - 調剤されていないプラスミド；レーン１２ - DNAプラスミドを含まない製剤１の希釈剤＋金ビーズで構成される、凍結乾燥された製剤１の陰性対照。
結果は以下のことを示した。
・5℃での対照と比較して、３つの凍結乾燥した製剤のいずれにおいても（25℃で）有意な構造変化は検出されなかった。比較的少量の開環状および直鎖状のアイソフォームも検出されたが、DNAの大部分はスーパーコイルであることが見いだされた。
・凍結乾燥前の液体製剤は凍結乾燥後のサンプルと同様のDNAプロフィールを生じる。凍結乾燥前のサンプルにおいて検出されるより高い量の蛍光はおそらく、それらの中のより高い濃度のDNAが原因である。
結論
本研究において我々は、糖/金を基材とするDNA製剤をDNA構造の有意な変化なしに凍結乾燥させることが可能であることを実証した。更に我々は、その結果生じる凍結乾燥ビーズが25℃で３週間安定であることを示した。
pVAC1.ovaを示す。 図２は、縫い針上への被覆および凍結乾燥ならびに37℃での保存後の、スーパーコイルプラスミドの割合（%ccc）、単量体（%cccmon）および二量体（%cccdim）両方のプラスミド形態の割合のグラフを示す。用いられたプラスミド剤は、様々な量の糖を含有する。すなわち、図２Ａは、5％スクロースを含有する。 図２Ａと同様のグラフを示す。用いられたプラスミド剤は、10％スクロースを含有する。 図２Ａと同様のグラフを示す。用いられたプラスミド剤は、17.5％スクロースを含有する。 図２Ａと同様のグラフを示す。用いられたプラスミド剤は、40％スクロースを含有する。 図２Ａと同様のグラフを示す。用いられたプラスミド剤は、40％トレハロースを含有する。 図２Ａと同様のグラフを示す。用いられたプラスミド剤は、40％グルコースを含有する。 図３は、40％スクロース中のプラスミドDNA剤（10 mg/ml）に対する示差走査熱量測定（DSC）データを示す。図３Ａの製剤は、100mM TrisHCl pH8.0、1mM EDTA、10mM メチオニンおよび2.9% エタノールも含有する。24時間の凍結乾燥サイクルを示す。 図３Ａと同様のデータを示す。図３Ｂの製剤は、100mM TrisHCl pH8.0、1mM EDTA、10mM メチオニンおよび2.9% エタノールも含有する。1時間の凍結乾燥サイクルを示す。 図３Ａと同様のデータを示す。24時間の凍結乾燥サイクルを示す。 図３Ａと同様のデータを示す。1時間の凍結乾燥サイクルを示す。 図４は、40％スクロース中のプラスミドDNA剤（10 mg/ml）に対する偏光顕微鏡データを示す。1AM、2AMおよび3AMは24時間の凍結乾燥サイクルに相当し、一方、1ST、2STと3STは1時間の凍結乾燥サイクルを示す。図４Ａの製剤は100mM TrisHCl pH8.0、1mM EDTA、10mM メチオニンおよび2.9% エタノールを含有する。 図４Ａと同様のデータを示す。 図４Ａと同様のデータを示す。図１５Ｃの製剤は40％スクロースのみを含む。 図４Ｄは、図１５Ａで示された剤に記載される賦形剤の結晶を示す。 図５は、糖およびポリオール中の凍結乾燥プラスミドDNA剤（10 mg/ml）に対する偏光顕微鏡データを示し、該剤は以下を含有する： 100mM TrisHCl pH8.0、1mM EDTA、10mM メチオニンおよび2.9% エタノール。図５Ａのサンプルは、サンプル１：40%w/vフィコール、サンプル２：20%w/vデキストラン、サンプル3：40%w/vスクロース、サンプル4：20%w/vマルトトリオースである。 図５Ａと同様のデータを示す。図５Ｂのサンプルは、サンプル5：20%w/vラクトース、サンプル6：30%w/vマルトース、サンプル7：40%w/vグルコース、サンプル8：40%w/vトレハロースである。 図６は、金ビーズ上に被覆し、25℃で１週間保存したスーパーコイルDNAプラスミドの安定性を示す。 図７は、金ビーズ上に被覆し、25℃で３週間保存したスーパーコイルDNAプラスミドの安定性を示す。

Claims (24)

  1. DNA薬剤を含む固形の貯蔵媒体で被覆された高密度核成分を有する、DNA医薬製剤。
  2. フリーラジカルの分解効果を阻害する安定化剤をさらに含む、請求項１記載のDNA医薬製剤。
  3. 安定化剤が金属イオンキレート剤およびフリーラジカルスカベンジャーの一方または両方である、請求項２記載のDNA医薬製剤。
  4. 金属イオンキレート剤が、イノシトール6リン酸、トリポリリン酸塩、コハク酸、リンゴ酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）、デスフェラール、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）およびエチレンジアミンジヒドロキシフェニル酢酸（EDDHA）から成る群より選択される、請求項３記載のDNA医薬製剤。
  5. 非還元フリーラジカルスカベンジャーが、エタノール、メチオニンまたはグルタチオンから成る群より選択される、請求項３記載のDNA医薬製剤。
  6. フリーラジカルの分解効果を阻害する安定化剤が（a）メチオニンもしくはEDTAと組み合わせたリン酸緩衝エタノール溶液、または（b）メチオニンもしくはエタノール（またはメチオニンおよびエタノールの併用）と組み合わせたTris緩衝EDTAである、請求項３記載のDNA医薬製剤。
  7. 固形の貯蔵媒体が非晶性ポリオールである、請求項１〜６のいずれか1項に記載のDNA医薬製剤。
  8. ポリオールが安定化ポリオールである、請求項７記載のDNA医薬製剤。
  9. 固形の生分解性貯蔵媒体が糖である、請求項１〜８のいずれか1項に記載のDNA医薬製剤。
  10. 糖が、ラクトース、グルコース、スクロース、ラフィノースまたはトレハロースから選択される、請求項９記載のDNA医薬製剤。
  11. 固形の貯蔵媒体がガラス形態である、請求項１〜１０のいずれか1項に記載のDNA医薬製剤。
  12. 固形の貯蔵媒体が糖ガラス形態である、請求項１１記載のDNA医薬製剤。
  13. DNAがスーパーコイルプラスミドDNAである、請求項１〜１２のいずれか1項に記載のDNA医薬製剤。
  14. 37℃での４週間の保存後に50％以上のDNAがそのスーパーコイル型を維持するように、スーパーコイルプラスミドDNAが安定化されている、請求項１３記載のDNA医薬製剤。
  15. 放出される際の単量体：二量体スーパーコイル型の比率が0.8：1.2の範囲内であるように、DNAが安定化されている、請求項１３記載のDNA医薬製剤。
  16. 薬剤がワクチンである、請求項１〜１５のいずれか1項に記載のDNA医薬製剤。
  17. 固形の貯蔵媒体がワクチンアジュバント、トランスフェクション促進剤、DNA分解酵素阻害剤または結晶阻害剤を更に含有する、請求項１〜１６のいずれか1項に記載のDNA医薬製剤。
  18. アジュバントがCpG、合成イミダゾキノリン、ツセラゾール（tucerasol）、サイトカイン、MPL、QS21、QS7および水中油型エマルジョンから成る群より選択される、請求項１７記載のDNA医薬製剤。
  19. 高密度核成分が0.5〜10μmの平均粒径のマイクロビーズである、請求項１記載のDNA医薬製剤。
  20. 高密度核成分が金またはタングステンマイクロビーズである、請求項１９記載のDNA医薬製剤。
  21. DNA薬剤、貯蔵媒体、およびフリーラジカルの分解効果を阻害する安定化剤からなる溶液を溶媒中で調製する工程、続いて、該溶液で少なくとも１つの高密度核成分を被覆する工程、ならびに、溶媒を除去して薬剤およびフリーラジカルの分解効果を阻害する薬剤を含有する固形の貯蔵媒体を形成する工程を含む、請求項１記載のDNA医薬製剤の製造方法。
  22. 貯蔵媒体が糖である、請求項２１記載のDNA医薬製剤の製造方法。
  23. 支持構材上での乾燥前の糖濃度が20〜40％w/vの範囲である、請求項２２記載のDNA医薬製剤の製造方法。
  24. 溶媒が工程の前に脱金属されている、請求項２３記載のDNA医薬製剤の製造方法。
JP2003561574A 2002-01-25 2003-01-23 Ｄｎａの製剤 Pending JP2005519905A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0201736.6A GB0201736D0 (en) 2002-01-25 2002-01-25 DNA dosage forms
GB0201735A GB0201735D0 (en) 2002-01-25 2002-01-25 DNA dosage forms
PCT/GB2003/000336 WO2003061629A2 (en) 2002-01-25 2003-01-23 Dna dosage forms

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2005519905A true JP2005519905A (ja) 2005-07-07
JP2005519905A5 JP2005519905A5 (ja) 2006-02-09

Family

ID=27614803

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003561574A Pending JP2005519905A (ja) 2002-01-25 2003-01-23 Ｄｎａの製剤

Country Status (8)

Country Link
US (2) US20050085434A1 (ja)
EP (1) EP1467711B1 (ja)
JP (1) JP2005519905A (ja)
AT (1) ATE357219T1 (ja)
CA (1) CA2473717A1 (ja)
DE (1) DE60312645T2 (ja)
ES (1) ES2285087T3 (ja)
WO (1) WO2003061629A2 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007063265A (ja) * 2005-08-02 2007-03-15 Santen Pharmaceut Co Ltd 熱的に不安定な薬物の分解抑制方法
JP2011057717A (ja) * 2005-08-02 2011-03-24 Santen Pharmaceut Co Ltd イソプロピルウノプロストンの分解抑制方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050052467A (ko) * 2002-08-12 2005-06-02 다이나박스 테크놀로지 코퍼레이션 면역조절 조성물, 이의 제조방법 및 이의 이용방법
AU2002951692A0 (en) * 2002-09-23 2002-10-17 Vital Biotech (Hong Kong) Limited Improvements in or relating to vaccines
GB0423681D0 (en) * 2004-10-26 2004-11-24 Sec Dep For Environment Food & Vaccine and nucleic acids
US8512679B2 (en) 2011-03-04 2013-08-20 Elwha Llc Glassy compositions

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08510639A (ja) * 1993-04-19 1996-11-12 メディソーブ・テクノロジーズ・インターナショナル・リミテッド・パートナーシップ 細胞取込みと遺伝子発現の促進と標的化をもたらす接合体と核酸のカプセル化
WO1997040839A1 (en) * 1996-04-26 1997-11-06 Merck & Co., Inc. Dna vaccine formulations
JP2001213807A (ja) * 1989-06-26 2001-08-07 Powderject Vaccines Inc 動物の体細胞の粒子媒介形質転換

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK28792D0 (da) * 1992-03-04 1992-03-04 Novo Nordisk As Nyt enzym
CN1112943C (zh) * 1994-01-21 2003-07-02 粉剂注射疫苗股份有限公司 气体驱动的基因送递装置
MX9701394A (es) * 1994-08-04 1998-03-31 Quadrant Holdings Cambridge Sistemas de administracion de solidos para la liberacion controlada de moleculas incorporadas en losmismos y metodos para hacer los mismos.
US6290991B1 (en) * 1994-12-02 2001-09-18 Quandrant Holdings Cambridge Limited Solid dose delivery vehicle and methods of making same

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001213807A (ja) * 1989-06-26 2001-08-07 Powderject Vaccines Inc 動物の体細胞の粒子媒介形質転換
JPH08510639A (ja) * 1993-04-19 1996-11-12 メディソーブ・テクノロジーズ・インターナショナル・リミテッド・パートナーシップ 細胞取込みと遺伝子発現の促進と標的化をもたらす接合体と核酸のカプセル化
WO1997040839A1 (en) * 1996-04-26 1997-11-06 Merck & Co., Inc. Dna vaccine formulations

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007063265A (ja) * 2005-08-02 2007-03-15 Santen Pharmaceut Co Ltd 熱的に不安定な薬物の分解抑制方法
JP2011057717A (ja) * 2005-08-02 2011-03-24 Santen Pharmaceut Co Ltd イソプロピルウノプロストンの分解抑制方法
JP2012140459A (ja) * 2005-08-02 2012-07-26 R Tec Ueno:Kk イソプロピルウノプロストンの分解抑制方法

Also Published As

Publication number Publication date
ATE357219T1 (de) 2007-04-15
DE60312645D1 (de) 2007-05-03
WO2003061629A2 (en) 2003-07-31
ES2285087T3 (es) 2007-11-16
EP1467711B1 (en) 2007-03-21
US20080095854A1 (en) 2008-04-24
CA2473717A1 (en) 2003-07-31
DE60312645T2 (de) 2007-11-29
EP1467711A2 (en) 2004-10-20
WO2003061629A3 (en) 2003-10-02
US20050085434A1 (en) 2005-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1512429B1 (en) Needles coated with vaccine
EP2709657B1 (en) Thermostable vaccine compositions and methods of preparing same
JP2015163652A (ja) 抗原−アジュバント組成物および方法
US20050266021A1 (en) Powder compositions
EP1467720B1 (en) Dna dosage forms
HUT77777A (hu) Szilárd vivőrendszerek molekulák kontrollált kibocsátására és eljárások a vivőrendszerek előállítására
JP2004506020A (ja) 経口投与固形ワクチン
JP2003535119A (ja) 粉末組成物
US20080095854A1 (en) Dna dosage forms
EP1528914B1 (en) Antigenic compositions
US20050002969A1 (en) Binary composition for prime-boost release of active ingredients like vaccines
RU2259817C2 (ru) Композиция для доставки стабильных инъецируемых жидкостей и способ доставки
AU2001275371A1 (en) Powder compositions

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20051213

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20051213

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20090203

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20090427

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20090508

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090723

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20090915

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20091209

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20091216

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20100525